UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNO-PRZYRODNICZY IM. JANA I JĘDRZEJA ŚNIADECKICH W BYDGOSZCZY WYDZIAŁ ROLNICTWA I BIOTECHNOLOGII mgr inż. Anna Ziółkowska Streszczenie rozprawy doktorskiej pt.: PRZEMIANY ZWIĄZKÓW FENOLOWYCH W GLEBACH ŁĄKOWYCH promotor prof. dr hab. inż. Bożena Dębska promotor pomocniczy dr inż. Magdalena Banach-Szott BYDGOSZCZ 2019
WSTĘP I CEL PRACY Badanie stanu roślinności i gleb oraz ich ochrona jest istotnym zagadnieniem w skali globalnej, regionalnej i lokalnej, co zarazem stanowi jeden z ważniejszych celów polityki Wspólnoty Europejskiej. W protokole z Kioto podano, że gleba dzięki zachodzącemu w niej procesowi sekwestracji stanowi największy magazyn zasobów węgla, który należy chronić i w miarę możliwości powiększać [COM 2002; COM 2006; Gonet 2007; Pastuszko 2007; Sapek 2009; Smreczak i in. 2017]. Gleby łąkowe są bardzo zróżnicowane pod względem zawartości i jakości materii organicznej. Ich znaczenie i istota przejawiają się w wyższej zawartości substancji organicznej w porównaniu do gleb leśnych czy uprawnych. W glebach łąkowych istnieją lepsze warunki do akumulacji i immobilizacji substancji organicznej. Tym samym użytki zielone są postrzegane, jako sposób wykorzystania gruntów sprzyjający sekwestracji węgla organicznego w glebie [Sapek 2000]. Źródłami materii organicznej w glebach łąkowych są przede wszystkim obumarłe korzenie roślin, znajdujące się na powierzchni szczątki roślinne oraz obumarłe drobnoustroje. Szata roślinna łąk trwałych składa się z gatunków wieloletnich, a zasadniczą rolę odgrywają trawy i rośliny bobowate. Na łąkach kośnych trawy stanowią 60-80% udziału w runi, zaś rośliny bobowate 5-10%, resztę stanowią zioła i chwasty, a ich udział zależny jest od stopnia pielęgnacji [Míka i in. 2005]. Podstawowymi związkami wchodzącymi w skład ścian komórek roślin są: celuloza, hemicelulozy oraz ligniny, związki odgrywające istotną rolę w procesach humifikacji. Zawartość lignin wzrasta w miarę rozwoju roślinności trawiastej, a ich skład chemiczny zależy od rodzaju tkanek roślinnych i ich anatomicznej struktury [Zawadzki 1999; Pastuszko 2007]. Substancje humusowe mogą również powstawać z garbników, terpenów, metabolitów mikroorganizmów i produktów autolizy ich komórek. Niezależnie od teorii powstawania substancji humusowych w glebach, przyjęto, iż główną rolę w ich powstawaniu odgrywają związki fenolowe, będące składnikiem lignin, związków flawonowych roślin oraz produktami mikrobiologicznej biosyntezy z alifatycznych substratów [Pastuszko 2007]. Na wyizolowanie związków fenolowych z komórek roślin i gleb pozwala hydroliza kwasowa i zasadowa. Zdaniem Verma i in. [2009] najskuteczniejszym sposobem na wyizolowanie związków fenolowych z próbek jest zastosowanie metody re-hydrolizy. Rehydroliza polega na poddaniu badanego materiału po hydrolizie kwasowej, hydrolizie zasadowej [Ross i in. 2009; Verma i in. 2009]. Jak podają Verma i in. [2009] konieczność zastosowania metody re-hydrolizy można wyjaśnić na przykładzie kwasu ferulowego. Około połowy zawartości tego kwasu jest nietrwała w środowisku kwasowym, a pozostała część w środowisku alkalicznym. W celu wyizolowania całkowitych ilości związków fenolowych obecnych w badanym materiale, należy stosować metodę re-hydrolizy, by uniknąć niedoszacowania zawartości związków fenolowych w próbkach. Określenie składu jakościowego i ilościowego związków fenolowych zawartych w otrzymanych hydrolizatach pozwala na wyznaczenie parametrów określających stopień rozkładu materiału roślinnego, w tym wielkości wyrażających ilość nienaruszonych, nieskondensowanych struktur ligninowych. Do powyższych parametrów zalicza się m.in. udział jednostek wanilinowych, syryngowych i cynamonowych, a także ich wzajemne stosunki [Kovaleva i Kovalev 2009; Dębska i Banach-Szott 2010]. 2
