Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o

ĆWICZENIE 2 Oznaczanie polimorfizmu cytochromu CYP2D6 za pomocą tradycyjnych metod biologii molekularnej: PCR-RFLP I. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction) Technika PCR rozwinęła się w drugiej połowie lat 80-tych XX wieku, a jej twórcami są K. Mullis oraz M. Smith, którzy w 1993 roku otrzymali za to Nagrodę Nobla. W ciągu kilku lat metoda ta stała się podstawową techniką naukową. Technika PCR jest teraz jednym z najważniejszych narzędzi w biologii molekularnej. Bardzo ważnym zastosowaniem PCR w diagnostyce jest wykorzystywanie tej techniki do uzyskania zwiększonej ilości DNA przed jego dalszą analizą. Dzięki amplifikacji (powielaniu) wybranych fragmentów DNA i analizie otrzymanego produktu można w krótkim czasie precyzyjnie określić np. pozycję systematyczną oraz filogenetyczną badanego organizmu. Najprostszym zastosowaniem PCR w diagnostyce medycznej jest wykazanie obecności lub nieobecności specyficznego fragmentu DNA. Technika ta doprowadziła do przełomu w diagnostyce klinicznej m. in. ze względu na niewielką wymaganą objętość próbki materiału biologicznego i fakt, że nie wymaga zastosowania radioaktywnych izotopów. Zasada metody Technika łańcuchowej syntezy fragmentów DNA (PCR) pozwala na selektywną amplifikację wybranych regionów DNA w warunkach in vitro poprzez naśladowanie zjawiska replikacji DNA zachodzącego w żywej komórce. Wymaga ona jednoniciowej matrycy DNA, dwóch starterów (sekwencji oligonukleotydów komplementarnych do końców zdefiniowanej sekwencji matrycowego DNA), trifosforanów dezoksynukleozydów (trójfosforanów deoksynukleozydów) dntp oraz enzymu polimerazy DNA. Reakcje łańcuchowej polimerazy (syntezę nowej nici, komplementarnej do matrycy) przeprowadza się w termocyklerach. Zachodzi ona aż do wyczerpania się jednego ze składników reakcji albo przeprowadzenia zaprogramowanej liczby cykli. Syntezę wspomnianych starterów (ang. primer), można zamówić w wyspecjalizowanych firmach biotechnologicznych. Konstrukcja starterów Dwa startery muszą przyłączyć się do matrycy na obu końcach amplifikowanego fragmentu DNA, co oznacza, że aby przygotować odpowiednie startery, konieczna jest znajomość przynajmniej sekwencji flankujących. Samodzielne projektowanie starterów należy zatem rozpocząć od uzyskania z banku genów sekwencji wybranego fragmentu DNA. W wyborze sekwencji powinno się przestrzegać kilku zasad: - startey powinny być komplementarne do sekwencji genomu zlokalizowanych wewnątrz regionów wysoce konserwatywnych nie zawierających SNP i innych polimorfizmów, - starter powinien mieć od 18 do 28 nukleotydów, - stosunek zasad C+G do A+T powinien być jak najbliższy 50%, - odległość pomiędzy końcem startera F a początkiem startera R nie powinna przekraczać 500 nukleotydów, - należy upewnić się, czy nukleotydy starterów nie są do siebie komplementarne,

- nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych, powinny być specyficzne dla pojedynczego locus w rodzinie genów jest to szczególnie istotne w przypadku badań genów CYP 450, które wykazują duży stopień homologii/podobieństwa sekwencji (jeśli uzyskane produkty PCR są niespecyficzne, wybrany fragment uzyskuję się dzięki zmodyfikowanej metodzie PCR, zwanej nested-pcr ). Zawartość par GC powinna stanowić 50-60% całej sekwencji, co ma związek m. in. z temperaturą topnienia T m (melting temperature). T m jest to temperatura, przy której 50% sparowanych zasad w dsdna ulega rozdzieleniu. Poszczególne pary starterów powinny wykazywać podobną T m, mieszczącą się w zakresie 55-72 o C, co