WAŻNOŚĆ WYNIKÓW POMIARÓW ANALITYCZNYCH

WAŻNOŚĆ WYNIKÓW POMIARÓW ANALITYCZNYCH Waldemar Korol, Grażyna Bielecka, Jolanta Rubaj, Sławomir Walczyński Instytut Zootechniki-PIB, Dział Analityki Chemicznej, Krajowe Laboratorium Pasz w Lublinie XXV Sympozjum MS Spektrum, 27-29.05.2019, Ślesin

Wprowadzenie Ważność wyników pomiarów analitycznych - PN-EN ISO/IEC 17025:2018-2, p. 7.7 Miarodajność wyników badań - PN-EN ISO/IEC 17025:2005, p. 5.9 ten sam odpowiednik angielski (validity).

Wprowadzenie monitorowanie ważności wyników - korzystanie z materiałów odniesienia lub materiałów kontrolnych; - korzystanie z alternatywnego wyposażenia, które zostało poddane wzorcowaniu w celu zapewnienia spójności pomiarowej; - sprawdzenia działania wyposażenia pomiarowego i badawczego; - stosowanie wzorców kontrolnych lub roboczych z kartami kontrolnymi, gdy ma to zastosowanie; - sprawdzenia pośrednie wyposażenia pomiarowego;

Wprowadzenie monitorowanie ważności wyników c.d. - powtarzanie badań lub wzorcowań z wykorzystaniem tych samych lub innych metod; - powtórne badanie lub wzorcowanie przechowywanych obiektów; - korelację wyników dotyczących różnych właściwości obiektu; - przegląd uzyskanych wyników; - porównania wewnątrzlaboratoryjne; - badanie ślepej(-ych) próbki (-ek).

Wprowadzenie monitorowanie działania lab poprzez porównanie z wynikami innych lab Uczestnictwo w badaniach biegłości Uczestnictwo w porównaniach mlab innych niż badania biegłości.

Cel prezentacji Celem prezentacji jest przedstawienie korzyści dla laboratorium, wynikających z monitorowania sposobów potwierdzania ważności wyników pomiarów analitycznych, ich analizowanie i wykorzystanie do wewnętrznej kontroli jakości oraz do doskonalenia działalności laboratoryjnej.

Korzyści wybranych sposobów monitorowania ważności wyników Na podstawie doświadczeń własnych i współpracy z laboratoriami upoważnionymi do wykonywania badań jakości handlowej pasz w ramach PUKP, przedstawione zostały korzyści wybranych sposobów monitorowania ważności wyników badań takie jak: - sprawdzanie powtarzalności wyników badań, - korzystanie z CRM i RM, - uczestnictwo w badaniach biegłości i porównaniach międzylaboratoryjnych. Przykłady wykorzystania monitorowania i korzyści dla laboratorium.

Monitorowanie ważności wyników sprawdzanie powtarzalności - Karty kontrolne SD(ip) (odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna Rw) Przykład: Ocena spełnienia wymagań producenta, w zakresie badania zmienności produktu w czasie SD(ip) Laboratorium powinno wykazać, że parametry metody/procedury są dostosowane do celu badań, np. dopuszczalne odchylenie badanego analitu do 5% nie może być badane przy wykorzystaniu metody o odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej Rw, np. 6% dla tego analitu.

Monitorowanie ważności wyników korzystanie z CRM i RM Przykład badania obciążenia i niepewności pomiaru Se w paszach metodą HGAAS na podstawie badania CRM CS-M-2 (Dried Mushroom Powder) RT Eurolab 1/2007 Parametry walidacji metody HGAAS oznaczanie Se w paszach (KLP): Obciążenie 3,9% Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna 8,3% Standardowa niepewność złożona u = 9,1% Niepewność rozszerzona U = 18,2% dla k=2.

