Wstęp do radiobiologii Wykład 2 radiobiologia komórkowa

Transkrypt

1 Wstęp do radiobiologii Wykład 2 radiobiologia komórkowa

2

3 DNA jest komórkową tarczą dla promieniowania jonizującego aparat Golgiego 6% jądro siateczka 6% śródplazmatyczna 9% błona komórkowa lizosom 1% endosom 1% rybosom mitochondrium 22% cytoplasma 54%

4 Częstości popromiennych i spontanicznych uszkodzeń DNA Dawka 1 Gy wywołuje ~100,000 jonizacji w komórce rodzaj uszkodzenia uszkodzenia w komórce na 1 Gy uszkodzenia spontaniczne w komórce na godzinę pęknięcie podwójnoniciowe pęknięcie pojedynczoniciowe utrata zasady uszkodzenie zasady <

5 popromienne uszkodzenia DNA promienie X, gamma, beta neutrony, protony, ciężkie jony uszkodzenie Basenschaden zasady DNA Einzelstrangbruch pojedynczoniciowe pęknięcie DNA Doppelstrangbruch podwójnoniciowe pęknięcie DNA Einzelstrangbruch H O H O 2 Radiolyse radioliza OH. (OH Radikal) rodnik H. pojedynczoniciowe Indirekte Wirkung pęknięcie DNA rodnik (hydratisierter Wasserstoff) tlen potęguje efekt pośredni: H. + O 2 HO. 2 2 HO. 2 H 2 O 2 + O2 2 HO. 2 + H. H 2 O 2

6 Ciąg zdarzeń w napromienionej komórce Uszkodzenia pośrednie i bezpośrednie Wychwyt wolnych rodników przez zmiatacze Rozpoznanie uszkodzeń DNA Zatrzymanie cyklu i naprawa uszkodzeń DNA lub skierowanie komórki na drogę apoptozy

7 Radioochraniacze, czyli zmiatacze wolnych rodników Glu glutation Cys Gly SH atak przez rodnik. OH powstaje disulfid glutationu GSH +. OH H 2 O + GS. GS. + GS. GSSG grupa tiolowa GSOH H 2 O H 2 O 2 peroksydaza glutationowa reduktaza glutationowa GS. RH GSH R. NADP + + H + Q-X HX transferaza glutationowa elektrofilowe ksenobiotyki GS-Q GSSG NADPH ATP ADP + P

8 Pierwszy krok w naprawie DNA: rozpoznanie uszkodzenia (mocno uproszczone!) białka genów supresorowych białka onkogenów aktywacja supresja Atm p53 Mdm2 Puma Noxa Bax Waf1 Rb zatrzymanie zatrzymanie w cyklu cyklu Bcl2 śmierć śmierć apoptotyczna apoptotyczna naprawa naprawa DNA DNA

9 Drugi krok w naprawie DNA: mechanizmy naprawy ale najpierw trochę o cyklu komórkowym... Chromatyna ulega dekondensacji Chromatyna rozluźniona Chromatyna ulega kondensacji Chromatyna spakowana + G 1 S G 2 M

10 Naprawa DNA: schemat głównych szlaków rodzaje uszkodzeń DNA: ssb ssb bd bd dsb ssb - single strand break bd - base damage dsb - double strand break uszkodzenia letalne subletalne potencjalnie letalne naprawa z wycięciem przy użyciu komplementarnej nici DNA jako matrycy BER - base excision repair NER - nucleotide excision repair NMR komórek - nucleotide mismatch w cyklu. repair ssb i bd powstają w komórkach spontanicznie z częstością około 8000 / komórkę / godzinę uszkodzenie w S / G 2 pojęcia operacyjne wprowadzone do wytłumaczenia zjawiska wzrostu odporności na promieniowanie przez: 1. rozbicie dawki na frakcje (Elkind repair) naprawa szybka i wierna 2. przez trzymanie komórek po napromienieniu w warunkach suboptymalnych (liquid holding) powodujących zatrzymanie naprawa rekombinacyjna przy użyciu chromatydy siostrzanej jako matrycy naprawa stosunkowo powolna ale wierna W obu przypadkach komórka zyskuje czas na naprawę uszkodzeń! HRR - homologous recombination repair uszkodzenie w G 1 naprawa przez sklejenie wolnych końców DNA po ich nadtrawieniu naprawa stosunkowo powolna i błędna NHEJ - non homologous end joining

11 Pomiar naprawy DNA - test kometowy (elektroforeza pojedynczych komórek) 0 min 15 min 30 min 180 min długość ogona kinetyka naprawy w czasie głowa ogon czas naprawy (min)

12

13 Naprawa DNA jest przestrzennie uporządkowana "ogniska" z udziałem białka Rad51 (białko naprawy HRR) B.C. Godthelp, M. Zdzienicka i wsp., Nucleic Acid Research 30, 2002 bez traktowania traktowane mitomycyną C traktowane promieniami X komórki V79B (dzikie - wt) ogniska komórki CL-V4B mutanty rad51c brak ognisk komórki CL-V4B z skomplementowanym genem rad51c ogniska

