B ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (Test ProbeTec ET wykrywający bakterie z rodziny Chlamydiaceae oparty na amplifikacji DNA)

B ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (Test ProbeTec ET wykrywający bakterie z rodziny Chlamydiaceae oparty na amplifikacji DNA) U.S. Nr patentu 5,27,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,311; 81957 5,846,726; 5,851,767; 5,866,336; 5,919,63; 5,928,869; 5,958,7; 6,54,279; 28/1 6,9,552; 6,117,635; 6,316,2; 6,656,68; 6,682,889; 6,743,582. U 344 Polski PRZEZNACZENIE Test BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (wykrywający bakterie z rodziny Chlamydiaceae, oparty na amplifikacji DNA), przeznaczony do użytku wraz z Systemem BD ProbeTec ET, wykorzystuje technologię amplifikacji z przesunięciem łańcucha (Strand Displacement Amplification, SDA) w celu bezpośredniego, jakościowego wykrywania DNA organizmów należących do rodziny Chlamydiaceae (włącznie, ale nie tylko, z Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci). Niniejszy test służy do badania wymazów z gardła (z podłożem transportowym i bez niego) pochodzących od pacjentów z klinicznymi objawami i innymi oznakami diagnostycznymi zapalenia płuc. Test można stosować w celu postawienia wstępnej diagnozy zapalenia płuc, wywołanego bakteriami z rodziny Chlamydiaceae. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIE Chlamydophila pneumoniae jest przyczyną od około 5 do 15% przypadków poza szpitalnego zapalenia płuc. 1 Jedynym znanym nosicielem bakterii jest człowiek. Do przeniesienia bakterii z jednej osoby na drugą dochodzi przy bliskim kontakcie i drogą kropelkową, 2 a czas inkubacji wynosi kilka tygodni. Większość przypadków zapalenia płuc spowodowanych C. pneumoniae przebiega łagodnie, a umieralność jest niska. Jednakże często dochodzi do nawrotów, które często dotyczą osób w starszym wieku i niejednokrotnie wymagają hospitalizacji. Ponieważ metody hodowli C. pneumoniae są czasochłonne i bardzo trudne do przeprowadzenia, nie znalazły one zastosowania w rutynowej diagnostyce. Są one jednak ważne w celu udokumentowania żywotności mikroorganizmu, a także dostarczenia materiału do testów wrażliwości. Najczęściej stosowanym testem serologicznym, pozwalającym na odróżnienie zakażenia pierwotnego od nawrotowego, jest test immunofluorescencyjny (MIF) wykrywający przeciwciała klasy IgM oraz IgG. Czterokrotny wzrost miana przeciwciał klasy IgG w surowicy w porównaniu z surowicą ozdrowieńca lub miano przeciwciał klasy IgM 16 powala na rozpoznanie ostrego zakażenia. Na przebytą ekspozycję wskazuje miano IgG 16. 3 Nie zaleca się stosowania pojedynczego, podwyższonego miana IgG do celów diagnostycznych. A zatem, testy serologiczne są raczej postrzegane w kategoriach narzędzi służących do retrospektywnej oceny epidemiologicznej niż do postępowania z pacjentem. Konieczność postawienia diagnozy i określenia etiologii zapalenia płuc staje się bardziej istotna w świetle zagadnienia nadużywania antybiotyków. Szybkie techniki diagnostyczne, wykorzystujące amplifikację kwasów nukleinowych, mogą okazać się pomocne w postawieniu diagnozy, pozwalając w ten sposób na zastosowanie właściwego leczenia. ZASADY PROCEDURY W teście BD ProbeTec ET wykrywającym bakterie z rodziny Chlamydia opartym na amplifikacji DNA wykorzystano jednoczesną amplifikację i detekcję docelowego DNA przy użyciu primerów i sondy detekcyjnej znakowanej związkiem fluorescencyjnym. Odczynniki SDA liofilizuje się w dwóch oddzielnych jednorazowych mikrostudzienkach. Przygotowaną próbkę dodaje się do studzienki Priming Microwell zawierającej primery amplifikacyjne, znakowane fluorescencyjnie sondy detekcyjne i inne odczynniki niezbędne w procesie amplifikacji. Primery zostały zaprojektowane w celu amplifikacji złożonego z 63 par zasad regionu konserwatywnego genu rybonukleazy P (RNazy P), należącego do członków rodziny Chlamydiaceae, włącznie z Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis oraz Chlamydophila psittaci. Po zakończeniu inkubacji mieszaninę reakcyjną przenosi się do mikrostudzienki Amplification Microwell, zawierającej dwa enzymy (polimerazę DNA i endonukleazę restrykcyjną), konieczne do przeprowadzenia testu SDA. W celu uniknięcia kontaminacji mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji uszczelnia się, a następnie inkubuje w sterowanym termicznie czytniku fluorescencyjnym, monitorującym każdą reakcję pod względem wytwarzania produktów amplifikacji. W przebiegu każdej reakcji następuje koamplifikacja i detekcja wewnętrznej kontroli amplifikacji (IAC), której celem jest sprawdzanie, czy są spełnione wymagane warunki amplifikacji oraz obniżenie ryzyka uzyskania fałszywie ujemnych wyników spowodowanych obecnością inhibitorów testu. Obecność lub brak DNA właściwego dla rodziny Chlamydiaceae oznacza się przez obliczenie dla próbki wartości wyniku PAT (Passes After Threshold), opartego na znanych wartościach progowych. Urządzenie automatycznie przedstawi zarówno wyniki pozytywne, negatywne, jak i nieokreślone. ODCZYNNIKI I MATERIAŁY Każde opakowanie odczynników testu BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (rodziny) (CF) Amplified DNA Assay zawiera następujące elementy: Chlamydiaceae Family (rodziny) (CF) mikrostudzienki do zalewania cieczy (1 x 24) 6 Oligonukleotydy 7,5 pmol, dntp s 15,2 nmol, 2 sondy detektorowe 22,5 pmol Syntetyczny oligonukleotyd 75 kopii

Chlamydiaceae Family (rodziny) (CF) mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji (1 x 24) Enzym restrykcyjny: 33 jednostki, Polimeraza DNA 14 jednostek 1 nakrywek mikrostudzienek, 16 uszczelek do amplifikacji (1/2), 8 torebek na odpady BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (Rozcieńczalnik do próbek z układu oddechowego i podłoża i zestaw kontrolny) (CF/LP*/MP**): Zawiera: Rozcieńczalnik do próbek z układu oddechowego i podłoża: Bicine, fosforan potasu, wodorotlenek potasu, dimetylosulfotlenek (DMSO) oraz Proclin, kontrole pozytywne 1 (CF/LP/MP): 15 ng DNA nasienia łososia, 47,3 µg Tris, 9, µg EDTA, 36 kopii plazmidu CF, 48 kopii plazmidu LP, 54 kopii plazmidu MP; kontrole negatywne 1 (CF/LP/MP): 15 ng DNA nasienia łososia, 47,3 µg Tris, 9, µg EDTA; 1 probówek o pojemności 2 ml z przykrywką zatrzaskową * zob. test BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay ** zob. test BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (Rozcieńczalnik do wymazów i zestaw kontrolny) (tcf/tmp)*: Zawiera: Rozcieńczalnik do wymazów: Bicice, fosforan potasu, wodorotlenek potasu, dimetylosulfotlenek (DMSO) oraz Proclin; kontrole pozytywne 1 (tcf/tmp): 175 ng DNA nasienia łososia, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA, 6 kopii plazmidu CF, 8 kopii plazmidu LP, 9 kopii plazmidu MP; kontrole negatywne 1 (tcf/tmp): 175 ng DNA nasienia łososia, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA * Oznaczenie t odnosi się do odczynników zaprojektowanych do użycia jedynie z wymazami z gardła (bez podłoża transportowego). Aparatura, wyposażenie i zaopatrzenie: Aparat BD ProbeTec ET z płytą, cieplarka lizująca BD ProbeTec ET Lysing Heater, blok grzewczy BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, statyw lizujący BD ProbeTec ET Lysing Rack, Pipetor BD ProbeTec ET, podstawka oraz zasilacz, zestaw akcesoriów BD ProbeTec ET, probówki i nakrętki BD ProbeTec ET 2 ml oraz 4 ml, końcówki pipet BD ProbeTec ET Materiały niezbędne, ale niedostarczane: Komora bezpieczeństwa biologicznego klasy II, mieszadło, chłodziarka niskotemperaturowa -2 C i/lub -7 C (lub poniżej), mikrowirówka osiągająca 16 x g, łaźnie wodne, termometr cyfrowy, stojak do łaźni wodnej z przykręcaną pokrywą, stojak na probówki 2 ml i inne odpowiednie stojaki na probówki, wymazówki BBL CultureSwab EZ, rękawiczki jednorazowe, mikropipety o pojemności od 2 do 1 µl, pipety z końcówkami z barierą dla aerozolu, woda destylowana, woda czysta dla biologii molekularnej, podchloryn sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox* * Rozpuścić 7,5 g preparatu Alconox w 1 L 1% roztworu podchlorynu sodu (v/v) i zmieszać. Codziennie przygotowywać świeżą mieszaninę. Warunki przechowywania i użytkowania: Zestaw odczynników BD ProbeTec ET CF może być przechowywany w temperaturze od 2 do 33 C. Nie stosować nieotwartych zestawów odczynników po upływie daty ważności. Po otwarciu opakowania, mikrostudzienki, o ile są właściwie uszczelnione, zachowują stabilność przez okres 12 tygodni lub do daty ważności (w zależności od tego, który termin upływa wcześniej). Nie zamrażać. Rozcieńczalnik do próbek BD ProbeTec ET z układu oddechowego i podłoża i zestaw kontrolny (CF/LP/MP) może być przechowywany w temperaturze od 2 do 33 C. Nie stosować odczynników po upływie daty ważności. Nie zamrażać. Rozcieńczalnik do wymazów BD ProbeTec ET i zestaw kontrolny (tcf/tmp) może być przechowywany w temperaturze od 2 do 33 C. Nie stosować odczynników po upływie daty ważności. Nie zamrażać. Ostrzeżenia i środki ostrożności Do stosowania w diagnostyce in vitro. 1. W próbkach klinicznych mogą być obecne drobnoustroje chorobotwórcze, takie jak wirusy zapalenia wątroby i wirus HIV. Podczas pracy z wszelkimi materiałami skażonymi krwią i innymi płynami ustrojowymi, należy stosować Standardowe środki ostrożności 4-7 oraz przestrzegać wytycznych obowiązujących w danej placówce. 2. Rozcieńczalnik do próbek BD ProbeTec ET z układu oddechowego i podłoża zawiera dimetylosulfotlenek (DMSO). Wdychanie, kontakt ze skórą lub połknięcie związku DMSO może być szkodliwe dla zdrowia. Należy unikać kontaktu z oczami; podczas pracy zawsze używać rękawiczek jednorazowych. W razie przedostania się do oczu przepłukać natychmiast oczy dużą ilością wody i zgłosić się do lekarza. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, natychmiast spłukać dużą ilością wody. 3. System BD ProbeTec ET zaprojektowano tak, by zmniejszyć do minimum możliwość kontaminacji amplikonów; do pracy z systemem BD ProbeTec ET nie są konieczne specjalne strefy robocze. Niemniej jednak w razie konieczności należy stosować inne środki ostrożności mające na celu zapobieganie kontaminacji, a zwłaszcza kontaminacji hodowli w czasie przygotowania lub przenoszenia.