Monitorowanie ważności wyników korzystanie z CRM i RM (z PT) PT / analit (Co, Se-m-ka dla królików) PT JRC 2017 / Co mg/kg ICP-MS PT JRC 2018/ Se mg/kg ICP-MS WP SD pt Bez korekty Korekta RM Wynik z-score Wynik z- 1,05 0,17 1,15 0,59 1,05 RM Rec.110% 0,469 0,070 0,42-0,60 0,44 RM Rec. 96% score 0-0,41

Monitorowanie ważności wyników korzyści PT / ILC KLP w ramach zadań lab ref przeprowadziło 36 PT i 44 ILC w latach 2004-2018 z udziałem laboratoriów urzędowego nadzoru (ZHW), w których zbadano ponad 135 próbek różnych pasz. PT/ILC organizowano zgodnie z zaleceniami (ISO Guide 43-1; PN-EN ISO/IEC 17043). Do oceny jakości i precyzji PT/ILC przyjęto wskaźnik Horwitz a (HorRat H), przy czym docelowe odchylenie standardowe σ obliczano z równania Horwitza σ = 2 C -0,15 Jeżeli wskaźnik HorRat mieścił się w granicach 0,5 < H < 2, uznawano oceniane PT/ILC za wystarczająco precyzyjne.

Monitorowanie ważności wyników korzyści PT / ILC - zakres badań Zakres PT/ILC był zgodny z PUKP i obejmował: podstawowe składniki pokarmowe: wilgotność, popiół surowy i nrozp. w HCl, białko surowe, tłuszcz surowy i po hydrolizie, włókno surowe, skrobia, cukry; makroelementy (P, Ca, Mg, Na, K, Cl); mikroelementy (Fe, Mn, Zn, Cu, Se, J, Co, Mo); witamina A, witamina E; aminokwasy i mocznik; azotany (III), fluorki, pozostałości opakowań (pasze GM, szkodniki żywe, zanieczyszczenia botaniczne KLP Pracownia w Szczecinie ok. 30 ILC) Większość badań wykonywano metodami oficjalnymi wg rozp. Komisji 152/2009. Makroelementy wg PN-EN ISO 6869:2002.

Monitorowanie ważności wyników korzyści PT / ILC ocena stopnia odzysku Czy korygować wyniki badań na 100% odzysk? (PDCA cykl Deminga) Przykład: Wit. A - przewaga ujemnych wartości wskaźnika z w PT. przeliczenia wyników PT dla witaminy A w mieszankach paszowych metodą HPLC na 100% odzysk ( z 96%) Odzysk % n PT nlab/ PT z-score b % u % U % 96 9 (7/9) 100 9 (6/9) 15 0,63 10,75 11,47 22,9 15 0,54 9,20 10,04 20,1

Monitorowanie ważności wyników korzyści PT / ILC: ocena niepewności pomiaru Przykład PT Pasze 2013 (KLP Lublin) MPP gran. (M/13), m=0,5 kg. Od 2013 r. laboratorium uczestniczące w PT samo rozdziela i rozdrabnia próbkę oraz podaje wynik z niepewnością pomiaru (u, U).

Rozdzielacze laboratoryjne i zestaw sit (pomiar wielkości cząstek) Zestaw sit Rozdzielacz szczelinowy Rozdzielacz obrotowy

PN-EN ISO 6498:2012P Pasze Wytyczne do przygotowania próbki (PL od 2014 r.)

Przykład - Ocena poprawności niepewności - wyniki badania wilgotności (X±U, g/100g) w próbce M/14- zaznaczone niepewności wyższe niż dopuszczalne tolerancje - nie spełniały wymagań rozp. 939/2010 i 2017/2279

Przykład: Wyniki badania białka ogólnego (X±U, g/100g) w próbce M/13; WP=14,45 g/100g; SD=0,165; H=0,35 U= 2 x SD = ±0,33 g/100g (± 2,28%) niepewność rozszerzona z PT z niepewnością przyg. próbki (tolerancje wg rozp. 939/2010)