Należy podkreślić, że bardzo sporadycznie [Kovaleva, Kovalev 2009] spotyka się prace, w których jednocześnie przedstawiane są wyniki badań zawartości związków fenolowych występujących w materiale roślinnym, glebach i frakcjach substancji humusowych, a tylko takie badania mogą dostarczyć informacji na temat znaczenia materiału roślinnego w procesach powstawania substancji humusowych (procesach humifikacji). Mając na uwadze powyższe, w pracy przyjęto hipotezę, że identyfikacja związków fenolowych i określenie ich zawartości w materiale roślinnym, glebach oraz frakcjach kwasów huminowych i fulwowych mogą pozwolić na określenie przemian, jakim ulega materiał roślinny gleb łąkowych, a tym samym przyczynić się do poszerzenia wiedzy na temat przebiegu procesów humifikacji. Założono również, że zastosowanie metody re-hydrolizy może pozwolić na otrzymanie wyższych średnich zawartości związków fenolowych aniżeli w przypadku wykonania tylko hydrolizy kwasowej. Celem badań niniejszej pracy było określanie roli związków fenolowych w procesach przekształceń materii organicznej gleb łąkowych, prowadzących do powstania substancji humusowych. MATERIAŁ I METODY BADAŃ Do badań wykorzystano próbki materiału roślinnego (siano, ruń i korzenie) oraz gleb (poziom darniowy A, eluwialny AE oraz iluwialny Bsv) pobrane na terenie Kompleksu Łąk Czerskich, znajdujące się w kolekcji próbek w Pracowni Chemii Środowiska oraz Pracowni Botaniki, Ekologii i Architektury Krajobrazu WRiB UTP. Wybrano próbki pobrane na terenie kwater Cegielnia, Kamionna, Podlesie nieprzerwanie nawadnianych od ponad 150 lat oraz z kompleksu, na którym zaprzestano nawadniania od 25 lat (w roku pobrania próbek do badań, to jest 2011) o historycznej nazwie Zielona Łąka. Wytypowano próbki pobrane w odległości 5 i 25 m od rowu nawadniającego. Ogółem do badań wybrano próbki pochodzące z 12 profili glebowych (łącznie 36 próbek materiału roślinnego i 36 próbek gleby). Gleby we wszystkich analizowanych profilach reprezentują podtyp gleb rdzawych z cechami bielicowania (RWbi) typ gleb rdzawych (RW), rzędu gleb rdzawoziemnych (R) wg Systematyki Gleb Polski (2011). Realizację celu badań oraz sprawdzenie hipotezy badawczej przeprowadzono w oparciu o wykonanie następujących analiz: 1. Hydroliza i ekstrakcja związków fenolowych. Próbki materiału roślinnego i próbki gleb poddano hydrolizie kwasowej (6 M HCl, 24 h, 120 C) i po niej hydrolizie zasadowej (3,5 M NaOH, 24 h, 20 C), tzw. re-hydrolizie. Hydrolizę kwasową i re-hydrolizę przeprowadzono z dodatkiem 2 cm 3 1% roztworu kwasu askorbinowego i 2 cm 3 0,0125 mm roztworu EDTA. Ekstrakcję związków fenolowych w roztworach po hydrolizie przeprowadzono octanem etylu. Otrzymane ekstrakty odparowano do sucha, a pozostałość rozpuszczono w metanolu i poddano analizie HPLC. 2. Ekstrakcja kwasów huminowych (KH) i kwasów fulwowych (KF) z próbek gleb. W celu otrzymania frakcji kwasów huminowych i fulwowych próbki gleb poddano selektywnej ekstrakcji metodą Schnitzera (dekalcytacja 0,1 M HCl; ekstrakcja kwasów humusowych 0,5 M NaOH; wytrącenie kwasów huminowych 6 M HCl). 3. Ekstrakcja związków fenolowych z frakcji kwasów huminowych i fulwowych. Frakcja kwasów huminowych została poddana kwaśnej hydrolizie. Ekstrakcję związków fenolowych 3
