Efektywność pracy dwufazowego reaktora z membraną enzymatyczną w oparciu o model sieciowy Piotr Adamczak*, Józef Ceynowa, Izabela Leciak Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Wydział Chemii * Tel.: (+4856) 6114517, Fax: (+4856) 6542477, E-mail: padam@chem.uni.torun.pl
WSTĘP Wykorzystanie bioreaktorów z membranami enzymatycznymi jest ciągle ograniczone przez duży spadek aktywności enzymu, spowodowany zarówno przez proces immobilizacji, jak i wszelkiego typu ograniczenia transportu reagentów do i ze środowiska reakcji. Procesy te w znaczącym stopniu wpływają również na zjawisko odwracalnej inhibicji biokatalizatora reagentami zalegającymi w środowisku reakcji. Znajomość wpływu warunków prowadzenia procesu na wydajność bioreaktora z membraną enzymatyczną pozwala na takie prowadzenie procesu aby wpływ niepożądanych efektów ograniczyć do minimum. Typowym przykładem procesu, w którym wpływ wymienionych ograniczeń jest szczególnie widoczny jest hydroliza triglicerydów w dwufazowym reaktorze z membraną enzymatyczną. Opracowany model matematyczny takiego reaktora pozwala na określenie warunków prowadzenie procesu hydrolizy w celu uzyskania wysokiej wydajności reaktora, bądź założonego składu mieszaniny poreakcyjnej. MODEL REAKTORA Pełny opis modelu reaktora przedstawiono w pracy [1]. Założono w nim ścisłe powiązanie procesów kinetycznych i transportowych. Zaproponowany model uwzględnia zarówno procesy chemiczne zachodzące w reaktorze (reakcję hydrolizy triglicerydu, odwracalną dezaktywację lipazy oraz nieodwracalną inhibicję enzymu), jak i procesy dyfuzyjnego transportu reagentów do i z środowiska reakcji do reaktora i z niego do zbiorników zewnętrznych.
Rys. 1 Model przedziałowy reaktora Hydrofilowa membrana z powierzchniowo immobilizowanym enzymem separuje dwie fazy - organiczną (trigliceryd T) i wodną (bufor fosforanowy). Glicerol G powstający w warstwie reakcyjnej w wyniku enzymatycznej hydrolizy triglicerydu dyfunduje przez hydrofilową membranę do fazy wodnej (n), a następnie hydrodynamicznie do zewnętrznego zbiornika. Pozostałe produkty A kwasy tłuszczowe, D diglicerydy, M monoglicerydy, dyfundują z warstwy reakcyjnej do fazy olejowej (n), a następnie są transportowane hydrodynamicznie do zbiornika fazy olejowej. Wszystkie etapy chemiczne hydrolizy oleju, inhibicji lipazy kwasami tłuszczowymi jak również procesy dezaktywacji lipazy zachodzą w warstwie reakcyjnej ( r ), zlokalizowanej w membranie i w przymembranowej warstwie olejowej. Procesy dyfuzji reagentów hydrofobowych zachodzą w warstwach reakcyjnej (r) i przymembranowej warstwie dyfuzyjnej (1,2) oraz komorze reaktora (n). Procesy dyfuzyjnego transportu glicerolu zachodzą w hydrofilowej membranie podzielonej na warstwy (r,1,2,3) i w komorze reaktora (n). Procesy hydrodynamicznego transportu reagentów zachodzą z odpowiednich komór reaktora (n) do zewnętrznych zbiorników faz (z). Na elementarny cykl reakcyjno transportowy w opracowanym modelu składają się następujące procesy:
Reakcja hydrolizy tri-, di-, oraz monoglicerydów Procesy nieodwracalnej i odwracalnej inhibicji i enzymu Procesy transportu reagentów z warstwy reakcyjnej do zbiorników faz (Kompletny model sieciowy reaktora przedstawiono w pracy [1]) ANALIZA EFEKTYWNOŚCI REAKTORA Analiza modelu wykazała, że efektywność pracy reaktora zależy przede wszystkim od: - dyfuzyjnego transportu glicerydów z i do warstwy reakcyjnej, - stałej szybkości reakcji inhibicji lipazy powstającymi kwasami tłuszczowymi, - stężenia lipazy immobilizowanej na membranie. Charakterystyka hydrolizy triglicerydu limitowana kinetyką reakcji Symulację procesu hydrolizy w warunkach ograniczeń kinetycznych prowadzono przy następujących założeniach: - szybkość reakcji inhibicji kwasami tłuszczowymi jest zaniedbywalnie mała (k inh. =0), - szybkość dyfuzji kwasów tłuszczowych i glicerydów jest duża i wynosi 1 10-6 (cm 2 s -1 ), - stężenie lipazy w warstwie reakcyjnej jest w zakresie od 5.04 10-7 do 6.30 10-5 (mol cm -3 ). Efekt ograniczeń kinetycznych reakcji hydrolizy jest szczególnie dobrze widoczny przy stężeniach enzymu nie przekraczających 1 10-5 mol cm -3. Wyniki symulacji (dla stężenia enzymu 5.04 10-7 mol cm -3 ) przedstawiono na Rys. 2.
