RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 206037 (21) Numer zgłoszenia: 362475 (22) Data zgłoszenia: 22.01.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 22.01.2002, PCT/EP02/000578 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 25.07.2002, WO02/57459 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/53 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 9/20 (2006.01) C12R 1/90 (2006.01) (54) Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące, białko fosfolipazy A 1 z Tetrahymena thermophila, zastosowanie kwasu nukleinowego i sposób ekspresji fosfolipazy A 1 oraz nośnik sekwencji kwasu nukleinowego (30) Pierwszeństwo: 22.01.2001, DE, 10105152.2 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.11.2004 BUP 22/04 (73) Uprawniony z patentu: CILIAN AG, Muenster, DE (72) Twórca(y) wynalazku: MARCUS HARTMANN, Muenster, DE MARCO GRENNINGLOH, Muenster, DE ARNO TIEDTKE, Muenster, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.06.2010 WUP 06/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Kamiński Zbigniew Kancelaria Patentowa PL 206037 B1
2 PL 206 037 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony niekodujące i kodujące fosfolipazę A 1 z Tetrahymena thermophila, N-końcowa sekwencja sygnałowa fosfolipazy A 1 (PLA 1 ), białko fosfolipazy A 1 (PLA 1 ), zastosowanie tej sekwencji kwasu nukleinowego lub jej fragmentów, sposób homologicznej lub heterogenicznej ekspresji białek i peptydów, oraz homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu. Przedmiotem wynalazku jest również wektor, plazmid, kosmid, chromosom, albo minichromosom, transpozon, element IS, rdna, albo inne rodzaje pierścieniowego bądź liniowego DNA, albo RNA, zawierający przynajmniej jedną z przedmiotowych sekwencji kwasów nukleinowych. W biotechnologicznych technikach ekspresji heterogenicznej obcych białek, szczególnie, stosowanych do uzyskiwania zrekombinowanych substancji czynnych, duże znaczenie odgrywają komórki drożdży, bakterii i ssacze linie komórkowe. Do wytwarzania zrekombinowanych peptydów lub białek, takich jak np. insulina, interleukina-2, aktywator plazminogenu tkankowego, proteazy i lipazy stosowane są układy ekspresyjne oparte na E.coli lub B.subtilis. W przypadku bakterii Gramujemnych, układy ekspresyjne oparte są najczęściej elementach genetycznych takich, jak operon lac lub operon tryptofanu. Białka obce dla organizmu gospodarza są wytwarzane w ciałkach inkluzyjnych, wewnątrz komórki, albo, jeśli zastosowano układ ekspresyjny oparty na genach kodujących β-laktamazę, w przestrzeni peryplazmatycznej. Nie opracowano jeszcze otrzymywania zrekombinowanych białek w otaczającej komórki pożywce fermentacyjnej. Jak dotychczas, wprowadza się w układach ekspresyjnych i uzyskuje nadekspresję w bakteriach Gram-dodatnich niemal wyłącznie białek komórkowych. Do otrzymywania, drogą nadekspresji heterogenicznej, białek zrekombinowanych, np. ludzkiego czynnika XIIla, bydlęcej pro-chymosyny, fitazy czy antygenów powierzchniowych stosowane są także drożdże np. Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis lub Pichia pastoris. W tych komórkach układy ekspresyjne oparte są na wektorach wahadłowych, które (w zależności od zastosowanego gospodarza) wykorzystują elementy genetyczne galakto-kinazo-epimerazy, oksydazy metanolowej, kwaśnej fosfatazy lub dehydrogenazy alkoholowej. Typowo białka zrekombinowane wytwarzane są do cytoplazmy komórki. Jeśli zastosowano sekwencje sygnałowe drożdży, np. czynnik alfa, wytworzone białka mogą być także wydzielane do środowiska fermentacyjnego. Glikozylacja wydzielanych białek zachodzi zgodnie z typem wysokiego poziomu mannozy" i często następuje wytworzenie nadmierne glikozylowanych białek, co może prowadzić do wytwarzania w organizmie pacjenta przeciwciał przeciwko tym białkom. Zastosowanie w heterogenicznej ekspresji rekombinowanych białek znajdują także linie komórek ssaczych, na przykład komórek różnych gatunków gryzoni (komórki CHO, komórki C127) lub małp (komórki vero, CV-1, lub COS). Układy ekspresyjne oparte są na zrekombinowanych wirusach (wektor BPV) lub na wektorach wahadłowych. Do regulacji ekspresji stosowane są także wirusowe układy Enhancer/Promotor SV40 lub komórkowe elementy enhancerowe. Zrekombinowane białka, takie jak erytropoetyna, są wydzielane do pożywki fermentacyjnej, gdyż wprowadzone geny niosą zazwyczaj gotowe sekwencje sygnałowe, które są odczytywane przez układ ekspresyjny i wykorzystywane do kierowania białek. Ponadto w biotechnologii, do wytwarzania glikozylowanych enzymów zewnątrzkomórkowych stosowane są pierwotniaki rodzaju Tetrahymena. Hodowla tych orzęsek może być prowadzona na podłożach fermentacyjnych korzystnych z ekonomicznego punktu widzenia, przy stosowaniu standardowego procesu fermentacyjnego. Do transformacji komórek odpowiednie są wektory oparte na rdna pochodzącym z Tetrahymena. Do heterogenicznej ekspresji białek bakteryjnych w komórkach Tetrahymena stosuje się konstrukty DNA obejmujące geny pochodzące z Tetrahymena. Opracowanie odpowiednich środków do regulacji transkrypcji, ukierunkowania białka i glikozylacji obcych białek, umożliwi wykorzystanie Tetrahymena jako idealnego układu ekspresyjnego w ekonomicznie korzystnej produkcji medycznie wykorzystywanych zrekombinowanych białek. W stosowanych dotychczas układach ekspresyjnych w bakteriach Gram-ujemnych, uzyskuje się typowo utworzenie ciałek inkluzyjnych w komórce, z jednoczesną denaturacją białka. W celu uzyskania zrekombinowanego białka komórki muszą zostać zniszczone i konieczne jest ponowne pofałdowanie unieczynnionego białka, prowadzącego do odzyskania jego aktywności biologicznej. Powoduje to konieczność zastosowania dalszych kosztownych etapów procesu technologicznego, a także obniża ilość uzyskanego pożądanego białka. Tak ważna dla białek eukariotycznych glikozylacja nie wy-
PL 206 037 B1 3 stępuje w ogóle. Natomiast zastosowanie układów ekspresyjnych w bakteriach Gram-dodatnich, powoduje, że pozyskanie docelowego białka jest wielce problematyczne ze względu na wysoką aktywność proteolityczną w pożywce fermentacyjnej. Zastosowanie drożdży do ekspresji heterogenicznej docelowego białka zawsze prowadzi do wytwarzania białka wewnątrzkomórkowo, i konieczności pozyskania go w wyniku zniszczenia komórki. Powoduje to, podobnie jak to ma miejsce w przypadku bakteryjnych układów ekspresyjnych, dodatkowe wydłużenie czasu obróbki oraz konieczność stosowania dodatkowych, kosztownych etapów. Jeżeli zostaną zastosowane własne peptydy sygnałowe drożdży, to obce białka nie zostaną odpowiednio złożone i glikozylowane podczas wydzielania. Przeciwnie, wytwarzanie zrekombinowanych białek w liniach komórkowych ssaków, prowadzi do uzyskania żądanego białka w podłożu fermentacyjnym, poza komórkami, prawidłowo złożone i glikozylowane. Wadą tego rozwiązania jest jednak niska efektywność ekspresyjna, wskutek występowania zakłóceń w przebiegu procesów biologicznych i nieefektywna translacja genów, które zostały wprowadzane do materiału genetycznego komórek z użyciem wektorów wirusowych. Z drugiej strony, zawierające surowicę podłoża