z frakcji kwasów fulwowych i hydrolizatów frakcji kwasów huminowych przeprowadzono analogicznie jak w przypadku próbek gleb i materiału roślinnego. 4. Rozdział chromatograficzny związków fenolowych. Analizę chromatograficzną związków fenolowych zawartych w ekstraktach otrzymanych z hydrolizatów z próbek materiału roślinnego, próbek gleb oraz frakcji kwasów huminowych i fulwowych wykonano przy pomocy chromatografu cieczowego HPLC Series 200 firmy Perkin Elmer wyposażonego w detektor DAD. Zastosowano kolumnę analityczną Bionacom Velocity STR o średnicy ziaren 5 μm i wymiarach 250 4,6 mm I.D. Faza ruchoma składała się z: eluentu A: H2O:CH3CN:CH3COOH (88,5:10:1,5 stosunek wyrażony % v) oraz eluentu B: CH3CN w programie gradientowym. Detekcję przeprowadzono przy długości fali 280 nm, objętość nastrzyku 10 µl. Identyfikację jakościową i analizę ilościową przeprowadzono w oparciu o roztwory wzorcowe następujących związków fenolowych: aldehyd 4-hydroksy-3,5- dimetoksybenzoesowy (syryngowy, AS), aldehyd 4-hydroksy-3-metoksybenzoesowy (wanilinowy, AW), kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy (protokatechowy, KP), kwas 4- hydroksybenzoesowy (p-hydroksybenzoesowy, KHB), kwas 4-hydroksy-3- metoksybenzoesowy (wanilinowy, KW), kwas 4-hydroksy-3,5-dimetoksybenzoesowy (syryngowy, KSR), kwas p-hydroksycynamonowy (p-kumarowy, KHC), kwas 3,4-dihydroksytrans-cynamonowy (kawowy, KK), kwas 4-hydroksy-3-metoksy-trans-cynamonowy (ferulowy, KFE), kwas 1,3,4,5-tetrahydroksycykloheksanokarboksylowy 3-(3,4- dihydroksycynamonowy) (chlorogenowy, KCH), kwas 2-hydroksybenzoesowy (salicylowy, KS). Analizę ilościową zidentyfikowanych związków fenolowych przeprowadzono z wykorzystaniem krzywych wzorcowych zależności powierzchni piku od stężenia związku fenolowego (μg/ml). Analizę HPLC roztworów wzorcowych wykonano analogicznie jak dla ekstraktów fenolowych. Wyniki zawartości związków fenolowych (µg/g s. m.) w ekstraktach z hydrolizatów z materiału roślinnego, próbek gleb oraz frakcji kwasów fulwowych i hydrolizatów kwasów huminowych przedstawiono w postaci średniej z trzech powtórzeń analitycznych. Na podstawie otrzymanych wyników obliczono następujące parametry: suma zawartości 11 analizowanych związków fenolowych (SUMA); jednostki wanilinowe (V) suma zawartości aldehydu wanilinowego i kwasu wanilinowego (AW+KW); jednostki syryngowe (S) suma zawartości aldehydu i kwasu syryngowego (AS+KSR); jednostki cynamonowe (C) suma zawartości kwasów p-kumarowego, ferulowego i kawowego (KHC+KFE+KK); oraz: sumę fenoli typu wanilinowego, syryngowego i cynamonowego (V+S+C) oraz ich stosunki (V:S:C); wartości stosunków S/V i C/V. Istotność różnic oznaczonych parametrów w zależności od rodzaju próbek materiału roślinnego (siano, ruń i korzenie), poziomu genetycznego próbek gleb (A, AE oraz Bsv) oraz odległości miejsca poboru próbek od rowu nawadniającego (5 i 25 m) oceniono odpowiednio: testem Kruskala-Wallisa i testem mediany oraz testem U Manna-Whitneya, przy poziomie istotności p=0,05. Zależności między wybranymi parametrami określono za pomocą współczynników korelacji Pearsona. Do obliczeń statystycznych wykorzystano arkusz kalkulacyjny Excel oraz pakiet Statistica MS 2012. 4
