AMPLICOR HCV HCV CTL 8 Sets P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 US: 83131

COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0 HCV DO BADAŃ DIAGNOSTYCZNYCH IN VITRO. Informacje AMPLICOR HCV HCV PREP 96 Tests P/N: 21111086 123 dotyczące zamówienia Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.0 US: 83126 AMPLICOR HCV HCV CTL 8 Sets P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 US: 83131 AMPLICOR HCV HCV AMP 96 Tests P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 US: 83127 COBAS AMPLICOR HCV DK 100 Tests P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, ART: 11 1113 2 version 2.0 US: 83130 COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 US: 83276 COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 US: 83305 COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 Poniższy zestaw służy wykrywaniu HCV Internal Control amplifikowanej przy użyciu AMPLICOR HCV Amplification Kit, version 2.0. Detekcja HCV Internal Control jest opcją zalecaną dla użytkownika. COBAS AMPLICOR IC 100 Tests P/N: 20757608 122 Internal Control Detection Kit ART: 07 5760 8 US: 83281 P/N: 04498313 190 Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu. 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 1/43

Zastosowanie COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, version 2.0 (v2.0) jest testem jakościowym in vitro do wykrywania wirusa RNA zapalenia wątroby typu C w próbkach klinicznych przy użyciu analizatora COBAS AMPLICOR Analyzer. Obecność HCV RNA świadczy o aktualnym zakażeniu HCV u chorych wykazujących kliniczne i/lub biochemiczne cechy choroby wątroby. Niniejszy test do wykrywania HCV RNA w ludzkiej surowicy lub osoczu używa odwrotnej transkrypcji badanego RNA do wytworzenia komplementarnego DNA (cdna), amplifikacji badanego cdna przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, Polymerase Chain Reaction) oraz hybrydyzacji kwasów nukleinowych. COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 nie jest przeznaczony do badań przesiewowych krwi ani produktów krwiopochodnych na obecność wirusa zapalenia wątroby typu C. Podsumowanie i objaśnienie testu Wirus zapalenia wątroby typu C uważany jest za główny czynnik etiologiczny odpowiedzialny za 90 95% przypadków wirusowego zapalenia wątroby nie-a i nie-b po przetoczeniach 1,2. HCV jest jednoniciowym wirusem RNA zawierającym nić sensowną z genomem liczącym około 10 000 nukleotydów kodujących 3000 aminokwasów 1. Jako wirus występujący we krwi, HCV może być przenoszony przez krew i produkty krwiopochodne. Zakażenie HCV występuje z dużą częstością u chorych po przeszczepach narządowych, przetoczeniach krwi lub dostępnych w handlu czynników krzepnięcia, jak również u chorych nadużywających leków podawanych dożylnie i narażonych na przezskórną drogę zakażenia, oraz u chorych dializowanych. Częstość występowania zakażenia HCV oceniana w oparciu o badania immunoserologiczne waha się od 0,6% w Kanadzie do 1,8% w Stanach Zjednoczonych 3. Obecność przeciwciał anty-hcv u chorych zakażonych HCV doprowadziła od opracowania swoistych dla nich testów immunoserologicznych 4,5. Wprowadzenie tego typu testów zmniejszyło na całym świecie częstość występowania poprzetoczeniowego zapalenia wątroby. Dodatkowe oznaczenia uzupełniające w celu dokładniejszej oceny próbek, które wielokrotnie wykazywały pozytywny wynik w teście przesiewowym dla przeciwciał, wykonywano przy użyciu testu typu RIBA (recombinant immunoblot assay). W przeprowadzonych niedawno badaniach stwierdzono, że interpretacja takiego testu uzupełniającego uzależniona jest od stopnia zagrożenia danego chorego. Na przykład w obarczonej niskim ryzykiem populacji dawców krwi, test HCV RNA daje dodatni wynik jedynie w 50% próbek z dodatnim wynikiem testu RIBA 6,7,8. Tak więc dodatni wynik testu RIBA nie stanowi rzeczywistego wskaźnika aktywnej infekcji HCV RNA ponieważ chorzy po przebytym wirusowym zapaleniu wątroby typu C mogą przez wiele lat wykazywać dodatni wynik testu anty-hcv 5. Ponadto niejednoznaczne wyniki testu uzupełniającego obserwowano zarówno u niedawno zakażonych osób w trakcie serokonwersji, jak i u osób przewlekle zakażonych HCV 9,10. Badanie immunoserologiczne świadczy o aktualnej i/lub wcześniejszej ekspozycji na zakażenie HCV, ale nie jest w stanie rozróżnić tych dwóch przypadków. Co więcej, w przypadkach ostrego zakażenia HCV, chorzy mogą nie wytworzyć przeciwciał skierowanych przeciwko HCV 11, co uniemożliwia rozpoznanie aktualnego zakażenia HCV przy użyciu technik immunoserologicznych. Ewentualnie, wykrycie HCV RNA przy użyciu testów oznaczających kwas nukleinowy może dostarczyć dowodów aktualnie trwającego zakażenia. Używając testów oznaczających kwas nukleinowy możliwe staje się wykrycie wiremii HCV przed serokonwersją immunologiczną 12,13. Ponieważ testy oznaczające kwas nukleinowy umożliwiają bezpośrednie wykrycie HCV RNA, tj. niezależnie od stanu immunologicznego chorego, tego typu test ma dużą wartość w wykrywaniu HCV RNA u chorych z obniżoną odpornością 8. 2/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus Zasady procedury Wewnętrzna kontrola Przygotowanie próbki Odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 oparty jest na z pięciu głównych procesach: przygotowanie próbki; odwrotna transkrypcja badanego RNA w celu wytworzenia komplementarnego DNA (cdna) 14 ; amplifikacja PCR 14 badanego cdna przy użyciu swoistych odcinków startowych (primerów) komplementarnych dla HCV; hybrydyzacja amplifikowanych produktów z oligonukleotydowymi sondami swoistymi dla badanego materiału; oraz wykrywanie amplifikowanych produktów związanych z sondami przy użyciu pomiarów kolorymetrycznych. COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 umożliwia równoczesną odwrotną transkrypcję i amplifikację PCR badanego HCV oraz docelowego RNA z HCV Internal Control. Odczynnik Master Mix zawiera parę primerów swoistych zarówno dla HCV RNA jak i RNA z HCV Internal Control. Amplifikowany DNA oznacza się przy użyciu oligonukleotydowych sond swoistych dla badanego materiału, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu zarówno HCV jak i HCV Internal Control. W procesach amplifikacji opartych na metodach enzymatycznych, takich jak PCR, inhibitory, które mogą być obecne w próbce klinicznej, mogą zmniejszać wydajność amplifikacji. COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 uzupełniono o kontrolę wewnętrzną HCV Internal Control aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR. HCV Internal Control jest transkryptem RNA zawierającym obszar wiązania primerów identyczny z badaną sekwencją HCV, losową wewnętrzną sekwencję o długości i składzie zasad podobnej do badanej sekwencji HCV, oraz unikalny obszar wiązania primerów, który odróżnia HCV Internal Control od badanego amplikonu. Powyższe cechy wybrano, aby zapewnić równoważną amplifikację HCV Internal Control i badanego RNA HCV. HCV RNA izoluje się z surowicy lub osocza poprzez lizę cząsteczek wirusa przy użyciu czynnika chaotropowego, a następnie strącenie RNA alkoholem. RNA jest ponownie zawieszany w rozcieńczalniku do próbki. RNA z HCV Internal Control, wprowadzany do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym służy jako kontrola ekstrakcji, amplifikacji i detekcji dla każdej indywidualnie przygotowywanej próbki. Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji RNA dla HCV uzależniony jest od identyfikacji regionów w obrębie genomu HCV wykazujących maksymalny konserwatyzm spośród różnych genotypów HCV 15,16,17. W związku z tym odpowiednia selekcja primerów i sondy jest kluczowym elementem decydującym o zdolności testu do wykrycia wszystkich genotypów (Zobacz punkt Ocena skuteczności w badania nieklinicznych, badanie reprezentatywności genotypu HCV). Region 5' nie ulegający translacji (UTR, 5'-untranslated region) genomu HCV zidentyfikowano jako najbardziej konserwatywną sekwencję RNA spośród znanych genotypów HCV 18,19. Do określenia sekwencji 244 nukleotydów w obrębie wysoce konserwatywnego obszaru 5'-UTR genomu HCV, COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 używa primerów KY78 i KY80 13. Sekwencje sondy wychwytującej i rimerów znajdują się w najbardziej konserwatywnych domenach w obrębie 5'-UTR 18. Odwrotna transkrypcja Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji wykonywane są przy użyciu termostabilnego, rekombinowanego enzymu polimerazy DNA Thermus thermophilus (rtth pol). W obecności manganu (Mn 2+ ) i w odpowiednich warunkach układu buforowego, rtth pol wykazuje aktywność zarówno odwrotnej transkryptazy, jak i polimerazy DNA 14. Umożliwia to prowadzenie odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej. Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (A-tubes), gdzie zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak i amplifikacja PCR. 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 3/43

Primer inicjujący transkrypcję nici sensownej, określany jako primer antysensowny (KY78) jest biotynylowany na końcu 5'; primer inicjujący transkrypcję nici antysensownej, określany jako primer sensowny (KY80) nie jest biotynylowany. Mieszaninę reakcyjną podgrzewa się, aby umożliwić primerowi antysenswnemu swoiste związanie się z docelowym RNA HCV oraz docelowym RNA HCV Internal Control. W obecności Mn 2+ i nadmiarze trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dntp, deoxynucleoside triphosphates), włączając trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast tymidyny), rtth pol wydłuża primer związany z nicią RNA tworząc nić DNA (cdna) komplementarną do badanego RNA. Amplifikacja badanego DNA Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji badanego HCV i RNA HCV Internal Control, mieszania reakcyjna jest podgrzewana aby umożliwić denaturację hybrydy RNA:cDNA i odsłonić sekwencje docelowe primerów. Po ochłodzeniu mieszaniny i swoistym związaniu primera sensownego (KY80) z nicią cdna, rtth pol wydłuża primer syntetyzując drugą nić DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA badanego regionu HCV i RNA HCV Internal Control. Mieszanina reakcyjna podgrzewana jest po raz kolejny w celu rozdzielenia powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. Po ochłodzeniu mieszaniny, primery KY78 i KY80 wiążą się z badanym DNA. W obecności Mn 2+ i nadmiaru dntps, rtth pol wydłuża primery związane z nićmi DNA zgodnie z badanym wzorcem wytwarzając cząsteczkę dwuniciowego DNA długości 244 par zasad nazywaną amplikonem. Analizator COBAS AMPLICOR Analyzer automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich podwajając rzeczywistą ilość DNA amplikonu. Wymagana liczba cykli w analizatorze COBAS AMPLICOR jest wstępnie zaprogramowana. Amplifikacja zachodzi jedynie w obszarze genomu HCV między primerami; całość genomu nie ulega amplifikacji. Amplifikacja wybiórcza Selektywną amplifikację badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej w teście COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozydaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje rozkład nici DNA zawierających dezoksyurydynę 20, nie wpływając na DNA zawierający dezoksytymidynę. Dezoksyurydyny nie stwierdza się w występującym w naturze DNA, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie z uwagi na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny zamiast trójfosforanu tymidyny jako jednego spośród dntps w odczynniku Master Mix; dlatego też jedynie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna sprawia, że przed amplifikacją docelowego DNA amplikon zanieczyszczający próbkę staje się podatny na rozkład przez enzym AmpErase. Enzym AmpErase zawarty w odczynniku Master Mix katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Z chwilą podgrzania w czasie pierwszego etapu cyklu termicznego w alkalicznym ph odczynnika Master Mix, łańcuch DNA amplikonu ulega rozerwaniu w pozycji dezoksyurydyny, przez co uniemożliwia amplifikację DNA. Enzym AmpErase ulega inaktywacji w temperaturach przekraczających 55 C, tj. w trakcie kolejnych etapów cyklu termicznego, i dlatego nie niszczy badanego amplikonu. Pozostały enzym jest po amplifikacji denaturowany przez dodanie roztworu denaturującego (Denaturation Solution), zapobiegając degradacji docelowych amplikonów. W przypadku COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 wykazano, że enzym AmpErase inaktywuje co najmniej 10 3 kopii amplikonu HCV zawierającego dezoksyurydynę w przeliczeniu na jedną reakcję PCR. 4/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus Reakcja hybrydyzacji Reakcja detekcji Odczynniki Po amplifikacji PCR, Analizator COBAS AMPLICOR automatycznie dodaje roztwór denaturujący (Denaturation Solution) do probówek typu A-tubes w celu chemicznej denaturacji amplikonu HCV oraz amplikonu HCV Internal Control i uzyskania jednoniciowego DNA. Próbki zdenaturowanego amplikonu przenosi się następnie do kubeczków używanych do oznaczeń (D-cups). Do poszczególnych pojemników typu D-cups dodaje się zawiesiny magnetycznych cząsteczek pokrytych sondą oligonukleotydową swoistą dla HCV (KY150) lub HCV Internal Control (SK535). Znakowane biotyną amplikony HCV i HCV Internal Control ulegają hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Hybrydyzacja amplikonów ze swoistą dla badanego materiału sondą zwiększa ogólną swoistość