fermentacyjne komórek ssaków są bardzo kosztowne. Technologia hodowli linii komórkowych wrażliwych na ścinanie, ze względu na konstrukcje zapewniające napowietrzanie podłoża wolne od pęcherzyków, jest skomplikowana oraz kosztowna. Kolejne problemy wynikają z dużego stopnia ryzyka grzybowego lub wirusowego zakażenia linii komórkowej. Reasumując, zastosowanie komórek ssaków do biotechnologicznego wytwarzania zrekombinowanych białek jest bardzo kosztowne, wymaga przestrzegania szeregu zasad bezpieczeństwa i charakteryzuje się niską wydajnością. Opisane powyżej wady nie występują w przypadku zastosowania do produkcji rekombinowanych białek orzęsków z rodzaju Tetrahymena. Zatem na przykład pewne kwaśne hydrolazy, które uczestniczą w trawieniu cząstek pokarmu, są usuwane z komórki w dużych ilościach i ulegają skomplikowanej glikozylacji. Alam i wsp. opisali w J. Euk. Microbiol. 43(4), 1996, strony 295 do 303, klonowanie genu kodującego kwaśną α-glukozydazę pochodzącą z Tetrahymena pyriformis. Jednakże tylko niewielka część tego białka została wydzielona z komórki. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/EP00/01853, opisano gen kodujący β-heksosaminidazę z Tetrahymena thermophila, jednak jak wiadomo białko to jest wydzielane z komórki tylko w 80%. Dotychczas jednak nie było możliwe uzyskanie ekspresji, glikozylowanego, białka eukariotycznego w komórkach Tetrahymena, tak aby jednocześnie białko to było wydzielane do podłoża fermentacyjnego. Nie było to możliwe, ponieważ dotychczas nie były znane sekwencje DNA kodujące białka wydzielane do otoczenia, pochodzące z Tetrahymena, które są niezbędne do opracowania wektorów ekspresyjnych zapewniających wydzielanie wytworzonego obcego białka wyłącznie do podłoża fermentacyjnego. Znane były natomiast sekwencje DNA kodujące białka β-heksosaminidazę z Tetrahymena thermophila. Sekwencja ta została przedstawiona do ochrony patentowej w zgłoszeniach o nr DE 199 58 979.8, DE 199 09 189.7, a także pod numerem PCT/EP00/01853. Wadą opisanych w tych wnioskach sekwencji jest jednak to, że obecne w białku pre/propeptydy zapewniają wydzielanie żądanego białka do otaczającego podłoża fermentacyjnego tylko w ilości około 80%. Jest to spowodowane zatrzymaniem w naturalnych warunkach przez błonę komórkową β-heksosaminidazy w około 20%, w wyniku tego tylko 80% naturalnie wyprodukowanego enzymu ulega wydzieleniu z komórki. Zatem jeśli w wyniku inżynierii genetycznej obce białko zostanie poprzedzone β-heksosaminidazą to obecne pre/pro-peptydy będą kierować to obce dla gospodarza białko w ilości około 20% do błony cytoplazmatycznej Tetrahymena thermophila. Jest to poważna wada techniczna procesu wytwarzania rekombinowanych substancji czynnych. Po pierwsze, zmniejsza ilość uzyskanego produktu, ponieważ część powstałego białka zostaje zatrzymana przez błonę komórkową a zatem nie całe uzyskane białko może zostać odfiltrowane z zawiesiny. Z kolei wprowadzone białko po wbudowany do błony komórkowej może działać toksycznie na własne komórki i w ten sposób spowolnić wzrost komórek. Do dnia dzisiejszego nie znane są żadne konstytutywne promotory z Tetrahymena, zapewniające jednorodność produktu lub stałość transkrypcji białek heterogenicznych. Jak dotąd znane są jedynie promotory genów kodujących histon i tubulinę (Bannon i wsp. 1984, Gaertig i wsp. 1993). Zasadniczą wadą tych promotorów jest jednak fakt, że ich aktywacja jest zależna od etapu cyklu komórkowego. Geny kodujące heterogeniczne białka zlokalizowane pod promotorem zależnym od etapu cyklu komórkowego, ulegają ekspresji tylko w komórkach rosnących lub ulegających podziałowi. Jest to zasadnicza wada procesu technologicznego, ponieważ żądane białka produkowane są tylko w lo-