zapewnia powstawanie specyficznych produktów PCR. Startery przyłączają się do matrycy na obu końcach amplifikowanego regionu i dają początek syntezie nowego, komplementarnego polinukleotydu, tworzonego w kierunku 5-3 poprzez kopiowanie matrycowego DNA w odwrotnym kierunku (3-5 ). Startery przyłączają się do obu nici, każdy z nich do innej łącznie wyznaczają długość dwuniciowego fragmentu DNA, który będzie amplifikowany. Mieszaninę podgrzewa się do 90 o C w celu oddzielenia nowo powstałych nici od matrycowego DNA. W pierwszym i drugim cyklu reakcji PCR powstają niespecyficzne, długie łańcuchy DNA. W trzecim i następnych cyklach reakcja PCR tworzy łańcuchy specyficzne o długości zdeterminowanej przez startery, a ich ilość przyrasta w postępie geometrycznym. Warunki PCR i przebieg reakcji Do amplifikacji wybranego fragmentu DNA metodą PCR potrzebne są: - jednoniciowa matryca DNA, którą otrzymuje się poprzez denaturacje termiczną dwuniciowego DNA (dsdna), - startery (sekwencje oligonukleotydów komplementarnych do końców zdefiniowanej sekwencji DNA, odpowiadające za rozpoczęcie replikacji), - dntp (trifosforany dezoksynukleozydów), - polimeraza DNA wykorzystuje się wiele wersji tego enzymu; izoluje się go z bakterii termofilnych Thermus aquaticus, dzięki czemu jest on odporny na denaturację w wysokiej temperaturze. Polimerazę, wyizolowaną pierwotnie z Termus aquaticus nazywa się, od nazwy bakterii, polimerazą Taq. Uzyskanie jednoniciowej matrycy DNA, a następnie namnożenie wybranego fragmentu DNA obejmuje 3 etapy (rysunek): 1) denaturację, czyli rozdzielenie podwójnej nici DNA, 2) przyłączanie starterów do miejsca komplementarnego na matrycy DNA (tzw. annealing), 3) wydłużanie startera (elongacja) poprzez dołączanie dntp od końca 3 -OH przez polimerazę DNA. Ad.1 Denaturacja DNA: - wstępna, trwająca 2-5 min w temperaturze 93-95 o C, mająca na celu oczyszczenie preparatu z resztek proteaz i pełną denaturację gebnomowego DNA,

- właściwa, trwająca zazwyczaj 30 s w temperaturze 93/94 o C; czas denaturacji dupleksu DNA zależy od rodzaju probówek i termocyklera oraz od długości amplifikowanych fragmentów (krótsze są denaturowane łatwiej). Ad.2 Przyłączanie starterów do miejsca komplementarnego do matrycy DNA w temp. 37-72 o C przez 20-40 sekund. Zbyt wysoka temperatura uniemożliwia przyłączanie starterów, zbyt niska powoduje przyłączanie niespecyficzne (startery hybrydyzują z wieloma miejscami w genomie o tylko częściowej komplementarności). Temperatura hybrydyzacji jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na swoistość reakcji PCR i zależy głownie od budowy starterów - im więcej par GC w stosunku do par AT, tym temperatura jest wyższa. Innymi czynnikami wpływającymi na temp. przyłączania się starterów to ich długość, skład buforu reakcyjnego (stężenie matrycy i starterów). W praktyce laboratoryjnej najlepiej jest ustalać temperaturę hybrydyzacji doświadczalnie przy użyciu termocyklera z gradientowym blokiem grzewczym. Ad.3 Wydłużanie starterów (elongacja) proces ten katalizowany jest przez polimerazę DNA i przeprowadza się go w temperaturze 72 o C przez 20-40 sekund (zależy od długości amplifikowanych fragmentów). Wydajność syntezy rośnie wraz ze wzrostem temperatury, aż do optimum w 72-75 o C. Optymalna temperatura syntezy produktu zależy od pochodzenia termostabilnej polimerazy. Wszystkie 3 etapy zachodzą cyklicznie przez zaprogramowaną ilość minut, tworząc cykl reakcji. Obejmuje on najczęściej 35 cykli (maksymalnie 40). Ich produktem jest zwiększona ilość cząsteczek DNA, wystarczająca do przeprowadzenia analiz.

