Zróżnicowanie polipów nosa w badaniach techniką mikromacierzy oligonukleotydowych*

PRACE ORYGINALNE Zróżnicowanie polipów nosa Zróżnicowanie polipów nosa w badaniach techniką mikromacierzy oligonukleotydowych* Diversity of nasal polyps in microarray technology research Beata Rostkowska-Nadolska 1, Małgorzata Kapral 2, Katarzyna Gruna-Pelczar 1, Marcin Frączek 1, Wojciech Gawron 1, Urszula Mazurek 3 1 Klinika Otolaryngologii AM we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. T. Kręcicki 2 Katedra i Zakład Biochemii, Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląskiego UM w Katowicach Kierownik: prof. dr hab. L. Węglarz 3 Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Kierownik: dr hab. U. Mazurek Summary Nasal polyps, according to many authors, generate as a result of chronic inflammation process with activation of cytokines, immunological reaction mediators that regulate proliferation, differentiation and cell apoptosis. Clarifying molecular mechanisms present in those disturbances may have diagnostic and prognostic value in evaluation of recurrence, dynamics and differentiation of nasal polyps as well as in their therapy. Aim. The aim of the work was an analysis of nasal polyps on the basis of molecular, histopathological and clinical picture as well as comparing differentiated genes transcription in nasal polyps and proper nasal mucosa. Material and method. Oligonucleotide array with HGU 133A Affymetrix were used to analyze the expression of 22 283 genes in nasal polyp tissues from 17 patients. The control group consisted of 8 tissue samples from patients after nasal septoplasty surgery. Results. All the samples could be classified to nasal polyps group or proper mucosa group, it reflected significant differences in genes profile expression in both groups. The evaluation of 22 283 genes transcriptions showed that in most cases nasal polyps tissue reflect classification connected with dominant inflammation cells infiltration. The data obtained let distinguish subgroups connected with clinical condition of the patients. The subgroup with massive nasal and sinus polyposis, eosinophilia and differentiated lower respiratory airways hyperactivity and the subgroup without eosinophilia infiltration may be distinguished. The data obtained suggest that molecular mechanisms may influence on the promotion and kind of inflammation process as well as the clinical course of nasal polyps. Hasła indeksowe: mikromacierze oligonukleotydowe, polipy nosa Key words: nasal polyps, DNA microarray Otolaryngol Pol 2008; LXII (3): 261 266 2008 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów Chirurgów Głowy i Szyi WSTĘP Powstawanie polipów nosa według wielu autorów [1 3] jest związane z przewlekłym procesem zapalnym, w którego przebiegu dochodzi do aktywacji cytokin i mediatorów reakcji immunologicznych, regulujących proliferację, różnicowanie i apoptozę komórek. Z doświadczeń klinicznych wynika, iż polipy nosowe rozpoznawane na podstawie badania laryngologicznego i histopatologicznego, w praktyce wykazują różny przebieg kliniczny i różnie reagują na stosowane leczenie. Duża i ciągle wzrastająca liczba znanych czynników wpływających na proces powstawania polipów nosa sugeruje niejednorodność choroby. Może o tym świadczyć m.in. stwierdzana różnorodność w badaniu histopatologicznym. Pogłębienie wiedzy o molekularnym podłożu tych zaburzeń może mieć wartość diagnostyczno-prognostyczną w ocenie skłonności do nawrotów, dynamiki rozrostu lub w różni- * Badania wykonane w ramach realizacji grantu 2P05C 01228. Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów. Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 3 261