4 PL 206 037 B1 garytmicznej fazie wzrostu kolonii. W statycznej fazie wzrostu, w której w procesie produkcyjnym osiągnięta zostaje najwyższa gęstość komórek i, w związku z tym, najwyższa wydajność organizmu produkującego (Tetrahymena), wzrost komórek prawie nie występuje, a w konsekwencji, występuje także niewielka ekspresja białek heterogenicznych. Wynalazek ma zatem za zadanie dostarczenie układu, który umożliwi po transformacji Tetrahymena, wydzielanie z komórek do środowiska białek heterogenicznych. Przedmiotem wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące określone sekwencją nr 4 (Seq. ID. Nr 4), w której regiony kodujące kodują fosfolipazę A 1 (PLA 1 ) z Tetrahymena thermophila (Seq. ID. Nr 5), a regiony niekodujące obejmują regiony zlokalizowane w górę i w dół od tego genu. Korzystnie niekodujące regiony w górę i w dół od genu są określone sekwencją Nr 2 oraz 3 (Seq. ID nr 2 oraz Seq. ID nr 3), a regiony kodujące są określone sekwencjami Nr 1, 8 i/lub 9 (Seq. ID nr 1, Seq. ID nr 8 i/lub Seq. ID nr 9). Przedmiotem wynalazku jest również N-końcowa sekwencja sygnałowa PLA 1 (Seq. ID nr 5), określona sekwencją Nr 6 (Seq. ID nr 6). Ponadto przedmiotem wynalazku jest białko fosfolipazy A 1 (PLA 1 ) o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej sekwencji Nr 7 (Seq. ID nr 7). Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kwasu nukleinowego według wynalazku lub jego fragmentów do homologicznych lub heterogenicznych ekspresji zrekombinowanych białek i peptydów, a także do homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób homologicznej lub heterogenicznej ekspresji białek i peptydów, oraz homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu, w którym orzęski Tetrahymena, transformuje się kwasem nukleinowym według wynalazku. Korzystnie kwasy nukleinowe lub ich fragmenty łączy się z homologicznymi i heterogenicznymi układami do ekspresji białek, takimi jak enhancery, promotory, operatory, miejsca inicjacji, terminatory, oporność na antybiotyki albo z innymi kwasami nukleinowymi, albo fragmentami DNA, albo sekwencjami różnych rodzajów wiroidów, wirusów, bakterii, archezoa, pierwotniaków, grzybów, roślin, zwierząt, albo ludzi. W innym korzystnym rozwiązaniu kwas nukleinowy wprowadza się do wektora, plazmidu, kosmidu, chromosomu, minichromosomu, transpozonu, IS, rdna, lub do każdego rodzaju pierścieniowego bądź liniowego DNA albo RNA. Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor, plazmid, kosmid, chromosom, albo minichromosom, transpozon, element IS, rdna, albo inne rodzaje pierścieniowego bądź liniowego DNA, albo RNA, zawierający przynajmniej jedną z sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku. Zaletą zastosowania kwasu nukleinowego kodującego fosfolipazę A 1 (Seq. ID Nr 7) jest to, że produkt tego DNA w określonych warunkach środowiskowych, jest wydzielany przez komórkę w dużych ilościach. Wytworzone białko ulega wydzieleniu w dużych ilościach do otaczającego komórki podłoża fermentacyjnego i nie jest wprowadzane do błony komórkowej. Zastosowana w ramach wynalazku sekwencja kwasu nukleinowego zawiera promotor, który powoduje konstytutywną tzn. niezależną od cykli komórkowych, transkrypcję przyłączonych do niego genów kodujących heterogeniczne białka. Ten sposób transkrypcji ma przy tym tę zaletę, że heterogeniczne białka są stale wytwarzane w organizmie gospodarza, w