PL 217144 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217144 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391926 (22) Data zgłoszenia: 23.07.2010 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) (54) Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE, Lublin, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 30.01.2012 BUP 03/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.06.2014 WUP 06/14 (72) Twórca(y) wynalazku: RADOSŁAW LESZEK MLAK, Kraśnik, PL PAWEŁ KRAWCZYK, Lublin, PL KAMILA WOJAS-KRAWCZYK, Lublin, PL JUSTYNA EMERYK-MAKSYMIUK, Lublin, PL JANUSZ MILANOWSKI, Lublin, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Bełz
2 PL 217 144 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób amplifikacji DNA w multipleks PCR za pomocą mieszaniny starterów specyficznych dla genu receptora β2-adrenergicznego (ADRB2). Sekwencja nukleotydowa oznacza następujące po sobie kolejno (w orientacji 5' 3') zasady azotowe (puryny i pirymidyny) gdzie A oznacza adeninę, T tyminę, G guaninę, C cytozynę. Choroby takie jak: przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), astma oskrzelowa (AO) czy alergiczny nieżyt nosa (ANN) należą obecnie do najczęściej występujących schorzeń państw uprzemysłowionych. Szacuje się, że liczba nowych zachorowań na POChP kształtuje się na poziomie 10-20% ogółu populacji. Występuje znacznie częściej u osób po 40 roku życia. Gwałtowny wzrost zachorowań na astmę w ostatnich 15 latach spowodował, że w dużych aglomeracjach miejskich ok. 10 procent populacji zgłasza się do lekarza z objawami tej choroby. Czyni to z AO jedną z najczęstszych chorób przewlekłych, z jakimi styka się lekarz pierwszego kontaktu. Niestety badania epidemiologiczne ostatnich lat potwierdzają gwałtowny wzrost zachorowań na wymienione wyżej schorzenia we wszystkich grupach wiekowych. Z farmakogenetycznego i klinicznego punktu widzenia najistotniejsze a zarazem najczęściej występujące są 2 polimorfizmy. Pierwszy z nich dotyczy pozycji aminokwasowej 16 (zamiana Arg/Gly wywołana zmianą w kodonie 16 GGA GGG), drugi pozycji aminokwasowej 27 (zamiana Gln/Glu wywołana zmianą w kodonie 27 GAA CAA). Obecnie coraz większa grupa badaczy wskazuje na możliwą rolę polimorfizmów genu w kształtowaniu się obrazu klinicznego wielu schorzeń układu oddechowego tj. POCHP, AO, ANN jak również w odpowiedzi na stosowane w leczeniu β-mimetyki. Hall i wsp. wykazali istnienie zależności pomiędzy zmniejszoną reaktywnością dróg oddechowych na pochodne choliny (m in. metacholinę) a występowaniem allelu Glu27 w genie ADRB2 u osób chorych na AO. Ramsey i wsp. wykazali ponadto związek pomiędzy występowaniem allelu Arg16 i zwiększoną podatnością na skurcz oskrzeli w przebiegu infekcji dróg oddechowych. Tan i wsp. donieśli o możliwej zależności pomiędzy ekspresją receptora β 2 -adrenergicznego u chorych na AO a obecnością poszczególnych polimorfizmów genu ADRB2. Następstwem czego jest obniżenie wrażliwości na bronchodilację po uprzedniej ekspozycji na β2-sympatykomimetyki. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest powszechnie znaną, podstawową techniką badawczą i diagnostyczną w biologii molekularnej i medycynie. Umożliwia ona amplifikację wybranego fragmentu DNA, zazwyczaj w celu otrzymania żądanej ilości kopii matrycy. Dzięki technice PCR dysponowanie niewielkimi ilościami DNA nie stanowi obecnie bariery w badaniach w dziedzinie biologii molekularnej oraz w procedurach diagnostycznych opartych na analizie DNA. Znane są również sposoby amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) za pomocą starterów specyficznych