4. Otwarte opakowania z odczynnikami zawierające niewykorzystane mikrostudzienki do zalewania cieczy i mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji MUSZĄ być ponownie starannie uszczelnione. Przed ponownym uszczelnieniem należy się upewnić, że w opakowaniu odczynnikowym znajduje się środek osuszający. 5. Przed przeniesieniem płytki zawierającej mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji z bloku grzewczego BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater do aparatu BD ProbeTec ET, NALEŻY ją starannie zakleić uszczelką przeznaczoną do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji. Uszczelnienie zapewnia zamkniętą reakcję amplifikacji i detekcji oraz jest konieczne w celu uniknięcia kontaminacji aparatu i miejsca pracy produktami amplifikacji. W żadnym wypadku nie wolno usuwać z mikrostudzienek materiału uszczelniającego. 6. Mikrostudzienki do zalewania cieczy z pozostałym płynem (po przeniesieniu płynu z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji) mogą stanowić źródło kontaminacji. Przed usunięciem mikrostudzienek do zalewania cieczy należy je starannie uszczelnić. 7. Aby uniknąć kontaminacji środowiska pracy produktami amplifikacji i usunąć zużyte mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji, należy używać dostarczonych wraz z zestawem odczynników torebek na odpady. Przed usunięciem należy upewnić się, czy torebki na odpady zostały prawidłowo zamknięte. 8. W celu uniknięcia krzyżowej kontaminacji próbek, w trakcie poszczególnych etapów przetwarzania próbki i procedury testowej należy ZMIENIAĆ RĘKAWICZKI. W przypadku kontaktu rękawiczek z próbką, należy je natychmiast zmienić, aby uniknąć kontaminacji pozostałych próbek. 9. W przypadku kontaminacji miejsca pracy lub aparatury z próbkami lub odczynnikami kontrolnymi, należy starannie przemyć strefę kontaminacji 1% (v/v) roztworem podchlorynu sodu z preparatem Alconox i spłukać dokładnie wodą. Przed przystąpieniem do dalszych etapów testu należy odczekać, aż powierzchnia będzie całkowicie sucha. 1. Do przenoszenia przygotowanych próbek do mikrostudzienek do zalewania cieczy i przenoszenia próbek z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji należy używać wyłącznie pipetora BD ProbeTec ET i końcówek BD ProbeTec ET. 11. Przestrzegać przyjętych praktyk laboratoryjnych dotyczących usuwania zużytych końcówek pipet, probówek na próbki, mikrostudzienek do zalewania cieczy i innych odpadów. Ostrożnie wyrzucać produkty jednorazowego użytku. Pojemniki na odpady należy uszczelnić i wyrzucić, gdy zostaną wypełnione w ¾ swojej pojemności lub codziennie (w zależności od tego, co nastąpi najpierw). 12. Nie zamieniać i nie mieszać mikrostudzienek, odczynników kontrolnych ani odczynników do przetwarzania próbek pochodzących z zestawów o różnych numerach seryjnych. 13. W przypadku wystąpienia niecodziennych sytuacji, takich jak wylanie się płynu do wnętrza aparatu BD ProbeTec ET lub kontaminacja DNA, której nie można się pozbyć przez mycie, należy się skontaktować z obsługą techniczną. POBIERANIE I TRANSPORT PRÓBEK 1. Pobieranie próbek Wszystkie próbki należy pobierać zgodnie z zaleceniami zawartymi w podręczniku Clinical Microbiology Procedures Handbook 8 lub z podręcznikiem procedur laboratoryjnych, obowiązującym w laboratorium Użytkownika. BBL CultureSwab EZ (BD nr kat. 22144) powinien być używany w celu pobierania wymazów z gardła, przechowywanych bez podłoża transportowego. 2. Przechowywanie i transport próbek Wymazy z gardła (bez podłoża transportowego): Próbki mogą być przechowywane/transportowane w temperaturze od 18 33 C, nie dłużej niż przez 2 dni. Próbki mogą być przechowywane w lodówce, w temperaturze 2 8 C, nie dłużej niż przez 3 dni. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -2 C lub niższej, nie dłużej niż przez 14 tygodni. Wymazy z gardła na podłożu 2SP: 8 Próbki powinny być niezwłocznie po pobraniu przechowywane w lodówce w temperaturze 2 8 C. Transportować na mokrym lodzie lub w schłodzonym opakowaniu, jeśli transport trwa dłużej niż kilka minut. Próbki powinny być przechowywane w temperaturze 2 8 C, nie dłużej niż przez 2 dni. Próbki wymagające przechowywania przez dłuższy czas powinny zostać umieszczone w temperaturze -7 C. PROCEDURA TESTOWA Aby uzyskać szczegółowe instrukcje użytkowania i obsługi składników systemu, należy zapoznać się z podręcznikiem użytkownika systemu BD ProbeTec ET. A. Przygotowanie aparatu: 1. Przed rozpoczęciem oznaczenia włączyć aparat i odczekać, aż osiągnie temperaturę roboczą.

a. Należy przeznaczyć około 9 min na nagrzanie i stabilizację cieplarki lizującej i bloku grzewczego. Cieplarka lizująca została ustawiona na temperaturę 114 C. Wartość nastawcza składowej Priming bloku grzewczego wynosi 72,5 C. Wartość nastawcza składowej Warming bloku grzewczego wynosi 54 C. b. Aparat BD ProbeTec ET jest sterowany programowo; czas osiągnięcia temperatury roboczej wynosi około 3 minut. 2. Przed rozpoczęciem oznaczenia należy sprawdzić temperatury podgrzewacza. Zapisać temperatury w dzienniku konserwacji systemu BD ProbeTec ET System Maintenance Log. a. Cieplarka lityczna Zdjąć plastikową przykrywkę i odczekać 15 minut do wyrównania temperatury. Termometr powinien wskazywać temperaturę w zakresie 112 116 C. b. Blok grzewczy (Priming, Warming) Termometr bloku grzewczego Priming powinien wskazywać temperaturę od 72 73 C. Termometr bloku grzewczego Warming powinien wskazywać temperaturę od 53,5 54,5 C. 3. Sprawdzić temperaturę wyświetlaną na ekranie aparatu BD ProbeTec ET. Powinna ona wynosić od 47,5 do 55, C. Zapisać temperatury w dzienniku konserwacji systemu BD ProbeTec ET System Maintenance Log. B. Pipetor: Aby uzyskać szczegółowe wyjaśnienia na temat funkcji klawiatury pipetora BD ProbeTec ET, należy zapoznać się z podręcznikiem użytkownika systemu BD ProbeTec ET. Dodatkowo pipetor BD ProbeTec ET powinien być czyszczony po każdym użyciu. W celu uzyskania wskazówek na temat prawidłowego czyszczenia i obsługi pipetora BD ProbeTec ET należy skontaktować się z przedstawicielem pomocy technicznej. Do wykonania oznaczenia BD ProbeTec ET CF Assay wymagane są następujące programy. Program 1 służy do przenoszenia płynu z przetworzonych próbek do mikrostudzienek CF do zalewania cieczy. Program 5 służy do przenoszenia płynu z mikrostudzienek CF do zalewania cieczy do mikrostudzienek CF przeznaczonych do amplifikacji. Pipetor należy zaprogramować w następujący sposób: Program 1: 1. WŁĄCZYĆ pipetor. Pipetor emituje pojedynczy sygnał dźwiękowy, przez chwilę jest wyświetlane ZERO i Software Version # (wersja oprogramowania), a następnie jest emitowany kolejny sygnał dźwiękowy. 2. Wcisnąć niebieski przycisk Prog (program). Aby wybrać program 1, należy wcisnąć i przytrzymać przycisk Vol (objętość), aż wyświetli się 1. Wcisnąć przycisk Enter. 3. Aby przejść do trybu programowania, należy wcisnąć i przytrzymać przycisk Prog. Przytrzymując wciśnięty przycisk Prog, jednocześnie wcisnąć specjalny przycisk funkcyjny (Special Function Key), używając końcówki pipety lub spinacza do papieru. 4. Wcisnąć przycisk Fill (napełnianie). Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 2. Wcisnąć przycisk Enter. 5. Wcisnąć przycisk Disp (dozowanie). Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 15. Wcisnąć przycisk Enter. 6. W celu zapisania danych i zakończenia programu ponownie wcisnąć przycisk Enter. Pipetor powinien emitować sygnał dźwiękowy potwierdzający zakończenie programowania. 7. Zweryfikować program wcisnąć przycisk spustowy, by przejrzeć wszystkie etapy. Po zakończeniu poszczególnych etapów należy ustawić szybkość pobierania/dozowania za pomocą przycisku Vol (objętość). Na każdym etapie jest wyświetlany wskaźnik szybkości (Speed). Stosując przycisk Vol, nastawić wskaźnik prędkości tak, aby wyświetlał 2 kwadraty dla kroków Fill (napełnianie) i Disp (dozowanie). Program 5 1. Wcisnąć przycisk Prog (program). Aby wybrać program 5, należy wcisnąć i przytrzymać przycisk Vol, aż zostanie wyświetlone 5. Wcisnąć przycisk Enter. 2. Aby przejść do trybu programowania, należy wcisnąć i przytrzymać przycisk Prog. Przytrzymując wciśnięty przycisk Prog, jednocześnie wcisnąć specjalny przycisk funkcyjny (Special Function Key), używając końcówki pipety lub spinacza do papieru. 3. Wcisnąć przycisk Fill (napełnianie). Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 1. Wcisnąć przycisk Enter. 4. Wcisnąć przycisk Disp (dozowanie). Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 1. Wcisnąć przycisk Enter. 5. Wcisnąć przycisk Mix (mieszanie). Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 5. Wcisnąć przycisk Enter. 6. W celu zapisania danych i zakończenia programu ponownie wcisnąć przycisk Enter. Pipetor powinien emitować sygnał dźwiękowy potwierdzający zakończenie programowania.