sposób niezależny od cyklu komórkowego. W ten sposób transkrypcja obcego genu a w konsekwencji, wytwarzanie heterogenicznych białek może mieć miejsce także w statycznej fazie wzrostu komórek. Zastosowana w ramach wynalazku sekwencja DNA kodująca fosfolipazę A 1 zawiera szczególnie pożądany odcinek PLA 1 w górę od tego genu (Seq. ID Nr 2), który jest nośnikiem elementów inicjacji transkrypcji, a także zawiera peptydy sygnałowe, propeptydy, oraz dalsze elementy genetyczne sterujące białkami, w szczególności odcinek PLA 1 zlokalizowany 'w dół' od genu (Seq. ID Nr 3), zawierający elementy genetyczne powodujące zatrzymanie transkrypcji. Zastosowanie kwasu nukleinowego według wynalazku umożliwia uzyskanie heterogenicznych białek niezależnie od cyklu komórkowego oraz ich transportowanie do otaczającego komórki podłoża fermentacyjnego, bez strat wskutek zatrzymywania białek w błonie cytoplazmatycznej i w konsekwencji możliwe jest odfiltrowywanie otrzymanych białek z zawiesiny fermentacyjnej bez konieczności lizy komórek. Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym
PL 206 037 B1 5 fig. 1 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego orzęsków, kodującą odcinek w górę (Seq. ID Nr 2), odcinek (Seq. ID Nr 1) oraz odcinek w dół (Seq. ID Nr 3) od genu kodującego fosfolipazę A 1 fig. 2 przedstawia wydzielony do podłoża produkt kwasu nukleinowego o Seq. ID Nr 1. Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja sygnałowa (Seq. ID Nr 6) objętego wynalazkiem białka. Odnosi się to przede wszystkim do objętych wynalazkiem, aminokwasów od 1 do 110 (Seq. ID Nr 5). Także sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje fragment N-końcowy, jest objęta wynalazkiem (Seq. ID Nr 3). Sekwencja kwasu nukleinowego odcinka nie ulegającego transkrypcji (odcinek w górę) (Seq. ID Nr 2) powyżej obszaru sekwencji kodującego PLA 1, pochodzącą z Tetrahymena jest usytuowana pomiędzy pozycją -275 a -1 (wyrażona przy pomocy małych liter). Stwierdzony odcinek nie podlegający transkrypcji obejmuje 275 zasad. Elementy promotora, TATA-Box, zlokalizowane są w pozycjach -49 do -55 (wytłuszczenie), a także domniemany CAAT-Box pomiędzy zasadami -133 a -136 (wytłuszczenie). Sekwencja kodująca cdna została przedstawiona wielkimi literami. Numerowanie sekwencji zaczyna się od kodonu start ATG. Obszary znane z sekwencjonowania białek umieszczono w ramkach, a kodon stop został podkreślony. Dojrzałe białko jest kodowane od zasady 331. Opis sekwencji od zasady 1 do 963 przedstawia pre/prosekwencję (Seq. ID Nr 8) PLA 1 Opis sekwencji od zasady 331 do 963 przedstawia sekwencję (Seq. ID Nr 9) dojrzałej PLA 1 W pozycji 961 znajduje się kodon stop TGA, a w pozycji 1039 sygnał poliadenilizacji AAT AAA. Sekwencja kwasu nukleinowego od pozycji 964 do 1134, znajdująca się poniżej sekwencji kodującej PLA 1 z Tetrahymena, przedstawia odcinek w dół od regionu kodującego PLA 1 (Seq. ID Nr 3), który nie będzie podlegał transkrypcji (także przedstawiony małymi literami). W pozycjach od 964 do 1101 mieści się obszar znany z sekwencjonowania cdna, który potwierdzono za pomocą odwrotnej PCR. Po transkrypcji, do ostatniego kodonu mrna (ttt, pozycje 1098-1101) przyłącza się łańcuch końcowy poli-a. Przedmiotem wynalazku jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego, lub jej fragmenty, kodująca fosfolipazę A1 może być łączona z typowymi czynnikami optymalizującymi ekspresję np.: regionem NF-1 (czynnik optymalizujący ekspresję w cytomegalowirusie), promotorami takimi jak np.: lac, trc, tic lub promotorami tac, promotorami