testu. Po reakcji hybrydyzacji Analizator COBAS AMPLICOR przemywa cząsteczki magnetyczne w pojemnikach typu D-cup w celu usunięcia niezwiązanego materiału, a następnie dodaje koniugat peroksydazy chrzanowej z awidyną. Koniugat peroksydazy chrzanowej z awidyną wiąże się ze znakowanymi biotyną amplikonami, które uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału (HCV lub Internal Control) sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Analizator COBAS AMPLICOR usuwa niezwiązany kompleks płucząc cząsteczki magnetyczne, a następnie do każdego pojemnika typu D-cup dodaje roztwór substratów zawierający nadtlenek wodoru oraz 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB). W obecności nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa związana z cząsteczkami katalizuje utlenianie TMB, tworząc barwny kompleks, którego absorbancja mierzona jest przez analizator COBAS AMPLICOR przy długości fali 660 nm. AMPLICOR HCV HCV PREP 96 testów P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 Zestaw do przygotowania próbki AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83126 HCV LYS, v2.0 (Odczynnik lizujący HCV, wersja 2.0) 8 x 6,9 ml Bufor Tris-HCl 68% tiocyjanian guanidyny 3% ditiotreitol < 1% glikogen + Xn 68% (udział wagowy) tiocyjanian guanidyny Produkt szkodliwy HCV DIL, v2.0 (Rozcieńczalnik próbki HCV, wersja 2.0) 8 x 4,8 ml Bufor Tris-HCl < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 5/43

HCV IC, v2.0 (Kontrola wewnętrzna HCV, wersja 2.0) 8 x 0,1 ml < 0,001% niezakaźny, transkrybowany in vitro RNA (pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje wiążące primery HCV oraz unikalny obszar wiążący sondę < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu AMPLICOR HCV HCV CTL 8 zestawów P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 Zestaw kontroli AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83131 NHP [Osocze ujemne (ludzkie)] 8 x 0,6 ml Ludzkie osocze, wykazujące ujemny wynik testów licencjonowanych przez US FDA w kierunku przeciwciał przeciw HCV, HIV-1/2, antygenowi HIV p24 oraz HBsAg; brak obecności HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA przy użyciu metod PCR 0,1% Substancja konserwująca ProClin 300 HCV ( ) C, v2.0 [Kontrola HCV ( ), wersja 2.0] 8 x 0,1 ml < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu HCV (+) C, v2.0 [Kontrola HCV (+), wersja 2.0] 8 x 0,1 ml < 0,001% niezakaźny, transkrybowany in vitro RNA (pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje HCV < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu AMPLICOR HCV HCV AMP 96 testów P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 Zestaw do amplifikacji AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83127 HCV MMX, v2.0 (Główny rozcieńczalnik HCV, wersja 2.0) 8 x 0,7 ml Bufor Bicine 16% DMSO Glicerol < 0,01% rtth polimeraza DNA (rtth pol, bakteryjna) Octan potasu < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% primery KY78 i KY80 (jeden z nich biotynylowany) < 0,01% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozydaza) (bakteryjny) 0,05% azydek sodu 6/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus HCV Mn 2+, v2.0 (Roztwór manganu HCV, wersja 2.0) 8 x 0,1 ml < 2% mangan Kwas octowy Barwnik amarantowy 0,05% azydek sodu COBAS AMPLICOR HCV DK 100 testów P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 Zestaw do detekcji COBAS AMPLICOR, wersja 2.0 US: 83130 CX PS1, v2.0 (Zawiesina sondy 1 HCV, wersja 2.0) 1 x 100 testów Bufor MES < 0,4% zawiesina Dynabeads (cząsteczki paramagnetyczne) pokrytych oligonukleotydową sondą wychwytującą, swoistą dla HCV (KY150) 0,09% azydek sodu CX4, v2.0 (Zawiesina sondy 2 HCV, wersja 2.0) Bufor fosforanu sodu < 0,2% środek zwiększający rozpuszczalność 42,2% tiocyjanian sodu Xn 42,2% (udział wagowy) tiocyjanian sodu + 1 x 100 testów Produkt szkodliwy COBAS AMPLICOR DK 100 testów P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 Zestaw odczynników do wykrywania COBAS AMPLICOR US: 83276 DN4 (Roztwór denaturujący) 1,6% wodorotlenek sodu EDTA Błękit tymolowy 1 x 100 testów + Xi 1,6% (udział wagowy) wodorotlenek sodu Produkt drażniący CN4 (Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) 1 x 100 testów Bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej Albumina surowicy wołowej (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% Substancja konserwująca ProClin 150 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/43

SB3 (Substrat A) Roztwór kwasu cytrynowego 0,01% nadtlenek wodoru 0,1% Substancja konserwująca ProClin 150 SB (Substrat B) 5 x 75 testów 5 x 5 ml 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB) 40% dimetyloformamid (DMF) T 40% (udział wagowy) dimetyloformamid (DMF) Produkt toksyczny R: 61-20/21-36 Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa drażniąco na oczy. S: 53-45 Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać się z instrukcją. W przypadku awarii lub jeżeli źle się poczujesz, niezwłocznie zasięgnij porady lekarza - jeżeli to możliwe, pokaż etykietę. COBAS AMPLICOR CN4 200 testów P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 Odczynnik do wykrywania koniugatu COBAS AMPLICOR US: 83305 CN4 (Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) 2 x 100 testów Bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej Albumina surowicy wołowej (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% Substancja konserwująca ProClin 150 COBAS AMPLICOR WB 500 testów P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 Bufor płuczący COBAS AMPLICOR US: 83314 WB (10X koncentrat płuczący) < 2% bufor fosforanowy < 9% chlorek sodu EDTA < 2% detergent 0,5% Substancja konserwująca ProClin 300 2 x 250 testów 8/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus Ostrzeżenia i środki ostrożności Do badań diagnostycznych in vitro. Niniejszy test przeznaczony jest do użycia z surowicą lub osoczem pobranym od ludzi wyłącznie przy użyciu środków przeciwkrzepliwych EDTA lub ACD. Wykazano, że heparyna hamuje PCR i dlatego nie może być stosowana w niniejszej procedurze. Nie pipetować ustami. W obszarach, gdzie prowadzone są prace laboratoryjne nie wolno spożywać posiłków, pić napojów ani palić papierosów. W czasie posługiwania się próbkami i odczynnikami z zestawów należy ubrać jednorazowe rękawiczki ochronne, fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne. Po użyciu próbek i odczynników z zestawów należy dokładnie umyć ręce. Pobierając próbki z butelek zawierających odczynniki należy unikać ich zanieczyszczenia bakteriami i rybonukleazą. Zaleca się stosowanie sterylnych pipet jednorazowych i końcówek do pipet pozbawionych