7. Zweryfikować program wcisnąć przycisk spustowy, by przejrzeć wszystkie etapy. Po zakończeniu poszczególnych kroków należy ustawić prędkość pobierania/dozowania/mieszania za pomocą przycisku Vol (objętość). Na każdym etapie jest wyświetlany wskaźnik szybkości. Stosując przycisk Vol, nastawić wskaźnik szybkości, tak aby wyświetlał 2 kwadraty dla funkcji pobierania i dozowania. Stosując przycisk Vol, nastawić wskaźnik szybkości tak, by wyświetlał 3 kwadraty. Przegląd programów Przed rozpoczęciem procedury należy dokonać przeglądu programów. W celu dokonania przeglądu programów należy WŁĄCZYĆ pipetor. Wcisnąć niebieski przycisk Prog (program). Wcisnąć i przytrzymać przycisk Vol (objętość), aż zostanie wyświetlony numer właściwego programu (1 lub 5). Wcisnąć przycisk Enter. Aby przejrzeć program krok po kroku, należy używać przycisku spustowego pipetora. Program 1: Program obejmuje pobieranie 2 µl i dozowanie 15 µl do mikrostudzienki CF. Na wyświetlaczu pipetora powinny być wyświetlane następujące dane: Fill 2 µl S Dispense 15 µl S Program 5: Program obejmuje pobranie 1 µl, dozowanie 1 µl i trzykrotne mieszanie 5 µl. Na wyświetlaczu pipetora powinny być wyświetlane następujące dane: Fill 1 µl S Dispense 1 µl S Mix 5 µl S Zero (wyświetlane pulsacyjnie) C. Układ płytki: Po wprowadzeniu do systemu rodzaju oznaczenia, danych identyfikacyjnych próbek, numerów seryjnych kontroli i numerów seryjnych zestawu, aparat BD ProbeTec ET wyświetla Raport o układzie płytki. Raport o układzie płytki przedstawia przestrzenne rozmieszczenie próbek badanych i kontrolnych na każdej badanej płytce. Rozmieszczenie ma zastosowanie zarówno dla płytki Priming Microwell, jak i płytki Amplification Microwell. Mikrostudzienki do zalewania cieczy przeznaczone do oznaczenia CF mają jednolicie niebieskie paski. Mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji posiadają jasno niebieskie paski. D. Przetwarzanie próbek wymazów z gardła (bez podłoża transportowego): UWAGI: Przed użyciem należy odczekać, aż Rozcieńczalnik BD ProbeTec ET do wymazów (tcf/tmp) osiągnie temperaturę pokojową, a następnie wymieszać delikatnie go odwracając. W czystym pojemniku umieścić odpowiednią ilość Rozcieńczalnika BD ProbeTec ET do wymazów (tcf/tmp). Aby oszacować wymaganą ilość, należy użyć 1 ml do każdej próbki, a następnie dodać kolejne 1 2 ml dla ułatwienia pipetowania. Aby uniknąć zanieczyszczenia rozcieńczalnika, nie należy wlewać jego pozostałości z powrotem do butelki. 1. Oznakować 4 ml probówkę każdego przetwarzanego wymazu z gardła. 2. Należy pozostawić fiolki do uzyskania temperatury pokojowej. 3. Do każdej probówki odmierzyć pipetą 1 ml Rozcieńczalnika do wymazów (tcf/tmp). 4. Włożyć wymazówkę. Przez 5 1 sekund mieszać zawartość probówki z rozcieńczalnikiem, wykonując okrężne ruchy probówką. 5. Wycisnąć wymazówkę o ściankę probówki tak, aby płyn spłynął na jej dno. 6. Ostrożnie wyjąć wymazówkę tak, aby nie rozchlapać zawartości. UWAGA: Spadające krople mogą zanieczyścić miejsce pracy. 7. Umieścić wymazówkę z powrotem w probówce transportowej, a następnie wyrzucić. 8. Szczelnie zatkać probówkę. 9. Wirować probówkę przez 5 sekund. 1. Powtórzyć kroki 3 9 dla dodatkowych wymazów z gardła. 11. Przygotować próbki kontrolne. Zob. Przygotowanie próbek kontrolnych wymazów z gardła (Rozdział F). 12. Przy użyciu Raportu o układzie płytki umieścić próbki badane i kontrolne w statywie litycznym według wskazanego porządku. 13. Zamknąć próbki w odpowiednich miejscach statywu litycznego BD ProbeTec ET. 14. Włożyć statyw lityczny do cieplarki lizującej BD ProbeTec ET. 15. Podgrzewać próbki przez 1 minut. 16. Po 1 minutach wyjąć statyw lityczny BD ProbeTec ET z cieplarki lizującej BD ProbeTec ET i poczekać na schłodzenie 15 minut. Delikatnie uderzać stojakiem o blat stołu tak, aby zebrać możliwie dużo kondensatu na dnie probówki. UWAGA: Po lizie próbek:

a. Można je przechowywać w temperaturze 18 33 C nie dłużej niż 6 godz. i mogą zostać poddane testowi bez ponownej lizy. b. Mogą być przechowywane w temperaturze 2 8 C nie dłużej niż 3 dni. Przed wykonaniem testu próbki muszą zostać poddane wirowaniu i ponownej lizie. c. Mogą być przechowywane w temperaturze -2 C nie dłużej niż 14 tygodni. Przed wykonaniem testu, próbki muszą zostać rozmrożone w temperaturze pokojowej, poddane wirowaniu i ponownej lizie. 17. Próbki są gotowe do wykonania Procedur testowych BD ProbeTec ET CF Assay (Rozdział G). E. Przetwarzanie próbek wymazów z gardła (na podłożu 2SP): Uwagi odnośnie do procedury: Między przenoszeniem wszystkich płynów należy zmieniać końcówki pipety. Zaleca się używanie końcówek z barierą dla aerozolu. Przed użyciem należy odczekać, aż Rozcieńczalnik BD ProbeTec ET do próbek z układu oddechowego i podłoża (CF/LP/MP) osiągnie temperaturę pokojową, a następnie wymieszać delikatnie go odwracając. W czystym pojemniku umieścić odpowiednią ilość Rozcieńczalnika BD ProbeTec ET do próbek z układu oddechowego i podłoża (CF/LP/MP). Aby oszacować wymaganą ilość, należy użyć,4 ml do każdej próbki, a następnie dodać kolejne 1 2 ml dla ułatwienia pipetowania. Aby uniknąć zanieczyszczenia rozcieńczalnika, nie należy wlewać jego pozostałości z powrotem do butelki. 1. Należy pozostawić fiolki do uzyskania temperatury pokojowej. 2. Oznaczyć 2 ml zakręcane probówki każdej badanej próbki. 3. Do każdej zakręcanej probówki przenieść 4 µl Rozcieńczalnika do próbek z układu oddechowego i podłoża (CF/LP/MP). Opisane poniżej kroki 4 6 powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego: 4. W celu pełnego wymieszania próbek obracać nimi miarowo przez 5 15 sekund. 5. Za pomocą pipety przenieść 2 µl próbki do oznakowanej probówki. UWAGA: Jeżeli objętość próbki nie przekracza 2 µl (objętość próbki musi wynosić co najmniej 1 µl), należy uzupełnić objętość do 2 µl za pomocą czystej wody do celów biologii molekularnej. 6. Po dodaniu próbek należy zmienić rękawiczki. UWAGA: Przed przystąpieniem do kroku 7 napełnić łaźnię wodną wodą destylowaną i doprowadzić ją do wrzenia. 7. Obracać miarowo przez 5 sekund. 8. Przygotować próbki kontrolne. Zob. Przygotowanie podłoża kontrolnego 2SP (Rozdział F). 9. Przenieść próbki badane i kontrolne do stojaka łaźni wodnej. 1. Umieścić stojak łaźni wodnej we wrzącej wodzie na 1 minut. 11. Po upływie 1 minut należy wyjąć stojak łaźni wodnej i odczekać 15 minut, aż probówki osiągną temperaturę pokojową. OSTRZEŻENIE: Wrząca woda, stojak i powierzchnia łaźni wodnej mogą być gorące. Należy postępować ostrożnie w celu uniknięcia oparzenia. 12. Po ostygnięciu wirować (16, x g) przez około 5 sekund. UWAGA: Po zagotowaniu próbek: Można je przechowywać w temperaturze 18 33 C nie dłużej niż 6 godz. i mogą zostać poddane testowi bez ponownego doprowadzania do wrzenia. Mogą być przechowywane w temperaturze 2 8 C nie dłużej niż 3 dni. Przed wykonaniem testu próbki muszą zostać poddane wirowaniu i ponownej lizie. Mogą być przechowywane w temperaturze -2 C nie dłużej niż 14 tygodni. Przed wykonaniem testu, próbki muszą zostać rozmrożone w temperaturze pokojowej, poddane wirowaniu i ponownie doprowadzone do wrzenia. 13. Próbki są gotowe do wykonania Procedur testowych BD ProbeTec ET CF Assay (Rozdział G). F. Przygotowanie próbek kontrolnych: Przygotowanie próbek kontrolnych wymazów z gardła 1. Dla każdego planowanego cyklu testu (płytki) należy przygotować jedną probówkę kontrolną negatywną (tcf/tmp) i jedną pozytywną (tcf/tmp). Jeżeli płytka zawiera zestawy odczynników o więcej niż jednym numerze seryjnym, próbki kontrolne powinny zostać przetestowane oddzielnie dla każdej serii. 2. Zdjąć nakrętkę z probówki kontroli negatywnej (tcf/tmp). 3. Przy użyciu nowej końcówki pipety dodać 1 ml Rozcieńczalnika do wymazów. 4. Ponownie mocno zamknąć probówkę.

