OCHRONA RADIOLOGICZNA PACJENTA BIOLOGICZNE EFEKTY DZIAŁANIA PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO dr Joanna Łanuszewska CZAS WYKŁADU: 2 godz.
Promieniowanie jonizujące uszkadza cząsteczki występujące w komórkach Najczęstszym zdarzeniem jest radioliza cząsteczek wody, ponieważ to woda stanowi największą część komórki H 2 O 2 Uszkadzanie składników komórki może być pośrednie, poprzez rodniki tlenowe, lub bezpośrednie: Białka Lipidy Kwasy nukleinowe 2
Obecność rodników, przede wszystkim tlenowych, to stres oksydacyjny. Komórka reaguje na ten stres, aby ograniczyć jego skutki 1. Nieswoiste systemy redukujące: - Glutation GSH (i inne związki zawierające grupy SH) - Witamina C - Kwas moczowy 2. Enzymatyczna ochrona przed ROS 3. Ochrona przed utlenianiem lipidów związki redukujące rozpuszczalne w tłuszczach i enzymy związane z błoną - witamina E - -karoten -peroksydaza glutationowa (GSH-Pox) 4.Wiązanie metali przejściowych białka wiążące metale: -transferyna (Fe) - ferrytyna (Fe) - ceruloplazmina (Cu) W obecności metali : H 2 O 2 + Fe(II) Fe(III) + HO. (reakcja Fentona) 5.Aktywacja systemu przekazywania sygnału umożliwia komórkom dopasowanie swojego działania do zmienionych warunków 3 6.Naprawa/usuwanie uszkodzonych cząsteczek Naprawa DNA, wymiana uszkodzonych białek i lipidów
Podwyższenie ilości silnie reaktywnych rodników tlenowych powoduje: 1. Obniżenie poziomu glutationu, wykorzystywanego do usuwania rodników tlenowych 2. Uszkodzenie DNA (kwasów nukleinowych) 3. Bezpośrednie uszkodzenie białek blokowanie/aktywacja enzymów deregulacja wymiany jonowej (sygnalizacja, uwodnienie) uszkodzenie szkieletu białkowego komórki zahamowanie syntezy ATP (magazynu energii) 4. Podwyższenie stężenia wolnego żelaza 5. Utlenianie lipidów błonowych, uszkodzenie błon 4
Budowa DNA odpowiada szczególnym właściwościom wymaganym dla nośnika informacji genetycznej kolejność zasad azotowych w DNA koduje informacje strukturalne (budowa białek) i regulacyjne GENY (DNA) BIAŁKA (budulec i funkcjonowanie komórki) 5 Zasady azotowe ich kolejność koduje informację
DNA informacja o budowie i funkcjonowaniu komórki, zapisana jest w jądrze komórkowym Budowa jądra międzypodziałowego: Mniej i bardziej skondensowana chromatyna jest łatwiej lub trudniej dostępna dla białek rozpoznających i naprawiających uszkodzenia Chromosom w pełni skondensowany w czasie podziału 6
Uszkodzenia radiacyjne DNA mogą być bardzo różne, niezależnie od tego, czy są to uszkodzenia bezpośrednie, czy pośrednie 7 Uszkodzenia złożone (kilka różnych uszkodzeń występujących w bezpośredniej bliskości) powstają przede wszystkim pod wpływem bombardowania cząstkami (neutrony, promieniowanie ), promieniowania o dużej gęstości. Skuteczność biologiczna takiego promieniowania jest znacznie większa od skuteczności biologicznej promieniowania.