RNazy. Nie należy mieszać odczynników z różnych serii produkcyjnych lub różnych butelek tej samej serii. Niewykorzystane odczynniki i odpady należy usuwać zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi i lokalnymi. Nie należy używać zestawu po upływie daty jego ważności. Karty charakterystyki bezpieczeństwa materiału (MSDS, Material Safety Data Sheets) dostępne są na żądanie w lokalnym przedstawicielstwie firmy Roche. Praca w laboratorium musi zachodzić w sposób jednokierunkowy, z początkiem w obszarze przedamplifikacyjnym i z jednokierunkowym ruchem w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności przed procesem amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie zaś przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie od określonej czynności przed procesem amplifikacji i nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym z obszarów konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenia i materiałów użytych do przygotowania odczynników nie wolno używać w czynnościach związanych z przygotowaniem próbki, pipetowaniem, obróbką amplifikowanego DNA ani innych źródeł badanego DNA. Materiały i wyposażenie związane z etapem po amplifikacji muszą przez cały okres czasu pozostawać w obszarze poamplifikacyjnym. Próbki należy traktować jako potencjalnie zakaźne, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa podobne do wymienionych w dokumencie Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 oraz dokumencie M29-A3 CLSI 22. Należy dokładnie czyścić i dezynfekować wszystkie powierzchnie robocze przy użyciu świeżo sporządzonego 0,5% roztworu podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. Uwaga Dostępne na rynku typowe płyny wybielające do zastosowania w gospodarstwach domowych zawierają podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie wybielacza przeznaczonego do gospodarstw domowych w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać 0,5% roztwór podchlorynu sodu. 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 9/43

PRZESTROGA: Niniejszy zestaw zawiera składnik (NHP) otrzymany z ludzkiej krwi. Materiał źródłowy zbadano przy użyciu testów zaaprobowanych przez US FDA, nie stwierdzając odczynów w kierunku obecności przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 ani antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg, Hepatitis B Surface Antigen). Badania ujemnego osocza ludzkiego przy użyciu metod PCR nie wykryły obecności HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA. Żadna ze znanych metod badania nie może zaoferować całkowitej pewności, że produkty otrzymane z ludzkiej krwi nie będą przenosić czynników zakaźnych. Dlatego też każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. NHP należy traktować jako potencjalnie zakaźne, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa podobne do przedstawionych w dokumencie Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 oraz dokumencie M29-A3 CLSI 22. Należy dokładnie czyścić i dezynfekować wszystkie powierzchnie robocze przy użyciu świeżo sporządzonego 0,5% roztworu podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. HCV IC, v2.0; HCV DIL, v2.0; HCV MMX, v2.0; HCV Mn 2+, v2.0; HCV ( ) C, v2.0; HCV (+) C, v2.0 i CX PS1, v2.0 zawierają azydek sodu. Azydek sodu może wchodzić w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą objętością wody aby zapobiec nagromadzeniu azydków. Używając HCV LYS, v2.0; HCV MMX, v2.0; CX4, v2.0, DN4, CN4, SB3, SB oraz substratu roboczego (mieszanina odczynnika SB3 i SB) należy założyć okulary ochronne, fartuchy laboratoryjne i rękawiczki jednorazowe. Należy unikać kontaktu powyższych materiałów ze skórą, oczami oraz błonami śluzowymi. W razie kontaktu należy natychmiast przemyć narażone miejsce dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania powyższych odczynników, przed wytarciem plam należy rozcieńczyć je wodą. Należy unikać kontaktu SB i substratu roboczego ze skórą i błonami śluzowymi. W razie kontaktu ze skórą należy natychmiast przemyć narażone miejsce dużą ilością wody. Dimetyloformamid zawarty w SB i substrat roboczy może wywierać szkodliwe działanie na płód, a także opisywano działania toksyczne po przyjęciu wysokich dawek doustnych. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania dymu i doustnego spożycia dimetyloformamidu. W razie kontaktu ze skórą, miejsce narażone należy dokładnie umyć mydłem i wodą oraz niezwłocznie zasięgnąć porady lekarza. Nie wolno dopuścić do kontaktu HCV LYS, v2.0, zawierającego tiocyjanian guanidyny ani CX4, v2.0 zawierającego tiocyjanian sodu z roztworem podchlorynu sodu (wybielacz). Tego typu mieszanina może powodować powstanie silnie toksycznego gazu. Do próbek i preparatu kontrolnego należy używać zakręcanych probówek, aby zapobiec rozlewaniu się i potencjalnej kontaminacji między próbkami. Nie należy stosować probówek z zatrzaskowym zamknięciem. 10/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus Wymagania dotyczące przechowywania i obchodzenia się Odczynników nie wolno zamrażać. HCV LYS, v2.0, HCV DIL, v2.0 i HCV IC, v2.0 przechowywać w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki przechowywane w zamkniętym opakowaniu są trwałe do czasu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania, pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. Przechowywanie HCV LYS, v2.0 w temperaturze 2 8 C prowadzi do powstania osadu. Aby rozpuścić osad, zestaw przed użyciem należy ogrzać w temperaturze 25-37 C i dokładnie wymieszać. HCV LYS, v2.0 należy ogrzewać przez okres maksymalnie 30 minut, a następnie dokładnie wymieszać do czasu rozpuszczenia kryształów. Każdą butelkę HCV LYS, v2.0 należy przed użyciem ocenić na białym tle czy nie wystąpuje żółty kolor lub cechy nieszczelności. W razie żółtego zabarwienia zawartości butelki lub cech jej nieszczelności, nie należy używać butelki do badań. Należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu wymiany zestawu. Po otwarciu opakowania, pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. Roboczy czynnik lizujacy (przygotowany przez dodanie HCV IC, v2.0 do HCV LYS, v2.0) należy przechowywać w temperaturze pokojowej i użyć w ciągu 8 godzin od chwili przygotowania. HCV MMX, v2.0 i HCV Mn 2+, v2.0 należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki są trwałe do czasu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania, pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. Główna mieszanina robocza (przygotowana przez dodanie HCV Mn 2+, v2.0 do HCV MMX, v2.0) należy przechowywać w temperaturze 2 8 C i użyć w ciągu 4 godzin od chwili przygotowania. NHP, HCV ( ) C, v2.0 i HCV (+) C, v2.0 należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki są trwałe do czasu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania, pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. CX PS1, v2.0 i CX4, v2.0 należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki są trwałe do czasu podanej daty ważności. Po wymieszaniu CX PS1, v2.0 i CX4, v2.0, odczynnik roboczy zachowuje trwałość przez 30 dni w temperaturze 2 8 C. Odczynnik roboczy stosować można w ciągu maksymalnie 6 cykli pracy urządzenia (12 godzin/cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go przechowywać w temperaturze 2 8 C. DN4 należy przechowywać w temperaturze 2 25 C. DN4 jest trwały do czasu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania, DN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2 8 C lub do upływu daty ważności. DN4 stosować można w ciągu maksymalnie sześciu cykli pracy urządzenia (12 godzin/cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go przechowywać w temperaturze 2 8 C. CN4 należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. CN4 jest trwały do czasu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania, CN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2 8 C lub do upływu daty ważności. CN4 stosować można w ciągu sześciu maksymalnie cykli pracy urządzenia (12 godzin/cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go przechowywać w temperaturze 2 8 C. SB3 i SB należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki przechowywane w zamkniętym opakowaniu są trwałe do czasu podanej daty ważności. Substrat roboczy musi być przygotowywany codziennie poprzez zmieszanie SB3 z SB. W analizatorze COBAS AMPLICOR, substrat roboczy jest trwały przez 16 godzin. SB3, SB ani substratu roboczego nie należy poddawać działaniu metali, środków utleniających lub bezpośredniego światła. 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 11/43

Dostarczane materiały WB należy przechowywać w temperaturze 2 30 C. WB jest trwały do czasu podanej daty ważności. WB należy ocenić przed rozcieńczeniem i w razie konieczności ogrzać w temperaturze 30 37 C celem rozpuszczenia ewentualnego osadu. Roboczy bufor płuczacy (1X), przygotowany przez rozcieńczenie WB wodą destylowaną lub dejonizowaną w stosunku 1:10 należy przechowywać w temperaturze 2 25 C w zbiorniku na bufor płuczący COBAS AMPLICOR. Bufor ten jest trwały przez okres 2 tygodni od daty przygotowania. Między cyklami pracy urządzenia, częściowo zużyte odczynniki do badania należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Przed wprowadzeniem do analizatora COBAS AMPLICOR odczynników z otwartych opakowań lub odczynników roboczych, należy sprawdzić ich datę ważności. AMPLICOR HCV HCV PREP P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 Zestaw do przygotowania próbki US: 83126 AMPLICOR HCV,wersja 2.0 HCV LYS, v2.0 (Odczynnik lizujacy HCV, wersja 2.0) HCV DIL, v2.0 (Rozcieńczalnik próbki HCV, wersja 2.0) HCV IC, v2.0 (Kontrola wewnętrzna HCV, wersja 2.0) AMPLICOR HCV HCV CTL P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 Zestaw kontroli AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83131 NHP [Osocze ujemne (ludzkie)] HCV ( ) C, v2.0 [Kontrola HCV ( ), wersja 2.0] HCV (+) C, v2.0 [Kontrola HCV (+), wersja 2.0] AMPLICOR HCV HCV AMP P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 Zestaw do amplifikacji AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83127 HCV MMX, v2.0 (Główny rozcieńczalnik HCV, wersja 2.0) HCV Mn 2+, v2.0 (Roztwór manganu HCV, wersja 2.0) COBAS AMPLICOR HCV DK P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 Zestaw do detekcji COBAS AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83130 CX PS1, v2.0 (Zawiesina sondy 1 HCV, wersja 2.0) CX4, v2.0 (Zawiesina sondy 2 HCV, wersja 2.0) 12/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus COBAS AMPLICOR DK P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 Zestaw odczynników do wykrywania US: 83276 COBAS AMPLICOR DN4 (Roztwór denaturujący) CN4 (Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 Odczynnik do wykrywania koniugatu US: 83305 COBAS AMPLICOR CN4 (Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 Bufor płuczacy COBAS AMPLICOR US: 83314 WB (10X koncentrat płuczący) Materiały wymagane, lecz niedostarczane Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania odczynników Pierścień (A-ring) przeznaczony do aparatu COBAS AMPLICOR z wbudowanymi 12 probówkami (A-tube) Statyw pierścienia (A-ring) przeznaczony do aparatu COBAS AMPLICOR Plastikowy worek do wielokrotnego zamykania Pipeta Eppendorf Multipette z pojemnikiem 1,25 ml Combitip (sterylny, indywidualnie pakowany) Pipetory (o pojemności 50 µl i 100 µl)* z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnymi od RNazy Rękawice jednorazowe bezpudrowe Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania próbek i kontroli Polipropylenowe probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml, sterylne, nie silikonowane, stożkowe (Sarstedt 72.692.005 lub równoważne)** Stojaki do próbówek (Sarstedt 93.1428 lub równoważne) 95% etanol, o klasie czystości odczynnika do zastosowań w mikrobiologii lub histologii (świeżo rozcieńczony do 70% przy użyciu wody destylowanej lub dejonizowanej) Alkohol izopropylowy, o stopniu czystości odczynnika chemicznego Jałowe pipety transferowe o cienkiej końcówce, wolne od RNazy 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 13/43

Sterylne, jednorazowe, polistyrenowe pipety serologiczne (5 ml, 10 ml i 25 ml) Pipetory (pojemność 20 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 600 µl i 1000 µl)* z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnymi od RNazy Mikrowirówka (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub równorzędna Mieszadło wibracyjne 60 C ± 2 C suchy blok grzejny Rękawice jednorazowe bezpudrowe Po amplifikacji obszar amplifikacji/detekcji Analizator COBAS AMPLICOR z drukarką Instrukcja obsługi analizatora COBAS AMPLICOR Opcjonalnie: oprogramowanie AMPLILINK obejmujące: Opcjonalnie: stację danych z oprogramowaniem AMPLILINK, wyposażoną w drukarkę Opcjonalnie: podręcznik obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR (współpracujący z programem AMPLILINK w wersji 3.2 Series) lub podręcznik obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR oraz aparatem cobas p 630 (współpracujący z programem AMPLILINK w wersji 3.3 Series). Instrukcja użytkowania COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 Stojaki na pojemniki typu D-cup Woda destylowana lub dejonizowana Pipety serologiczne o pojemności 5 ml Rękawice jednorazowe bezpudrowe * Dokładność