Parametr P/16 wapń g/kg Średnia (mediana) 160 (160) Wartość przypisana 160 (X*) Odchylenie standardowe 9,6 (s*) Tolerancje - aktualne Tolerancje - projekt -10 / + 20-15 / + 30 Nr laboratorium Wartość z-score u U=2xu 2 161,0 0,10 4 8 3 147,0-1,35 10 21 4 164,0 0,42 10 20 6 174,0 1,46 11 22 7 154,4-0,58 7 14 8 165,5 0,57 12 24 9 166,0 0,63 12 23 10 168,7 0,91 19 39 12 154,3-0,59 8 15 13 156,0-0,42 9 19 14 154,0-0,63 13 26 15 160,0 0,00 11 23 16 168,0 0,83 8 16 17 147,0-1,35 23 46 18 170,0 1,04 - - 19 147,0-1,35 8 15 20 154,0-0,63 9 18 21 166,0 0,63 - -

Przykład: Wpływ U na ocenę zgodności wyników badań zawartości azotanu (III) w paszach. DP (MZ) = 15 mg/kg; odzysk 95%; U=15% (reg. 152/2009) RT 1/2017

Monitorowanie ważności wyników. Szacowanie niepewności ocena podejść 1. Podejście modelowe - budżet składowych niepewności - przewodnik GUM; przewodnik EURACHEM /CITAC (III wydanie 2012) 2. Podejścia praktyczne CRM, PT/ILC - Zalety PT/ILC - podobieństwo materiałów testowych do rzeczywistych próbek badanych rutynowo w laboratorium. - Wady PT/ILC możliwe trudności wykazania spójności pomiarowej w przypadku gdy wartość przypisana jest określana na podstawie wyników uczestników niepewność i statystyki odporne wg ISO 13528:2015

Szacowanie obciążenia i niepewności pomiaru na podstawie PT RT Eurolab Nr 1/2007 Niezbędne dane: - odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna s (karty kontrolne) - obciążenie (bias) b na podstawie PT - s bias odchylenie standardowe obciążenia. - u PT niepewność wartości przypisanej (u PT =1.25 s PT / n) - Δ średnie odchylenie wyników laboratorium u s 2 b 2 Δ = ( bias i n 2 )

Obciążenie i niepewność pomiaru AA w mieszankach paszowych obliczona na podstawie wyników PT AGES Austria i odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej, n=5 - Dane: Szkudzińska i wsp. ACQA 2017 DOI: 10.1007/s00769-017-1281-9 Aminokwas His Ser Arg Gly Asp Glu Thr Ala Pro Lys Tyr Val Ileu Leu Phe Cys Met p 16 16 16 15 16 16 19 16 16 19 16 18 17 17 16 18 20 od-do g/kg s.m. 6,20-7,66 11,9-15,3 14,6-18,4 9,64-11,7 22,8-30,9 42,9-55,8 10,1-22,4 12,0-15,4 13,9-17,7 15,6-37,9 7,32-10,1 10,9-14,1 9,80-12,9 19,6-22,9 11,7-15,2 3,68-4,38 4,23-13,9 X g/kg s.m. 6,85 12,9 16,5 10,6 25,7 47,8 12,9 12,8 15,6 20,4 8,99 11,9 10,7 22,3 12,9 4,12 4,88 HorRat 1,93 1,33 1,58 1,18 1,16 2,02 1,14 1,10 1,81 1,45 2,05 1,79 1,88 1,24 1,19 1,34 1,55 RSD Rw (%) 3,62 2,02 3,28 2,62 2,28 1,68 1,80 1,46 1,66 2,65 4,83 2,11 2,19 1,54 2,86 3,96 2,76 s bias (%) 6,43 2,44 1,76 1,41 2,55 2,86 1,77 2,62 1,25 1,73 7,26 2,92 3,03 2,01 2,92 4,23 2,01 Eurolab TR [18] b (%) u (%) U (%) 7,50 4,28 3,06 2,40 4,16 5,76 3,38 4,22 3,10 3,25 11,4 5,20 6,07 2,30 4,23 5,45 6,61 8,33 4,73 4,48 3,56 4,74 6,00 3,83 4,47 3,51 4,20 12,4 5,61 6,45 2,77 5,10 6,74 7,16 16,7 9,46 8,96 7,12 9,48 12,0 7,66 8,94 7,02 8,40 24,8 11,2 12,9 5,54 10,2 13,5 14,3

