Streszczenie Rola układu immunologicznego w rozwoju zaburzeń psychicznych jest szczególna. Przekaźnikami układu immunologicznego są cytokiny. Zmiany w poziomie wydzielania cytokin mogą prowadzić do zaburzeń funkcjonowania ośrodkowego układu nerwowego. Celem pracy było porównanie rozkładu alleli i genotypów w grupie osób zdrowych i chorych na schizofrenię paranoidalną, a następnie ocena, czy polimorfizm IL-2 jest czynnikiem ryzyka rozwoju tej choroby. Badania wykonano w dwóch równoległych grupach. Pierwszą stanowili zdrowi ochotnicy (n=59), drugą pacjenci ze schizofrenią paranoidalną (n=61).genomowe DNA było ekstrahowane metodą fenolowo-chloroformową. Polimorfizm IL-2 (T-330G) analizowano przy pomocy metody AS-PCR. Wynik reakcji PCR sprawdzano poprzez przeprowadzenie rozdziału otrzymanych produktów w 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano istnienie asocjacji pomiędzy obecnością genotypów GG i TT, a wystąpieniem schizofrenii. Genotyp TT w promotorze genu IL-2 jest związany z większym ryzykiem wystąpienia schizofrenii, natomiast genotyp GG ze zmniejszonym ryzykiem wystąpienia tej choroby. Poszerzenie obecnych badań w innych ośrodkach badawczych o kolejne grupy chorych jest niezbędne dla właściwej oceny przedstawionych wyników. Osoby o genotypach G/T oraz G/G mają niższe ryzyko wystąpienia schizofrenii w stosunku do osób z genotypem T/T (odpowiednio OR G/T =0,03). Słowa kluczowe: schizofrenia paranoidalna, IL-2, AS- PCR, genotyp, allel, asocjacja Wstęp Termin schizofrenia wprowadził Bleuler w 1911. Od tamtej pory środowisko naukowe stara się wyjaśnić podłoże tej złożonej jednostki chorobowej, bowiem etiopatogeneza schizofrenii wciąż budzi wiele wątpliwości [1]. Istnieje kilka koncepcji tłumaczących rozwój schizofre- Abstract The role of immune system in psychiatric disorders development is unic. Cytokines are responsible for immune system activation. Changes in cytokines level can lead to paranoid schizophrenia. The aim of the study was to compare location of allels and genotypes in healthy individuals and patients with paranoid schizophrenia and identify whether polymorphism of IL-2 is risk factor for the development of these illness. The studied group was divided into two subgroups. The first group included patients with paranoid schizophrenia (n=61). Control group was consisted of 59 healthy individuals. Methods: Genomic DNA was extracted with with the use of phenol-chloroform method. Genotype for -330G/C polymorphism in IL2 gene promoter was estimated using AS-PCR. PCR products were analysed by agarose electrophoresis in 2% agarose gel stained with ethidium bromide. Genotype T/T of IL2 gene promoter is connected with highest risk of paranoid schizophrenia development. Changes on the molecular level outrun changes on the phenotypical level. Differences in IL-2 promoter haplotype may have an important role in determining level of transcription for the IL-2 gene in schizophrenic. There is a great difficulty to get sufficient clinical material, it is possible that scientists of different centers provide profound analysis. Persons with genotypes G/T and G/G have lower risk of schizophrenia development than subjects with T/T (respectively OR G/T =0,03). Key words: paranoid schizophrenia, cytokines, AS-PCR, genotype, allel, association nii, wśród nich na plan pierwszy wysuwają się koncepcje: zaburzonego neuroprzekaźnictwa, neurorozwojowa, immnologiczno-wirusowa, czy wpływu czynników genetycznych [1-3]. W ostatnich latach szczególnie zainteresowano się koncepcją immunologiczną w rozwoju schizofrenii. Zaburzenia pracy układu immunologicznego, a przede wszystkim zmia-