pipetorów musi wahać się w zakresie 3% podanej objętości. Końcówki z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem wolne od RNazy muszą być zastosowane zgodnie z przeznaczeniem, aby uniknąć skażenia krzyżowego próbki i amplikonu. ** Do przygotowywania próbek badanych i kontrolnych konieczne jest stosowanie zakręcanych probówek, aby zapobiec rozchlapaniu i potencjalnej kontaminacji między próbkami badanymi i kontrolnymi. Nie należy stosować probówek z zatrzaskowym zamknięciem. Pobieranie próbek, transport i przechowywanie Uwaga Pobieranie próbek Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem zdolnym do przenoszenia czynników zakaźnych. COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 stosuje się wyłącznie do próbek surowicy lub osocza. Krew należy pobierać do probówek typu SST (Serum Separation Tubes) lub sterylnych probówek stosując jako koagulant EDTA (lawendowa nakrętka) lub ACD (żółta nakrętka). Próbki, w których użyto heparyny jako czynnika przeciwkrzepliwego, nie nadają się do niniejszego testu. Pełną krew należy przechowywać w temperaturze 2 25 C nie dłużej niż 6 godzin. Surowicę lub osocze należy oddzielić od krwi pełnej w ciągu 6 godzin od pobrania, odwirowując przy 1500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Surowicę lub osocze należy przenieść do sterylnych polipropylenowych probówek. 14/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus Transport próbek Przechowywanie próbek Instrukcje użytkowania Transport pełnej krwi, surowicy lub osocza musi przebiegać zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi i lokalnymi dla transportu czynników zakaźnych 23. Krew pełną należy transportować w temperaturze 2 25 C i poddać obróbce w ciągu 6 godzin od pobrania. Surowicę lub osocze transportować można w temperaturze 2 8 C lub zamrożone w temperaturze -70 C lub poniżej i należy je poddać obróbce w podanych poniżej granicach czasu. Próbki surowicy lub osocza przechowywać można w temperaturze 2 8 C przez okres do 72 godzin, lub zamrożone w temperaturze -70 C i poniżej. Zaleca się przechowywanie próbek w porcjach o objętości 250 300 µl, w sterylnych, polipropylenowych, zakręcanych o pojemności 1,5 ml (takich jak firmy Sarstedt 72.692.105). Próbki surowicy i osocza można dwukrotnie zamrażać i rozmrażać. Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga Liczba cykli Przebieg pracy Szczegółowe informacje na temat obsługi, drukowania wyników i interpretacji sygnałów oraz komentarzy przedstawiono w (1) podręczniku obsługi analizatora COBAS AMPLICOR lub (2) w przypadku używania programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series w podręczniku obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series współpracującego z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR, bądź w przypadku używania programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series w podręczniku obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series współpracującego z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR oraz aparatem cobas p 630. Wszystkie odczynniki muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem. Przed rozpoczęciem procedury oznaczenia, sprawdź wzrokowo, czy objętość odczynników jest wystarczająca. Próbki surowicy i osocza muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem. Gdzie to zaznaczono, używać pipetorów z barierą aerozolową lub z końcówkami dodatniego wypierania. Dołóż wszelkich starań, aby zapewnić selektywną amplifikację. Do przygotowywania próbek badanych i kontrolnych konieczne jest stosowanie zakręcanych probówek, aby zapobiec rozchlapaniu i potencjalnej kontaminacji między próbkami badanymi i kontrolnymi. Nie należy stosować probówek z zatrzaskowym zamknięciem. Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające dla ośmiu cykli po 12 oznaczeń każdy, które wykonywać można oddzielnie lub równocześnie. Każdy cykl oznaczeń musi zawierać co najmniej jedno powtórzenie AMPLICOR HCV ( ) Control i AMPLICOR HCV (+) Control (patrz punkt Kontrola jakości). Odczynniki do przygotowania próbki i amplifikacji pakowane są w butelki jednorazowe, wystarczające na przeprowadzenie 12 testów. Kontrole HCV ( ) i HCV (+) pakowane są w fiolki jednokrotnego użytku. Aby najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane i kontrolne należy poddawać obróbce w seriach będących wielokrotnością 12. Test AMPLICOR HCV Test, v2.0 można wykonać w ciągu jednego dnia lub dwóch dni. Aby przeprowadzić oznaczenie w ciągu jednego dnia roboczego należy kolejno wykonywać instrukcje w punktach Przygotowanie odczynników, Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych oraz Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja. Test przeprowadzić można w ciągu 2 dni rozpoczynając od punktu Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych w dniu 1, a następnie 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 15/43

Przygotowanie odczynników Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych Uwaga Przygotowanie odczynników i Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja w dniu 2 lub rozpoczynając od Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, Odwrotna transkrypcja i Amplifikacja w dniu 1, a Detekcja w dniu 2. Aby przygotować próbkę badaną i kontrolną w dniu 1, a odwrotną transkrypcję, amplifikacja i detekcja w dniu 2, należy wykonać punkty Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych (etapy 1 do 15) i przechować przygotowane próbki badane i kontrolne w sposób przedstawiony w etapie 15. Dzień 2 należy rozpocząć od Przygotowanie odczynników, a następnie rozmrozić przygotowane próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej, po czym wykonać punkt Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, etap 16, oraz Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja. Aby przygotować próbki badane i kontrolne oraz wykonać odwrotną transkrypcję i amplifikację w dniu 1, należy wykonać wszystkie etapy Przygotowanie odczynników i Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych. Należy zaprogramować analizator COBAS AMPLICOR do pracy w trybie równoległym, a następnie zakończyć etapy amplifikacji. Należy pozostawić zdenaturowany amplikon przez noc w temperaturze 2 8 C i kontynuować oznaczenie od punktu Detekcja w dniu 2. Wykonywane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania odczynników 1. Ustal odpowiednią liczbę pierścieni (A-ring) potrzebnych do oznaczenia próbek pacjentów i kontrolnych. Umieść pierścienie (A-ring) w odpowiednim statywie(ach). 