ANALIZA INSTRUMENTALNA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO ANALIZA INSTRUMENTALNA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO

ANALIZA INSTRUMENTALNA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO ANALIZA INSTRUMENTALNA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO Materiał biologiczny pochodzenia ludzkiego, zwierzęcego bądź roślinnego zwany jest w kryminalistyce śladem biologicznym. W praktyce kryminalistycznej ślady biologiczne można podzielić na trzy grupy: - pochodzenia tkankowego - np. krew, paznokcie, włosy, zęby, kości, fragmenty roślin - wydzieliny - ślina, nasienie, wydzielina łojowa, wydzielina pochwowa, pot - wydaliny - kał, mocz, wymiociny, smółka płodowa. Spośród wielu zadań, dla chemików sądowych najważniejszym jest analiza i identyfikacja różnego rodzaju śladów znalezionych na miejscu przestępstwa oraz zabezpieczonych materiałów dowodowych oraz analiza materiału dowodowego pod kątem obecności substancji toksycznych zagrażających zdrowiu i życiu człowieka, takich jak: narkotyki, leki psychotropowe, alkohol, metale ciężkie i inne toksyny organiczne i nieorganiczne. ANALIZA INSTRUMENTALNA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO 1. Ocena zawartości kannabinoidów wybranych odmian konopi Cannabis sativa L/w materiale biologicznym (GC-MS) 2. Oznaczanie zawartości kwasu benzoesowego w napojach (HPLC-UV) 3. Oznaczanie skażeń związkami chlorowcopochodnymi (GC-ECD) 4. Identyfikacja sterydów anabolicznych w próbkach biologicznych/analiza produktów alkoholowych na zawartość metanolu (GC-FID) Metody chromatograficzne (rozdzielcze) w analizie materiału biologicznego (GC, HPLC) 1

Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. Fazą ruchomą może być gaz, ciecz lub płyn w stanie nadkrytycznym, a fazą nieruchomą (stacjonarną) - ciało stałe lub ciecz. Klasyfikacja technik chromatograficznych Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) 2

Chromatografia kolumnowa Przykładowe rodzaje metod chromatograficznych Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) Ekstrakcja z fazy stałej (SPE) Chromatografia gazowa (GC) Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) Elektroforeza kapilarna (CE) To też jest technika chromatograficzna Każdy proces chromatograficzny składa się z trzech etapów dozowanie próbki rozdział składników detekcja rozdzielonych składników detektor 3

Wynikiem rozdziału chromatograficznego jest chromatogram HPLC Wysokosprawna (wysokociśnieniowa) chromatografia cieczowa (HPLC) 4

HPLC Zestaw do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej Od prawej: komputer sterujący aparatem i rejestrujący dane, pompa z zaworem dozującym, kolumna wewnątrz termostatu i różnego rodzaju detektory rozdzielanych substancji, np. UV-vis, fluorescencyjny, MS-MS. HPLC - rozdział składników Kolumny chromatograficzne 5

Żel krzemionkowy HPLC dozowanie próbki Faza normalna Faza odwrócona HPLC - detekcja składników 6

Przykładowy chromatogram uzyskany metodą HPLC (detektor fluorescencyjny) HPLC - detekcja składników Chromatografia gazowa - GC Chromatografia gazowa - GC 7

H RESET 3.1.218 Chromatografia gazowa - GC Gas Carrier Hydrogen Air 8

GC dozowanie próbki Kolumna Kolumny kapilarne stosowane w chromatografii gazowej 9

Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych Najbardziej znanym typem faz stacjonarnych są polisiloksany. Każdy atom krzemu w łańcuchu zawiera dwie grupy funkcyjne. Typ i ilość grup decyduje o właściwościach fazy stacjonarnej, a tym samym kolumny. Poli(dimetylosiloksan) Przekroje kolumn do GC w powiększeniu Poli(35 - difenylo- 65 dimetylosiloksan) GC - detekcja składników - FID GC - detekcja składników - ECD Względna czułość detektora wychwytu elektronów (ECD) w stosunku do różnych związków organiznych Węglowodory 1 Etery, estry 1 Alifatyczne alkohole, ketony, aminy, związki mono Cl, i mono F 1 Związki mono Br, di Cl, I, di F 1 Anhydrydy i związki tri Cl 1 Związki mono I, di Br, poli Cl i poli F 1 Związki di I, tri Br, i poli F 1 1