Szacowanie obciążenia i niepewności pomiaru na podstawie PT Nordtest TR 537, ed. 4, 2012 NORDTEST NT TR 537 ed. 4 Niezbędne dane: odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna s(karty kontrolne) obciążenie (bias) b na podstawie badania PT (p PT 6; n lab 30?) u s 2 b 2 2 b u PT 2 Δ = ( bias i n 2 )

Monitorowanie ważności wyników. Szacowanie niepewności ocena podejść. Przykład: Porównanie niepewności pomiaru niektórych dodatków w paszach na podstawie danych z PT 2004-2018 Badany składnik, jednostka (p, n) Witamina A (9,6) Premiksy (10,7), jm/kg Witamina E* (8,6) Premiksy (11,7) mg/kg Lizyna, g/kg (8,15) Metionina (7,17) g/kg Mocznik, g/100g (8, 8) Średnia zaw. 62865 3011900 305 12722 Niep. rozsz. U (2 x S pt ), ± % 24,4 11,4 16,4 12,8 U wg Eurachem ± % 20,9 10,3 17,9 13,0 U wg Nordtest ± % 20,3 10,0 16,5 12,8 HorRat (H) 1,20 1,65 1,21 1,00 20,8 7,6 8,4 8,2 1,06 6,5 11,7 14,3 14,2 1,37 4,3 8,4 11,9 11,8 1,31 * jako octan tokoferolu; p liczba PT; n- średnia liczba laboratoriów w PT;

Monitorowanie ważności wyników korzyści PT / ILC: ocena niepewności pomiaru c.d. Szacowanie niepewności wg EA-04/16 Dla dobrze sprawdzonych metod i matryc możliwe jest wykorzystanie SD odtwarzalności S R (z badań międzylaboratoryjnych) jako standardowej niepewności złożonej gdy na poziomie walidacji uwzględniono wszystkie źródła niepewności (U = 2 x S R ) * Czy w przypadku PT można wykorzystać S pt jako standardową niepewność złożoną i czy takie podejście będzie miarodajne (U = 2 x S pt )? *ISO 17025:2017, rozdział 7.6

Monitorowanie ważności wyników korzyści PT / ILC Zalety ujednoliconego systemu - wytyczne EA-04/16 Wyniki oszacowania niepewności rozszerzonych na podstawie badań porównawczych mogą być wykorzystane do budowy spójnego systemu (VDLUFA) polegającego na przyjęciu jednolitych wartości niepewności rozszerzonych dla sprawdzonych w PT analiz i matryc przez laboratoria upoważnione do badań w ramach urzędowego (żywność, pasze) i przez laboratorium referencyjne (U = 2 S R )

Przykład. Porównanie niepewności (U = 2 S pt )na podstawie wyników PT oficjalnych laboratoriów, polskich, niemieckich i węgierskich, w zakresie składników pokarmowych w paszach (2004-2018),% Rodzaj badania Zawartość średnia Polska ± % Niemcy ± % Węgry ± % Wilgotność, g/100 g 9,9 4,4 3,1 8,0 Popiół surowy, g/100 g 9,2 5,3 5,4 8,0 Popiół surowy, g/100 g 86,3 2,4 5,0 4,0 Popiół nrozp. HCl, g/100 g 3,6 11,6 12,9 10,0 Białko surowe, g/100 g 19,4 2,7 5,0 4,0 Białko surowe, g/100 g 39,4 2,8 4,0 2,0 Tłuszcz surowy A, g/100 g 5,0 10,4 12,0 8,0 Tłuszcz surowy B, g/100 g 3,3 11,2 18,2 12,1 Włókno surowe, g/100 g 4,0 8,4 25 15,0 Włókno surowe, g/100 g 12,3 8,4 10,0 10 Skrobia, g/100 g 39,3 5,8 5,1 5,1 Cukry, g/100 g 2,8 14,9 bd 10,0