2. Przygotuj główną mieszaninę robocza dodając 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 do jednej fiolki z HCV MMX, v2.0. Nie musisz mierzyć objętości głównej mieszaniny. Dodaj 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 do całej fiolki HCV MMX, v2.0. Zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj, odwracając ją 10 15 razy. Nie mieszaj na mieszadle wibracyjnym roztworu głównej mieszaniny roboczej. Różowy barwnik w HCV Mn 2+, v2.0 używany jest do wizualnego potwierdzenia, że HCV Mn 2+, v2.0 dodano do HCV MMX, v2.0. Usuń pozostały HCV Mn 2+, v2.0. Główna mieszanina robocza musi być przechowywana w temperaturze 2 8 C i zużyta w ciągu 4 godzin od przygotowania. 3. Dodaj 50 µl głównej mieszaniny roboczej do każdej z probówek (A-tube) używając pipetora powtarzalnego lub pipetora wyposażonego w barierę aerozolową lub końcówkę dodatniego wypierania. Nie należy jeszcze zamykać probówek (A-tube). 4. Włóż pierścień(nie) (A-ring) zawierające główną mieszaninę roboczą do plastikowego woreczka przeznaczonego do wielokrotnego zamykania i zamknij go pewnie. Przenieś pierścień(nie) (A-ring) do Obszaru przed amplifikacją przygotowanie próbek badanych i kontrolnych. Pierścień(nie) (A-ring) zawierające główną mieszaninę roboczą należy przechowywać w temperaturze 2 8 C w Obszarze przed amplifikacją przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, do czasu zakończenia przygotowywania próbek badanych i kontrolnych. Główna mieszanina robocza zachowuje stabilność przez 4 godziny w temperaturze 2 8 C w probówkach (A-tube) umieszczonych w szczelnie zamkniętej torebce z tworzywa. Wykonywane w: Obszar przed amplifikacją obszar przygotowania próbek badanych i kontrolnych W celu amplifikacji uprzednio przygotowanych próbek badanych i kontrolnych, należy najpierw wykonać etapy w punkcie Przygotowanie odczynników. Należy rozmrozić przygotowane próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, etap 16. 16/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga Każdą butelkę HCV LYS, v2.0 należy przed użyciem ocenić na białym tle pod kątem wystąpienia żółtego koloru lub cech nieszczelności. W razie żółtego zabarwienia zawartości butelki lub cech jej nieszczelności, nie należy używać butelki do badań. Należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu wymiany zestawu. Przechowywanie HCV LYS, v2.0 w temperaturze 2 8 C prowadzi do powstania osadu. Przed użyciem odczynnik należy ogrzać w temperaturze 25 37 C przez maksymalnie 30 minut oraz dokładnie wymieszać w celu rozpuszczenia osadu. 1. Przygotuj 70% etanol. W celu wykonania 12 testów, wymieszaj 11,0 ml 95% etanolu i 4,0 ml dejonizowanej lub destylowanej wody. 2. Oznacz jedną zakręcaną probówkę pojemności 1,5 ml dla jednego pacjenta oraz dwie dodatkowe probówki jako HCV ( ) C i HCV (+) C. 3. Przygotuj roboczy odczynnik lizujący. Przed użyciem, wymieszaj na mieszadle wibracyjnym HCV IC, v2.0 przez 5 10 sekund. Dla każdej serii liczącej do 12 próbek badanych i kontrolnych, dodaj 100 µl HCV IC, v2.0 do jednej butelki HCV LYS, v2.0 i dobrze wymieszaj. Nie musisz mierzyć objętości HCV LYS, v2.0. HCV IC, v2.0 musi być dodany do HCV LYS, v2.0 nawet jeżeli HCV Internal Control nie zostanie wykryty. Usuń pozostały HCV IC, v2.0. Roboczy odczynnik lizujący jest trwały przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. W razie używania zamrożonych próbek, należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej i wymieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3 do 5 sekund. Aby zebrać badaną próbką na dnie probówki, odwiruj ją krótko. Zachować ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic przy obchodzeniu się z próbkami. 4. Dodaj 400 µl roboczego odczynnika lizującego do każdej z oznaczonych probówek i zamknij je. 5. Przygotuj kontrole w następujący sposób: Wymieszaj na mieszadle wibracyjnym NHP, HCV ( ) C, v2.0 i HCV (+) C, v2.0 co najmniej 5 10 sekund. Dodaj 200 µl NHP do każdej z kontrolnych probówek. Zamknij probówki i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej 3 5 sekund. Dodaj 20 µl HCV ( ) C, v2.0 do probówki oznaczonej HCV ( ) C zawierającej roboczy odczynnik lizujący i NHP. Zamknij probówki i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej 3 5 sekund. Dodaj 20 µl HCV (+) C, v2.0 do probówki oznaczonej HCV (+) C zawierającej roboczy odczynnik lizujący i NHP. Zamknij probówkę i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3 5 sekund. 6. Dodaj 200 µl każdej badanej próbki chorego doodpowiednio oznaczonej probówki zawierającejroboczy odczynnik lizujący. Zamknij probówki i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3 5 sekund. 7. Inkubuj probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi w suchym bloku grzejnym przez 10 minut w temperaturze 60 C ± 2 C. Wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 10 sekund. 8. Otwórz probówki i do każdej z nich dodaj 600 µl 100% alkoholu izopropylowego (o temperaturze pokojowej). Zamknij ponownie probówki i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3 5 sekund. Inkubuj wszystkie probówki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. 9. Na każdą probówkę nanieś znak orientacyjny, a następnie umieść probówki w mikrowirówce tak, aby wspomniany znak skierowany był na zewnątrz, a peletki ustawiły się zgodnie ze znakami. Odwiruj próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy maksymalnej prędkości (12 500 16 000 x g). 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 17/43

Uwaga 10. Używając dla każdej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką na każdą próbkę odciągnij ostrożnie i usuń supernatant z każdej probówki, zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić peletki (która może być nie widoczna). Usuń tak dużo płynu, jak to jest możliwe bez uszkodzenia peletki. Usuń powoli supernatant, pozwalając na całkowite spłynięcie płynu po ścianie probówki. Nie należy stosować aspiracji próżniowej. 11. Do każdej probówki dodaj 1,0 ml 70% etanolu (o temperaturze pokojowej), a następnie zamknij ją i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3 5 sekund. 12. Umieść probówki w mikrowirówce ze znakami orientacyjnymi skierowanymi na zewnątrz i wiruj probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy maksymalnej prędkości (12 500 16 000 x g). 13. Używając dla każdej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką na każdą probówkę odciągnij ostrożnie i usuń supernatant nie uszkadzając peletki. Na tym etapie peletka powinna być wyraźnie widoczna. Usuń tak dużo supernatantu, jak to jest możliwe. 14. Zamknij ponownie probówki i odwiruj przy maksymalnej prędkości przez 3 5 sekund. Ostrożnie usuń supernatant bez uszkadzania peletki przy użyciu pipetora o pojemności 200 µl zaopatrzonego w nową końcówkę dla każdej probówki. Na tym etapie peletka powinna być wyraźnie widoczna. Usuń tak dużo supernatantu, jak to jest możliwe. Pozostały etanol może hamować amplifikację. 