Flow Flow 3.1.218 GC - detekcja składników - TCD Uniwersalny detektor cieplno-przewodnościowy (TCD) Drut oporowy wewnątrz detektora jest chłodzony przez przepływający gaz nośny Kiedy w gazie nośnym pojawia się inna substancja, właściwości chłodzące gazu nośnego się zmieniają. Generuje to powstawanie sygnału w detektorze Chromatogram GC składników soku z pomarańczy Wpływ warunków termicznych na rozdział w GC Techniki łączone Warunki rozdziału: (a) izotermiczny w 45 o C (b) izotermiczny w 145 o C (c) programowany w 3 o C do 18 o C 11

Zastosowanie instrumentalnych technik analitycznych do detekcji w chromatografii gazowej i HPLC (techniki łączone) Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas Chromatograf Spektrometr mas Spektrometr podczerwieni Spektrometr absorpcji atomowej Jądrowy rezonans magnetyczny - HPLC-MS, GC-MS - HPLC-IR, GC-IR - HPLC-AAS, GC-AAS - HPLC-NMR, GC-NMR Techniki instrumentalne nie tylko wykrywają obecność substancji, ale również dokonują jej analizy, przez co potwierdzają autentyczność mierzonej substancji w danym szczycie sygnału. Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas - Detektor wykonuje co sekundę widmo masowe (skan) wycieku z kolumny. - Analizowane są jony o masach większych niż jony gazu nośnego. - Każda substancja ma charakterystyczne dla siebie widmo mas. 12

Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas Zasada działania spektrometru masowego Spektometria mas 13

Interpretacja obecności w widmie jonów o m/z = 189 i 261 Masa cz. IAA = 175 Reszta Me = 15 Reszta TMS = 73 Masa cz. H = 1 IAA + TMS + Me 2H = 261 IAA + Me - H = 189 Widmo masowe pochodnej metylowej (B) i metylowo-sililowej (A) kwasu indolilo-3- octowego (IAA) oraz (po prawej) - najintensywniejsze jony danego widma. A jak zinterpretować obecność w widmie jonów o m/z = 189 i 261? 14

Dodatkowe zalety detektora ze spektrometrem mas Wytwarzanie lotnych pochodnych (derywatyzacja) Oznaczanie IAA w próbce ekstraktu z pożywki pohodowlanej bakterii wykonane techniką MS-Full scan i MS-SIR Wytwarzanie lotnych pochodnych związków organicznych Aby możliwa była analiza GC substancji organicznych należy przeprowadzić je w stan gazowy. Jednakże ogromna większość z tych substancji to ciała stałe o wysokiej temperaturze wrzenia. Nielotność tych substancji wywołana jest złożonością budowy (wysoka masa cząsteczkowa) i w dużej mierze obecnością w cząsteczkach polarnych grup funkcyjnych: COOH, NH 2, SH 2, OH. Zablokowanie tych grup wydatnie obniża temperaturę wrzenia i zwiększa trwałość związków organicznych. Metody blokowania grup funkcyjnych: - pochodne TMS (sililowe) 6 CH OH 2 5 4 OH HO 3 Glukoza O 1 OH 2 OH CH 3 + 5 Cl Si CH 3 CH 3 Trimetylochlorosilan (TMS-Cl) 4 (CH 3) 3-Si-O 6 CH O-Si(CH 3) 3 2 O 5 O-Si(CH 1 3) 3 + 5HCl 3 2 O-Si(CH 3) 3 O-Si(CH 3) 3 15

- pochodne (estry) alkilowe RCOOH + R 2OH RCOOR 2 + RCOOH + CH 2N 2 RCOOCH 3 + N 2 reakcja z diazometanem - uzyskiwanie pochodnych acetylowych (acylowych) - uzyskiwanie pochodnych sililowych O R C OH + CH 3 OH + H 2 SO 4 Kwasy tłuszczowe (nielotne) Reflux O R C O CH 3 Lotna pochodna O CH 2 O C R Bezwodnik kwasu octowego + O CH O C R O CH 2 O C R Tłuszcze CH 3 ONa O + CH 3 OH 3 R C O CH 3 Lotna pochodna (biopaliwo!) Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC Analizy jakościowa i ilościowa w GC i HPLC Czas, w którym substancja przechodzi przez kolumnę nazywany jest czasem retencji (t R). Czas retencji przypisany jest pikowi odpowiadającemu danej substancji. Jest to więc podstawowy parametr identyfikujący substancję w analizie GC i HPLC. 16