dla genu ADRB2. Znane są również w literaturze patentowej sposoby amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora β2-adrenergicznego. Sposób amplifikacji DNA znany jest m.in. z patentu amerykańskiego US1294937, przy czym sposób opisany w patencie jest kilkuetapowy i kosztowny, gdyż metoda ta wymaga przyłączenia odpowiedniej sondy molekularnej i dopiero po zastosowaniu jej uzyskuje się wynik oznaczenia. Sposób amplifikacji DNA we wspomnianym opisie, jak również w opisie zgłoszenia międzynarodowego WO 2008089397 dotyczy oznaczania ekspresji genu. Zagadnienie allelo specyficznej amplifikacji genu ADRB2 wspomniane było także w zgłoszeniu patentowym US 20090298839, dotyczącym leczenia jaskry. Z publikacji Ning McLaren et al., ARCH. OPHTHAMOL., 2007, vol.125 Evaluation of the β2- -Adrenergic Receptor Gene as a Candidate Glucoma Gene in 2 Ancestral Populations" znane jest wykorzystanie w reakcji PCR dwóch następujących starterów: starter sensowny F16G dla kodonu 16: 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAATG 3' oraz starter sensowny F16A dla kodonu 16 5' GCCTTCT- TGCTGGCACCCAATA 3'. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą mieszaniny starterów specyficznych dla genu ADRB2 według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się łącznie startery posiadające następujące sekwencje nukteotydowe: 1. Starter sensowny F16G dla kodonu 16; 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAATG 3', 2. Starter sensowny F16A dla kodonu 16; 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAATA 3', 3. Starter sensowny F27G dla kodonu 27; 5' GACCACGACGTCACGCAGG 3' 4. Starter sensowny F27C dla kodonu 27; 5' GACCACGACGTCACGCAGC 3'
PL 217 144 B1 3 5. Starter antysensowny R16; 27 (wspólny dla kodonów 16 i 27) 5' AGGCCCATGACCAGATCAGCA 3' Dzięki korzystaniu ze sposobu według wynalazku możliwe jest stosunkowo proste i wydajne otrzymywanie kopii matryc DNA zawierających miejsca przyłączania specyficznych (dla fragmentu genu ADRB2) starterów. Stosowana w sposobie według wynalazku mieszanina starterów może być wykorzystywana, ze względu na swoją efektywność w reakcji PCR jako narzędzie służące do zamplifikowania fragmentów genu czy cdna ADRB2. Przykładem takich zastosowań może być oznaczanie polimorfizmu genu metodą multipleksowego allelospecyficznego PCR, otrzymywanie dużych ilości kopii DNA do sekwencjonowania czy innych analiz, uzyskiwania odcinków DNA mogących służyć jako sondy w metodach hybrydyzacyjnych. Celem uproszczenia w opisie i przykładzie używane są następujące skróty: A - adenina ADRB2 - gen dla receptora β2 adrenergicznego ANN - alergiczny nieżyt nosa AO - astma oskrzelowa C - cytozyna cdna - DNA komplementarne do RNA DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy G - guanina mrna - matrycowy RNA PCR - łańcuchowa reakcja polimerazy PCR multipleks - metoda umożliwiająca amplifikację wielu SNP lub genów podczas jednej reakcji POCHP - przewlekła obturacyjna choroba płuc p.z. - par zasad RNA - kwas rybonukleinowy SNP - polimorfizm pojedynczego nukleotydu T - tymina Wynalazek wyjaśniony jest bliżej w przykładzie, który jednak nie ogranicza jego zakresu. P r z y k ł a d 1. Allelospecyficzna Reakcja multipleks PCR z wykorzystaniem unikalnej mieszaniny starterów do amplifikacji specyficznych regionów DNA wykorzystywanych w oznaczaniu SNP w kodonach 16 i 27 genu ADRB2. W celu przeprowadzenia reakcji niezbędne są: 1) Wyizolowany z krwi lub innego materiału biologicznego DNA. 2) Unikalna mieszanina reakcyjna zawierająca wymienione wyżej startery oraz inne odczynniki chemiczne w odpowiednich proporcjach. 