15. Dodaj 200 µl HCV DIL, v2.0 do każdej probówki. Jak najdokładniej rozprowadź peletkę przy użyciu pipetora o pojemności 200 µl zaopatrzonego w końcówkę z barierą aerozolową. Zamknij ponownie probówki. Wymieszaj na mieszadle wibracyjnym energicznie przez 10 sekund. Pozostać może niewielka ilość nierozpuszczalnego materiału. Przygotowane próbki badane i kontrolne należy poddać amplifikacji w ciągu 3 godzin od przygotowania lub przechowywać zamrożone w temperaturze -70 C lub niższej przez okres do jednego miesiąca, przy nie więcej niż dwóch cyklach zamrażanie/rozmrażanie. Więcej niż dwa cykle zamrażanie/rozmrażanie mogą powodować utratę sygnału HCV lub HCV Internal Control. Jeżeli przygotowane próbki badane i kontrolne przechowywano w stanie zamrożenia przed amplifikacją, przed przejściem do etapu 16 należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej, wymieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. 16. Do odpowiednich probówek (A-tube) zawierających główną mieszaninę roboczą dodaj przy użyciu mikropipetora wyposażonego w końcówki z barierą aerozolową lub dodatniego wypierania 50 µl każdej z przygotowanych próbek pacjenta i kontrolnych. Do każdej próbki badanej i kontrolnej użyj nowej końcówki. Zwróć uwagę, żeby uniknąć przenoszenia wytrąconego materiału, który mógł nie ulec rozpuszczeniu. Zamknij probówki (A-tube). 17. Zapisz lokalizację próbek kontrolnych i badanych w pierścieniach (A-ring). Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 45 minut od czasu dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do probówek (A-tube) zawierających główną mieszaninę roboczą. Przenieś przygotowane próbki badane i kontrolne w pierścieniach (A-ring) do obszaru amplifikacji/detekcji. Pozostałą część przygotowanej próby można zamrozić w temperaturze -70 C lub niższej przez okres do jednego miesiąca. Przygotowane próbki można zamrażać i rozmrażać nie więcej niż dwa razy. Więcej niż dwa cykle zamrażanie/rozmrażanie mogą powodować utratę HCV RNA. 18/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0

Hepatitis C Virus Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja Wykonywana w: Obszarze obróbki poamplifikacyjnej obszarze amplifikacji/detekcji Należy wykonać codzienne czynności serwisowe obejmujące: Przetrzyj stanowisko startowe przy użyciu wilgotnej szmatki pozbawionej kłaczków, a następnie osusz je Przetrzyj końcówkę uchwytu do pojemników D-cup przy użyciu wilgotnej szmatki pozbawionej kłaczków, a następnie osusz ją Sprawdź pojemnik buforu płuczącego i napełnij go w razie potrzeby Przygotuj roboczy bufor płuczacy (1X) w sposób podany poniżej. Sprawdź WB, a w razie potrzeby ogrzej go w temperaturze 30 37 C w celu rozpuszczenia osadu. Dodaj 1 objętość WB do 9 objętości destylowanej lub dejonizowanej wody. Wymieszaj dokładnie. Przez cały czas utrzymuj co najmniej 3 4 litry buforu płuczącego (1X) w zbiorniku buforu płuczącego systemu. Opróżnij pojemnik na odpady Załaduj system Podczas ładowania systemu sprawdź strzykawki i przewody Podczas ładowania systemu sprawdź końcówkę pipetującą Przed każdym cyklem Sprawdź pojemnik na odpady i opróżnij go w razie potrzeby Sprawdź pojemnik bufora płuczącego i dodaj buforu w razie potrzeby Usuń zużyte stojaki do pojemników D-cup Załaduj system Ładowanie analizatora COBAS AMPLICOR i sprawdzenie działania systemu 1. Sprawdź ilości odczynników wewnątrz analizatora COBAS AMPLICOR. Przygotuj wystarczającą ilość kaset z odczynnikami do ukończenia analizy wprowadzonych próbek. 2. Wymieszaj dokładnie CX PS1, v2.0 na mieszadle wibracyjnym. Dodaj 2,5 ml CX PS1, v2.0 do jednej kasety zawierającej CX4, v2.0. Umieść kasetę w stojaku dla odczynników specyficznych dla określonego testu. Usuń zużytą fiolkę CX PS1, v2.0. Zanotuj datę przygotowania odczynnika na kasecie CX4, v2.0. 3. Oznaczając HCV Internal Control, dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym IC PS1. Dodaj 2,5 ml IC PS1 do jednej kasety z IC4. Umieść kasetę w stojaku dla odczynników specyficznych dla określonego testu. Usuń zużytą fiolkę IC PS1. Zanotuj datę przygotowania odczynnika na kasecie IC4. 4. Przygotuj substrat roboczy pipetując 5 ml SB do jednej kasety z SB3. Aby wymieszać roztwór, kilkakrotnie nabierz i usuń płyn z pipety. Usuń pustą fiolkę SB. Odnotuj datę przygotowania na kasecie z SB3. 5. Umieść substrat roboczy w ogólnym stojaku dla roztworów. 6. Umieść kasety z DN4 i CN4 w ogólnym stojaku dla roztworów. Na każdej kasecie odnotuj datę jej otwarcia. 7. Oznaczyć ramki na odczynniki jako zwykłe lub określone dla danego testu, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. 09/2012, Revision 11.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 19/43

8. Skonfigurować ramki na odczynniki przez wprowadzenie pozycji odczynników i numerów serii do analizatora COBAS AMPLICOR, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. Uwaga 9. Załadować ramki na odczynniki do analizatora COBAS AMPLICOR, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. Upewnić się, że każda kaseta z odczynnikami znajduje się w przypisanym jej miejscu i jest mocno zamocowana w statywie. 10. Umieść stojak dla pojemników D-cup na przeznaczonej dla nich platformie. Dla każdej reakcji detekcji wymagany jest jeden pojemnik D-cup, a dla każdej kasety z substratem roboczym wymagane są dwa pojemniki D-cup, aby umożliwić wyzerowanie analizatora COBAS AMPLICOR. 11. Umieść pierścień(nie) A-ring w segmencie(tach) termocyklera analizatora COBAS AMPLICOR. 12. Załadować pierścienie A do analizatora COBAS AMPLICOR, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. 13. Utworzyć listę roboczą pierścienia A. 14. Szczelnie zamknąć pokrywę segmentu(ów) termocyklera. 15. Uruchomić analizator COBAS AMPLICOR. 16. Zaczekać, aż analizator COBAS AMPLICOR wyświetli komunikat o omyślnym sprawdzeniu systemu w czasie uruchamiania. Analizator COBAS AMPLICOR umożliwia wykonanie do 6 oddzielnych oznaczeń zawartości każdej probówki A-tube. Analizator COBAS AMPLICOR oblicza wymaganą ilość każdego odczynnika, a test wkładu wykonywany na początku każdego cyklu określa, czy dostępna ilość odczynników jest wystarczająca do żądanych oznaczeń. 17. Analizator COBAS AMPLICOR automatycznie wykonuje odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję. Wyniki wyrażone są w postaci wartości absorbancji przy długości fali 660 nm oraz jako dodatni, ujemny lub niejednoznaczny. 20/43 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 09/2012, Revision 11.0