Wydłużanie końcowe zwykle po ostatnim cyklu reakcji PCR przeprowadza się przez 5-15 minut inkubację w 72 o C w celu dokończenia niekompletnych syntez i pełnej hybrydyzacji jednoniciowych komplementarnych produktów. Po zakończeniu reakcji PCR próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 o C, aż do czasu użycia ich do dalszej analizy. Skład mieszaniny reakcyjnej - polimeraza DNA wydajność syntezy DNA przez polimerazę zależy od jej stężenia, a ponadto od: temperatury, stężenia jonów Mg 2+, struktury drugorzędowej matrycy i stężenia dntp; szybkość syntezy zależy od temperatury reakcji i czasy półtrwania enzymu w danej temperaturze (zwiększając temperaturę, zmniejsza się czas półtrwania enzymu); dla większości reakcji optymalna ilość polimerazy Taq wynosi 0,5-2,5 jednostki w próbce o objętości 50µl na około 40 cykli; zbyt duże stężenie polimerazy może obniżyć specyficzność reakcji; Ze względu na wrażliwość enzymu na zamrażanie i odmrażanie zaleca się przechowywanie polimerazy w temperaturze -20 o C oraz jej wyjmowanie tylko na czas odpipetowania enzymu. - bufor reakcyjny zapewnia odpowiednie warunki dla działania polimerazy; w jego skład wchodzą: Tris-HCl (o stężeniu 10-50 mm), KCl (o stężeniu ok 50 mm), żelatyna (0,01%), MgCl 2 (o stężeniu 0,5-5 mm czasami bufor nie zawiera MgCl 2, w takich przypadkach jest on dostarczany osobno w zestawie wraz z buforem oraz polimerazą). Jony Mg 2+ wiązane są przez startery, matrycę, polimerazę i dntp i wpływają na aktywność enzymu; dokładność reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów magnezu, a ich stężenie zależy od dntp, PPi (difosforany) i EDTA. - trifosforany dezoksynukleozydów (dntp) stężenie każdego z tych związków (datp, dctp, dgtp, dttp) powinno wynosić w reakcji 20-200 µm (stężenie wyjściowe wynosi 5-10 mm); wymagane jest stosowanie jednakowych stężeń wszystkich nukleotydów; optymalne stężenie dntp zależy od długości amplifikowanego produktu oraz od stężeń jonów Mg 2+ i startera; optimum ph dla dntp wynosi 7,0; przechowuje je się w temperaturze -20 o C. - startery komplementarne do amplifikowanej sekwencji, pojednyczoniciowe, o długości 18-28 nukleotydów; zapewniają specyficzność reakcji PCR; optymalne stężenie wynosi 0,1-1,0 µm (0,1-1,0 pmol/µl) Przygotowanie reakcji PCR obliczenia Do dobrania odpowiedniej ilości składników do reakcji PCR można wykorzystać wzór: gdzie: C 1 V 1 =C 2 V 2 C 1 stężenie (procentowe, molowe) roztworu wyjściowego, V 1 objętość roztworu wyjściowego, C 2 stężenie (procentowe, molowe) roztworu docelowego, V 2 objętość roztworu docelowego.

Przykład: Przygotowanie dntp roztwór wyjściowy: 5 mmol [C 1 ] roztwór docelowy: 200 µmol [C 2 ] objętość docelowa (cała objętość próby): 15 µl [V 2 ] objętość wyjściowa (ile mamy pobrać roztworu, aby uzyskać 200 µmol w objętości 15 µl): X µl [V 1 ] 1 mmol = 1000 µmol, więc -> 5 mmol = 5000 µmol C 1 V 1 =C 2 V 2 5000 µmol X = 200 µmol 15 µl X = 0,6 µl PCR - zapobieganie kontaminacjom (zanieczyszczeniom): - poszczególne etapy analizy: a) przygotowanie próbek DNA, b) przygotowanie mieszaniny reakcyjnej oraz przebieg reakcji PCR, c) analizy produktów reakcji powinny być wykonywane w oddzielnych pomieszczeniach - do każdego etapu reakcji powinno się zakładać nowe rękawiczki - roztwory wykorzystywane do mieszaniny powinny być podzielone na małe porcje i przechowywane w wyznaczonych do tego rejonach zamrażarki - blaty laboratoryjne powinny być utrzymane w czystości oraz okresowo przecierane środkami utleniającymi oraz naświetlane lampami UV (alkohol ma właściwości dezynfekcyjne ale nie niszczy DNA) II. PCR-RFLP Nowe allele pojawiają się w populacji w wyniku rekombinacji i mutacji w komórkach rozrodczych poszczególnych organizmów. Skutkuje to polimorfizmem wielu genów i występowania w puli genowej populacji co najmniej dwóch alleli, każdego z określoną częstością. Występująca w DNA naturalna zmienność nukleotydów nie musi prowadzić do zmian fenotypowych, może być natomiast wykorzystywana jako charakterystyczny marker dla danego DNA. Szacuje się, że ten typ zmienności, czyli tzw. polimorfizm