ny w poziomie wydzielania cytokin mogą mieć związek z rozwojem schizofrenii. Wiele badań dotyczy IL-2 produkowanej przez limfocyty Th1[1-3, 10]. IL-2, oprócz właściwości immunomodulujących, pełni w mózgu wiele istotnych funkcji: jest miogenem dla limfocytów T, wpływa na plastyczność synaps oraz na różnicowanie gleju [4, 5, 8, 9]. Gen kodujący IL-2 zlokalizowany jest w chromosomie 4q29-q27. Liczne badania wskazują, że geny zlokalizowane w tym regionie mogą być szczególnie istotne w rozwoju schizofrenii. W regionie promotorowym genu IL-2 znajduje się miejsce wiązania czynnika transkrypcyjnego NFAT dla limfocytów T. Region ten zawiera polimorfizm funkcjonalny w pozycji -330. Polimorfizm -330 T/G został opisany w takich jednostkach chorobowych jak reumatoidalne zapalenie stawów czy stwardnienie rozsiane, a nawet choroba Gravesa-Basedowa. W badaniach in vitro występowanie homozygoty GG związane było ze stałą zwiększoną produkcją IL-2 [2]. Znaczenie IL-2 w rozwoju schizofrenii wciąż nie zostało do końca poznane. Część badań wskazuje na zmniejszenie wydzielania IL-2 wytwarzanej przez limfocyty u pacjentów ze schizofrenią, natomiast pewne badania wskazują na wzrost stężenia IL-2 w we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym w tej samej grupie pacjentów. Podanie IL-2 wiąże się z rozwojem klinicznie istotnych zmian neuropsychiatrycznych takich jak halucynacje czy urojenia [2, 3]. Stąd przedmiotem naszego zainteresowania stał się potencjalny udział polimorfizmu IL-2 (T-330G) w rozwoju schizofrenii paranoidalnej. Uzyskane wyniki mogą wyjaśnić, czy polimorfizm w promotorze genu IL-2 może być jednym z czynników zaangażowanych w patogenezę schizofrenii paranoidalnej, a w dalszej perspektywie stanowić podstawę stosowania leków wpływających na przemiany cytokin w ustroju w chorobach psychicznych. Materiał i metody Grupa badana Badania zostały przeprowadzone na dwóch grupach. Grupa badawcza (n= 61) obejmowała osoby ze zdiagnozowaną schizofrenią paranoidalną, natomiast kontrolę stanowiło 59 zdrowych osób. Kryteria diagnostyczne, wykorzystane w procesie kwalifikacji pacjentów i doboru badanych grup, oparto na klasyfikacji DSM-IVR. W diagnozie oceny stopnia nasilenia objawów psychotycznych schizofrenii paranoidalnej posłużono się skalą PANSS (Positive and Negative Syndrome Scale) wg Kay i wsp. (1987). Krew obwodową stanowiącą materiał do badań uzyskano od pacjentów leczonych w Klinice Psychiatrii i Psychoterapii Górnośląskiego Centrum Medycznego w Katowicach Ochojcu, Wojewódzki Szpital Neuropsychiatryczny w Lublińcu oraz dawców z Regionalnego Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Katowicach. Grupę kontrolną stanowili ochotnicy z wykluczonymi chorobami zakaźnymi, autoimmunologicznymi i zapalnymi oraz prawidłowymi wynikami badań krwi, jak również deklarujący w badaniu ankietowym brak obecności choroby psychicznej, uzależnienia