OMÓWIENIE WYNIKÓW W niniejszej pracy określono zawartości związków fenolowych w próbkach materiału roślinnego i gleb po zastosowaniu hydrolizy kwasowej, a po niej hydrolizy zasadowej (tzw. rehydrolizy). Dla wszystkich próbek materiału roślinnego (siano, ruń, korzenie) oraz próbek gleby pobranych z poziomu darniowego (A) otrzymano wyższe sumaryczne zawartości związków fenolowych, w wyniku przeprowadzenia re-hydrolizy w porównaniu z samą hydrolizą kwasową. Metoda re-hydrolizy pozwoliła na wyizolowanie 70,2-84,7% sumarycznych zawartości związków fenolowych otrzymanych po zastosowaniu obu metod (hydroliza kwasowa, re-hydroliza). Należy podkreślić, że dla materiału roślinnego i gleby poziomu darniowego metoda re-hydrolizy była podstawą otrzymania kwasów ferulowego (KFE) i p-kumarowego (KHC). Z kolei metodą hydrolizy kwasowej wyizolowano z próbek materiału roślinnego (siano, ruń) znacznie większe ilości kwasów protokatechowego, p-hydroksybenzoesowego i chlorogenowego w porównaniu z ich ilościami wyizolowanymi metodą re-hydrolizy. W ekstraktach z hydrolizatów próbek materiału roślinnego i gleb zidentyfikowano 11 związków fenolowych, tym samym materiał badawczy nie był zróżnicowany pod względem jakościowym. Natomiast wykazano istotne zróżnicowanie zawartości związków fenolowych w zależności od rodzaju badanego materiału. Najwięcej związków fenolowych zidentyfikowano w ekstraktach z hydrolizatów materiału roślinnego (siano>ruń>korzenie). Następną pod względem zawartości związków fenolowych była gleba (poziom A>AE>Bsv), a najmniej aldehydów i kwasów fenolowych zidentyfikowano w hydrolizatach kwasów huminowych. W ekstraktach z hydrolizatów z próbek materiału roślinnego pobranych na terenach łąk nawadnianych i nienawadnianych wyizolowano najwyższe spośród wszystkich związków fenolowych ilości kwasów: ferulowego, p-kumarowego, kawowego oraz chlorogenowego. W ekstraktach z hydrolizatów kwasowych i re-hydrolizatów z próbek siana oznaczono średnio 1784-2596 μg/g s.m. kwasu ferulowego, 1159-1950 μg/g s.m. kwasu p-kumarowego oraz 434-875 μg/g s.m. kwasu chlorogenowego. Ekstrakty z hydrolizatów z próbek runi i korzeni zawierały najwyższe spośród wszystkich analizowanych związków fenolowych zawartości kwasów: ferulowego oraz p-kumarowego mieszczące się w przedziale 734-1509 μg/g s.m. Ponadto oznaczono duże zawartości kwasów: chlorogenowego (213-711 μg/g s.m.) oraz kawowego (168-242 μg/g s.m.) i aldehydu wanilinowego, szczególnie w próbkach runi z obiektu łąk nawadnianych (327-389 μg/g s.m.). Skład chemiczny roślinności przekłada się na skład chemiczny materii organicznej gleb oraz substancji humusowych. Duże zawartości kwasów: ferulowego, p-kumarowego, chlorogenowego oraz kawowego w ekstraktach z hydrolizatów z próbek materiału roślinnego przekładają się na duże ich zawartości w ekstraktach z hydrolizatów z próbek gleb. Ponadto w ekstraktach z hydrolizatów próbek gleb stwierdzono duże zawartości kwasów: p-hydroksybenzoesowego (KHB) i kawowego (KK). W ekstraktach z kwasów fulwowych niezależnie od odległości poboru próbek do badań od rowu nawadniającego dominującymi były kwasy: chlorogenowy (KCH), ferulowy (KFE) i p-kumarowy (KHC), zaś w hydrolizatach kwasów huminowych kwasy: chlorogenowy, ferulowy (poziom A), kawowy i wanilinowy (poziom AE i Bsv). Niższe w porównaniu do wymienionych kwasów zawartości pozostałych 5