3) Termocykler z możliwością ustawienia optymalnych warunków termicznych. Allelospecyficzną reakcję multipleks PCR w wariancie do oznaczania SNP w kodonach 16 i 27 genu dla ADRB2 według wynalazku prowadzono przy użyciu opisanych wyżej 5 starterów. W opisywanym wynalazku oznaczono 2 polimorfizmy. W probówce PCR 200 μι przygotowano odpowiednią mieszaninę reakcyjną o objętości 25 ul dodając kolejno: bufor Taq (z dodatkiem KCI/ bez MgCl 2 ), mieszaninę nukleotydów (dntp mix), roztwór MgCl 2, termostabilną polimerazę Taq DNA oraz startery: sensowne (F27G, F27C), antysensowny (R27), wyizolowane DNA, w proporcjach podanych w tabeli 1. Następnie przeniesiono mieszaninę do termocyklera i ustawiono program składający się z 6 etapów: wstępnej denaturacji DNA, denaturacji właściwej, przyłączania starterów, wydłużania produktu PCR, końcowego wydłużania produktu PCR, chłodzenia próbki. Reakcja prowadzona jest cyklicznie od etapu właściwej denaturacji do etapu wydłużania produktu PCR 33 razy w warunkach temperaturowych podanych w tabeli 2. Po zakończeniu reakcji otrzymane produkty PCR (kodon 16G/A: 227pz; kodon 27G/C: 194pz) rozdzielono elektroforetycznie w 2% żelu agarozowym. W przypadku obecności danych alleli na elektroforegramie pojawią się prążki o odpowiedniej długości ocenianej względem markera wielkości. Przykładowy rozdział elektroforetyczny produktów allelospecyficznej reakcji PCR multipleks powstałych przy użyciu zaprojektowanych starterów przedstawia rycina 1. W załączonej tabeli 1 przedstawiono proporcje odczynników stosowanych podczas oznaczania polimorfizmów genu ADRB2 w reakcji multipleks PCR, zaś w tabeli 2 warunki temperaturowe prowadzenia reakcji multipleks PCR w wariancie służącym do oznaczania polimorfizmów genu ADRB2.
4 PL 217 144 B1 T a b e l a 1. Proporcje odczynników stosowanych podczas oznaczania polimorfizmów genu ADRB2 w reakcji multipleks PCR. Bufor Taq (10x) Skład mieszaniny reakcyjnej (stężenie) Mieszanina nukleotydów (2 mmol/μl) Jony Mg 2+ (25 mmol/μι) Polimeraza Taq DNA (5U/μl) Starter F16G lub F16A (100 pmol/μι) Starter F27G lub F27C (100 pmol/μι) Starter R16;27 (100 pmol/μι) Woda wolna od nukleaz DNA (20-200 ng/μι) Suma Ilość 3 μι 3 μι 3,6 μι 0,14 μι 0,8 μι 0,8 μl 1,6 μι 10 μι 2,06 μι 25 μι T a b e l a 2. Warunki temperaturowe prowadzenia reakcji multipleks PCR w wariancie przystosowanym do oznaczania polimorfizmów genu ADRB2. (Etapy prowadzone cyklicznie wyróżniono pogrubioną czcionką). Etap Temp. Czas 1. Wstępna denaturacja DNA 96 C 8 min. 2. Właściwa denaturacja DNA 96 C 30 sek. 3. Przyłączanie starterów 60 C 30 sek. 4. Wydłużanie produktu PCR 72 C 45 sek. 5. Końcowe wydłużanie produktu PCR 72 C 12 min. 6. Chłodzenie próbki 4 C Rycina 1. Przykładowy rozdział elektroforetyczny produktów reakcji PCR powstałych przy użyciu zaprojektowanych starterów.
PL 217 144 B1 5 Zastrzeżenie patentowe Sposób amplifikacji DNA w multipleksowej łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą mieszaniny starterów specyficznych dla genu receptora β2 adrenergicznego, znamienny tym, że stosuje się łącznie startery posiadające następujące sekwencje nukleotydowe: 1. Starter sensowny F16G dla kodonu 16; 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAATG 3', 2. Starter sensowny F16A dla kodonu 16; 5' GCCTTCTTGCTGGCACCCAATA 3', 3. Starter sensowny F27G dla kodonu 27; 5' GACCACGACGTCACGCAGG 3' 4. Starter sensowny F27C dla kodonu 27; 5' GACCACGACGTCACGCAGC 3' 5. Starter antysensowny R16;27 (wspólny dla kodonów 16 i 27) 5' AGGCCCATGACCAGATCAGCA 3
6 PL 217 144 B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)