Stężenie kwasów tł. i gliceryny 10 3 [mole cm -3 ] 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Kwasy tł. Gicerol Diglicerydy Monoglicerydy 0 1 2 3 4 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Stężenie mono- i diglicerydów 10 3 [mole cm -3 ] Czas reakcji [h] Rys. 2. Czasowe zmiany stężenia reagentów w procesie hydrolizy limitowanej kinetyką reakcji Obserwowane maksima stężeń mono- (M) i diglicerydów (D) w zbiornikach faz i warstwie reakcyjnej są wyraźnie rozdzielone. W początkowym okresie przebiegu reakcji stosunek stężenia glicerolu do kwasów tłuszczowych jest zdecydowanie niższy niż wynika to ze stechiometrii reakcji (1:3), i wynosi dla stopnia przereagowania 25% około 1:15. Dla wyższych stężeń immobili-zowanej lipazy maksima stężeń M i D obserwowane w zewnętrznych zbior-nikach faz przesuwają się do wyższych stopni przereagowania (około ~60% konwersji) (Fig.3).
400 C E =6.30 10-6 mol cm -3 D 1 C E =1.26 10-5 mol cm -3 C E =2.52 10-6 mol cm -3 Stężenie 10 6 [mole cm -3 ] 300 200 100 D 2 D 3 C E =5.04 10-7 mol cm -3 M 1 M 2 M 3 M 4 D 4 0 0 20 40 60 80 100 Stopień konwersji [%] Rys.3. Stężenia mono i diglicerydów w funkcji stopnia przereagowania dla różnych stężeń lipazy w warstwie reakcyjnej Efekt ten jest wynikiem wzrostu dyfuzyjnych ograniczeń w transporcie glicerydów i kwasów tłuszczowych z i do warstwy reakcyjnej; przy dużym stężeniu lipazy szybko powstające produkty hydrolizy akumulują się w warstwie reakcyjnej i przymembranowych warstwach dyfuzyjnych, nie opuszczając środowiska reakcji wchodzą w dalsze etapy hydrolizy. Charakterystyka procesu hydrolizy kontrolowanego procesami dyfuzji glicerydów i kwasów tłuszczowych Symulację pracy reaktora w warunkach ograniczeń transportu dyfuzyjnego glicerydów przeprowadzono dla następujących parametrów modelu: - brak inhibicji odwracalnej enzymu k inh = 0, - współczynnik przenikania glicerydów w warstwie olejowej jest równy P ol = 4.0 10-8 (cm 2 s -1 ), oraz - wartości stężeń enzymu w warstwie reakcyjnej od 5.04 10-7 do 6.30 10-5 (mol cm -3 ).