klasy II i III układu T7 RNAP, promotorami bateriofagowymi T7 i SP6, apre, amylazami lub promotorami spac bakteryjnych układów ekspresyjnych, promotorami AOX1, AUG1 oraz 2 lub promotorami GAPp (Pichia) układów ekspresyjnych drożdży, promotorami RSV (Virus SV 40), promotorami CMV (cytomegalowirus), promotorami AFP (adenowirusy) lub promotorami metalotionininy w układach ekspresyjnych ssaków, promotorami wirusów sindbis, lub promotorami wirusa Semlike-Forest dla komórek owadów, promotorami dla układów ekspresyjnych komórek owadów takich, jak hsp70, DS47, aktyna 5C lub kopia, promotorami specyficznymi dla roślin, takimi jak promotor 35S (wirus mozaiki kalafiora), promotor amylazy lub promotor patatyny klasy I, operatorami takimi, jak np. operator tet; peptydami sygnałowymi takimi, jak pre/prosekwencje sygnałowe a-mf (Saccharomyces), miejscami inicjacji, terminatorami, genami oporności na antybiotyk oraz substancje biologicznie czynne, takie jak amplicylina, kanamycyna, strepromycyna, chloramfenikol, penicylina, amfoterycyna, cykloheksymid, 6-metylopuryna, paromomycyna, higromycyna, α-amanatyna, markerami auksotroficznymi, takimi jak gen kodujący reduktazę dhf lub różnorodnymi sekwencjami wiroidów, wirusów, bakterii, archezoa, pierwotniaków, grzybów, roślin, zwierząt czy ludzi. Osoba biegła w dziedzinie wie, że w procesie technologicznym będącym przedmiotem wynalazku można zastosować kwasy nukleinowe, które posiadają minimum 40 procentową homologię z kwasem nukleinowym o Seq. ID. Nr 1. Także białko o Seq. ID. Nr 2 może być modyfikowane nie tracąc jego funkcji. W ten sposób mogą być przykładowo przeprowadzane tak zwane konserwatywne wymiany aminokwasów. Poza tym można, np. wymieniać pomiędzy sobą aminokwasy hydrofobowe. Następujące metody mogą być zastosowane w celu wyodrębnienia i oczyszczenia fosfolipazy A 1 pozyskanej z Tetrahymena oraz w celu ustalenia sekwencji: Pozyskiwanie PLA 1 PLA 1 otrzymano z supernatantów hodowli Tetrahymena termophila pozbawionych komórek. Fermentację komórek prowadzono w 2 litrowym fermentatorze (Biostat MD, Braun Diessel Biotech, Melsungen, Niemcy), który sterowany jest przez cyfrową jednostkę DCU. Fermentator przez pierwsze 24 godziny pracuje w cyklu okresowym a następnie stale. Zebranie supernatantów pozbawionych komórek prowadzi się przez filtr prefuzyjny o wielkości porów ok. 0,3 μm (S6/2, Enka, Wuppertal). Fermentacja przeprowadza się według następujących parametrów: objętość robocza 2 litry wydajność prefuzyjna 2 litry/dobę
6 PL 206 037 B1 liczba obrotów mieszadła została ograniczona do 800 obr./min. wartość temperatury wynosiła niezmiennie około 30 C wartość ph była utrzymywana niezmiennie w pobliżu ph 7 gęstość początkowa wynosiła 50.000 komórek/ml Do fermentacji zastosowano szczep SB 1868 VII, będący typem dzikim szczepu Tetrahymena thermophilia. Fermentację prowadzi się przez 264 godzin, a następnie zbiera supernatanty i bada pod kątem aktywności PLA 1. Oczyszczanie PLA 1 W celu oczyszczenia PLA 1 wykorzystano 1 I supernatantu pożywki hodowlanej pozbawionego komórek 1. Do tej hodowli dodano następnie 140 g siarczanu amonu i stosując jednostkę ultrafiltrującą (Pellikon XL, wielkość wykluczenia 3kDa, Millipore) zatężono do objętości 50 ml. Następnie próbkę oczyszczono stosując chromatografię oddziaływań hydrofobowych (20x1,6 Fractogel EMD fenyl I 650, Merck, Darmstadt). Szybkość przepływu wynosiła 5 ml/min, a eluent zebrano jako 5ml frakcje. Aktywność enzymatyczna określono jako poziom deacylacji radioaktywnie znakowanego fosfolipidu (L-3-fosfatydocholina, 