B. Rostkowska-Nadolska i inni Ryc. 1. Schemat badania aktywności transkrypcyjnej genów z wykorzystaniem mikromacierzy oligonukleotydowych (na podstawie http://www.albany.edu/genomics/genechipexpression, zmodyfi kowane) cowaniu polipów, a także może być pomocne w ich terapii. Ekspresja genów jest procesem dwuetapowym: podczas transkrypcji powstaje komplementarny do sekwencji nukleotydowych genów mrna, który następnie staje się matrycą do syntezy białek w procesie translacji. Jedna z najnowszych technik biologii molekularnej mikromacierze DNA pozwala na analizę ekspresji genów na poziomie transkrypcji. Twórcami mikromacierzy oligonukleotydowych był zespół naukowców z Whitehead Institute for Biomedical Research (Massachusets, USA) [4]. Zasada ich działania oparta jest na metodzie hybrydyzacji wykorzystującej zjawisko tworzenia dwuniciowych kompleksów przez jednoniciowe fragmenty kwasów nukleinowych. Rolę sond pełnią krótkie, oligonukleotydowe fragmenty DNA umieszczone na szklanych płytkach. W reakcji hybrydyzacji, zgodnie z zasadą komplementarności przyłączają się do nich wyznakowane barwnikami fluorescencyjnymi fragmenty kwasów deoksyrybonukleinowych lub rybonukleinowych izolowane z badanych tkanek. Zastosowanie czułych technik detekcji umożliwia precyzyjną identyfikację i szacunkową ocenę ilościową każdej badanej cząsteczki. Komercyjnie dostępne mikroprocesory zawierają od 200 do 250 000 oligonukleotydów na cm 2, co pozwala na analizę aktywności transkrypcyjnej setek lub tysięcy genów w trakcie jednego doświadczenia (ryc. 1). Zastosowana w niniejszej pracy powyższa technika pozwala na jednoczesną analizę 22 283 cząsteczek mrna w jednej badanej próbie. Porównanie profilu ekspresji genów w tkankach zdrowych i chorych niejednokrotnie pozwala na wyjaśnienie spodziewanych i nieoczekiwanych ścieżek sygnałowych. Analiza ekspresji genów w zapalnie zmienionej tkance polipa może być uzupełnieniem w diagnostyce i potencjalnym leczeniu. Zmiany mo- Tabela I. Charakterystyka pacjentów LP Nr tkanki Pacjent Wiek Płeć Liczba polipektomii Alergia Astma Triada Rodzaj nacieku zapalnego 1 PE2 PT 21 M 1 nie nie nie eozynofilowy 2 PE3 MM 47 M 2 tak nie nie eozynofilowy 3 PE4 SK 47 M 2 tak tak tak eozynofilowy 4 PE5 PT 57 M 1 nie nie nie eozynofilowy 5 PE6 ZD 56 K 6 tak tak tak eozynofilowy 6 PN7 KM 67 M 4 nie nie nie neutrofilowy 7 PE10 EJ 43 M 5 nie nie nie eozynofilowy 8 PE18 ST 57 K 3 tak tak nie eozynofilowy 9 PE19 GS 64 K 2 tak tak tak eozynofilowy 10 PE20 WA 63 M 10 nie nie nie eozynofilowy 11 PN22 NH 70 K 3 nie nie nie neutrofilowy 12 PN24 GG 31 M 1 nie nie nie neutrofilowy 13 PN27 KR 53 M 3 nie nie nie neutrofilowy 14 PN31 SM 12 K 1 nie nie nie neutrofilowy 15 PE32 KJ 69 M 2 tak tak nie eozynofilowy 16 PN35 BM 51 K 1 nie nie nie neutrofilowy 17 PE38 OJ 56 M 3 tak nie nie eozynofilowy 262 Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 3