. Frakcja przeżywająca 8 Zależność efektu promieniowania od liniowego przekazywania energii Dawka w Gy LPE (ang. LET linear energy transfer) = współczynnik liniowego przekazywania energii, (KeV/μm) Promieniowanie cząsteczkowe wywiera większy efekt w przeliczeniu na jednostkę dawki (np. 1 Gy) niż promieniowanie elektromagnetyczne RBE (Relative biological efficiency) = = WSB (względna skuteczność biologiczna) WSB = Dawka referencyjna (prom. X) Dawka prom. o wysokim LPE Dla jednakowego poziomu przeżycia (zmienia się z dawką) Np. WSB dla neutronów dla 50% przeżycia = 3,0 dla 10% przeżycia = 2,4
Skutki biologiczne uszkodzenia DNA Zależnie od tego, jakie miejsce w DNA jest uszkodzone i czy uszkodzenie jest szybko naprawione, skutki biologiczne mogą być żadne, lub nieznaczne (uszkodzenie naprawione, lub miejsce uszkodzenia nie zawiera informacji aktywnej), albo bardzo istotne. Skutki nie naprawionego uszkodzenia mogą dotyczyć jednego rodzaju białek (uszkodzenie konkretnego genu), lub całych grup cząsteczek, a nawet całej komórki (uszkodzenie fragmentów regulujących funkcjonowanie genomu). 9
Częstości uszkodzeń DNA Rodzaj uszkodzenia Liczba uszkodzeń spontanicznych w komórce na godzinę Liczba uszkodzeń w komórce na 1 Gy Pęknięcie podwójnoniciowe < 1 40 Pęknięcie pojedynczoniciowe 5 x10 3 1000 Utrata zasady 1.5 x10 3 950 Uszkodzenie zasady 1.25 x10 3 Najbardziej istotne dla skuteczności biologicznej promieniowania jonizującego są podwójne pęknięcia DNA i (szczególnie dla bombardowania cząstkami) uszkodzenia złożone. 10 D. Billen, Spontaneous DNA damage and its significance for negligible dose controversy in radiation protection, Radiat. Res., 124, 242 (1990). Wg: Janusz Harasimowicz
Komórki w różny sposób odpowiadają na uszkodzenie DNA (Synteza nowych białek) 11
Cykl komórkowy i jego zatrzymywanie po uszkodzeniu DNA Zatrzymanie cyklu komórkowego jest możliwe tylko w pewnych okresach tego cyklu. W czasie fazy S zatrzymanie syntezy DNA jest możliwe tylko na pewien czas, potem komórka podejmuje syntezę DNA lub ginie. 12
Naprawa uszkodzeń radiacyjnych DNA Pęknięcia pojedynczych nici DNA powstające na skutek promieniowania jonizującego są na ogół łatwo i szybko naprawiane. Podwójne pęknięcia nici DNA, a szczególnie uszkodzenia złożone są znacznie trudniejsze do naprawy. W komórkach ssaków głównym systemem naprawczym takich pęknięć jest łączenie niehomologicznych końców. Ten system naprawy może prowadzić do powstawania mutacji. 13
Dlaczego tak istotna jest naprawa DNA w komórce? DNA jest jedyną makrocząsteczką, która ze względu na swoją rolę nośnika informacji genetycznej, podlega naprawie; inne cząsteczki są na ogół wymieniane!!! Nowotwory, wiele chorób neurodegeneracyjnych oraz starzenie się organizmu są, m.in., wynikiem niekompletnej naprawy DNA. Międzyosobnicze różnice w wydajności naprawy DNA są jedną z przyczyn różnic w podatności na nowotwory. Wydajność systemów naprawy DNA w komórkach nowotworowych decyduje w wrażliwości niektórych nowotworów na chemio- i radioterapię. 14
15 Naprawa przez wycinanie zasady usuwa radiacyjne uszkodzenia zasad i pojedyncze pęknięcia nici DNA
Naprawa podwójnych pęknięć DNA: przez łączenie niehomologicznych końców (A) naprawa szybka, występuje w komórkach nie dzielących się, lub w fazie G1 i S cyklu komórkowego; przez rekombinację homologiczną (B) znacznie wolniejsza, ale dokładna, jest możliwa tylko w obecności drugiej kopii chromosomu, a więc w późnej fazie S i w fazie G2 przed podziałem jądra. A B 16
Niekiedy komórka nie może naprawić uszkodzonego DNA Synteza DNA (replikacja) na uszkodzonej matrycy może doprowadzić do powstania mutacji. Nie naprawione pęknięcia DNA mogą powodować niewłaściwą wymianę fragmentów chromosomów aberracje chromosomowe. W pewnych wypadkach może doprowadzić to do utrwalenia niestabilności genetycznej. W najlepszym przypadku dochodzi do śmierci komórki, lub zablokowania możliwości podziału (usuwanie zagrożenia). 17