1-palmitoyl-2-[1-14 C]linoelyl). Fig. 3 przedstawia uzyskany profil elucyjny, gradient octanu sodu oraz aktywność enzymatyczną poszczególnych frakcji. Trzy frakcje o najwyższej aktywności enzymatycznej zostały połączone i zmieniono bufor na bufor wyjściowy (Bis-Tris 20 mm, ph 6,5) w celu przeprowadzenia chromatografii anionowymiennej (AEC). Następnie próbkę umieszczono w kolumnie (Q-Sepharose-Hiload-16/10, Pharmacia, Szwecja) i PLA 1 wymywano z kolumny liniowym gradientem NaCI (szybkość przepływu 3 ml/min) i zebrano jako frakcje po 5 ml. Fig. 4 przedstawia uzyskany profil elucyjny, gradient NaCI oraz aktywność enzymatyczną poszczególnych frakcji. Z frakcji o najwyższej aktywności PLA 1 pobrano 200 μl i rozdzielono stosując chromatografię wykluczenia (SEC). Zastosowano przy tym kolumnę Superdex HR 75 30/10 (Pharmacia, Szwecja). Podczas chromatografii szybkość przepływu wynosiła 0,6 ml/min, a eluent zbierano we frakcjach po 200 μl. Fig. 5 przedstawia otrzymany profil elucyjny oraz aktywność enzymatyczną poszczególnych frakcji. Uzyskane frakcje zostały zbadane pod względem czystości z zastosowaniem jednowymiarowej elektroforezy w żelu. Stwierdzono przy tym występowanie dwóch wyraźnych prążków przy ~26 oraz -28 kda. Rozdzielenie tych dwóch prążków stosując dwuwymiarową elektroforezę prowadziło do uzyskania z prążków 2 i 3 plamek o różnych punktach izoelektrycznych. W przypadku białek o masie cząsteczkowej 26 kda, wartości te wystąpiły przy ph 6,3 oraz 5,7, dla białek o masie 28 kda - przy ph 6,3, 5,7 oraz 5,3. Ostateczne badanie tych punktów przy pomocy analizy Mass-Fingerprint pozwoliło stwierdzić, że plamki te odpowiadają izoformom tego samego białka. Badanie PLA 1 metodami biologii molekularnej Po stwierdzeniu czystości białka, próbki białka zostały przeniesione na membranę PVDF i poddano wstępnemu sekwencjonowaniu od końca N. Dodatkowo kolejną próbkę trawiono enzymem, trypsyną i również poddano wstępnemu sekwencjonowaniu. Stosując uzyskane w ten sposób sekwencje białek opracowano starter oligonukleotydowy, który następnie zastosowano w transkryptazie odwrotne PCR (3'RACE, Szybka amplifikacja końców cdna). W wyniku zastosowania techniki PCR, A 1 amplifikowano, a następnie zsekwencjonowno cdna kodujący fosfolipazę A 1. Uzyskane sekwencje mają długość odpowiednio, 633 i 729 zasad, a obliczona na tej podstawie masa cząsteczkowa dojrzałego białka wynosi ok. 22,4 kda. W uzyskanej sekwencji znalazły się w 100%, oligopeptydy z 22 aminokwasów (koniec N) i 18 aminokwasów (w obrębie białka). Dodatkowo, poza sekwencją dojrzałego białka można z pomocą 5'RACE (szybka amplifikacja końców cdna) ustalić także sekwencję pre/propeptydu (fig. 2). Jest to peptyd o długości 110 aminokwasów, który jako taki zawiera zarówno sekwencję sygnałową jak i propeptyd, który dezaktywuje enzym i ulega odcięciu dopiero po ostatecznym osiągnięciu miejsca działania enzymu. Porównanie sekwencji ze znanymi już fosfolipazami A 1, nie umożliwiło stwierdzenia żadnych homologii, z wyjątkiem jednej sekwencji konsensusowej 5 aminokwasów (GxSxG), które występują we wszystkich lipazach i fosfolipazach, i które są brane pod uwagę jako miejsce przyłączania lipidów lub fosfolipidów. Poza tym, w wyniku odwrotnego PCR ustalono sekwencje w górę i w dół względem genu kodującego PLA 1 (fig. 1). Zaten, genomowy DNA trawiono endonukleazami restrykcyjnymi, fragmenty połączono ligazą T4 i ostatecznie zamplifikowano z zastosowaniem starterów odwrotnych. Do amplifikowania regionu w górę względem genu PLA 1 poprzez odwrotnym PCR zastosowano genomowy DNA, trawiony endonukleazą restrykcyjną Sspl. W ten sposób, zidentyfikowano region w górę wzglę-
