AmpliTest TBEV (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji RNA specyficznych dla TBEV (Tick-borne encephalitis virus) techniką Real Time PCR Nr kat.: RV03-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość pojedynczej reakcji: 20 µl Limit detekcji: 12 kopii RNA wirusa Przed użyciem zestawu należy uważnie zapoznać się z niniejszą instrukcją. Amplicon sp. z o. o. ul. Duńska 9 54-427 Wrocław Polska, NIP: 8943052339, KRS: 0000501830 www.amplicon.pl email: contact@amplicon.pl, tel. +48 71 733 67 06, fax +48 71 733 67 24
ZASTOSOWANIE Zestaw AmpliTest TBEV (Real Time PCR) jest przeznaczony do wykrywania sekwencji RNA specyficznych dla wirusa kleszczowego zapalenia mózgu (KZM / TBEV - Tick-borne encephalitis virus) w próbkach RNA uzyskanych od zwierząt. Materiałem wyjściowym do izolacji RNA może być kleszcz, krew, płyn mózgowordzeniowy lub inne tkanki. W celu uniknięcia problemów z wydajnością reakcji Real Time PCR próbki RNA powinny być uzyskane przy użyciu metod pozwalających na otrzymanie wysokiej jakości RNA pozbawionego inhibitorów reakcji PCR. Zalecane są zestawy do izolacji RNA oparte o złoża krzemionkowe (tzw. zestawy kolumienkowe). ZAKRES STOSOWANIA Diagnostyka weterynaryjna in vitro Badania i rozwój (B+R) SKŁADNIKI ZESTAWU Nazwa Opis Ilość Kolor wieczka RM Mieszanina reakcyjna 2 275 µl Zielony PC Kontrola pozytywna 2 50 µl Czerwony NC Kontrola negatywna 2 50 µl Niebieski RT Odwrotna transkryptaza 1 10 µl Czarny Rin Inhibitor RNAz 1 20 µl Żółty Woda Woda wolna od nukleaz 1 500 µl Biały TRANSPORT i PRZECHOWYWANIE Transport odbywa się w suchym lodzie. Po otrzymaniu przesyłki należy ją natychmiast rozpakować. Składniki testu przechowywać -20 C; UNIKAĆ EKSPOZYCJI SKŁADNIKA RM NA ŚWIATŁO; Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania składników testu, w szczególności składnika RM. Trzy cykle zamrożenia i rozmrożenia składnika RM nie wpływa znacząco na jakość wyników. WSKAZÓWKA: na etykietach probówek zawierających składnik RM znajdują się pola, w których można zaznaczać ilość rozmrożeń danej porcji. Składniki RM oraz PC zawierają RNA należy je chronić przed działaniem rybonukleaz. Nie używać składników testu po upływie daty przydatności do użycia. 2
ZASADA DZIAŁANIA TBEV (KZM) jest wirusem typu RNA należącym do rodziny Flaviviridae. Do jego detekcji metodą Real Time PCR konieczny jest proces odwrotnej transkrypcji polegający na syntezie cząsteczek cdna na podstawie RNA. Zestaw AmpliTest TBEV (Real Time PCR) jest zestawem typu one-step. Dzięki temu procesy odwrotnej transkrypcji i amplifikacji sekwencji specyficznych dla TBEV zachodzą w jednej probówce. Zestaw AmpliTest TBEV (Real Time PCR) zawiera startery umożliwiające namnożenie sekwencji charakterystycznych dla TBEV. Detekcja obecności wirusowych sekwencji następuje dzięki specyficznej sondzie typu TaqMan, która przyłączając się do powstającego amplikonu (powielanego fragmentu DNA wirusa) ulega hydrolizie. Podczas hydrolizy z sondy jest uwalniany barwnik fluorescencyjny FAM, który następnie jest wykrywany przez układ optyczny aparatu do Real Time PCR. Odpowiednio dobrane sekwencje starterów i sondy zapewniają wysoką czułość i specyficzność reakcji. W celu zwiększenia wiarygodności wyników Zestaw AmpliTest TBEV (Real