14 Poziom podwójnoniciowych pęknięć DNA można mierzyć badając ogniska gamma-h2ax M. Löbrich et al. Kinetyka powstawania ognisk w jądrze komórki napromienionej światłem laserowym

15 Naprawa DNA nie zawsze przebiega w sposób bezbłędny... schemat powstawania popromiennych aberracji chromosomowych może prowadzić do procesu nowotworzenia prowadzi do śmierci komórki dicentryk fragmenty acentryczne translokacja

16 Komórka z chromosomem dicentrycznym ace dic

17 Jeszcze trochę o cyklu i podziale mitotycznym... Podział chromosomu podczas mitozy podział chromosomu na dwie chromatydy M G 0 G 2 G 1 cytoplazma jądro S wrzeciona mitotyczne

18 Schemat powstawania mikrojąder popromiennych wrzeciono mitotyczne fragment acentryczny mikrojądro mikrojądra są przyczyną śmierci mitotycznej komórki

19 Komórki dwujądrzaste z mikrojądrami Mn Mn

20 Rzut oka na całość: los komórki napromienionej Gy komórka zdrowa naprawa DNA bezbłędna naprawa DNA błędna po wysokiej dawce komórka z uszkodzonym DNA śmierć nekrotyczna efekt somatyczny brak efektu niestabilne aberracje chromosomowe mikrojądra śmierć mitotyczna stabilne aberracje chromosomowe, mutacje tor mutacyjny nowotwór brak efektu w komórkach rozrodczych śmierć apoptotyczna efekt somatyczny efekt somatyczny efekt kancerogenny efekt genetyczny

21 Dlaczego i w jaki sposób umierają komórki z uszkodzonym DNA? śmierć mitotyczna śmierć jest konsekwencją błędów podczas podziału komórkowego śmierć interfazalna komórka umiera zanim zdoła się podzielić śmierć apoptotyczna śmierć nekrotyczna komórka umiera ponieważ włącza program autodestrukcji komórka umiera ponieważ traci zdolność do zachowania równowagi wodno-elektrolitowej

22 Historia hodowli tkankowej Alexis Carrel ( ) chirurg francuski Laureat nagrody Nobla 1912 hodowla tkanki sercowej wyizolowanej z 18-dniowego zarodka kurczaka do Hodowla w osoczu krwi zwierzęcej Scientific Amercian January 1942

23 1951: pierwsza stała linia komórkowa HeLa Założona przez George a i Margaretę Gey Wyizolowana z wycinka nowotworu szyjki macicy Henrietty Lacks Komórki HeLa

24 Ważny punkt końcowy w radiobiologii: ocena przeżywalności komórek Test przeżywalności - schemat eksperymentu komórki w hodowli trypsyna 0 Gy 1 Gy 2 Gy 3 Gy rozsianie zawiesina komórek frakcja przeżywalności (SF) inkubacja: 1-2 tygodnie SF = liczba kolonii liczba komórek x PE/100 PE = wydajność klonowania liczba kolonii: wydajność klonowania: frakcja przeżywalności: 70 70% , , ,14

25 Pierwsza krzywa przeżywalności Puck i Markus, 1956 ramię krzywej (shoulder) skala log eksponencjalna część krzywej

26 krzywa przeżywalności D Q = miara szerokości ramienia Przeżywalność 1 0,1 D Q krzywa 1 = 0,6 Gy D 0 krzywa 2 = 1,5 Gy D 0 D 0 = miara promieniowrażliwości = dawka, która powoduje obniżenie przeżywalności do e -1 = do 37% mierzonej na prostej duże D 0 0,037 D 0 D 0 małe D 0 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Dawka (Gy)

27 Jak wytłumaczyć eksponencjalną część krzywej? Prawdopodobieństwo przeżycia komórek nie trafionych jako funkcja średniej liczby trafień na komórkę liczba trafień w komórkę Według równania Poissona: P (0) = e -λ (λ = średnia trafień na komórkę) zależność dawka-efekt liczba trafień w komórkę liczba trafień w komórkę

28 Modele wyjaśniające przebieg krzywej Model wysyconej naprawy (repair saturation model) D Q = miarą zdolności naprawy uszkodzeń subletalnych naprawa naprawa sprawna ale nie w 100% => część komórek ginie naprawa naprawa wysycona => przeżywalność zależy od liczby trafień

29 Modele wyjaśniające przebieg krzywej Model liniowo-kwadratowy (LQ model, Douglas and Fowler 1976) P(0) = e (-αd - βd2 ) uszkodzenia typu one-hit (zależność liniowa) prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D uszkodzenia typu two-hit (zależność liniowo-kwadratowa) prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D 2 Dose (Gy)