5. Zdjąć nakrętkę z probówki kontroli pozytywnej (tcf/tmp). 6. Przy użyciu nowej końcówki pipety dodać 1 ml Rozcieńczalnika do wymazów. 7. Ponownie mocno zamknąć probówkę. 8. Mieszać zawartość probówek kontrolnych przez 5 sekund. 9. Probówki kontrolne są teraz gotowe do lizy. Zob. Przetwarzanie próbek wymazów z gardła (Rozdział D). Przygotowanie podłoża kontrolnego 2SP: 1. Dla każdego planowanego cyklu testu (płytki) należy przygotować jedną probówkę kontrolną negatywną (CF/LP/MP) i jedną pozytywną (CF/LP/MP). Jeżeli płytka zawiera zestawy odczynników o więcej niż jednym numerze seryjnym, próbki kontrolne powinny zostać przetestowane oddzielnie dla każdej serii. 2. Przed użyciem delikatnie odwrócić Rozcieńczalnik do próbek z układu oddechowego i podłoża. 3. Zdjąć nakrętkę z probówki kontroli negatywnej (CF/LP/MP). 4. Przy użyciu nowej końcówki pipety dla każdej probówki kontrolnej dodać po 2 µl czystej wody do celów biologii molekularnej. 5. Przy użyciu nowej końcówki pipety dla każdej probówki kontrolnej dodać po 4 µl Rozcieńczalnika do próbek z układu oddechowego i podłoża. 6. Ponownie mocno zamknąć probówkę. 7. Zdjąć nakrętkę z probówki kontroli pozytywnej (CF/LP/MP). 8. Przy użyciu nowej końcówki pipety dla każdej probówki kontrolnej dodać po 2 µl czystej wody do celów biologii molekularnej. 9. Przy użyciu nowej końcówki pipety dla każdej probówki kontrolnej dodać po 4 µl Rozcieńczalnika do próbek z układu oddechowego i podłoża. 1. Ponownie mocno zamknąć probówkę. 11. Mieszać zawartość probówek przez 5 sekund. 12. Probówki kontrolne są teraz gotowe do doprowadzenia do wrzenia. Zob. Przetwarzanie podłoża próbek 2SP (Rozdział E). G. Procedura testowa testu BD ProbeTec ET CF Assay: UWAGA: Przed przystąpieniem do procedury testowej, próbki badane i kontrolne należy ustawić na stojaku przystosowanym do probówek 2 i 4 ml, np. statyw BD ProbeTec ET na probówki o pojemności 2 ml lub statyw lizujący BD ProbeTec, kompatybilnym z pipetorem BD ProbeTec ET. 1. Zdjąć i wyrzucić nakrętki ze schłodzonych próbek i probówek kontrolnych. 2. Aby uniknąć zanieczyszczenia, przed przystąpieniem do dalszej części ZMIENIĆ RĘKAWICZKI. 3. Posługując się raportem o układzie płytki, przygotować płytkę mikrostudzienek Priming Microwell zob. Układ płytki (Rozdział C). 4. Ponownie uszczelnić opakowanie mikrostudzienek, stosując następującą procedurę: a. Umieścić opakowanie na równej powierzchni. Jedną ręką trzymać otwarty koniec płytki. b. Naciskając płytkę, przesuwać palec wzdłuż zewnętrznej strony uszczelnienia, poruszając się od jednej do drugiej krawędzi opakowania. c. Sprawdzić, czy opakowanie zostało dostatecznie uszczelnione. 5. Wybrać Program 1 na pipetorze BD ProbeTec ET. 6. Pobrać końcówki do pipety. Rozwinąć pipetor BD ProbeTec ET przez całkowite wyciągnięcie pokrętła regulacyjnego. UWAGA: Aby uniknąć przecieku, należy się upewnić, że końcówki są pewnie umocowane na pipetorze. 7. Pobrać 2 µl z pierwszej kolumny próbek. 8. Naciskając delikatnie pipetor, dotknąć końcówkami pipet ścianek studzienek i wprowadzić 15 µl roztworu do odpowiedniej kolumny mikrostudzienek do zalewania cieczy (1 A H). UWAGA: Nie należy naciskać pipetora nad próbkami ani mikrostudzienkami, ponieważ może to spowodować kontaminację. Wykonywanie gwałtownych ruchów może spowodować powstawanie kropelek i aerozoli. 9. Wyrzucić końcówki. Wcisnąć przycisk spustowy pipetowania w celu wyzerowania pipetora. UWAGA: Końcówki należy wyrzucać ostrożnie, aby uniknąć powstawania kropelek i aerozoli mogących powodować kontaminację miejsca pracy. 1. Pobrać nowe końcówki, rozwinąć pipetor i pobrać 2 µl z drugiej kolumny próbek. 11. Naciskając delikatnie pipetor, dotknąć końcówkami pipet ścianek studzienek i wprowadzić 15 µl roztworu do odpowiedniej kolumny mikrostudzienek do zalewania cieczy (2 A H). 12. Wyrzucić końcówki. 13. Kontynuować przenoszenie pozostałych próbek przeznaczonych do danego cyklu.

14. Przykryć płytkę Priming Microwell pokrywą Priming i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej na co najmniej 2 minut. (Maksymalnie do 6 godz.) UWAGA: Zamknąć przygotowane próbki nowymi nakrętkami. ZMIENIĆ RĘKAWICZKI. 15. Pod koniec inkubacji płytki Priming Microwell przygotować płytkę Amplification Microwell. Rozmieścić mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji na płytce w sposób odpowiadający Raportowi o układzie płytki (podobnie jak w przypadku płytek Priming). Ponownie uszczelnić opakowanie mikrostudzienek zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4. 16. Zdjąć pokrywę z płytki Priming Microwell i przenieść płytkę do bloku grzewczego Priming Heater. W celu wstępnego ogrzania, NATYCHMIAST umieścić płytkę Amplification Microwell w bloku grzewczym. 17. Ustawić minutnik na 1 minut. (UWAGA: Dla tego etapu czas ma zasadnicze znaczenie). 18. Pod koniec 1-minutowej inkubacji (± 1 min) wybrać na pipetorze Program 5. 19. Pobrać końcówki do pipety i przenieść 1 µl z kolumny 1 płytki Priming Microwell do kolumny 1 płytki Amplification Microwell. Wprowadzić płyn dotykając końcówkami pipety ścianek studzienek. Po zakończeniu dozowania płynu odczekać, aż pipetor automatyczne zmiesza ciecz w studzienkach. Delikatnie przenieść pipetor poza płytkę. Unikać dotknięcia innych studzienek. 2. Wyrzucić końcówki. Pobrać nowe końcówki i kontynuować przenoszenie mieszaniny reakcyjnej z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji, używając nowych końcówek dla wszystkich kolejnych kolumn. 21. Po przeniesieniu wszystkich kolumn usunąć podklejkę z uszczelki Amplification sealer (Jedna uszczelka (1/2) pozwala na zakrycie maksymalnie do 6 kolumn. Jeżeli stosuje się więcej niż 6 kolumn, KONIECZNE jest użycie pełnego arkusza uszczelek). Trzymając brzegi uszczelki, nałożyć uszczelkę na mikrostudzienki. Przy nakładaniu uszczelki należy stosować wskazówki dotyczące bloku grzewczego. Docisnąć uszczelkę w celu zapewnienia całkowitego uszczelnienia wszystkich mikrostudzienek. 22. W interfejsie użytkownika urządzenia BD ProbeTec ET wysunąć stojak, otworzyć drzwiczki i unieść pokrywę płytki. NATYCHMIAST (w ciągu 3 sekund) przenieść uszczelnioną płytkę Amplification Microwell do aparatu BD ProbeTec ET i rozpocząć cykl. (Szczegółowe instrukcje znajdują się w podręczniku użytkownika Systemu BD ProbeTec ET.) 23. Po rozpoczęciu cyklu należy postępować zgodnie z następującymi wskazówkami dotyczącymi czyszczenia: a. Uszczelnić mikrostudzienki do zalewania cieczy uszczelką Amplification Sealer i wyjąć płytkę z bloku grzewczego Priming and Warming Heater. OSTRZEŻENIE: Do wyjmowania płytki używać rękawicy termoodpornej temperatura płytki przekracza 7 C. b. Odczekać 5 minut, pozostawiając płytkę na blacie do ostygnięcia. c. Usunąć uszczelnionie mikrostudzienki do zalewania cieczy z płytki, trzymając uszczelki z obu stron i unosząc studzienki w całości do góry. Umieścić uszczelnione mikrostudzienki w torebce na odpady i szczelnie zamknąć. d. Wyczyścić metalową płytkę: Spłukać płytkę 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) roztwór Alconox. Spłukać płytkę wodą. Przed ponownym użyciem należy zawinąć płytkę w czysty ręcznik i pozostawić do całkowitego wyschnięcia. 24. Po zakończeniu cyklu zostanie utworzony wydruk zawierający wyniki testu. 25. Przesunąć stojak płytki, otworzyć drzwiczki i wyjąć płytkę. Zamknąć drzwiczki i ponownie umieścić płytkę wewnątrz aparatu. 26. Usunąć z płytki uszczelnione mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji. PRZESTROGA: W żadnym wypadku nie usuwać z mikrostudzienek materiału uszczelniającego. Uszczelnione mikrostudzienki można łatwo zdjąć w całości, trzymając uszczelkę z przodu i z dołu i podnosząc płytkę prosto ku górze i na zewnątrz. Umieścić uszczelnione mikrostudzienki w torebce na odpady. Szczelnie zamknąć torebkę. 27. Wyczyścić płytkę metalową: Spłukać płytkę 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) roztwór Alconox. Spłukać płytkę wodą. Przed ponownym użyciem należy zawinąć płytkę w czysty ręcznik i pozostawić do całkowitego wyschnięcia. 28. Po zakończeniu ostatniego cyklu danego dnia należy przeprowadzić następujące procedury porządkowe:

a. Nasączyć papierowe ręczniki lub gaziki 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z roztworem Alconox, następnie zastosować je do mycia blatów i zewnętrznych powierzchni cieplarki lizującej, bloku grzewczego, stojaka na probówki, łaźni wodnej, wirówki oraz aparatu BD ProbeTec ET. Pozostawić roztwór na powierzchni przez 2 3 minuty. Nasączyć wodą ręczniki papierowe lub gaziki i usunąć roztwór myjący. Podczas nakładania roztworu myjącego lub spłukiwania wodą należy często wymieniać ręczniki lub gaziki. Zwilżyć ręcznik papierowy lub gazik 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox i wytrzeć uchwyt pipetora (JEDYNIE UCHWYT). Po 2 3 minutach wytrzeć uchwyt zwilżonym wodą ręcznikiem papierowym lub gazikiem. b. Zanurzyć statyw lityczny, jego podstawę, pokrywę oraz płytki lub statyw łaźni wodnej w 1% roztworze podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox, na czas 1 2 minuty. Dokładnie przepłukać wodą i suszyć na powietrzu. c. Naładować ponownie pipetor. d. Szczelnie zamknięte torebki na odpady i odpady skażone mikrobiologicznie należy usuwać zgodnie z przyjętymi procedurami usuwania zanieczyszczonego materiału odpadowego. 29. Co najmniej raz w tygodniu przeprowadzać następujące procedury: a. Usuwać wodę z łaźni wodnych. b. Czyścić łaźnie wodne 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox. Dokładnie płukać wodą i suszyć na powietrzu. c. Napełnić ponownie wodą destylowaną. Kontrola jakości Należy postępować zgodnie z obowiązującymi wymogami kontroli jakości, wynikającymi z przepisów miejscowych, krajowych i/lub federalnych, wymogami akredytacji i rutynowymi procedurami kontroli jakości w danym laboratorium. Zaleca się, aby użytkownik stosował się do odpowiednich wytycznych CLSI (dawniej NCCLS) i przepisów CLIA, dotyczących sposobów kontroli jakości. Rozcieńczalnik do wymazów i próbki kontrolne są dostarczane łącznie w zestawie Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp). Rozcieńczalnik do próbek z układu oddechowego i podłoża i próbki kontrolne są dostarczane łącznie w zestawie Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP). W ramach każdego cyklu na płytce, a także dla każdego nowego numeru seryjnego zestawu odczynników, należy stosować jedną kontrolę pozytywną i jedną negatywną. Kontrole można umieszczać w sposób losowy. Kontrola pozytywna służy do monitorowania defektu odczynników. Kontrola negatywna służy do monitorowania kontaminacji odczynników i/lub otoczenia. Aby podawać wyniki próbek, konieczne jest uzyskanie pozytywnego wyniku kontroli pozytywnej i negatywnego kontroli negatywnej. Jeżeli wyniki kontroli różnią się od oczekiwanych, cykl oznaczania uważa się za nieważny. Dlatego aparat nie przedstawi wyników oznaczenia próbek pochodzących od pacjentów. Jeżeli wynik kontroli jakości nie osiągnie spodziewanych rezultatów, należy powtórzyć cały cykl z zastosowaniem nowego zestawu kontroli, nowych mikrostudzienek i przetwarzanych próbek. Jeśli podczas powtórnego testu pozostają resztki przetwarzanej próbki, należy ponownie przeprowadzić test przy użyciu innej porcji pochodzącej z poprzedniej próbki. Jeżeli powtórna kontrola jakości odbiega od spodziewanych wyników, należy się skontaktować z obsługą techniczną (zobacz część Interpretacja wyników ). Wewnętrzna kontrola amplifikacji (IAC, Internal Amplification Control) jest wbudowana do mikrostudzienek Priming Microwell. IAC zawiera docelowy kwas nukleinowy, amplifikowany w obecności macierzy próbki. IAC jest przeznaczona do potwierdzania wiarygodności reakcji amplifikacji oraz identyfikacji czynników hamujących amplifikację, zawartych w przetwarzanej próbce. Kontrole przetwarzanych próbek Kontrole przetwarzanych próbek mogą być testowane zgodnie z wymaganiami odpowiednich akredytowanych organizacji. Zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne powinny sprawdzać cały system testowy. W tym celu próbki o znanym wyniku pozytywnym mogą służyć jako kontrola w stosunku do poddawanych przetwarzaniu i testowaniu nieznanych próbek. Próbki służące jako kontrola procesu przetwarzania muszą być przechowywane, przetwarzane i testowane zgodnie z ulotką do produktu. Kontrole pozytywne i negatywne służą do kontroli efektywności procedur przetwarzania próbek podczas testowania wymazów z gardła (zarówno z podłożem, jak i bez podłoża transportowego, odpowiednio Swab Control oraz Respiratory and Media Controls) dlatego, że próbki kontrolne są przetwarzane w podobny sposób jak właściwe próbki badane. Monitorowanie w kierunku kontaminacji DNA Co najmniej raz w miesiącu należy przeprowadzić następującą procedurę testową służącą do monitorowania strefy roboczej i powierzchni oprzyrządowania pod kątem kontaminacji DNA. Monitorowanie otoczenia ma podstawowe znaczenie dla wykrycia kontaminacji jeszcze przed pojawieniem się problemu. 1. W przypadku każdej powierzchni* poddawanej testowi należy stosować wymazówki BBL CultureSwab EZ. 2. Dla każdej powierzchni, z której będzie pobierany wymaz, należy opisać probówkę o pojemności, a następnie do każdej probówki odpipetować po 1 ml Rozcieńczalnika do wymazów (tcf/tmp).

3. Zanurzyć pierwszą wymazówkę w rozcieńczalniku, a następnie szerokim ruchem przetrzeć pierwszą badaną powierzchnię. 4. Zamieszać wymazówką w rozcieńczalniku, wycisnąć wymazówkę, ponownie zamknąć probówkę i wstrząsać przez 5 sekund. Wyrzucić wymazówki. 5. Powtórzyć czynności dla każdej powierzchni, z której pobiera się wymaz. 6. Umieścić probówki w statywie litycznym i ogrzewać w cieplarce lizującej Lysing Heater przez 1 minut. Wyjąć statyw z cieplarki i przed kontynuowaniem odczekać 15 minut, aż próbki ostygną. 7. W trakcie podgrzewania probówek, za pomocą ręczników nasączonych wodą, należy usunąć pozostałości mieszaniny buforów z powierzchni, z których pobierano wymazy. 8. Po ochłodzeniu próbek należy postępować zgodnie z procedurą testową dotyczącą testu BD ProbeTec ET CF Assay (Rozdział G). *Zaleca się testowanie następujących miejsc: Powierzchnie statywu litycznego, cieplarka lizująca, stojak łaźni wodnej, mikrowirówka, blok grzewczy Priming and Warming Heater, czarne płytki z mikrostudzienkami, uchwyt pipetora, przyciski aparatu, klawiatura aparatu, suche powierzchnie łaźni wodnej, powierzchnie stojaka na próbki, blat stołu doświadczalnego włącznie z obszarem przetwarzania próbek. Jeżeli wynik danej powierzchni jest pozytywny, należy ją wyczyścić, stosując świeży roztwór podchlorynu sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Dopilnować, by cała powierzchnia została zwilżona roztworem czyszczącym, następnie pozostawić roztwór odkażający na powierzchni przez co najmniej 2 minuty lub do czasu jego wyschnięcia. Jeżeli to konieczne, za pomocą czystego ręcznika należy usunąć nadmiar roztworu czyszczącego. Wytrzeć powierzchnię czystym ręcznikiem nasączonym wodą i pozostawić do wyschnięcia. Wykonać ponowny test danej powierzchni. Powtarzać, aż do uzyskania negatywnego wyniku. Jeżeli nie udaje się usunąć kontaminacji, w celu uzyskania dalszych instrukcji należy się skontaktować z obsługą techniczną. INTERPRETACJA WYNIKÓW Obecność lub brak DNA właściwego dla rodziny Chlamydiaceae oznacza się przez obliczenie dla próbki wskaźnika PAT (Passes After Threshold), opartego na znanych wartościach progowych. Punktacja PAT jest systemem metrycznym stosowanym do oceny wielkości sygnału będącego wynikiem reakcji. W tym systemie większe liczby wskazują, że próg został osiągnięty we wczesnej fazie amplifikacji, natomiast mniejsze liczby oznaczają późniejsze osiągnięcie progu w przebiegu reakcji. Wielkość punktacji PAT nie odzwierciedla ilości materiału DNA rodziny Chlamydiaceae zawartej w próbce. Jeśli test próbki kontrolnej nie powiódł się, nie należy podawać wyników pacjentów. W celu zapoznania się z prawidłowymi wartościami próbek kontrolnych, zob. rozdział Kontrola jakości. Wyniki podawane są w następujący sposób: Punktacja PAT Docelowe CF Docelowe IAC Wynik Interpretacja Raport > > lub = Pozytywny Przy zastosowaniu technologii SDA wykryto DNA rodziny Chlamydiaceae = > Negatywny Przy zastosowaniu technologii SDA nie wykryto DNA rodziny Chlamydiaceae Wynik pozytywny dla mikroorganizmów nale ¹cych do rodziny Chlamydiaceae sugeruje aktualne zaka enie. Aby zidentyfikowaæ wykryty gatunek, nale y u yæ dodatkowych testów. Nie wykryto mikroorganizmów nale ¹cych do rodziny Chlamydiaceae. Nie mo na wykluczyæ zaka enia bakteri¹ z rodziny Chlamydiaceae, poniewa stê enie DNA w próbce mo e byæ ni sze ni poziom wykrywany przez test. = = Nieokreœlony Kontrola amplifikacji zatrzymana. Aby zinterpretowaæ test, wymagane jest wykonanie dodatkowych badañ. a a Powtórzyć test BD ProbeTec ET CF Assay dla aktualnie przetwarzanej próbki. Jeżeli w próbce znajduje się niewystarczająca ilość materiału, należy powtórzyć test wykorzystując oryginalną próbkę lub, w razie potrzeby, zażądać nowej. Jeżeli wynik powtórnego badania jest pozytywny lub negatywny, należy zastosować formułę przedstawioną powyżej. Jeśli wynik jest ponownie nieokreślony, należy zastosować nową próbkę. 1