Wybraną symulację procesu hydrolizy kontrolowanego procesami transportu glicerydów (stęż. lipazy 6.30 10-5 cm -3 ) przedstawiono na Rys. 4 A i B. mol Stężenie kwsaów tł. i glicerolu 10 3 [mol cm -3 ] 3.0 2.0 1.0 0.0 A Kwasy tł. Glicerol Diglicerydy Monoglicerydy 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 0.000 Stężenie mono- i diglicerydów 10 3 [mol cm -3 ] Czas reakcji [h] Stężenie kwasów tł. i glicerolu 10 3 [mol cm -3 ] 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 B Kwasy tł. Glicerol Diglicerydy Monoglicerydy 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 Stężenie mono- i diglicerydów 10 3 [mol cm -3 ] 0.0 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 0.000 Czas reakcji [h] Rys. 4.. Czasowe zmiany stężenia reagentów od czasu reakcji hydrolizy dla procesu kontrolowanego dyfuzją glicerydów i kwasów tłuszczowych; A zewnętrzne zbiorniki faz, B warstwa reakcyjna
Proces o ograniczeniach dyfuzyjnych jest znacznie wolniejszy niż proces limitowany kinetyką reakcji, maksimum stężenia mono- i diglicerydów obserwowany w zewnętrznych zbiornikach faz pojawia się dla obu produktów przy stopniu konwersji ok. 60 % i jest zdecydowanie niższe. Wskazuje to (Rys. 4. B), że w warstwie reakcyjnej hydroliza triglicerydu zachodzi do kwasów tłuszczowych i glicerolu, a powstające produkty pośrednie nie opuszczają środowiska reakcji. Stosunek stężeń glicerolu do kwasów tłuszczowych jest w całym zakresie czasów reakcji bliski 1:3 (Rys.5). 0.35 Stosunek stęż. glicerolu do kwasów tł. 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 Ograniczenia kinetyczne Ograniczenia dyfuzyjne 0.00 0 20 40 60 80 100 Stopień konwersji [%] Rys. 5. Stosunek stężeń glicerolu do kwasów tłuszczowych w funkcji stopnia przereagowania dla procesów hydrolizy o ograniczeniach kinetycznych i dyfuzyjnych Wpływ ograniczeń dyfuzyjnych na proces hydrolizy jest widoczny na Rys. 6. Przedstawiono na nim krzywe stężenia di i monoglicerydów w funkcji stopnia przereagowania dla różnych współczynników dyfuzji glicerydów w warstwie olejowej.
70 D 1 60 M 1 Stężenie 10 6 [mole cm -3 ] 50 40 30 20 P ol =4.8 10-8 cm 2 s -1 P ol =2.0 10-7 cm 2 s -1 P ol =1.0 10-6 cm 2 s -1 D 2 M 2 10 D 3 0 0 20 40 60 80 100 M 3 Stopień konwersji [%] Rys. 6. Zależność stężenia mono- i diglicerydów od stopnia przereagowania dla różnych współczynników dyfuzji glicerydów w warstwie olejowej Dwie najwyższe krzywe były wcześniej klasyfikowane jako procesy hydrolizy limitowanej kinetyką z dużym udziałem ograniczeń dyfuzyjnych, obserwowanych dla dużych stężeń immobilizowanej lipazy (Rys. 3.). Pozostałe krzywe, dla niższych współczynników dyfuzji lipazy. Wraz ze wzrostem ograniczeń dyfuzyjnych stężenia produktów pośrednich (mono- diglicerydów) obserwowane w zewnętrznych zbiornikach faz zmniejszają się, a stosunek stężenia glicerolu do kwasów tłuszczowych (dla 20% przereagowania) zbliża się do 1:3. otrzymane są przy tym samym stężeniu Charakterystyka procesu limitowanego procesami inhibicji Symulację procesu hydrolizy, w którym dominującym efektem są procesy odwracalnej inhibicji enzymu powstającym produktem reakcji prowadzono analogicznie jak w przypadku poprzednich procesów zakładając, że: - stała inhibicji odwracalnej k inh = 2.50 10 4 (s -1 ), - współczynnik przenikania glicerydów P ol =1.0 10-6 (cm 2 s -1 ), oraz - stężenia enzymu w warstwie reakcyjnej od 5.04 10-7 do 6.30 10-5 (mol cm - 3 ).