związków w ekstraktach z próbek roślinnych przekładają się na niższe ich ilości w ekstraktach z hydrolizatów z próbek gleb i frakcji kwasów humusowych. Wartym podkreślenia są malejące zawartości związków fenolowych w głąb profilu glebowego. Z punktu widzenia procesów humifikacji i roli związków fenolowych w tych procesach należy zwrócić szczególną uwagę na fakt niższych zawartości związków fenolowych w ekstraktach z hydrolizatów z frakcji KH w porównaniu do średnich zawartości związków fenolowych w ekstraktach z frakcji KF. Nie wykazano jednoznacznych różnic w składzie ilościowym związków fenolowych między próbkami pobranymi w różnych odległościach od rowu nawadniającego, jak i między próbkami pobranymi na terenie obiektów nawadnianych i nienawadnianych. Ważnych informacji na temat przemian związków fenolowych w glebach dostarczają parametry rozkładu lignin wyznaczone na podstawie oznaczonych zawartości związków fenolowych w ekstraktach z hydrolizatów z próbek materiału roślinnego, gleb oraz frakcji kwasów humusowych. W niniejszej pracy obliczono następujące parametry: jednostki wanilinowe (V), jednostki syryngowe (S), jednostki cynamonowe (C), sumę fenoli typu wanilinowego, syryngowego i cynamonowego (V+S+C), ich stosunki S/V i C/V oraz wartości stosunków udziału jednostek V, S i C (V:S:C). W ekstraktach z hydrolizatów z próbek materiału roślinnego (siano, ruń i korzenie), gleb i frakcji kwasów fulwowych oraz hydrolizatów frakcji kwasów huminowych poziomu A, najwyższymi średnimi zawartościami odznaczały się jednostki cynamonowe w porównaniu do średnich zawartości jednostek wanilinowych i syryngowych. Nieco inaczej kształtowały się zawartości jednostek V, S i C w hydrolizatach frakcji KH poziomów AE oraz Bsv. W ekstraktach z hydrolizatów frakcji kwasów huminowych poziomu AE zawartości jednostek cynamonowych były porównywalne z zawartościami jednostek wanilinowych, zaś w próbkach z poziomu Bsv nie stwierdzono istotnych różnic między zawartościami V, S i C. W ekstraktach z obu hydrolizatów łącznie (hydroliza kwasowa i re-hydroliza) z próbek materiału roślinnego pobranego na terenie obiektów łąk nawadnianych oznaczono średnio 3549,0, 2264,0 i 1952,0 μg/g jednostek cynamonowych odpowiednio dla ekstraktów z próbek siana, runi i korzeni (z czego udziały hydrolizy kwasowej wynosiły: 11,7, 11,5 i 10,2%). Średnie zawartości jednostek wanilinowych i syryngowych w ekstraktach z obu hydrolizatów łącznie były 77,7-85,2% mniejsze w porównaniu ze średnimi zawartościami jednostek cynamonowych. W ekstraktach z hydrolizatów kwasowych próbek materiału roślinnego zawartości jednostek wanilinowych i syryngowych były zbliżone i około 50,0-67,2% mniejsze w porównaniu z zawartościami jednostek cynamonowych. W ekstraktach z hydrolizatów z próbek gleb łąk nawadnianych z poziomu A, AE oraz Bsv wyizolowano średnio 223,1, 171,9 i 102,6 μg/g jednostek cynamonowych, zaś średnie zawartości jednostek V i S były istotnie niższe i wynosiły 40,7-81,4 μg/g. Analogicznymi zależnościami statystycznymi odznaczały się ekstrakty z hydrolizatów kwasowych gleb. W ekstraktach z frakcji KF z poziomów A, AE i Bsv oznaczono odpowiednio 87,3, 29,2 i 12,7 μg/g jednostek cynamonowych. Zawartości jednostek wanilinowych i syryngowych były zdecydowanie niższe i mieściły się w zakresie 3,4-12,5 μg/g. W ekstraktach z hydrolizatów z frakcji kwasów huminowych z poziomu darniowego średnie zawartości jednostek cynamonowych były wyższe niż zawartości jednostek wanilinowych i syryngowych i wynosiły 18,8 μg/g, natomiast średnie zawartości jednostek wanilinowych i syryngowych były zbliżone i wynosiły odpowiednio: 8,8 i 8,9 μg/g. Średnie zawartości jednostek cynamonowych i wanilinowych w ekstraktach z hydrolizatów z frakcji kwasów huminowych z poziomu AE były istotnie wyższe w porównaniu ze średnimi 6