Zróżnicowanie polipów nosa lekularne mogą wskazywać na kierunek zmian klinicznych (fenotypowych). Celem przedstawionej pracy była analiza polipów nosa na podstawie obrazu molekularnego, histopatologicznego i klinicznego, a także wykazanie stopnia zróżnicowanej transkrypcji genów w polipach nosa i w prawidłowej błonie śluzowej. MATERIAŁ I METODA Materiał do badań stanowiły tkanki polipów nosa pobrane od 17 pacjentów (6 kobiet i 11 mężczyzn w wieku 12 70 lat średnio 51 lat) (tab I). U czterech spośród 17 pacjentów zidentyfikowano na podstawie SPT alergię. Pięciu pacjentów miało zdiagnozowaną astmę oskrzelową. U trzech pacjentów stwierdzono triadę aspirynową. W badaniu hist.-pat. 11 polipów było eozynofilowych, 6 neutrofilowych. Grupę kontrolną stanowiły wycinki z prawidłowej błony śluzowej nosa pobrane od 8 pacjentów operowanych z powodu skrzywionej przegrody nosa. Na przeprowadzone badania uzyskano zgodę lokalnej Komisji Bioetyki (Nr 435/2004). Izolacja RNA Fragmenty tkanki przeznaczone do badań molekularnych natychmiast po pobraniu zamrażano i transportowano w ciekłym azocie. Do momentu rozpoczęcia analiz molekularnych zamrożone tkanki przechowywano w temperaturze -70 C. Całkowity RNA izolowano z wycinków polipów nosowych oraz prawidłowej błony śluzowej (ok. 40 mg) z wykorzystaniem odczynnika TRIZOL (Invitrogen), zgodnie z zaleceniami producenta. Tkanki homogenizowano z użyciem homogenizatora Polytron (Kinematyka AG). Uzyskane ekstrakty całkowitego RNA trawiono DNazą I i oczyszczano na kolumienkach Rneasy Mini Kit (Qiagen), zgodnie z protokołem producenta. Analiza aktywności transkrypcyjnej genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych Badanie ekspresji genów wykonano z użyciem mikromacierzy oligonukleinowych o wysokiej gęstości HG-U133A firmy Affymetrix zawierających 22 283 sond, przystosowanych do analizy około 14 500 genów. Syntezę cdna przeprowadzono z użyciem zestawu SuperScript Choice System (Gibco BRL Life Technologies), do przeprowadzenia reakcji użyto 8 μg całkowitego RNA. Syntezę biotynylowanego crna przeprowadzono z zastosowaniem zestawu Ryc. 2 Profi le ekspresji wybranych genów wyznaczone techniką mikromacierzy oligonukleotydowych w prawidłowej błonie śluzowej i polipach nosa (na rycinie przedstawiono dane jako średnie wartości znormalizowane) Ryc. 3. Grupowanie badanych polipów nosa (PE, PN) i prawidłowych błon śluzowych (K) na podstawie znormalizowanych wartości fl uorescencji 22 284 transkryptów na każdej z analizowanych mikromacierzy HGU133A BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Life Sciences). Zsyntetyzowany crna poddano fragmentacji z użyciem zestawu Sample Cleanup Module (Qiagen) w temperaturze 94 C. Hybrydyzację pofragmentowanego crna z mikromacierzami HG-U133A prowadzono przez 16 godzin w temperaturze 45 C przy 53 rpm. Produkty hybrydyzacji wyznakowano kompleksem streptawidyna-fikoerytryna. Sygnał fluorescencji wzmocniono dodatkowo stosując biotynylowane przeciwciała. Pomiar intensywność fluorescencji wykonano z użyciem skanera Agilent GeneArray Scanner G2500A. Wyniki poddano analizie w programie MicroArray Suite 5.0 (Affymetrix). Wydajność ekstrakcji RNA oraz ilość cdna i crna wyznaczono spektrofotometrycznie z pomocą kalkulatora DNA/RNA GeneQuant Pro (Amersham Pharmacia Biotech). Jakość kwasów nukleinowych oceniono Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 3 263