Time PCR) zawiera kontrolę wewnętrzną (egzogenny fragment RNA) oraz układ starterów i sondy do jej amplifikacji i detekcji. Detekcja kontroli wewnętrznej odbywa się dzięki uwalnianiu przez sondę barwnika fluorescencyjnego HEX. Obecność kontroli wewnętrznej pozwala na monitorowanie prawidłowego przebiegu odwrotnej transkrypcji i reakcji Real Time PCR. Amplifikacja kontroli wewnętrznej nie wpływa na wydajność wykrywania sekwencji specyficznych dla wirusa TBEV. Pozytywny wynik kontroli wewnętrznej stanowi potwierdzenie prawidłowego przebiegu odwrotnej transkrypcji i reakcji Real Time PCR. 3
POTRZEBNY SPRZĘT I DODATKOWE MATERIAŁY Aparat do Real Time PCR: LightCycler 480 (Roche) LightCycler 96 (Roche) LightCycler 2.0 (Roche) RotorGene 3000/6000 (Qiagen) Inne urządzenia umożliwiające detekcję barwników fluorescencyjnych FAM i HEX. Zestaw AmpliTest TBEV (Real Time PCR) nie zawiera barwnika normalizacyjnego ROX. W przypadku urządzeń wymagających takiej normalizacji należy do mieszaniny reakcyjnej dodać barwnik ROX do odpowiedniego stężenia. Barwnik ROX nie jest dołączony do zestawu. Probówki reakcyjne (próbówki PCR, płytki PCR, kapilary w zależności od posiadanego urządzenia do Real Time PCR) Wirówka do probówek reakcyjnych Wirówka stołowa Pipety automatyczne w zakresie 1-1000 µl Sterylne końcówki z filtrami do pipet automatycznych Zestaw do izolacji RNA W zależności od użytego zestawu do izolacji RNA może być potrzeby dodatkowy sprzęt i materiały. IZOLACJA RNA Z uzyskanego materiału (krew lub inne płyny ustrojowe, fragmenty narządów wewnętrznych) należy wyizolować RNA. Ilość potrzebnego materiału biologicznego zależy od użytej metody izolacji RNA. Ze względu na dużą podatność RNA na degradację czas pomiędzy pobraniem materiału biologicznego a izolacją RNA powinien być jak najkrótszy. Do chwili izolacji RNA uzyskany materiał biologiczny powinien być odpowiednio zabezpieczony (przechowywany w -20 C, ewentualnie w +4 C, najlepiej w środowisku hamującym aktywność nukleaz, np. w obecności EDTA). Niewłaściwe przechowywanie pobranego materiału biologicznego może skutkować degradacją RNA, co będzie prowadzić do uzyskania wyników fałszywie negatywnych. 4
Do izolacji RNA zaleca się stosowanie zestawów opartych o złoża krzemionkowe (tzw. zestawów kolumienkowych), gdyż zapewniają one uzyskanie próbek RNA o odpowiedniej jakości pozbawionych inhibitorów reakcji PCR. W przypadku innych metod izolacji preparat RNA może zawierać związki, które istotnie zmniejszają wydajność reakcji PCR. Prowadzi to do obniżenia czułości testu, a w skrajnych przypadkach do braku amplifikacji DNA. Próbki RNA należy przechowywać w -20 C (krótki okres przechowywania) lub w -80 C (długi okres przechowywania). Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek RNA i chronić je przed kontaktem z nukleazami. W tym celu należy korzystać z materiałów (woda, probówki, końcówki do pipet itp.) wolnych od nukleaz (potwierdzonych odpowiednimi certyfikatami). REAKCJA REAL TIME PCR 1. Określić liczbę próbek RNA poddawanych analizie (n). 