Określanie progu CF i IAC: Wartości progowe docelowego DNA rodziny Chlamydiaceae (CF) oraz IAC zostały określone przy użyciu krzywej ROC (Receiver Operator Characteristic) analizującej otrzymane dane z kontroli pozytywnej i negatywnej. Niniejsze wartości progowe zostały zweryfikowane i zatwierdzone w badaniach klinicznych. OGRANICZENIA PROCEDURY 1. Test BD ProbeTec ET CF Assay jest specyficzny dla rodziny Chlamydiaceae, ale nie określa szczegółowo jej przedstawicieli (tj. C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. abortus, C. percorum, C. caviae, C. pneumoniae, C. felis, oraz C. psittaci). 2. Test BD ProbeTec ET CF Assay został zbadany jedynie dla wymazów z gardła (z podłożem lub bez podłoża transportowego 2SP). Nie oceniano skuteczności działania testu w badaniu innych typów próbek. 3. Test BD ProbeTec ET CF Assay został zbadany jedynie dla pacjentów powyżej pierwszego roku życia. 4. Podobnie jak w przypadku innych testów diagnostycznych, także wyniki oznaczenia BD ProbeTec ET CF Assay należy interpretować łącznie z innymi danymi laboratoryjnymi i klinicznymi dostępnymi dla lekarza. Pozytywny wynik niniejszego testu wraz z innymi objawami klinicznymi i diagnostycznymi dowodami na obecność zapalenia płuc wskazuje na zapalenie płuc wywołane bakteriami z rodziny Chlamydiaceae. 5. Wynik negatywny nie wyklucza rozpoznania zapalenia płuc wywołanego bakteriami z rodziny Chlamydiaceae, ponieważ może on być spowodowany nieprawidłowym pobraniem próbki, błędem technicznym, pomyleniem próbki, jednoczesnym stosowaniem antybiotykoterapii lub obecnością materiału DNA rodziny Chlamydiaceae w ilości mniejszej niż wynosi czułość analityczna testu. Dlatego zaleca się zastosowanie dodatkowych metod diagnostycznych, rekomendowanych w opublikowanych wytycznych 9, takich jak hodowla, metody serologiczne i/lub atestowany test amplifikacji kwasów nukleinowych. 6. Test BD ProbeTec ET CF Assay nie może być stosowany w celu kontroli skuteczności terapii przeciwbakteryjnej, ponieważ nawet po zastosowaniu skutecznego leczenia materiał DNA bakterii z rodziny Chlamydiaceae może być wykrywany. 7. Osiągnięcie optymalnej wydajności oznaczenia wymaga odpowiedniego pobierania i obchodzenia się z próbką. 8. Test BD ProbeTec ET CF Assay może być wykonywany jedynie przez personel przeszkolony w zakresie procedury oznaczenia i systemu BD ProbeTec ET. 9. Test BD ProbeTec ET CF Assay dostarcza wyników jakościowych. Nie istnieje związek pomiędzy wielkością wyniku PAT a znajdującą się próbce ilością materiału DNA pochodzącego od bakterii rodziny Chlamydiaceae. OCZEKIWANE WYNIKI A: Chorobowość Liczba wyników pozytywnych obserwowana w testach w kierunku bakterii Chlamydiaceae różni się w zależności od zastosowanej metody, wieku pacjenta, ukrytych czynników ryzyka, lokalizacji geograficznej oraz, co najważniejsze, chorobowości na danym obszarze. B: Rozkład częstości punktacji PAT Badanie prospektywne Uwaga: Wszystkie wyniki testu BD ProbeTec ET CF Assay zostały porównane z wynikami hodowli wymazów z gardła na podłożu transportowym 2SP. W celu uzyskania szczegółowego opisu planu badania klinicznego zob. rozdział Charakterystyka wydajnościowa. Do badania nad testem BD ProbeTec ET CF Assay zebrano 354 wymazy z gardła (przechowywane bez podłoża transportowego), uzyskane od 354 pacjentów, z siedmiu ośrodków klinicznych w Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej i Kanady. Rysunek 1 przedstawia rozkład częstości początkowej punktacji CF PAT w porównaniu z wynikami hodowli. Siedemdziesiąt pięć z pośród wymazów z gardła zostało pobranych prospektywnie i posianych na podłożu transportowym 2SP w celu jednoczesnego zastosowania testów hodowli oraz testu BD ProbeTec ET CF Assay. Rysunek 2 przedstawia rozkład częstości początkowej punktacji CF PAT w porównaniu z wynikami hodowli. Badanie retrospektywne Dwadzieścia pięć pobranych retrospektywnie wymazów z gardła na podłożu transportowym 2SP i przechowanych w zamrażarce zostało przetestowanych testem BD ProbeTec ET CF Assay w europejskich ośrodkach klinicznych. Rysunek 3 przedstawia rozkład częstości początkowej punktacji CF PAT w porównaniu z wynikami oryginalnej hodowli. Rozkład częstości początkowej punktacji CF PAT w porównaniu z oryginalnymi wynikami PCR tych samych próbek przedstawia Rysunek 4. 11

Rysunek 1: Rozkład częstości punktacji CF PAT Porównanie wyników wymazów z gardła pobranych prospektywnie (bez podłoża transportowego) z wynikami hodowli Czêstoœæ 4 35 3 25 2 15 1 5 35 (-) (+) 3 1-19 2-39 4-6 Punktacja PAT CF 1 Hodowla Hodowla + Wynik hodowl 1-19 2-39 4-6 Razem Negatywny 35 1 351 Pozytywny 3 3 Razem 353 1 354 Rysunek 2: Rozkład częstości punktacji CF PAT Porównanie wyników wymazów z gardła pobranych prospektywnie (podłoże 2SP) z wynikami hodowli 8 7 71 6 Czêstoœæ 5 4 3 (-) (+) Hodowla Hodowla + 2 1 3 1 Punktacja PAT CF Wynik hodowl 1-19 2-39 4-6 Razem Negatywny 71 1 72 Pozytywny 3 3 Razem 74 1 75 12

Rysunek 3: Rozkład częstości punktacji CF PAT Porównanie wyników wymazów z gardła pobranych retrospektywnie (podłoże 2SP) z wynikami hodowli (podłoże 2SP) 3.5 3 3 2.5 Czêstoœæ 2 1.5 1 (-) (+) 1 Hodowla Hodowla +.5 1-19 2-39 4-6 Punktacja PAT CF Wynik hodowl 1-19 2-39 4-6 Razem Negatywny Pozytywny 1 3 4 Razem 1 3 4 Rysunek 4: Rozkład częstości punktacji CF PAT Porównanie wyników wymazów z gardła pobranych retrospektywnie (podłoże 2SP) z wynikami PCR (podłoże 2SP) Czêstoœæ 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 3 9 9 (-) (+) 4 1-19 2-39 4-6 Punktacja PAT CF Hodowla Hodowla + Wynik PCR 1-19 2-39 4-6 Razem Negatywny Pozytywny 3 4 Razem 7 9 9 25 9 9 3 22 13

C. Próbki kontrolne Podczas badania klinicznego wszystkie z 45 cykli zostały przeprowadzone przy użyciu próbek kontrolnych Respiratory and media controls (CF/LP/MP). Wszystkie cykle uzyskały zadowalające wyniki kontroli. Wszystkie z 78 cykli zostały przeprowadzone przy użyciu próbek kontrolnych wymazów (tcf/tmp). Dwa cykle wykazały błąd kontroli. Jeden z nich był spowodowany błędem procedury, dla drugiego nie ustalono konkretnej przyczyny. Punktacja PAT dla próbek kontrolnych CF/LP/MP oraz tcf/tmp została podsumowana odpowiednio w tabelach 1 i 2 Tabela 1: Podsumowanie punktacji PAT CF dla próbek kontrolnych Respiratory and Media (CF/LP/MP) Kontrola N Zakres 5 percentyl Średnia Mediana 95 percentyl Negatywny CF 45 - Pozytywny CF 45 39,5-52,3 41,4 49,6 51 52,3 Tabela 2: Podsumowanie punktacji PAT CF dla próbek kontrolnych wymazów (tcf/tmp) Kontrola N Zakres 5 percentyl Średnia Mediana 95 percentyl Negatywny CF 77 - Pozytywny CF 76 28,3-52,7 48,5 51,1 51,8 52,5 CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCIOWA Badanie prospektywne Test BD ProbeTec ET CF Assay został poddany badaniu prospektywnie w siedmiu ośrodkach klinicznych w Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej i Kanadzie, w latach 22 23 w okresie zwiększonej zapadalności na choroby układu oddechowego. Wymazy z gardła (CultureSwab EZ przechowywane bez podłoża transportowego) zostały pobrane i przetestowane przy użyciu testu BD ProbeTec ET CF Assay. Jeden wymaz (na poliestrowej wymazówce) został pobrany i zawieszony na podłożu transportowym 2SP (fosforan sacharozy) w celu wykonania testu hodowli, drugi zaś w buforze Tris-EDTA (TE) w celu wykonania testów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Dlatego też wyniki testu BD ProbeTec ET CF Assay uzyskane ze wszystkich prospektywnie pobranych próbek zostały porównane z wynikami hodowli na podłożu 2SP materiału z wymazów z gardła. Jeden z siedmiu centralnych ośrodków klinicznych przeprowadził wszystkie referencyjne testy hodowli Chlamydiaceae. Wykrycie obecności co najmniej jednego ciałka wtrętowego, po wykonaniu barwienia przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla rodzaju Chlamydiaceae, było traktowane jako pozytywny wykładnik obecności w badanej próbce bakterii z rodziny Chlamydiaceae. Wykrycie obecności co najmniej jednego ciałka wtrętowego, po wykonaniu barwienia przy użyciu sprzężonych z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla gatunku C. pneumoniae, było traktowane jako pozytywny wykładnik obecności w badanej próbce bakterii z gatunku C. pneumoniae. Jeden z siedmiu centralnych ośrodków klinicznych przeprowadził wszystkie testy PCR w pobranych prospektywnie próbkach. Reakcja PCR została przeprowadzona w przypadku wymazów z gardła zawieszonych w buforze TE, pochodzących od wszystkich pacjentów, u których w teście BD ProbeTec ET CF Assay uzyskano wynik pozytywny, a także części próbek z wynikiem negatywnym oraz wszystkich próbek z wynikami rozbieżnymi (tj. próbki z rozbieżnymi wynikami między testem BD ProbeTec ET CF Assay a metodą referencyjną). Test PCR jest specyficzny dla gatunku C. pneumoniae, a zarazem jest jednym z czterech opublikowanych protokołów, które spełniają optymalne kryteria walidacji testu PCR. 3,9 Wszystkie spośród 354 wymazów z gardła (przechowywanych bez podłoża transportowego) zostały pobrane od pacjentów spełniających kryteria włączenia do badania (tj. dowody radiologiczne zapalenia płuc, wiek powyżej 1 r. ż., czas trwania antybiotykoterapii 14 dni, pobranie prawidłowych rodzajów próbek, właściwe przeprowadzenie metod referencyjnych itp.). W celu oszacowania charakterystyki wydajnościowej testu BD ProbeTec ET CF Assay wszystkie wyniki wymazów z gardła (bez podłoża transportowego) zostały porównane z wynikami hodowli równoległych wymazów z gardła na podłożu 2SP. Próbkę uznawano za pozytywną w przypadku pozytywnego wyniku hodowli. Próbkę uznawano za negatywną w przypadku negatywnego wyniku hodowli. W tabeli 3 zestawiono wyniki wymazów z gardła (bez podłoża transportowego). Nie uzyskano wyników nieokreślonych. 14