Charakter obliczonych krzywych zależności stężeń reagentów w zbiornikach zewnętrznych i w warstwie reakcyjnej od czasu reakcji jest zbliżony do obserwowanych w procesie o ograniczeniach kinetycznych, ale efektywność reaktora (szybkość konwersji triglicerydu) jest zdecydowanie niższa. Na Rys. 7. przedstawiono zależność produkcji kwasów tłuszczowych od stężenia immobilizowanej lipazy dla procesów hydrolizy z różnymi ograniczeniami. 14.0 Produkcja kwasów tł. 10 3 [mol cm -3 h -1 ] 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 Ograniczenia - kinetyczne - inhibicja lipazy - dyfuzja glicerydów - dyfuzja i inhibicja 0.0 0 10 20 30 40 50 60 70 Stężenie lipazy 10 6 [mol cm -3 ] Rys. 7. Zależność produkcja kwasów tłuszczowych od stężenia immobilizowanej lipazy dla różnych ograniczeń procesu hydrolizy Poszczególne krzywe różnią się znacznie i eksperymentalnie otrzymane krzywe mogą być podstawą do określenia efektów limitujących całkowity proces hydrolizy. Ponadto, stosunek stężeń glicerolu do kwasów tłuszczowych bliski 1:3 dla niskich stopni przereagowania (10-20%), może być szybkim wskaźnikiem dyfuzyjnych ograniczeń procesu. Cechą charakterystyczną procesu o ograniczeniach dyfuzyjnych jest nasyceniowy charakter krzywej produkcji kwasów tłuszczowych od stężenia lipazy. Zwiększanie stężenia enzymu w membranie ponad pewną wielkość graniczną jest w tym przypadku niecelowe. Charakter zależności tego procesu jest jakościowo zgodny z procesem hydrolizy opisanym w pracy E. Drioli i współp. [3-4]. Jak było pokazane reaktor pracujący przy
ograniczeniach dyfuzyjnych produkuje glicerol i kwasy tłuszczowe w stosunku bliskim 1:3 w całym zakresie stopni przereagowania. Oznacza to, że dla takich procesów z dobrym przybliżeniem można stosować uproszczony model Michaelisa-Menten do opisu kinetyki reakcji hydrolizy triglicerydu [3-6]. Omówione procesy w reaktorze z tą sama ilością immobilizowanego enzymu różnią się również aktywnościami membrany, co łatwo można zauważyć na Rys.8. W przypadku procesu o ograniczeniach kinetycznych obserwuje się najwyższą aktywność membrany w całym zakresie stopni przereagowania. Aktywność membrany [mol cm -3 h -1 mg enz -1 ] 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Ograniczenia Kinetyczne dyfuzyjne Inhibicja dyfuzja i inhibicja 0 20 40 60 80 100 Stopień konwersji [%] Rys. 8. Zależność aktywności membrany od stopnia przereagowania przy różnych ograniczeniach procesu hydrolizy Przedstawione ogólne zależności pomiędzy parametrami prowadzenia procesu hydrolizy a uzyskiwanymi wydajnościami reaktora enzymatycznego pozwoliły na zaprojektowanie nowego reaktora, w którym ograniczenia natury dyfuzyjnej i inhibicji są znacząco zredukowane. Wprowadzone zmiany dotyczą zarówno postaci membrany enzymatycznej (membrany kapilarne), sposobu immobilizacji lipazy, jak i samego sposobu prowadzenia procesu hydrolizy. WNIOSKI
Największą efektywność pracy reaktora uzyskuje się w warunkach, gdy o procesie decyduje kinetyka reakcji. Cechą charakterystyczną takiego procesu jest wyraźny wzrost wydajności reaktora wraz ze wzrostem stężenia enzymu w warstwie reakcyjnej, a obserwowane czasowe zmiany produktów reakcji hydrolizy są charakterystyczne dla reakcji następczych. Model pozwala na ustalenie warunków prowadzenia procesu ciągłego, przy których jest możliwe uzyskiwanie zwiększonych ilości mono- i / lub diglicerydów o założonym stosunku mono- do diglicerydów. Wymaga to prowadzenia procesu w warunkach stacjonarnych i związanego z tym opracowania technik ciągłej separacji produktów hydrolizy z fazy wodnej i olejowej. W przypadku silnych ograniczeń dyfuzyjnych i związanej z tym inhibicji produktem reakcji, szczególne znaczenie w poprawie wydajności pracy mają odpowiednie właściwości transportowo-separacyjne membran oraz lokalizacji enzymu immobilizowanego w membranie. Istotne znaczenie praktyczne mają wskazania wynikające z analizy modelu co do celowości lub braku uzasadnienia w zwiększaniu gęstości zaszczepienia enzymu w membranie. Zwiększanie gęstości zaszczepienia enzymu ma sens tylko w przypadku reaktora o ograniczeniach kinetycznych. Literatura [1] Ceynowa J., Adamczak P., Staniszewski M., Kinetics of Olive Oil Hydrolysis on Membrane Reactor. I Bond Graph Network Model of Reactor Performance, Biotechnologica Acta 17 (1997) 161-176 [2] Ceynowa J., Adamczak P., Enzyme Membrane Based Upon Poliamide-6 for Oil Hydrolysis, Journal Applied Polymer Science, 46 (1992) 749-755 [3] Molinari R, Santoro M.,E., Drioli E., Study and Comparison of Two Enzyme Membrane Reactors for Fatty Acids and Glycerol Production, Ind. Eng. Chem. Res., 33(11) (1994) 2591. [4] Giorno l., Molinari R., Drioli E., Bianchi D., Cesti P., Performance of a Biphasic Organic/Aqueous Hollow Fibre Reactor Using Immobilized Lipase, J. Chem. Tech. Biotechnol., 64 (1995) 345-352.