od środków psychoaktywnych (z wyjątkiem nikotyny i kofeiny) zarówno w stosunku do własnej osoby, jak i członków swych rodzin. Z grupy badanej wykluczone zostały osoby niespełniające kryteriów diagnostycznych zawartych w DSM-IVR dla schizofrenii paranoidalnej, jak również osoby, u których obserwowano upośledzenie umysłowe, zaburzenia lękowe, zespoły mieszane depresyjno-lękowe, zaburzenia schizoafektywne, psychozy pochodzenia organicznego lub będące wynikiem działania środków psychoaktywnych, ponadto choroby autoimmunologiczne i przewlekłe choroby zapalne.wszystkie zakwalifikowane osoby do badań należą do rasy kaukaskiej. Ekstrakcja DNA DNA genomowe ekstrahowano z krwi pełnej z wykorzystaniem metody fenolowo-chloroformowej wg standardowej procedury. Do 0.5 ml krwi pełnej dodawano 800 μl fenozolu. Próbkę inkubowano 10 min. w 50 0 C. Następnie dodawano 200 μl chloroformu, próbkę intensywnie worteksowano i wirowano 10 min. przy 12000 obr./min. w +4 0 C. Do nowej probówki odciągano supernatant i dodawano taką samą objętość zimnego izopropanolu, a następnie wymrażano przez noc w -20 0 C. Następnie próbki wirowano 20 min. przy 12000 obr./min. w +4 0 C. Nadsącz dekantowano i do osadu dodawano 1 ml zimnego 75% etanolu. Próbkę wirowano 5 min. przy 12000 obr./min. Nadsącz dekantowano a osad DNA suszono i przechowywać w -70 0 C lub po rozpuszczeniu w 40 μl H 2 0 dej. w -20 0 C do momentu dalszej analizy. Genotypowanie IL-2 Polimorfizm IL-2 (T-330G) analizowano z wykorzystaniem metody AS-PCR. Reakcję prowadzono w 25 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej od 30-100 ng genomowego DNA, 0,2 mmol/l dntps, 15mmol/L MgCl 2, 10X bufor dla polimerazy Taq, 2X wzmacniacz dla polimerazy Taq, parę 0,5 pm starterów oraz 2,5 U polimerazy Taq. Reakcję prowadzono w następujących warunkach termicznych: wstępna denaturacja 5 min. w 95 0 C; 30 cykli trójstopniowej PCR: denaturacja w 95 0 C 60 sekund, anniling 59 0 C przez 60 sekund, elongacja 72 0 C przez 1 minutę oraz końcową elongację w 72 0 C przez 5 minut. Do amplifikacji wybranego fragmentu genu IL-2 wykorzystano następującą parę starterów specyficznych dla danego allela : IL-2G_F 5 CTGACATGTAAGAAGCAATCTAT3 (starter sensowny) IL-2G_R 5 CTCAGAAAATTTTCTTTGTCC3 (starter antysensowny) długość amplimeru 215 pz. IL-2T_F 5 TTCACATGTTCAGTGTAGTTTTAT3 (starter sensowny) IL-2G_R 5 TGTTACATTAGCCCACACTTA3 (starter antysensowny) długość amplimeru 152 pz. Długość otrzymanego amplimeru wynosi 330 pz. Amplifikację przeprowadzono z wykorzystaniem termocyklera G-STORM (Gene-Technologies). Wynik reakcji PCR sprawdzano poprzez przeprowadzenie rozdziału otrzymanych produktów w 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.
Tab. 1. Porównanie rozkładu genotypów i alleli pomiędzy kobietami i mężczyznami w grupie kontrolnej Charakterystyka kliniczna n Mężczyźni 36 Kobiety 23 Razem 59 Rozkład genotypów Rozkład alleli G/G G/T T/T χ 2 p G T χ 2 p 6 29 1 16.7 % 80.6 % 0,36% NW 41 31 P 3 20 0 13% 87% 0% 1.18 0.5543 26 20 0.00 0.9639 9 49 1 15.2 % 83.1% 1.69% 67 51 Tab. 2. Porównanie rozkładu genotypów i alleli pomiędzy kobietami i mężczyznami w grupie badanej Charakterystyka kliniczna n Mężczyźni 35 Kobiety 26 Razem 61 Rozkład genotypów Rozkład alleli G/G G/T T/T χ 2 p G T χ 2 p 2 26 7 5,7% 74,3% 20% NW 30 40 P 2 16 8 7,7% 61,5% 30,7% 1.14 0.5661 20 32 0.24 0.6254 4 42 15 6,5% 67,7% 24,6% 50 72 Tab. 3. Charakterystyka kliniczna pacjentów ze schizofrenią paranoidalną Mężczyźni Kobiety p Skala P (pukty?) 