zawartościami jednostek syryngowych w ekstraktach. Ekstrakty z hydrolizatów KH poziomu iluwialnego nie były zróżnicowane pod względem średnich zawartości fenoli typu wanilinowego, syryngowego i cynamonowego. Ekstrakty z hydrolizatów kwasowych i re-hydrolizatów łącznie oraz z hydrolizatów kwasowych z próbek pobranych na terenach łąk nienawadnianych odznaczały się analogicznymi zależnościami statystycznymi pod względem zawartości jednostek typu wanilinowego, syryngowego i cynamonowego jak materiał badawczy pobrany na terenach łąk nawadnianych. Konsekwencją wyższych zawartości jednostek cynamonowych nad wanilinowymi i syryngowymi jest ich wyższy udział, co przejawia się w otrzymanych wartościach parametru V:S:C. Dla próbek materiału roślinnego wartości V:S:C zmieniały się w zakresie od 1:1:6 do 1:1:9 suma hydroliz oraz od 1:1:2,5 do 1:1:4 hydroliza kwasowa. Na ogół dwukrotnie wyższy udział jednostek cynamonowych w próbkach materiału roślinnego po zastosowaniu rehydrolizy jest konsekwencją wpływu tej metody na ekstrakcję kwasów: p-kumarowego i ferulowego. Wzajemne proporcje V:S:C w hydrolizatach z próbek gleb generalnie mieściły się w zakresie 1:1:1,5 do 1:1:3 niezależnie od zastosowanej metody hydrolizy. Najniższym udziałem jednostek cynamonowych charakteryzowały się kwasy huminowe, a wzajemne proporcje omawianych jednostek dla KH poziomu Bsv były bardzo zbliżone do 1:1:1 (z lekką przewagą jednostek cynamonowych). W cząsteczkach kwasów fulwowych badanych gleb łąkowych proporcje jednostek kształtowały się w zakresie od 1:1:3,5 do 1:1:5. Proces humifikacji materii organicznej badanej roślinności łąkowej związany jest więc ze wzrostem udziału jednostek wanilinowych i syryngowych oraz zmniejszeniem udziału jednostek cynamonowych. Jednak należy podkreślić, że wzajemne proporcje jednostek wanilinowych i syryngowych na ogół nie ulegają zmianom. Kolejnym parametrem będącym wskaźnikiem stopnia rozkładu lignin jest V+S+C. Spośród ekstraktów z próbek materiału roślinnego (siano, ruń i korzeń) istotnie najwyższymi średnimi wartościami parametru V+S+C odznaczały się ekstrakty z sumy hydrolizatów kwasowych i re-hydrolizatów z próbek siana, a najniższymi korzeni. Suma zawartości V+S+C w ekstraktach z próbek gleb zmniejszała się wraz z głębokością, przy czym zdecydowanie większe różnice V+S+C między poziomami A i AE zanotowano dla łąk nienawadnianych w porównaniu z łąkami nawadnianymi. Dla łąk nawadnianych różnica w zawartości V+S+C między A i AE nie była istotna statystycznie. Dla hydrolizatów kwasowych zawartość sumy jednostek V+S+C w glebach łąk nienawadnianych zmniejszała się wraz z głębokością (A>AE>Bsv), a w glebach łąk nawadnianych była najwyższa w warstwie AE. Zarówno dla ekstraktów z frakcji kwasów fulwowych jak i z hydrolizatów kwasów huminowych wartość parametru sumy jednostek wanilinowych, syryngowych i cynamonowych istotnie malała w głąb profilu glebowego. Należy zwrócić uwagę, iż wartości V+S+C charakteryzujące ekstrakty frakcji KF były wyższe w porównaniu z wartościami tego parametru w ekstraktach z hydrolizatów z frakcji KH z tożsamych próbek gleb pochodzących zarówno z terenów obiektów nawadnianych jak i nienawadnianych. Ponadto dowiedziono istnienia zależności między zawartością węgla organicznego w próbkach gleb, a średnimi wartościami parametru sumy jednostek wanilinowych, syryngowych i cynamonowych (V+S+C). Świadczą o tym istotne statystycznie współczynniki korelacji dla obiektu łąk nawadnianych 0,67 (dla hydrolizatów kwasowych), zaś dla obiektów 7