2. Rozmrozić składniki testu, z wyjątkiem składników RT i Rin. Składniki po rozmrożeniu przechowywać w +4 C lub na lodzie. UNIKAĆ EKSPOZYCJI składnika RM NA ŚWIATŁO. UWAGA: Składniki RT (odwrotna transkryptaza) i Rin (inhibitor RNAz) w miarę możliwości utrzymywać przez cały czas w temperaturze poniżej 0 C, gdyż pozostają one w postaci płynnej w tej temperaturze. Składniki te są wrażliwe na temperaturę i ogrzewanie ich do temperatury powyżej 00 C może doprowadzić do ich inaktywacji. 3. Określić ilość RNA dodawanego do reakcji (x µl). Optymalna ilość RNA w reakcji wynosi 100-200 ng. Ilość RNA dodawanego do reakcji nie powinna przekroczyć 1 µg. Duże ilości RNA dodanego do reakcji PCR mogą negatywnie wypływać na obniżenie wydajności odwrotnej transkrypcji i podwyższyć limit detekcji testu. 4. W probówce wolnej od nukleaz wymieszać następujące składniki: RM (n + 3) 11 µl RT (n + 3) 0,2 µl Rin (n + 3) 0,4 µl Woda (n + 3) (8,4 - x) µl 5. Do n + 2 probówek reakcyjnych (probówek PCR, kapilar, studzienek na płytce PCR) nanieść po (20 x) µl mieszaniny przygotowanej w punkcie 4. 6. Do n probówek reakcyjnych dodać po x µl przygotowanych próbek RNA. Do jednej z pozostałych dwóch próbówek reakcyjnych dodać kontrolę negatywną 5
NC, a do drugiej kontrolę pozytywną PC. UWAGA: Kontrolę pozytywną należy dodać jako ostatnią. 7. Zamknąć probówki reakcyjne, a następnie krótko je zwirować. 8. Probówki reakcyjne upieścić w aparacie do Real Time PCR i wykonać reakcję według następującego protokołu: Odwrotna transkrypcja 45 C 15 min Denaturacja wstępna Amplifikacja (45 cykli) Schłodzenie aparatu 95 C 5 min 95 C 10 s 60 C 25 s* 30-40 C 30s (zależnie od typu aparatu) *Na końcu tego etapu ustawić odczyt fluorescencji w kanałach dla FAM i HEX. Kanał dla FAM służy do wykrywania sekwencji specyficznych dla TBEV. Kanał dla HEX służy do wykrywania kontroli wewnętrznej. INTERPRETACJA WYNIKÓW L.p. Rodzaj próbki FAM HEX Wynik 1 Kontrola pozytywna + + Prawidłowy 2 Kontrola negatywna - + Prawidłowy 3 Oznaczenie 1 - + Ujemny 4 Oznaczenie 2 + + Dodatni Brak odczytu w kanale dla HEX* oznacza, że reakcja Real Time PCR nie przebiegła w sposób prawidłowy. Jednoczesny brak pozytywnego odczytu fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej wskazuje na złą jakość Zestawu AmpliTest TBEV (Real Time PCR) (niewłaściwe przechowywanie, transport, wygaśnięcie terminu przydatności do użycia itp.) Pozytywny odczyt fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej i brak pozytywnego odczytu dla badanych próbek RNA oznacza złą jakość próbek RNA (obecność związków hamujących reakcję PCR) lub zbyt dużą ilość RNA użytego w reakcji. W tym przypadku należy do reakcji dodać mniejszą objętość próbki RNA, jednocześnie zwiększając objętość wody tak, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20 µl. 6
*Przy bardzo wysokim mianie wirusa może wystąpić brak odczytu w kanale HEX przy jednoczesnym odczycie w kanale FAM. Zaleca się wtedy powtórzenie reakcji z zmniejszoną (10-100-krotnie) ilością RNA dodanego do reakcji. UWAGI DODATKOWE Zastosowane sondy TaqMan posiadają wygaszacze (Quenchers) typu BHQ (Black Hole Quencher ), które nie generują dodatkowych sygnałów fluorescencyjnych. W aparatach, które tego wymagają (np. RotorGene 6000), jako typ wygaszacza należy wybrać opcję none. Przygotowany test wykrywa powyżej 12 kopii RNA wirusa obecnych w dodanej próbce RNA. Próbki RNA uzyskane z pojedynczych osobników można ze sobą pulować i wykorzystywać w