Response Response Odpowiedź detektora 1 mg/litr 2 mg/litr 3 mg/litr Powierzchnia piku 3.1.218 Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC Analiza jakościowa Identyfikacja substancji na podstawie czasu retencji Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC Analiza ilościowa - wyznaczanie stężenia substancji na podstawie krzywej wzorcowej Chromatogram mieszaniny węglowodorów 1.6 min = t R Oktan Dekan Heksan 1 8 6 4 GC Retention Time on Carbowax-2 (min) 2 Badana próbka Wykryta substancja może być heksanem.5 1. 1.5 2. 2.5 3. Stężenie próby (mg/litr) 1.6 min = t R Retention Time on Carbowax-2 (min) - Wyznaczanie stężenia substancji na podstawie wzorca wewnętrznego - Wyznaczanie stężenia substancji na podstawie znakowanego wzorca wewnętrznego (w GC-MS) Metoda rozcieńczenia izotopowego Technika rozcieńczenia izotopowego w GC-MS Jas 37 1 12.1 wzorzec wewnętrzny 227. 2.56e6 Specyficzna odmiana techniki dodatku wzorca. Specyficzność ta polega na tym, iż w tym przypadku dodawaną substancją jest znana ilość związku, który różni się od analitu jedynie składem izotopowym W trakcie analizy ilościowej wyznaczane są stosunki sygnałów dla odpowiednich jonów masowych (co najmniej dwóch) uzyskanych w trakcie analizy próbki rzeczywistej, próbki wzorca oraz próbki rzeczywistej z dodatkiem wzorca Do określenia zawartości analitu w badanej próbce potrzebna jest jedynie znajomość ilości izotopowo znaczonego analitu dodanego do próbki Jas 37 1 Jas 37 1 12.1 12.13 12.13 analit 12.25 12.57 224. 2.34e6 c an =pow an /pow wz x cwz x wsp 12.6 TIC 8.61e6 12.25 12.44 12.5 12.1 12.15 12.2 12.25 12.3 12.35 12.4 12.45 12.5 12.55 12.6 Time Chromatogram JA-Me, d3-ja-me, H2JA-Me z użyciem techniki SIM. A analiza jonu o m/z 227 Th; B analiza jonu o m/z 224 Th; C analiza sumy jonów o m/z 151,153,224,226 i 227 Th. 17

Metoda rozcieńczenia izotopowego Metoda rozcieńczenia izotopowego Jas 37 1 12.1 wzorzec wewnętrzny 227. 2.56e6 Jas 37 1 12.1 wzorzec wewnętrzny 227. 2.56e6 Jas 37 1 12.13 analit 12.25 12.57 224. 2.34e6 c an =pow an /pow wz x cwz x wsp Jas 37 1 12.13 analit 12.25 12.57 224. 2.34e6 c an =pow an /pow wz x cwz x wsp Jas 37 1 12.1 12.13 12.6 TIC 8.61e6 Jas 37 1 12.1 12.13 12.6 TIC 8.61e6 12.25 12.25 12.44 12.44 12.5 12.1 12.15 12.2 12.25 12.3 12.35 12.4 12.45 12.5 12.55 12.6 Time 12.5 12.1 12.15 12.2 12.25 12.3 12.35 12.4 12.45 12.5 12.55 12.6 Time Chromatogram JA-Me, d3-ja-me, H2JA-Me z użyciem techniki SIM. A analiza jonu o m/z 227 Th; B analiza jonu o m/z 224 Th; C analiza sumy jonów o m/z 151,153,224,226 i 227 Th. Chromatogram JA-Me, d3-ja-me, H2JA-Me z użyciem techniki SIM. A analiza jonu o m/z 227 Th; B analiza jonu o m/z 224 Th; C analiza sumy jonów o m/z 151,153,224,226 i 227 Th. Metoda rozcieńczenia izotopowego 1 ng d3jm 1ul (55 V, rep 6) Jas 179 761 (11.271) Cm (758:764-(664:699+883:922)) 151 1 224 153 226 Jas 181 734 (11.226) Cm (729:737-(626:646+81:864)) 151 1 227 6.11e5 7.89e4 Zastosowania techniki GC/MS Analiza składu mieszanin poreakcyjnych Analiza produktów naturalnych (np. olejki zapachowe) Badania reakcji chemicznych w fazie gazowej Identyfikacja zanieczyszczeń w lekach, kosmetykach, artykułach pożywczych itp. Analizy antydopingowe Analizy kryminalistyczne (np. identyfikacja producentów narkotyków) Analizy zanieczyszczeń środowiska 153 226 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 Porównanie intensywności wybranych jonów (m/z 151, 153, 224, 226, 227) estru metylowego kwasu jasmonowego (JA-Me) (A) oraz standardu wewnętrznego d3ja-me (B) 18

Typowy schemat przygotowania próbki do analizy GC i LC 19