Programowana śmierć komórki - apoptoza Śmierć komórki wynikająca z włączenia wewnętrznego programu samobójczego. Zachodzi dobrze wyróżnionymi etapami, które można obserwować już w mikroskopie świetlnym. W czasie apoptozy nie następuje naruszenie ciągłości błon komórkowych. Nie powoduje powstawania stanów zapalnych w organizmie. 18
Apoptoza indukowana promieniowaniem jonizującym jest związana z sygnałami zarówno z uszkodzonego DNA (w jądrze), jak i pozostałych części komórki (błony komórkowe) Receptory śmierci - FAS ceramid Błona komórkowa JNK ROS Kaspaza 8 mitochondrium Specyficzne białka apoptotyczne i antyapoptotyczne Inne kaspazy Aktywacja kaspaz Degradacja białek ATM/ATR Uszkodzenia DNA p53 19 Degradacja DNA jądro
Nekroza Śmierć komórek wynikająca z zaburzenia podstawowej homeostazy komórki. Z reguły związana jest z przerwaniem ciągłości błony komórkowej. Obraz morfologiczny różni się znacząco od obrazu apoptozy. Powoduje powstanie silnego odczynu zapalnego. 20
DNA nie jest jedyną cząsteczką uszkadzaną w komórce Uszkodzeniom podlegają wszystkie cząsteczki, najistotniejsze zmiany występują w przypadku białek (utrata lub zaburzenie funkcji) i lipidów (zaburzenia struktury błon komórkowych). Uszkodzenie błon wpływa nie tylko na regulację śmierci (indukcja apoptozy lub nekrozy), ale też na aktywację receptorów błonowych i przeżycie komórki. 21
Zmiana funkcjonowania komórki pod wpływem uszkodzenia DNA Przekazywanie sygnału o uszkodzeniu DNA w komórce może spowodować włączanie syntezy specyficznych białek regulujących funkcjonowanie komórek. Do takich białek zalicza się białka regulujące etapy cyklu komórkowego, białka rozpoznające i naprawiające uszkodzenia DNA, białka usuwające uszkodzone struktury komórkowe (RNA, białka, lipidy) i hamujące syntezę innych białek na uszkodzonych matrycach, białka aktywujące programowaną śmierć komórki i wiele innych. 22
Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące W komórkach występuje szereg szlaków sygnałowych regulujących wzrost i przeżycie a reagujących na promieniowanie jonizujące. Ostateczna reakcja na działanie tych szlaków zależy od: typu komórki, natężenia i czasu trwania bodźca, tła genetycznego 23
Szlaki sygnałowe często rozpoczynają się w błonie komórkowej a kończą na terenie jądra, gdzie czynnik transkrypcyjny ostatni element szlaku sygnałowego, wiąże się z DNA i aktywuje syntezę potrzebnych białek Błona komórkowa jądro Receptor Czynnik transkrypcyjny Różne białka = Przystosowanie komórki do nowych warunków 24 Fosforylacja dołączenie grupy fosforanowej, jest najczęściej występującą modyfikacją białka, która zmienia jego aktywność. Często jest wykorzystywana do szybkiego reagowania na różne bodźce.
Wiele szlaków sygnałowych, regulujących przeżycie jest aktywowanych przez receptorowe kinazy tyrozynowe, przede wszystkim z grupy ERBB (receptory hormonów wzrostu), które mogą być stymulowane przez promieniowanie jonizujące. Taka aktywacja może spowodować zablokowanie śmierci komórki. Na fioletowo zaznaczone są, indukowane przez czynnik transkrypcyjny, białka hamujące programowaną śmierć komórki (apoptozę) NFkB Czynnik transkrypcyjny 25
Śmierć lub przeżycie komórki zależy od równowagi pomiędzy szlakami powodującymi przeżycie i śmierć. Ta równowaga jest z kolei zależna od rodzaju komórek, typu, natężenia i czasu trwania uszkodzenia, oraz oddziaływania komórki ze środowiskiem (sygnały zewnątrzkomórkowe) 26
Ocena wrażliwości komórek na promieniowanie -Testy oparte o przeżycie komórek (krzywa przeżycia, oznaczenia apoptozy, oznaczenia metabolizmu komórek). - Testy cytogenetyczne (test mikrojądrowy [MN], aberracje chromosomowe [CA], wymiana siostrzanych chromatyd [SCE]). - Oznaczanie uszkodzeń i/lub naprawy DNA (fosforylacja histonu H2AX, test kometowy). - testy oparte o całościowe analizy genetyczne i genomiczne pozwalają na pełną analizę uszkodzeń DNA w wielu genach i zmian ekspresji genów w komórkach. 27