Tabela 3: Porównanie wyników testu BD ProbeTec ET CF Assay wymazów z gardła pobranych prospektywnie (bez podłoża transportowego) z wynikami hodowli Hodowla Ośrodek Wynik Cf Pozytywny Negatywny Razem Czułość (95% CI) 1 Pozytywny Negatywny 2 a 89 91 Razem 2 89 91 % (/2) (% - 84,2%) 2 Pozytywny Negatywny 26 26 Swoistość (95% CI) 1% (89/89) (95,9% - 1%) Razem 26 26 n. d. 1% (26/26) (86,8% - 1%) 3 Pozytywny 1 b 1 Negatywny 97 97 Razem 98 98 n. d. 99% (97/98) (94,4% - 1%) 4 Pozytywny Negatywny 24 24 Razem 24 24 n. d. 1% (24/24) (85,8% - 1%) 6 Pozytywny Negatywny 34 34 Razem 34 34 n. d. 1% (34/34) (89,7% - 1%) 7 Pozytywny Negatywny 1 c 8 81 Razem 1 8 81 % (/1) (% - 97,5%) 1% (8/8) (95,5% - 1%) W sumie Pozytywny 1 1 Negatywny 3 35 353 Razem 3 351 354 % (/3) (% - 7,8%) 99,7% (35/351) (98,4% - 1%) a Wyniki hodowli obu próbek wykazały stopień wzrostu na 1+ (1 ciałko wtrętowe na studzienkę lub 5 ciałek wtrętowych na ml podłoża 2SP). Wyniki testu PCR dla obu próbek były negatywne. b Wynik testu PCR był pozytywny. c Hodowla wykazała stopień wzrostu na 2+ (72 ciałka wtrętowe na studzienkę lub 36 ciałek wtrętowych na ml podłoża 2SP). Wyniki testów PCR dla obu próbek były negatywne. n. d. = nie dotyczy UWAGA: Test PCR jest specyficzny dla gatunku C. pneumoniae, a zarazem jest jednym z czterech opublikowanych protokołów, które spełniają kryteria walidacyjne testu PCR. 3,9 Siedemdziesiąt pięć z pośród wymazów z gardła (posianych na podłożu 2SP) zostało pobranych prospektywnie i posianych na podłożu transportowym 2SP, w celu jednoczesnego zastosowania testów hodowli oraz testu BD ProbeTec ET CF Assay. Wyniki wymazów z gardła posianych na podłożu 2SP zostały porównane z wynikami hodowli pochodzących z tych samych próbek. Próbkę uznawano za pozytywną w przypadku pozytywnego wyniku hodowli. Próbkę uznawano za negatywną w przypadku negatywnego wyniku hodowli. W tabeli 4 zestawiono wyniki wymazów z gardła przechowywanych na podłożu transportowym 2SP. Nie uzyskano wyników nieokreślonych. 15

Tabela 4: Porównanie wyników testu BD ProbeTec ET CF Assay wymazów z gardła pobranych prospektywnie (podłoże 2SP) z wynikami hodowli Hodowla Ośrodek Wynik Cf Pozytywny Negatywny Razem Czułość (95% CI) 2 Pozytywny Negatywny 1 a 36 37 Razem 1 36 37 % (/1) (% - 97,5%) 3 Pozytywny 1 c 1 Negatywny 2 b 35 37 Razem 2 36 38 % (/2) (% - 84,2%) Swoistość (95% CI) 1% (36/36) (9,3% - 1%) 97,2% (35/36) (85,5% - 99,9%) W sumie Pozytywny 1 1 Negatywny 3 71 74 Razem 3 72 75 % (/3) (% - 7,8%) 98,6% (71/72) (92,5% - 1%) a Hodowla wykazała stopień wzrostu na 2+ (72 ciałka wtrętowe na studzienkę lub 36 ciałek wtrętowych na ml podłoża 2SP). Wynik testu PCR dla obu próbek był negatywny. b Wyniki hodowli obu próbek wykazały stopień wzrostu na 1+ (1 ciałko wtrętowe na studzienkę lub 5 ciałek wtrętowych na ml podłoża 2SP). Wynik testu PCR dla obu próbek był negatywny. c Wynik testu PCR dla obu próbek był negatywny. UWAGA: Test wykorzystujący metodę PCR jest specyficzny dla gatunku C. pneumoniae, a zarazem jest jednym z czterech opublikowanych protokołów, które spełniają optymalne kryteria walidacji testu PCR. 3,9 Jeden wymaz z gardła pobrany od każdego pacjenta objętego badaniem prospektywnym, dotyczącym testu BD ProbeTec ET CF Assay, został zawieszony w buforze Tris-EDTA w celu wykonania testu PCR. Wszystkie próbki z wynikami pozytywnymi sprzecznymi (pozytywny wynik testu BD ProbeTec ET CF Assay i negatywny wynik hodowli lub odwrotnie) oraz około 1% jednoznacznie negatywnych zostało przetestowanych za pomocą zatwierdzonej metody PCR specyficznej dla C. pneumoniae. Wszystkie testy PCR zostały przeprowadzone w jednym ośrodku klinicznym. Próbki wszystkich z pośród 27 pacjentów zostały przebadane testem PCR C. pneumoniae (tj. 21 pacjentów ze zgodnymi wynikami negatywnymi oraz 6 pacjentów ze sprzecznymi wynikami). W tabeli 5 znajduje się zestawienie całościowe połączenia wyników hodowli, testu BD ProbeTec ET CF Assay oraz PCR. Tabela 5: Zestawienie prospektywnych metod badania pacjenta i wyniki testu BD ProbeTec ET CF Assay Wynik hodowli Wyniki testu BD ProbeTec ET CF Assay Wymaz z gardła Podłoże 2SP Wynik PCR c Liczba pacjentów + a - - - 3 Niezgodny b + n. d. + 1 - + + + 1 - - - - 5 - - - n. d. 65 - - n. d. - 17 - - n. d. n. d. 263 - n. d. - n. d. 1 16

Legenda: n. d. = nie dotyczy + oznacza wynik pozytywny oznacza wynik negatywny a Dwie hodowle wykazały stopień wzrostu na 1+ (1 ciałko wtrętowe na studzienkę lub 5 ciałek wtrętowych na ml podłoża 2SP). Jedna hodowla wykazała stopień wzrostu na 2+ (72 ciałka wtrętowe na studzienkę lub 36 ciałek wtrętowych na ml podłoża 2SP). b Próbka została dostarczona do miejsca wykonania testu w postaci rozmrożonej. Mimo to próbka została poddana testowi z wynikiem negatywnym. Z powodu niedoskonałości próbki wynik hodowli nie został włączony do szacowania charakterystyki wydajnościowej testu BD ProbeTec ET CF Assay. c Test wykorzystujący metodę PCR jest specyficzny dla gatunku C. pneumoniae, a zarazem jest jednym z czterech opublikowanych protokołów, które spełniają optymalne kryteria walidacji testu PCR. 3,9 Badanie retrospektywne Z powodu niewielkiej liczby próbek z wynikiem pozytywnym występujących w badaniu prospektywnym, firma BD znalazła miejsce w Europie, posiadające 25 próbek wymazów z gardła posianych i przechowywanych na podłożu transportowym 2SP w postaci zamrożonej. Wspomniane próbki pobrane retrospektywnie były przechowywane w postaci zamrożonej przez okres do ośmiu lat, z których większość (84%, 21/25) przechowywano nie dłużej niż sześć lat. 25 retrospektywnych próbek zostało ocenionych w połączeniu metod hodowli i PCR lub tylko PCR. Wszystkie 25 próbek uzyskało wyniki testu PCR (22 pozytywne, trzy negatywne). Spośród 22 próbek z pozytywnym wynikiem testu PCR jedynie cztery uzyskały pozytywny wynik w hodowli C. pneumoniae. W przypadku jednej z pozostałych 18 próbek z wynikiem pozytywnym testu PCR nie przeprowadzono testu hodowli. Próbkę uznawano za pozytywną zarówno w przypadku pozytywnego wyniku hodowli, jak i testu PCR. Próbkę uznawano za negatywną w przypadku negatywnego wyniku testu PCR. Oczekiwany odsetek zgodności testu BD ProbeTec ET CF wymazów z gardła, przechowywanych na podłożu transportowym 2SP w porównaniu z dostępnymi wynikami hodowli i/lub PCR, został zestawiony w Tabeli 6. W porównaniu z hodowlą, odsetek zgodności wyników pozytywnych wyniósł 1% (4/4). Odsetek zgodności wyników pozytywnych, negatywnych oraz obu łącznie, w porównaniu z testem PCR wyniósł odpowiednio: 81,8% (18/22), 1% (3/3) oraz 84% (21/25). Tabela 6: Wyniki testu BD ProbeTec ET CF Assay retrospektywnych wymazów z gardła (na podłożu 2SP) w porównaniu z wynikami hodowli (na podłożu 2SP) i/lub testu PCR (podłoże 2SP). Hodowla i/lub PCR Oczekiwany odsetek zgodności (95% CI) Ośrodek Wynik CF Pozytywny Negatywny Razem Pozytywny Negatywny W sumie DAN 8 Pozytywny 18 a,b 18 Negatywny 4 c 3 d 7 Razem 22 3 25 81,8% (18/22) (59,7% - 94,8%) 1% (3/3) (29,2% - 1%) 84% (21/25) (63,9% - 95,5%) a Wyniki 4 z 18 próbek poddanych hodowli C. pneumoniae zostały określone jako pozytywne. b Wyniki 18 próbek poddanych PCR zostały określone jako pozytywne, w tym w dwóch przypadkach zidentyfikowano DNA gatunku C. psittaci, a w 16 C. pneumoniae. c Cztery próbki określono jako pozytywne dla gatunku C. pneumoniae w teście PCR. d Trzy próbki określono jako negatywne na podstawie testu PCR, zarówno w kierunku obu gatunków rodziny Chlamydiaceae, jak i w teście PCR specyficznym dla C. pneumoniae. Hodowla nie została przeprowadzona. Badania analityczne W celu przeprowadzenia reakcji amplifikacji za pomocą testu BD ProbeTec ET CF Assay potrzeba 1 µl badanej próbki. Czułość analityczna Czułość analityczna testu BD ProbeTec ET CF Assay została określona na podstawie testów przeprowadzonych na reprezentacyjnym panelu mikroorganizmów, należących do rodziny Chlamydiaceae, zawierających gatunki: Chlamydophila pneumoniae (16 odmian), Chlamydia trachomatis (15 serotypów), Chlamydophila psittaci (6 odmian) oraz C. muridarum (1 odmiana). Dla każdego organizmu, z wyjątkiem serotypów E i F C. trachomatis, zawiesiny bakteryjne zostały rozcieńczone do poziomów, 6, 9 i 12 ciałek elementarnych (Elementary Bodies, EB) na reakcję. Serotypy E i F C. trachomatis zostały przebadane w rozcieńczeniach, 6, 12 i 18 EB/na reakcję. W celu przeprowadzenia badania na bazie próbek klinicznych lub podłoża transportowego, jako reprezentanta organizmów z rodziny Chlamydiaceae wybrano C. pneumoniae ATCC, odmiana AR39. 17