Przykład: Porównanie niepewności (U = 2 S pt ) na podstawie wyników PT oficjalnych laboratoriów, polskich, niemieckich i węgierskich, w zakresie makroelementów w paszach (2004-2018),% Rodzaj badania Zawartość średnia Polska ± % Niemcy ± % Węgry ± % Chlorki, g/kg 12,5 10,0 8,0 24,0 Wapń, g/kg 21,1 10,6 10 10 Wapń, g/kg 270 8,3 10 6 Fosfor, g/kg 7,5 7,4 9 13,3 Sód, g/kg 3,1 13,4 14 12,5 Magnez, g/kg 2,6 9,4 13 12,5 Potas, g/kg 9,8 10,8 11 12,5

Przykład: Porównanie niepewności (U = 2 S pt ) na podstawie wyników PT oficjalnych laboratoriów, polskich, niemieckich i węgierskich, w zakresie mikroelementów w paszach (2004-2018), % Rodzaj badania Zawartość średnia Polska ± % Niemcy ± % Węgry ± % Żelazo, mg/kg 439 19,0 18,6 15 Mangan, mg/kg 123 13,0 19 15 Cynk, mg/kg 234 11,4 16 15 Miedź, mg/kg 45 14,4 20 30 Kobalt, mg/kg 0,77 30,7 25 30 Selen, mg/kg 0,48 21,4 50 30 Jod, mg/kg 2,0 26,4 25 25

Przykład: Porównanie niepewności (U = 2 S pt ) na podstawie wyników PT oficjalnych laboratoriów, polskich, niemieckich i węgierskich, w zakresie witamin A i E, Liz, Met i mocznika w paszach (2004-2018),% Rodzaj badania Zawartość średnia Polska ± % Niemcy ± % Węgry ± % Witamina A, 62865 24,4 25 12,5 j.m./kg Witamina E, 305 16,4 15 15 mg/kg Lizyna, g/kg 20,8 7,6 10 10 Metionina, g/kg 6,5 11,7 15 15 Mocznik, g/100g 4,3 8,4 10 15

Monitorowanie ważności wyników. Wpływ niepewności na ocenę zgodności (stwierdzenie zgodności lab). Ocena zgodności składników analitycznych pasz zasada oceny zgodności wg rozp. Komisji 2017 / 2279 (EUROLAB, Przewodnik dok. 8) Dopuszczalne tolerancje podane w rozp.2017/2279 obejmują odchylenia techniczne i analityczne (niepewność pomiaru). Zasada: Jeżeli wynik badania mieści się w zakresie dopuszczalnej tolerancji należy go interpretować jako zgodny z deklaracją na etykiecie, niezależnie od niepewności wyniku (PL - PUKP 2019) Dopuszczalne tolerancje wymienione w tym rozp. 2017/2279 dotyczą składników analitycznych takich jak wilgotność, białko, popiół, tłuszcz, włókno, cukry, skrobia, wartość energetyczna (EM) i makroelementów takich jak Ca, P, Na, K i Mg. Uwaga. Niepewność rozszerzona pomiaru składników analitycznych pasz nie powinna być wyższa od dopuszczalnych tolerancji wg rozp. 2017/2279

Dopuszczalne tolerancje wybranych składników pokarmowych pasz wg rozp. 2017/2279 interpretacja wyników stwierdzenie zgodności Składnik Włókno surowe Białko ogólne Skrobia Tłuszcz surowy Cukry Deklarowana zawartość, % Poniżej wartości na etykiecie Tolerancja Powyżej wartości na etykiecie <10 1,75 1,75 10-20 17,7% 17,5% >20 3,5 3,5 <8 1 1 8-24 12,5 12,5 >24 3 3 <10 3,5 3,5 10-20 35% 35% >20 7 7 <8 1 1 8-24 12,5% 25% >24 3 6 <10 1,75 3,5 10-20 17,5% 35% >20 3,5 7