Test przeżywalności komórek Ilościowa ocena wpływu promieniowania na populację komórkową: jaka część populacji zachowa po napromienianiu zdolność do namnażania się, tj. zdolność wytworzenia kolonii zawierających 50 komórek po czasie odpowiadającym 5-6 podziałom komórkowym. 28
Krzywe przeżycia komórek klonogennych metoda Pucka i Marcusa Kontrola nienapromieniona Ilość posianych komórek, np. 100 Czas 7-14 dni (6-7 podziałów) Ilość wyrosłych kolonii, np. 20 Kolonia pełnocenna = 50 komórek Komórki napromienione np. 2Gy Ilość posianych komórek, np. 100 (im wyższa dawka tym wiecej posiewanych komórek) Czas 7-14 dni (6-7 podziałów) Ilość wyrosłych kolonii, np. 12 Kolonia poronna <50 komórek Wydajność posiewu (ang. Plating efficiency, PE) dla kontroli = 20/100 = 0,2 (zawsze<1). Wydajność posiewu dla dawki 2 Gy = 12/100 = 0,12 29 Frakcja przeżywająca (ang. Surviving fraction, SF) dla kontroli przyjęta za 1; SF po dawce 2 Gy = 0,12/ 0,2 = 0,6
Oznaczenie radiowrażliwości metodą przeżywalności komórek klononogennych Krzywa przeżywalności w układzie półlogarytmicznym Frakcja przeżywająca Dawka pochłonięta (Gy) 30 Krzywa ta pozwala jednakowo dokładnie ocenić zmniejszenie przeżycia z poziomu 100% do 10%, jak i np. z 0,001% do 0,0001%
Metoda mikrojądrowa - schemat Linie komórkowe zablokowanie podziału komórek Zbieranie i liczenie komórek dwujądrzastych i zawierających mikrojądra tworzenie mikrojąder Limfocyty 31
Test mikrojądrowy obrazy komórek A B Przykład komórek jedno- (A) i dwujądrzastych (B) linii HCT116, barwionych DAPI. Powiększenie 40X. 32 Limfocyty człowieka z mikrojądrami wyindukowanymi dawką 2 Gy in vitro Wideł 2007
Analiza aberracji chromosomowych jako metoda dozymetrii biologicznej Aberracje chromosomowe (widoczne uszkodzenia struktury chromosomu związane z podwójnymi pęknięciami DNA, które są błędnie połączone) prowadzą do śmierci reprodukcyjnej lub też do niestabilności genetycznej 33
Chromosomowe następstwa działania promieniowania jonizującego Aberracje chromosomowe: delecje chromosom dwucentryczny chromosom pierścieniowy Wymiana fragmentów w obrębie jednego chromosomu inwersje Fragmenty acentryczne najczęściej przekształczne są w mikrojadra Wymiana fragmentów pomiędzy dwiema chromatydami translokacje symetryczne translokacje asymetryczne 34
Zasada działania metody kometowej Komórki z uszkodzonym DNA (pęknięcia nici) Komórki zawieszone są w agarozie i umieszczone na szkiełku Po elektroforezie, uszkodzone DNA (ogon) jest oddzielone od nieuszkodzonego (głowa). można je oglądać Po zabarwieniu barwnikiem fluorescencyjnym w mikroskopie żywe komórki z kultur, krwi i tkanek 35
Test kometowy: Pozwala ocenić stopień uszkodzeń DNA i kinetykę ich naprawy na poziomie pojedynczych komórek. W komórkach z uszkodzonym DNA powstają ogony DNA, ponieważ przecięte nici DNA mogą wędrować w polu elektrycznym. Miarą poziomu uszkodzenia jest długość ogona i ilość zawartego w nim DNA wraz z upływem czasu ilość uszkodzeń maleje dzięki naprawie. Występuje korelacja wyników testu z efektem biologicznym napromieniania. 36 D = 0*A0 + 1*A1 + 2*A2 + 3*A3 + 4*A4
Półautomatyczna analiza komet w za pomocą programu komputerowego moment ogonowy = zawartość DNA x długość ogona 37
Wyniki oznaczenia cechują się dużym rozrzutem w populacji osób zdrowych i chorych 38 Palyvoda i wsp. 2001
Inne metody pomiaru radiowrażliwości Podatność na podwójne pęknięcia DNA można mierzyć obserwując kinetykę tworzenia i zanikania foci jądrowych zawierających białka odpowiedzi na stres genotoksyczny np. H2AX Andegeko 2001 Ocena żywotności komórek w oparciu o aktywność metaboliczną: Test MTT/MTS: kolorymetryczna metoda redukcji błękitu tetrazolowego przez żywe komórki do barwnej postaci związku (formazonu) przy udziale dehydrogenazy NADP/NADPH: Porównuje się wartości absorbancji w grupie komórek napromienianych różnymi dawkami i komórek kontrolnych Metody oceny apoptozy a.mikroskopowe b.cytometryczne 39