26.1±5.5 22.9±5.4 <0.05 Skala N 29.0±6.1 28.0±5.7 0.5214 Skala G 48.9±8.9 46.5±9.0 0.3155 Skala suma 104.1±16.8 97.5±17.6 0.1410 Czas trwania choroby (lata) 18.9±8.3 20.2±9.8 0.5844 Czas I epizodu choroby (lata) 25.7±6.2 26.7±7.3 0.5715 Tab. 4. Rozkład genotypów IL-2 u chorych ze schizofrenią paranoidalną oraz w grupie kontrolnej; OR odds ratio CI confidence interval Genotyp Kontrola Schizofrenia OR (95% CI) p T/T 1 (1.7%) 15 (24.6%) 1.00 G/T 49 (83%) 42 (68.8%) 0.06 (0.01-0.45) <0.0001 G/G 9 (15.2%) 4 (6.6%) Wyniki Charakterystyka grupy kontrolnej 0.03 (0.00-0.31) Grupę kontrolną stanowiło 59 zdrowych ochotników, w tym 23 (39.0%) kobiety, w wieku 46.0±6.4 (32-55) lat. Nie wykazano istotnego statystycznie wpływu płci na wiek badanych ochotników (p=0.6748 U). Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w rozkładzie genotypów i alleli pomiędzy kobietami i mężczyznami (Tabela 1). Charakterystyka grupy ze schizofrenią paranoidalną Grupę badaną stanowiło 61 chorych ze schizofrenią, w tym 26 (42.6%) kobiet, w wieku 45.6±7.6 (30-59) lat. Nie wykazano istotnego statystycznie wpływu płci na wiek wystąpienia I epizodu u chorych na schizofrenię paranoidalną (p=0.2534 t). Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w rozkładzie genotypów i alleli pomiędzy kobietami i mężczyznami (Tabela 2). Nie wykazano istotnych statystycznie różnic wieku pomiędzy grupą kontrolną a grupą osób ze schizofrenią paranoidalną (p=0.7392 t). Charakterystykę kliniczną grupy badanej przedstawiono w Tabeli 3. Kobiety i mężczyźni różnili się nasileniem objawów wytwórczych, przy czym u mężczyzn stopień nasilenia wspomnianych objawów był wyższy. Pozostałe badane parametry nie były zróżnicowane w zależności od płci. Stwierdzono istotną statystycznie różnicę w rozkładzie genotypów pomiędzy grupą ze schizofrenią paranoidalną i kontrolą wśród mężczyzn (p<0.05) oraz kobiet (p<0.01) Rycina 1. Nie wykazano istotnych statystycznie różnic w rozkładzie alleli pomiędzy grupą kontrolną a schizofrenią paranoidalną zarówno w grupie mężczyzn (χ 2 =2.82; p=0.0933), jak i kobiet (χ 2 =3.20; p=0.0738). Osoby o genotypach G/T oraz G/G mają niższe ryzyko wystąpienia schizofrenii w stosunku do osób z genotypem T/T ( odpowiednio OR G/T =0,03;Tabela 4) Dyskusja Przedstawione badania obejmowały poszukiwanie związku pomiędzy wystąpieniem schizofrenii paranoidalnej a rozkładem genotypów i alleli dla polimorfizmu w promotorze genu IL-2 w pozycji 330 G/T. Chorzy na schizofrenię paranoidalną i osoby zdrowe nie różniły się statystycznie wiekiem. Rozkład genotypów i alleli w grupie kobiet i mężczyzn zdrowych podobnie jak w grupie kobiet i mężczyzn chorujących na schizofrenię paranoidalną był zbliżony. Dane te pozwoliły na podział badanych populacji ze względu na płeć. Jakkolwiek, bowiem schizofrenia występuje u obu płci