Część B. Dopuszczalne tolerancje dla dodatków paszowych zgodnie z rozp. 939/2010 tylko tolerancje techniczne 2. W przypadku niedoboru dodatku paszowego w materiałach i mieszankach paszowych dopuszcza się następujące tolerancje **: - 10 % dla zawartości deklarowanych 1 000 jednostek* lub więcej, - 100 jednostek dla zawartości deklarowanych w ilości poniżej 1 000 jednostek, ale nie mniej niż 500 jednostek, - 20 % dla zawartości deklarowanej w ilości poniżej 500 jednostek, ale nie mniej niż 1 jednostka, - 0,2 jednostki dla zawartości deklarowanych w ilości poniżej 1 jednostki, ale nie mniej niż 0,5 jednostki, - 40 % dla zawartości deklarowanej w ilości poniżej 0,5 jednostki. * 1 jednostka oznacza 1 mg, 1 000 j.m. (IU), 1x10 9 CFU lub 100 jednostek aktywności enzymu odpowiedniego dodatku paszowego. ** w przypadku nadmiaru dopuszcza się trzykrotność tolerancji

Monitorowanie ważności wyników inne działania (spójność pomiarowa) Zad. 2 wg art. 33 ust. 2 rozporządzenia PEiR (WE) nr 882/2004 z 29 kwietnia 2004 r. w sprawie kontroli urzędowych żywności i pasz. Koordynacja, w dziedzinie swoich kompetencji, działania laboratoriów urzędowych odpowiedzialnych za analizę próbek; Zad. 2 wg art. 101 ust. 1 rozporządzenia PEiR (UE) 2017/625 z 5 marca 2017 r. w sprawie kontroli urzędowych żywności i pasz. Koordynacja działań laboratoriów urzędowych wyznaczonych przez Inspekcję Weterynaryjną do przeprowadzania analiz, badań i diagnostyki laboratoryjnej na próbkach pobranych w ramach kontroli urzędowych i innych czynności urzędowych na terytorium Rzeczypospolitej Polskiej lub w innym państwie członkowskim lub w państwie trzecim, które jest stroną Porozumienia o Europejskim Obszarze Gospodarczym, w celu zharmonizowania i udoskonalenia metod analizy laboratoryjnej, badania lub diagnostyki oraz ich stosowania, a także odpowiednio walidacji odczynników i partii odczynników, tworzenia i prowadzenia aktualnych wykazów dostępnych substancji referencyjnych i odczynników oraz producentów i dostawców takich substancji i odczynników;

Monitorowanie ważności wyników inne działania (spójność pomiarowa) Zad. 2 podzadanie 9: Tworzenie i prowadzenie aktualnych wykazów dostępnych substancji referencyjnych i odczynników oraz producentów i dostawców takich substancji i odczynników. Celem podzadania będzie utworzenie wykazów certyfikowanych materiałów odniesienia o matrycy paszowej i certyfikowanych substancji wzorcowych chemicznych, o potwierdzonej jakości, w których certyfikowane wartości będą podane z niepewnością pomiaru i z zachowaniem spójności pomiarowej, poprzez odniesienie do stosownego wzorca wyższego rzędu. Wykazy certyfikowanych materiałów odniesienia i certyfikowanych substancji wzorcowych będą dotyczyć badań wykonywanych w ramach PUKP na rok 2019 w odniesieniu do jakości handlowej pasz. Wykazy będą uwzględniały dane dotyczące producentów i dostawców certyfikowanych materiałów i certyfikowanych substancji. Pierwsze wykazy zostaną sporządzone do 30 czerwca 2019 r. i będą uaktualniane w odstępach półrocznych. Termin realizacji

Podsumowanie Zapewnienie ważności wyniku badania dotyczy nie tylko wartości średniej ale także niepewności pomiaru ważne dla stwierdzeń zgodności. Dane z monitorowania (w tym z PT/ILC) powinny być analizowane, wykorzystywane do kontroli oraz do doskonalenia. W przypadku stwierdzenia przekroczenia przyjętych kryteriów, należy podjąć odpowiednie działania, aby zapobiec umieszczaniu nieprawidłowych wyników w raporcie.

Dziękuję za uwagę Pytania? Instytut Zootechniki-PIB, DAL, Krajowe Laboratorium Pasz, ul. Chmielna 2, 20-079 Lublin, tel/fax +48 81 7436349 www.klp.izoo.krakow.pl XXV Sympozjum MS Spektrum, 27-29.05.2019, Ślesin