pojedynczym oznaczeniu. W tym celu równe objętości próbek RNA (np. 10 µl) przeznaczonych do pulowania należy ze sobą dokładnie wymieszać i użyć jako matrycy w reakcji Real Time PCR. Należy jednak pamiętać, że pulowanie próbek RNA zmniejsza możliwość uzyskania pozytywnego wyniku w przypadku próbek zawierających niewielką ilość cząsteczek wirusa. Pulowaniu można poddać również próbki krwi lub surowicy uzyskane od zwierząt, a następnie wyizolować RNA. Nie stosować objętości reakcji mniejszych niż 20 µl. Zmniejszenie objętości reakcji powoduje zmniejszenie czułości testu. Należy zachować szczególną ostrożność podczas izolacji RNA, a materiał biologiczny uzyskany od chorych zwierząt traktować jako potencjalnie zakażony. Izolację RNA oraz detekcję obecności wirusa TBEV powinien wykonać odpowiednio przeszkolony personel w laboratorium spełniającym odpowiednie wymogi i dopuszczonym do pracy z zakażonym materiałem biologicznym. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas izolacji RNA nie doszło do krzyżowego zanieczyszczenia próbek RNA izolowanych równolegle. W celu maksymalnego wyeliminowania fałszywych wyników powinno się przestrzegać następujących zasad: - w miarę możliwości wyznaczyć osobne stanowiska do izolacji RNA, przygotowania reakcji Real Time PCR oraz jej wykonania/analizy. - pomiędzy etapami izolacji RNA, przygotowania reakcji Real Time PCR należy dokonać zmiany odzieży laboratoryjnej (fartucha) oraz zmiany rękawiczek jednorazowych. - powierzchnię stanowisk do izolacji RNA i przygotowania reakcji Real Time PCR należy przemywać środkami usuwającymi/niszczącymi RNA. 7
- do pipet automatycznych należy stosować wyłącznie sterylne końcówki z filtrem. - podczas przygotowywania reakcji Real Time PCR Kontrolę pozytywną PC należy dodać jako ostatnią. Przed jej dodaniem w miarę możliwości należy zamknąć probówki z dodanymi próbkami DNA i kontrolą negatywną NC. RNA jest materiałem bardzo łatwo podatnym na degradację. Z tego względu należy zadbać o odpowiednie zabezpieczenie materiału biologicznego do czasu izolacji RNA (niska temperatura, środki inaktywujące nukleazy). Czas pomiędzy pobraniem materiału biologicznego a izolacją RNA powinien być możliwie jak najkrótszy. Izolację RNA należy wykonać ściśle według wskazówek producenta odpowiedniego zestawu do izolacji RNA. Podczas izolacji RNA szczególnie istotny jest etap homogenizacji materiału biologicznego (w przypadku próbek narządów wewnętrznych). Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas homogenizacji nie doszło do degradacji RNA. Uzyskaną próbkę RNA chronić przed działaniem nukleaz (stosować odpowiednio certyfikowane materiały wolne od nukleaz). Próbkę RNA należy przechowywać w postać zamrożonej. Należy unikać jej wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. W celu zwiększania stabilności RNA, zarówno po jego wyizolowaniu, jak i na etapie materiału biologicznego można używać preparatów poprawiających stabilność RNA i hamujących działanie nukleaz. TaqMan jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Applied Biosystems, Inc. LightCycler jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Roche Diagnostics GmbH. Black Hole Quencher jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Biosearch Technologies, Inc. 8