DNA, występuje średnio raz na 100 nukleotydów. W populacji może występować kilka alleli określonego markera. W wykrywaniu zmian polimorficznych DNA najczęściej wykorzystuje się enzymy restrykcyjne. Po rozdziale elektroforetycznym DNA poddanego uprzednio działaniu określonych enzymów restrykcyjnych zmiany te obserwowane są jako charakterystyczny wzór tzw. fragmentów restrykcyjnych, czyli odcinków DNA o różnej długości. Ten typ analizy określany jest jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych DNA lub RFLP (restriction fragment length polymorphism). Ponieważ poszczególne typy restryktaz tną cząsteczki DNA w określonych sekwencjach, to trawienie tej samej cząsteczki

przez ten sam typ restryktaz powinno zawsze dawać ten sam zestaw fragmentów, czyli ten sam wzór restrykcyjny. Uzyskany obraz prążków w żelu po elektroforezie można użyć do identyfikacji poszczególnych osobników. Osobnicze różnice w długości powstających fragmentów restrykcyjnych są wynikiem indywidualnych różnic w liczbie i lokalizacji miejsc przecinanych przez poszczególne enzymy restrykcyjne. Różnice te są wynikiem polimorfizmu DNA i dziedziczą się zgodnie z prawami Mendla. Badanie RFLP znalazło zastosowanie w medycynie sądowej w ustalaniu ojcostwa oraz identyfikacji sprawców przestępstwa. Metodę tę wykorzystuje się również do identyfikacji czynników chorobotwórczych oraz śledzenia sposobu dziedziczenia określonego genu w rodzinie. Na powyższym schemacie cząsteczka DNA po prawej stronie ma polimorficzne miejsce restrykcyjne (oznaczone x), nieobecne w cząsteczce po lewej stronie. W przykładzie tym RFLP ujawnia się po cięciu cząsteczki z prawej strony enzymem restrykcyjnym na cztery fragmenty (restryktaza znalazła 3 miejsca restrykcji). Ta sama restryktaza w cząsteczce z lewej strony znalazła tylko 2 miejsca restrykcji, dlatego ta cząsteczka została rozcięta na 3 fragmenty. Enzymy restrykcyjne Aby móc manipulować cząsteczkami DNA, trzeba przede wszystkim dysponować możliwością ich przecinania. Jest to niezbędne, by np. wyodrębnić interesujący nas odcinek DNA lub podzielić genom danego organizmu. Można tę czynność wykonać za pomocą ultradźwięków, ale jeżeli chcemy przeciąć DNA w ściśle określonym miejscu, stosujemy enzymy restrykcyjne, rozpoznające i przecinające dwuniciowy DNA w obrębie określonej sekwencji nukleotydów. Dzięki enzymom restrykcyjnym można uzyskać powtarzalne fragmenty DNA, potrzebne m.in. do sporządzania map chromosomowych, porównywania DNA różnych osobników, klonowania określonych genów, konstruowania wektorów. W nazwie enzymów restrykcyjnych podaje się pierwszą literę nazwy rodzajowej gatunku bakterii, z której po raz pierwszy wyizolowano enzym, dwie pierwsze litery nazwy gatunkowej, ewentualnie skrót od nazwy serotypu bakterii i kolejny numer enzymu otrzymanego z danego gatunku bakterii (np. HindIII trzeci enzym otrzymany z Haemophilus influenzae, serotyp d). Ważniejsze od numeru i gatunku bakterii jest to, jaką sekwencję i w jakim miejscu dany enzym przecina. Zdarza się, że kilka różnych restryktaz

przecina tę samą sekwencję. Zdarza się także, że rozpoznając tę samą sekwencję, różne enzymy przecinają ją w różnych miejscach. Odcinek DNA rozpoznawany przez restryktazy może być rożnej długości, od 4 nukleotydów (AluI, 5 AG CT3 ) do 32-33 nukleotydów (AloI, 5 N 7 GAACN 6 TCCN 12-13 3 ). Znane są 3 zasadnicze klasy enzymów restrykcyjnych: - klasa I: wymagają ATP, Mg 2+ i adenozyloaminy; przecinają DNA nieswoiście, w miejscach odległych od tej sekwencji; w wyniku trawienia otrzymuje się zbiór heterogennych fragmentów DNA; - klasa II: wymagają jedynie Mg 2+ ; rozpoznają ściśle określone sekwencje dsdna i przecinają cząsteczkę w obrębie tych sekwencji; większość restryktaz z tej klasy przecina obie nici w dwóch różnych miejscach, położonych symetrycznie względem osi symetrii sekwencji, tworząc tzw. końce lepkie (użyteczne w manipulacjach genetycznych); Te enzymy sa najczęściej wykorzystywane w biologii molekularnej. - klasa III: mniej przydatne w biotechnologii, rozpoznają sekwencje nukleotydowe i przecinają nić DNA w sposób przypadkowy, w odległości 400-700 pz od rozpoznanej sekwencji. Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi kompletnie 1µg DNA faga λ (ok. 50kb) w czasie 1h w optymalnej dla enzymu temperaturze, np. 37 C. Obecnie setki oczyszczonych enzymów restrykcyjnych z różnych gatunków oferują firmy biotechnologiczne. III. Elektroforeza DNA Elektroforeza to przemieszczanie się naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym prądu stałego lub zmiennego. Metoda ta jest jedną z głównych metod identyfikacji, rozdzielania i oczyszczania kwasów nukleinowych. Elektroforezę DNA przeprowadza się na żelach agarozowych lub poliakrylamidowych. Żele agarozowe mają mniejszą zdolność rozdzielczą niż poliakrylamidowe, ale pozwalają na rozdział cząsteczek w znacznie większym zakresie wielkości (100-50000 pz). Na szybkość migracji cząsteczek podczas elektroforezy wpływa ich wielkość, kształt i ładunek. Kwasy nukleinowe posiadają ładunek elektryczny ujemny w całym zakresie ph stosowanym w elektroforezie wędrują w kierunku elektrody dodatniej (anody). Przy niskim napięciu, szybkość poruszania się liniowego DNA jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. Elektroforetyczne zachowanie DNA w żelu agarozowym nie zależy od składu zasad i słabo zależy od temperatury, co umożliwia jej przeprowadzanie w temperaturze pokojowej. Do uwidocznienia DNA stosuje się rutynowo bromek etydyny, który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary zasad dwuniciowego DNA. Obecność interkalatora zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA. Uwaga: Bromek etydyny jest praktycznie jedynym odczynnikiem chemicznym stosowanym w biologii molekularnej o potwierdzonej toksyczności i działaniu teratogennym. Kobiety w ciąży nie powinny brać udziału w tym etapie ćwiczenia. Szybkość elektroforetycznej migracji DNA zależy od: - masy cząsteczkowej DNA, - stężenia agarozy, - konformacji DNA, - natężenia pola elektrycznego,

- składu buforu do elektroforezy. Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o Do nanoszenia próbek DNA do studzienek na żelu służą odpowiednie bufory obciążające, które zwiększają gęstość próbek zapewniając dobre umiejscowienie DNA w studzience bez dyfuzji. Dodatkowo, dzięki zabarwieniu próbki, możliwe jest śledzenie rozdziału na żelu. Produkt PCR powinien być widoczny na żelu jako ostry prążek o określonej wielkości. Prążek ten porównuje się z tzw. markerem mas cząsteczkowych (mieszanina kwasów nukleinowych o znanej masie). W przypadku analizowania na żelu produktu PCR powinno się wprowadzić kontrolę pozytywną i negatywną. Kontrola pozytywna zawiera wcześniej syntetyzowany gen - w przypadku PCR-RFLP DNA od pacjenta o znanym, wcześniej określonym genotypie. Kontrola negatywna zawiera wszystkie substraty PCR, z wyjątkiem matrycy. Diagnozowanie błędów elektroforezy agarozowej DNA: widoczne bardzo słabe lub niewidoczne prążki DNA w żelu - niewystarczająca ilość albo stężenie DNA nałożonego na żel- zwiększyć zawartość DNA - DNA zdegradowane- możliwa kontaminacja nukleazami - DNA uciekło z żelu- przeprowadzić elektroforezę ponownie przy krótszym czasie, zastosować niższe napięcie, albo użyć bardziej stężonego żelu - użyć światło UV o krótszej długości fali (254nm), aby znacznie zwiększyć czułość - jeśli chcemy izolować DNA z żelu do dalszych analiz (np. ligacja), zastosować światło UV o długości 315nm (zminimalizowanie degradacji DNA) widoczne niewyraźne rozmazane prążki DNA - DNA zdegradowane- możliwa kontaminacja nukleazami - nałożono za dużo DNA na żel- zmniejszyć ilość DNA - udoskonalić warunki elektroforezy, nie przykładać napięcia powyżej 20V/cm -w czasie elektroforezy utrzymywać temperaturę poniżej 30st C jeśli obserwujemy nieprawidłową migrację prążków - udoskonalić warunki elektroforezy jw. Literatura: Bal J. (red.): Biologia molekularna w medycynie. PWN. Warszawa, 2001. Brown T.A.: Genomy. PWN. Warszawa, 2001. Roberts R.J.: Restriction enzymes and their isozomers. Nucleid Acids Res. 18/2331-2339, 1990. Słomski R. (red.): Przykłady analiz DNA. Akademia Rolnicza w Poznaniu. Poznań, 2004