B. Rostkowska-Nadolska i inni techniką elektroforezy w 1% żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny. Analiza statystyczna Otrzymane wyniki poziomu fluorescencji transkryptów znormalizowano w programie RMAExpress (normalizacja wyników polegała na przekształceniu logarytmicznym o podstawie 2). Analiza statystyczna znormalizowanych wyników poziomu fluorescencji została wykonana z użyciem programu STATISTICA 6.0 (StatSoft). Ocenę stopnia zróżnicowania transkryptomów komórek polipów nosa i prawidłowej błony śluzowej wykonano metodą aglomeracji. WYNIKI W badanych tkankach polipów nosa oraz prawidłowych błon śluzowych wyznaczono transkryptom 22 283 mrna techniką mikromacierzy oligonukleotydowych (ryc. 2). Na podstawie różnic we wzorze aktywności transkrypcyjnej genów badane próbki zostały pogrupowane w dwa klastry: polipy i grupa kontrolna (ryc. 3). W grupie polipów nosa wyodrębniły się dwie podgrupy. W skład jednej podgrupy weszły tkanki polipów z przeważającym naciekiem eozynofilowym (PE6, PE32, PE4, PE3, PE38, PE19) oraz jedna próbka, w której oprócz nacieku eozynofilów obecne są limfocyty i neutrofile (PN27 ryc. 3). Obraz kliniczny tej grupy pacjentów przedstawiał się podobnie. Zmiany polipowate występowały obustronnie z różnym stopniem nadreaktywności dolnych dróg oddechowych. U wszystkich pacjentów stwierdzono zajęcie zatok w stopniu od I do IV. W grupie tej znaleźli się również pacjenci z rozległymi polipami nosa z astmą, a także pacjenci z astmą związaną z nietolerancją NLPZ. Druga podgrupa wykazała dość duże zróżnicowanie co do składu nacieku komórek zapalnych. Możemy jednak wyróżnić w niej dwa klastry. Klaster polipów z przeważającym naciekiem komórek neutrofilowych (PN35, PN22, PN24, PN7). Znalazła się tu jedna tkanka z przeważającym naciekiem eozynofilów PE10. Pacjenci z tej grupy stanowili dość jednorodny obraz: po kilkakrotnych polypektomiach w wywiadzie, u wszystkich występował przewlekły, ropny stan zapalny zatok, niepoddający się leczeniu. Skarżyli się na upośledzenie węchu i smaku, uporczywy katar śluzowo-ropny i niedrożność nosa. Dwa pozostałe klastry tkanek zawierają przeważający naciek komórek eozynofilowych. Do jednego należą pacjenci z niealergicznym eozynofilowym nieżytem nosa (PE2, PE5). Wśród tej grupy znalazła się tkanka z naciekiem komórek neutrofilowych z polipa pobranego od 12-letniej dziewczynki (PE31). Drugi klaster stanowią dwie tkanki pochodzące od pacjentów o cięższym przebiegu klinicznym (PE18, PE20). DYSKUSJA W bibliografii istnieje dotychczas niewiele prac na temat uwarunkowania genetycznego w patogenezie polipów nosa. Greissner i Settipane [5] stwierdzili w 14% pozytywny wywiad rodzinny odnośnie do występowania polipów nosa u 50 badanych pacjentów. W tych samych badaniach 50% pacjentów miała co najmniej jednego członka w rodzinie z polipami nosa. W badaniach Rugina i wsp. [6] ponad połowa z 224 pacjentów (52%) miała pozytywny wywiad rodzinny związany z polipami nosa. Stwierdzono także zależność między występowaniem HLA-A1B8 [7] oraz HLA-A74 [8] a polipami nosa. W badaniach Molnar- Gabor i wsp. [9] u jednostek z genotypem HLA-DRB1, -DQA1, i -DQB1, od 2 do 3 razy częściej rozwijają się polipy nosa. Drake-Lee opisał występowanie polipów nosa u bliźniąt monozygotycznych [10]. Studia nad bliźniętami jednojajowymi nie zawsze jednak wykazują wzrost polipów u obojga rodzeństwa. Może to świadczyć o wpływie czynników środowiskowych na rozwój choroby [11, 12]. Z doświadczeń klinicznych wynika, iż polipy nosowe rozpoznawane na podstawie badania laryngologicznego i histopatologicznego, w praktyce wykazują różny przebieg kliniczny i różnie reagują na stosowane leczenie. Analiza profilu ekspresji genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych dostarcza ogromnej ilości danych, których znaczenie biologiczne musi być bardzo starannie