PL 206 037 B1 7 dem genu PLA 1 o długości 275 zasad oraz elementy promotora. W pozycji -136 znajduje się sekwencja CAAT (CAAT-box), oddalona podobnie od miejsca inicjacji translacji, jak sekwencje CCAAT (CCAAT-boxes) genów histonowych (-141 lub -151) Tetrahymena, których odkrycia dokonali Brunk i Sadler (1990). Sekwencja TATA (TATA-box), która określa w przypadku genów eukariotycznych dokładny punkt inicjacji transkrypcji, została zidentyfikowana w pozycji -55. Sekwencja odpowiada obecnym u eukariontów sekwencjom konsensusowym. W celu amplifikacji odcinka zlokalizowanego w dół od genu PLA 1 odwrotna PCR, który zawiera terminator transkrypcji PLA 1 z Tetrahymena, trawiono genomowy DNA BamHI. W ten sposób, oprócz regionu w dół znanego jako 3'RACE, kolejne 222 zasady mogły być określone (fig. 3).
8 PL 206 037 B1
PL 206 037 B1 9
10 PL 206 037 B1
PL 206 037 B1 11
12 PL 206 037 B1
PL 206 037 B1 13 Zastrzeżenia patentowe 1. Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące określone sekwencją nr 4 (Seq. ID. Nr 4), znamienna tym, że regiony kodujące kodują fosfolipazę A 1 (PLA 1 ) z Tetrahymena thermophila (Seq. ID. Nr 5), a regiony niekodujące obejmują regiony zlokalizowane w górę i w dół od tego genu. 2. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że niekodujące regiony w górę i w dół od genu są określone sekwencją Nr 2 oraz 3; (Seq. ID nr 2 oraz Seq. ID nr 3), a regiony kodujące są określone sekwencjami Nr 1, 8 i/lub 9 (Seq. ID nr 1, Seq. ID nr 8 i/lub Seq. ID nr 9). 3. N-końcowa sekwencja sygnałowa PLAi (Seq. ID nr 5) jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienna tym, że jest określona sekwencją Nr 6 (Seq. ID nr 6). 4. Białko fosfolipazy A 1 (PLA 1 ) o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej sekwencji Nr 7 (Seq. ID nr 7). 5. Zastosowanie kwasu nukleinowego lub jego fragmentów o sekwencji jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 3 do homologicznych lub heterogenicznych ekspresji zrekombinowanych białek i peptydów, a także do homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu. 6. Sposób homologicznej lub heterogenicznej ekspresji białek i peptydów, oraz homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu, znamienny tym, że orzęski Tetrahymena, transformuje się kwasem nukleinowym o sekwencji jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 3. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że kwasy nukleinowe lub ich fragmenty łączy się z homologicznymi i heterogenicznymi układami do ekspresji białek, takimi jak enhancery, promotory, operatory, miejsca inicjacji, terminatory, oporność na antybiotyki albo z innymi kwasami nukleinowymi, albo fragmentami DNA, albo sekwencjami różnych rodzajów wiroidów, wirusów, bakterii, archezoa, pierwotniaków, grzybów, roślin, zwierząt, albo ludzi. 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że kwas nukleinowy wprowadza się do wektora, plazmidu, kosmidu, chromosomu, minichromosomu, transpozonu, IS, rdna, lub do każdego rodzaju pierścieniowego bądź liniowego DNA aibo RNA. 9. Wektor, plazmid kosmid, chromosom, albo minichromosom transpozon, element IS, rdna, albo inne rodzaje pierścieniowego bądź liniowego DNA, albo RNA, zawierający przynajmniej jedną z sekwencji kwasów nukleinowych, jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 3.
14 PL 206 037 B1 Rysunki
PL 206 037 B1 15
16 PL 206 037 B1
PL 206 037 B1 17
18 PL 206 037 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.