Czułość analityczna testu BD ProbeTec ET CF Assay w obecności macierzy próbki wymazu z gardła została określona za pomocą posiewu wymazów z 2 µl rozcieńczalnika C. pneumoniae AR39, dodanego w celu uzyskania rozcieńczeń, 3, 6 i 9 EB na reakcję. Czułość analityczna testu BD ProbeTec ET CF Assay w obecności podłoża transportowego 2SP została określona za pomocą posiewu podłoża 2SP z rozcieńczonym C. pneumoniae AR39 w celu uzyskania rozcieńczeń, 9, 12, 2, 4 i 6 EB na reakcję. Wszystkie próbki zostały przetworzone i poddane testowi trzykrotnie. W oparciu jedynie o wyniki pozytywne, czułość analityczna w stosunku różnych mikroorganizmów i macierzy próbek została zestawiona w Tabeli 7. Aktualna granica wykrywalności (Limit of Detection, LOD) może być niższa od najniższego testowanego poziomu. Tabela 7: Test BD ProbeTec ET CF Assay Czułość analityczna w stosunku do różnych szczepów* Drobnoustrój Czułość analityczna (EB/reakcję) C. pneumoniae (16 odmian) 6 C. trachomatis serowar. B, Ba, C, D, I, LGV-1, LGV-2, LGV-3 C. trachomatis serowar. A 9 C. trachomatis serowar. G 12 C. trachomatis serowar. H, J, K 15 C. trachomatis serowar. E i F odpowiednio 12 i 25 C. psittaci (6 odmian) 6 (5 odmian) i 12 (1 odmiana) C. muridarum (1 odmiana) 6 Przetwarzane wymazy z gardła 3 Podłoże transportowe 2SP 9 * Jeżeli nie określono inaczej, granica wykrywalności (LOD) odpowiada medianie wszystkich testowanych odmian i serotypów. Swoistość analityczna Wszystkie spośród 18 mikroorganizmów (86 bakterii, siedem grzybów, 14 wirusów i jeden parazyt) zostały przetestowane za pomocą testu BD ProbeTec ET CF Assay. Izolaty bakterii zostały przetestowane w stężeniach sięgających od 1,17 x 1 7 do 3,7 x 1 9 CFU/mL lub komórek/ml, z wyjątkiem Coccidioides immitis oraz Haemophilus ducrei, które były testowane przy użyciu zawiesin bakteryjnych odpowiadających odpowiednio wartościom 5 i 2 według standardu McFarlanda. Wirusy były badane w stężeniu 1 x 1 6 cząsteczek wirusa/ml, a Trichomonas vaginalis w stężeniu 4,6 x 1 6 komórek/ml. Genomowe DNA lub RNA badano dla czterech wirusów w stężeniu 1 x 1 6 genomów/ml. Żaden z badanych mikroorganizmów nie wykazał wyniku pozytywnego ani nie hamował wewnętrznej kontroli amplifikacji (IAC) (Tabela 8). 6 18

Tabela 8: Test BD ProbeTec ET CF Assay Swoistość analityczna Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter lwoffii Haemophilus parainfluenzae Herpes simplex virus-1 Peptostreptococcus asaccharolyticus Actinomyces israelii Herpes simplex virus-2 Peptostreptococcus productus Adenovirus-5 Histoplasma capsulatum Plesiomonas shigelloides Aeromonas hydrophila HIV-I, Clade B Porphyromonas asaccharolytica Alcaligenes faecalis HPV, typ 16 Prevotella melaninogenicus Bacillus subtilis HPV, typ 18 Prevotella oralis Bacteroides fragilis Wirus Influenza typ A Propionibacterium acnes Blastomyces dermatitidis Wirus Influenza typ B Proteus mirabilis Bordetella bronchiseptica Kingella kingae Providencia stuartii Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella catarrhalis Candida albicans Candida glabrata Candida tropicalis Citrobacter freundii Clostridium perfringens Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae typ 4 Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Pseudomonas aeruginosa Syncytialny wirus oddechowy, odmiana długa Rinowirus Salmonella choleraesuis serotyp Enteritidis Salmonella choleraesuis serotyp Typhi Coccidioides immitis Mobiluncus mulierieris Salmonella Minnesota Corynebacterium diphtheriae Moraxella lacunata Salmonella typhimurium Corynebacterium jeikeium Moraxella osloensis Serratia marcescens Corynebacterium renale Cryptococcus neoformans Cytomegalowirus Edwardsiella tarda Morganella morganii Mycobacterium avium Mycobacterium gordonae Mycobacterium kansasii Staphylococcus aureus, szczep wytwarzający białko A Staphylococcus aureus, szczep niewytwarzający białka A Eikenella corrodens Mycobacterium intracellulare Staphylococcus epidermidis Enterobacter aerogenes Mycobacterium smegmatis Stenotrophomonas maltophilia Enterobacter cloacae Mycobacterium tuberculosis Streptococcus, grupa B Enterococcus faecalis Mycoplasma genitalium Streptococcus mitis Enterococcus faecium Mycoplasma hominis, typ 1 Streptococcus mutans Enterovirus (Echovirus) Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Wirus Epsteina-Barr Neisseria cinerea Streptococcus pyogenes Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Streptomyces griseus Flavobacterium meningosepticum Neisseria meningitidis Tatlockia (Legionella) micdadei Fusobacterium nucleatum Neisseria mucosa Trichomonas vaginalis Gardnerella vaginalis Neisseria polysaccharea Ureaplasma urealyticum Gemella haemolysans Wirus parainfluenza I Veillonella parvula Haemophilus ducreyi Peptostreptococcus anaerobius Vibrio parahaemolyticus Haemophilus influenzae Yersinia enterocolitica 19

Substancje zakłócające Substancje potencjalnie zakłócające, mogące występować w próbkach wymazów z gardła, zostały zbadane przy zastosowaniu testu BD ProbeTec ET CF Assay przy braku materiału docelowego i z jego zawartością równą 15 ciałek elementarnych (EB)/reakcję C. pneumoniae ATCC odmiana AR39. Przy braku materiału docelowego żadna z badanych substancji, w stężeniach wymienionych w Tabeli 9, nie dała wyniku pozytywnego ani nie spowodowała zahamowania IAC. W przypadku obecności materiału docelowego w stężeniu wymienionym w Tabeli 9 wszystkie badane próbki dały wynik pozytywny. Tabela 9: Test BD ProbeTec ET CF Assay Substancje potencjalnie zakłócające Próbki wymazów z gardła Badane substancje Stężenie w próbce Syrop na kaszel Robitussin DM 25% Triaminic (gronowy) 25% Spray do nosa (mieszanina) Vicks Sinex 1% Neo-Synephrine (zwykłej mocy) 1% Spray do gardła Cepacol (miętowy) 25% Vicks Chloraseptic (wiśniowy) 25% Płyn do płukania jamy ustnej Scope (miętowy) 25% Listerine (oryginalny) 25% Pastylki na kaszel Halls Sugar Free Citrus Blend 25% Cold-Eeze Zinc 25% Drobnoustroje Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae i Legionella pneumophila 1 7 komórek/ml 1 7 CFU/mL odpowiednio 1 7 komórek/ml oraz 1 7 CFU/mL Badanie próbek W celu uzupełnienia liczby próbek z wynikiem pozytywnym występujących w badaniu klinicznym, do 25 wymazów z gardła dodano 5 x 1 4 EB/mf C. pneumoniae (próbki pozytywne). Podobnie, aby naśladować wymazy z gardła z wynikiem negatywnym pod względem bakterii Chlamydiaceae, do 5 wymazów dodano zawiesinę bakteryjną, zawierającą jedynie bakterie L. pneumophila oraz M. pneumoniae. Wszystkie próbki zbadano za pomocą testu BD ProbeTec ET CF Assay. Wyniki zestawiono w Tabeli 1. Całkowita dokładność wyniosła 98,7% (74/75). Tabela 1: Test BD ProbeTec ET CF Assay Wyniki uzupełnionych próbek wymazów z gardła Dodany poziom Pozytywny Negatywny Razem Wyniki testu BD ProbeTec ET CF Assay Pozytywny 25 1* 26 Negatywny 49 49* Razem 25 5 75 *Początkowo fałszywie pozytywne, powtórzono za pomocą testu BD ProbeTec ET CF Assay, wynik negatywny 2