przeanalizowane. W ostatnich latach ukazało się kilka istotnych prac oceniających ekspresję genów z wykorzystaniem techniki mikromacierzy w polipach nosa [13 16]. Wiarygodne porównanie wyników uzyskanych przez różnych autorów nie jest jednak obecnie możliwe. Należy wziąć pod uwagę różnice metodyczne, zwłaszcza jeśli chodzi o zastosowanie mikromacierze, różnice w sekwencjach stosowanych sond, brak danych o sekwencji sond, czy też brak jednolitego nazewnictwa genów [17]. Aktualnie badania postępują dwukierunkowo. Jedni z autorów koncentrują się na poszukiwaniu genów różnicujących, starając się wyznaczyć markery odpowiedzialne za powstawanie polipów nosa. Liu i wsp. wykorzystując mikromacierze oligonukleotydowe typu HG-U95Av2 firmy Affimetrix wyznaczyli profil ekspresji genów w tkankach polipów nosa pochodzących od 10 pacjentów w porównaniu z błoną 264 Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 3

Zróżnicowanie polipów nosa śluzową pobraną z zatoki klinowej od 4 pacjentów [15]. Podobnie Wang i wsp. badali 491 genów w tkankach polipów nosa (n=4) i w tkankach prawidłowej błony śluzowej (n=4), wykorzystując technikę mikromacierzy cdna BionstarH-IC [16]. Również Fritz i wsp. z zastosowaniem płytek firmy Affymetrix różnicowali błonę śluzową pochodzącą od 10 pacjentów z alergicznym nieżytem i polipami nosa od błony śluzowej 10 pacjentów z alergicznym nieżytem nosa bez polipów nosa [13]. Drugi kierunek badań to ocena działania zastosowanej terapii na ekspresję genów w polipach nosa. Benson i wsp. wykorzystując mikromacierze oligonukleotydowe HG-U133A (Affymetrix) badali, jak zmienia się ekspresja genów w tkankach polipów nosa pochodzących od 4 pacjentów pod wpływem steroidoterapii donosowej. W pracy zwrócono uwagę, że pod wpływem glikokortykosteroidów nie tylko dochodzi do obniżenia ekspresji prozapalnych mediatorów, ale również nadekspresji czynników antyzapalnych, co może się według autorów przyczyniać do korzystnego efektu GCs in vivo [14]. W przeprowadzonych przez nas badaniach analiza grupowania znormalizowanych poziomów fluorescencji dla zdefiniowanych transkryptów wykazała zróżnicowanie aktywności transkrypcyjnej genów w komórkach prawidłowej błony śluzowej i polipów nosa. Stwierdzono, że wszystkie badane tkanki klasyfikują się odpowiednio do grupy polipów lub prawidłowych błon śluzowych, co wskazuje na istotne różnice w profilu ekspresji genów w tych dwóch grupach. Ocena ekspresji 22 283 transkryptów genów wykazała, iż przynależność do grupy polipów nosa pokrywa się w większości przypadków z podziałem ze względu na dominujący w nich naciek komórek zapalnych. Uzyskane dane pozwalają na wyodrębnienie podgrup pod kątem obrazu klinicznego chorych. Można wyodrębnić podgrupę z masywnymi zmianami polipowatymi nosa i zatok z eozynofilią, z różnym stopniem nadreaktywności dolnych dróg oddechowych oraz drugą podgrupę polipów bez dominującego nacieku eozynofilowego w przebiegu zapalenia nosa i zatok. Grupy te odpowiadają podziałowi polipów wg Stammbergera (grupa IV i III). Pozostałe wycinki nie klasyfikują się w sposób jednorodny. W podsumowaniu należy podkreślić, że wykorzystanie badania profilu ekspresji genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych stanowi niezwykle ciekawą drogę oceny procesów powstawania polipów nosa. Mogą one służyć do budowania nowych hipotez i teorii, oraz mogą stanowić punkt wyjścia dla wielu interesujących analiz. Uzyskane przez nas wyniki wskazują, iż mechanizmy