Ryc. 1. Porównanie rozkładu genotypów i alleli IL-2 pomiędzy grupą ze schizofrenią paranoidalną i kontrolną wśród mężczyzn i kobiet. i objawy są na ogół podobne to jednak odsetek chorujących mężczyzn jest wyższy w porównaniu z zachorowalnością obserwowaną u kobiet. Może to sugerować, na przykład w związku ze zróżnicowaniem hormonalnym, że drogi molekularne prowadzące do wystąpienia zaburzeń schizofrenicznych mogą nie być identyczne. Pojawiły się badania, które wykazały, że po podziale populacji ze względu na płeć obserwowano związek pomiędzy allelami lub genotypami a występowaniem choroby psychicznej, podczas gdy dla całej populacji takiego związku nie wykazywano [15]. Wyniki niniejszej pracy wykazały istnienie związku pomiędzy obecnością genotypów GG lub TT a występowaniem schizofrenii paranoidalnej. Wynik ten jest niezwykle interesujący ze względu na toczące się dyskusje na temat znaczenia fluktuacji stężenia IL-2 w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym u chorych. Niewiele jest danych w piśmiennictwie dotyczących genetycznych aspektów IL-2 w schizofrenii. Dane te dotyczą tylko polimorfizmu 330 G/T oraz sekwencji powtórzeń genu receptora IL-2. Obserwacje literaturowe są sprzeczne, bowiem Schwartz i wsp. zaobserwowali wystąpienie asocjacji pomiędzy obecnością genotypu TT a schizofrenią w populacji niemieckiej, podczas gdy takiego związku w populacji japońskiej nie stwierdzono[3]. Podobny wynik dla populacji polskiej i niemieckiej może popierać znany pogląd o różnicach w rozkładzie genotypów i alleli pomiędzy populacją kaukaską a orientalną. Zaobserwowano, że homozygota GG występuje rzadziej w przypadku osób ze schizofrenią paranoidalną w porównaniu do osób zdrowych. Wynik ten potwierdza obserwacje wielu autorów dotyczące obniżenie wydzielania IL-2 przez limfocyty w schizofrenii, bowiem homozygota GG warunkuje zwiększenie produkcji białka IL-2 [16]. Co niemniej ciekawe, analiza statystyczna wykazała, iż obecność genotypu GG zmniejsza ryzyko wystąpienia schizofrenii paranoidalnej podczas gdy obecność genotypu TT to ryzyko zwiększa. Znaczenie tego wyniku jest trudne do interpretacji ze względu na niezwykle skomplikowaną sieć powiązań w ekspresji genów i białek pomiędzy sobą w ośrodkowym układzie nerwowym. IL-2 wytwarzana jest w ośrodkowym układzie nerwowym przez astrocyty, w stężeniach fizjologicznych zwiększa wydzielanie dopaminy z neuronów a jej receptory występują w wysokim stężeniu na neuronach hipokampa [17]. Zjawiska te potwierdzają ważną rolę IL-2 w funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego. Jednak koronny dowód na jej udział w wywoływaniu zaburzeń psychicznych jest niepewny, bo obserwowany u ludzi leczonych z powodu choroby nowotworowej ogromnymi dawkami IL-2, które nie korespondują z jej stężeniem fizjologicznym [19]. Asocjacja pomiędzy obecnością genotypów GG i TT a wystąpieniem choroby jest kolejnym dowodem na pewną rolę tej cytokiny w patogenezie schizofrenii paranoidalnej. Przewlekły charakter choroby, którą trzeba leczyć najczęściej do końca życia sugeruje, że musi istnieć jakiś fundamentalny i niezmienny czynnik ją powodujący. Czynnikiem takim bez wątpienia jest DNA. Jest jednak mało prawdopodobne by polimorfizm jednego genu mógł być przyczyną schizofrenii. Ogromna złożoność i zróżnicowanie symptomów tej choroby zdecydowanie wskazuje na zaburzenia w funkcjonowaniu jednocześnie wielu genów i białek, powodując tak znaczne rozstrojenie pracy mózgu, iż objawia się ono w postaci zachowania charakterystycznego dla schizofrenii. Podsumowując, wyniki obecnego badania wskazują na udział IL-2 w patogenezie schizofrenii paranoidalnej, lecz poszerzenie badań na znacznie większej populacji chorych jest konieczne dla właściwej oceny uzyskanych rezultatów. Piśmiennictwo 1. Hauser J, Węglarz-Dmitrzak M. W poszukiwaniu genów schizofrenii. Neuropsych. i Neuropsych 2009; 4 (1): 1-9. 