nienawadnianych 0,49 (dla hydrolizatów kwasowych) oraz 0,68 dla hydrolizatów kwasowych i re-hydrolizatów łącznie, p=0,05. Uzupełnieniem rozważań nad znaczeniem składu chemicznego resztek roślinnych w procesach tworzenia substancji humusowych są wartości stosunku S/V i C/V. Najniższymi spośród próbek materiału badawczego wartościami parametru C/V wynoszącymi 0,86-2,13 odznaczały się ekstrakty z hydrolizatów z frakcji KH. Wartości tego parametru dla ekstraktów z frakcji KF były wyższe i wynosiły 3,12-4,78. Porównywalne zawartości jednostek typu wanilinowego i syryngowego w materiale badawczym przejawiają się w wartościach stosunku jednostek syryngowych do wanilinowych wynoszącym 0,53-1,57. Jednak dla większości próbek materiału badawczego parametr ten przyjmuje wartość bliską jedności zarówno dla ekstraktów z obu hydrolizatów, jak i z ekstraktów z hydrolizatów kwasowych. WNIOSKI 1. Zastosowanie metody hydrolizy zasadowej po hydrolizie kwasowej istotnie wpływa na zawartości związków fenolowych. Metodą re-hydrolizy wyizolowano z próbek materiału roślinnego i gleb od 35,8 do 84,7% związków fenolowych. 2. Znacznie większy udział związków fenolowych wyizolowanych z próbek gleby poziomu darniowego w porównaniu z poziomami AE i Bsv po zastosowaniu rehydrolizy jest konsekwencją ilości materii organicznej podlegającej rozkładowi, a tym samym zawartości związków fenolowych izolowanych w roztworze o odczynie zasadowym. 3. Zawartości związków fenolowych zmniejszały się w kolejności: siano > ruń > korzenie > gleba poziom A > gleba poziom AE > gleba poziom Bsv > KF poziom A > KF poziom AE > KF poziom Bsv > KH poziom A > KH poziom AE > KH poziom Bsv. 4. Nie wykazano jednoznacznych różnic w składzie ilościowym związków fenolowych między próbkami pobranymi w różnych odległościach od rowu nawadniającego, jak i między próbkami pobranymi na terenie obiektów nawadnianych i nienawadnianych. 5. Wśród zidentyfikowanych związków fenolowych w próbkach materiału roślinnego (siano, ruń, korzenie) dominującymi były kwasy: ferulowy, p-kumarowy i chlorogenowy, których udziały stanowiły 6,8-36,7% sumy wszystkich oznaczonych związków fenolowych. Udziały tych kwasów w próbkach gleby wynosiły 3,8-35,7%. 6. Roślinność łąkowa występująca na badanych obiektach charakteryzowała się znacznym udziałem jednostek cynamonowych (C) w porównaniu z udziałami jednostek wanilinowych (V) i syryngowych (S). Wzajemne proporcje V:S:C mieściły się w zakresie od 1:1:6 do 1:1:9. 7. Proces humifikacji materii organicznej badanych gleb był związany ze zmniejszającymi się zawartościami sumy jednostek wanilinowych, syryngowych i cynamonowych. Najniższe zawartości V+S+C otrzymano dla KH poziomu Bsv. 8. W procesie humifikacji zmniejsza się udział jednostek cynamonowych, zaś wzrasta udział jednostek syryngowych i wanilinowych, przy jednoczesnym zachowaniu proporcji V:S na poziomie zbliżonym do 1:1. 8
9. Istotnie wyższy udział jednostek cynamonowych nad wanilinowymi i syryngowymi w ekstraktach kwasów fulwowych i nieznaczna ich przewaga w hydrolizatach kwasów huminowych, potwierdza wpływ składu chemicznego materiału roślinnego ulegającego rozkładowi na właściwości powstających substancji humusowych. 9