molekularne mają wpływ na rozwój i rodzaj nacieku zapalnego, a także przebieg kliniczny polipów nosa. Przedstawiona praca prezentuje wstępne wyniki naszych badań. W kolejnych etapach zostaną one poszerzone o wyznaczenie genów charakteryzujących się odmiennym poziomem ekspresji w tkankach polipów nosa i prawidłowej błonie śluzowej oraz poszukiwania procesów komórkowych, w które zaangażowane są ich produkty białkowe, a następnie potwierdzenia wyników klasycznymi technikami biologii molekularnej. Prace te mogą się przyczynić do pogłębienia wiedzy o mechanizmach patogenezy polipów nosa, a także opracowania bardziej skutecznych i specyficznych rodzajów ich terapii. PIŚMIENNICTWO 1. Pawankar R. Nasal polyps: an update: editorial review. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003; 3: 1 6. 2. Bernstein JM. Update on the molecular biology of nasal polyposis. Otolaryngol Clin N Am 2005; 38: 1243 1255. 3. Bachert C, Wagenmann M, Rudack C, Hopken K, Hillebrandt M, Wang D, i wsp. The role of cytokines in infectious sinusitis and nasal polyposis. Allergy 1998; 53: 2 13. 4. Stephenson J. Lab-on-a-chip shows promise in defining and diagnosing cancers. JAMA 1999; 282: 1801 1802. 5. Greisner W, Settipane G. Hereditary factor for nasal polyps. Allergy Asthma Proc 1996; 17: 283 286. 6. Rugina M, Serrano E, Klossek JM, Crampette L, Stoll D, Bebear JP, i wsp. Epidemiological and clinical aspects of nasal polyposis in France; the ORLI group experience. Rhinology 2002; 40: 75 79. 7. Moloney J, Oliver R. HLA antigens, nasal polyps and asthma. Clin Otolaryngol 1980; 5: 183 189. 8. Luxenberger W, Posch U, Berghold A, Hofmann T, Lang-Loidolt D. HLA patterns in patients with nasal polyposis. Eur Arch Otorhinolaryngol 2000; 257: 137 139. 9. Molnar-Gabor E, Endreffy E, Rozsasi A. HLA-DRB1, -DQA1, and -DQB1 genotypes in patients with nasal polyposis. Laryngoscope 2000; 110: 422 425. 10. Drake-Lee A. Nasal polyps in identical twins. J Laryngol Otol 1992; 106(12): 1084 1085. 11. Lockey RF, Rucknagel DL, Vanselow NA. Familial occurrence of asthma, nasal polyps and aspirin intolerance. Ann Intern Med 1973; 78: 57 63. 12. Settipane GA. Benefit/risk ratio of aspirin. NES Allergy Proceedings 1981; 2: 96 102. 13. Fritz SB, Terrell JE, Conner ER, Kukowska-Latalo JF, Baker JR. Nasal mucosal gene expression in patients with allergic rhinitis with and without nasal polyps. J Allergy Clin Immunol 2003; 112: 1057 1063. 14. Benson M, Carlsson I, Adner M, Jernas M, Rudemo M, Sjogren A, i wsp. Gene profiling reveals increased expression of uteroglobin Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 3 265

B. Rostkowska-Nadolska i inni and other anti-inflammatory genes in glucocorticoid-treated nasal polyps. J Allergy Clin Immunol 2004; 113: 1137 1143. 15. Liu Z, Kim J, Sypek JP, Wang IM., Horton H., Oppenheim FG, i wsp. Gene expression profiles in human nasal polyp tissues studies by means of DNA microarray. J Allergy Clin Immunol 2004; 114: 783 790. 16. Wang X, Dong Z, Zhu DD, Guan B. Expression profile of immuneassociated genes in nasal polyps. Ann Otol Rhinol Laryngol 2006;115(6): 450 456. 17. Jarząb B, Gubała E, Lange D. Mikromacierze DNA i profil ekspresji genów raka brodawkowatego tarczycy. Enokrynol Pol 2005; 56: 294 301. Adres autora: Beata Rostkowska-Nadolska Klinika Otolaryngologii ul. Chałubińskiego 2 50-367 Wrocław Pracę nadesłano: 13.12 2008 r. 266 Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 3