2. Schwarz MJ i wsp. IL-2 and IL-4 polymorphisms as candidate genes in schizophrenia. Eur Arch Clin Neurosci 2006; 256: 72-76. 3. Watanabe Y i wsp. Association study of interleukin 2 (IL-2) and IL-4 with schizophrenia in Japanese population. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 2008; 258: 422-427. 4. Shin WG i wsp. Polymorphism of interleukin-1 and interleukin-2 genes in patients with gastric cancer in Korea. J of Gastroenterol and Hepatol 2008; 23: 1567-1573. 5. Mahendran R i wsp. Interleukin-2 levels in chronic schizophrenia patients. Ann Acad of Med. 2004; 4: 33. 6. Kronfol Z, Remick DG. Cytokines and the brain: implication for clinical psychiatry. Am J Psychiatry 2000; 5: 157. 7. Sawa A., Synder S.H. Schizophrenia: neuronal mechanisms for novel therapis. Mol Med, 2003; 9: 3-9. 8. Leonard BE. Is there an immunological basis for schizophrenia? Expert Rev Clin Immunol 2005; 1: 103-112. 9. Prasad S i wsp. Molecular genetics of schizophrenia: past, present and future. J Biosci 2002; 27: 35-52.
10. Kim YK i wsp. The role of the cytokine network in psychological stress. Acta Neuropsych 2003, 15: 148-155. 11. Ganguli R i wsp. Mitogen stimulated IL-2 production in never-medicated first episode schizophrenic patients. The influence of the age at onset and negative symptoms. Arch Gen Psychiatry 1995; 52: 668-72. 12. Hornberg M i wsp. Production of interferones and lymphokines in leukocyte cultures of patients with schizophrenia. Schizophr Res 1995; 15: 237-242. 13. Kim YK i wsp. Th1, Th2 and Th3 cytokine alteration in schizophrenia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2004; 28: 1129-1134. 14. Rothermundt M i wsp. Production of cytokines in acute schizophrenic psychosis. Biol Psychiatry 1996; 40: 1294-1297. 15. Verhagen M i wsp. Meta-analysis of the BDNF val66met polymorphism in major depressive disorder: effect of gender and ethnicity. Mol Psychiatry 2010; 15: 260-271. 16. Hoffmann SC i wsp. Association of cytokine polymorphic inheritance and in vitro cytokine production in anti-cd3/cd28-stimulated peripheral blood lymphocytes. Transplantation 2001; 72: 1444-1450. 17. Lapchak PA. A role for interleukin-2 in the regulation of striatal dopaminergic function. Neuroreport 1992; 3: 165-168. 18. Plata-Salaman CR i wsp. Interleukin-2 modulates calcium currents in dissociated hippocampal CA1 neurons. Neuroreport 1993; 4: 579-581. 19. Rosenberg SA i wsp. A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokineactivated killer cells and IL-2 alone. N Engl J Med 1987; 316: 889-897. data otrzymania pracy: 18.03.2010 r. data akceptacji do druku: 23.03.2010 r. Adres do korespondencji: Marta Palacz Katedra i Zakład Genetyki Medycznej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny, Katowice ul. Ostrogórska 30 41-200 Sosnowiec tel.: +48 60 638 90 12 e-mail: m.palacz@poczta.fm