Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności Seminarium STC 2018 Interpretacja wyników analiz ilości i obecności drobnoustrojów zgodnie z zasadami badań mikrobiologicznych żywności i pasz? Dr inż. Agnieszka Papiewska Instytut Technologii i Analizy Żywności PŁ Zakład Cukrownictwa
PN-EN ISO 7218 PN-EN ISO 7218/Ap1 (2010 r.) PN-EN ISO 7218/A1 (2015 r.) 2 Mikrobiologia żywności i pasz Wymagania ogólne i zasady badań mikrobiologicznych
Oznaczenie liczby drobnoustrojów Seminarium STC 2018 3 bezpośrednie np.: badanie pod mikroskopem; pośrednie np.: posiew na pożywkach stałych lub płynnych; cytometria przepływowa; łańcuchowa reakcja polimerazy; itd
Modyfikacje metod hodowlanych pomiaru ilości drobnoustrojów Petrifilmy Test łopatkowy Metoda filtracji membranowej 4 http://www.uwm.edu.pl/kmizj/wp-content/uploads/2012/04/%c4%86wiczenie-2-ocena-higienicznej-jako%c5%9bci-mleka-surowego-jako%c5%9b%c4%87- mikrobiologiczna-i-cytologiczna.pdf http://www.4active.eu/oferta/dla-przemyslu-spozywczego.html
Posiew jest podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej i mikologicznej zarówno w mikrobiologii klinicznej, jak i badawczej wykonywany w celu uzyskania pojedynczych, odosobnionych kolonii bakterii, czy grzybów na podłożach mikrobiologicznych. 5 https://pl.wikibooks.org/w/index.php?title=mikrobiologia/posiew&oldid=163186
Wiele metod i sposobów, np. 6 https://pl.wikipedia.org/wiki/kultura_mikroorganizm%c3%b3w
Technika seryjnych (wielokrotnych) rozcieńczeń, opracowana w 1878 roku przez angielskiego chirurga, twórcę antyseptyki barona Józefa Listera. 7 Pozwala dokładnie określić ilość bakterii w wyjściowej zawiesinie. Podstawą metod ilościowych jest prawo mówiące, że z jednej bakterii w roztworze wyjściowym powstaje na drodze podziałów jedna kolonia. https://www.rcseng.ac.uk/library-and-publications/library/blog/lord-lister-of-lyme-regis/ http://b1.pinger.pl/3de5354a825711ad1bf77a1bb2a67170/mikrobiologia_posiew-wikibooksbib.pdf
Schemat wykonywania rozcieńczeń i posiewów metodą wgłębną i powierzchniową 8 http://www.uwm.edu.pl/wnz/sitefiles/file/mikrobiologia/%c4%87wiczenie_7,8-m%c5%bb-mikrobiologia.pdf
Oznaczenie liczby drobnoustrojów metodą płytkową Metoda oznaczania liczby drobnoustrojów przez posiew na podłoże stałe zakłada, że liczba powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek w badanej próbie. 9 jtk - jednostki tworzące kolonie (ang. cfu - colony forming units) w 1g lub 1cm 3 produktu
Wg PN EN ISO 7218: Oznaczanie liczby drobnoustrojów z zastosowaniem pożywek stałych 10 oparte jest na zdolności drobnoustrojów do tworzenia kolonii na albo w pożywce agarowej, rozpoznawalnych nieuzbrojonym okiem lub/z użyciem szkła powiększającego zaleca się tak dobrać rozcieńczenia, aby zapewnić odpowiednią liczbę kolonii na płytce
Wg PN EN ISO 7218: Liczba płytek Petriego dla każdego rozcieńczania 11 W laboratoriach badających żywność, działających w systemie jakości zgodnie z ISO 17025, dla oznaczania liczby drobnoustrojów można stosować jedną płytkę na każde rozcieńczenie z co najmniej dwóch kolejnych rozcieńczeń. Jeżeli wykonywane jest tylko jedno rozcieńczenie, albo laboratorium nie działa w systemie zapewnienia jakości, stosować dwie płytki zgodnie z ISO 8199
wg PN EN ISO 7218: liczenie kolonii po okresie inkubacji policzyć kolonie (wszystkie kolonie, typowe lub kolonie podejrzane) na każdej płytce, których liczba wynosi do 300 włącznie (lub jest to jakakolwiek podana liczba zawarta w odpowiedniej normie) rozlane kolonie ( w formie łańcucha) traktować jak jedną kolonię. Jeżeli więcej niż jedna czwarta płytki jest porośnięta, pominąć liczenie. 12
wg PN EN ISO 7218: wyrażanie wyników Seminarium STC 2018 najczęściej występujące przypadki, gdy badania są prowadzone zgodnie z dobrą praktyką laboratoryjną. 10.3.2.2 Metoda obliczania: przypadek ogólny (liczenie wszystkich kolonii lub kolonii typowych) Aby wynik był ważny, powszechnie przyjmuje się za niezbędne liczenie kolonii co najmniej na jednej płytce zawierającej co najmniej 10 kolonii 13 Obliczyć liczbę N drobnoustrojów występujących w próbce do badań, jako średnią ważoną z dwóch kolejnych rozcieńczeń, zastosować wzór:
14 wg PN EN ISO 7218: 10.3.2.2 Metoda obliczania: przypadek ogólny (liczenie wszystkich kolonii lub kolonii typowych) N = C C V 1,1 d suma kolonii na dwóch wybranych, liczonych płytkach z dwóch kolejnych rozcieńczeń, z których co najmniej jedna zawiera minimum 10 kolonii; V - objętość inokulum naniesionego na każdą płytkę, w ml; d - rozcieńczenie odpowiadające pierwszemu uzyskanemu rozcieńczeniu [d = 1, gdy posiewa się nierozcieńczony produkt płynny (próbka do badań)].
wg PN EN ISO 7218: 10.3.2.2 Metoda obliczania: przypadek ogólny Seminarium STC 2018 (liczenie wszystkich kolonii lub kolonii typowych) N = 10-2 168 14 10-3 168 + 14 182 = 1 1,1 10 2 0,011 = 16 545 po zaokrągleniu wyniku do dwóch znaczących liczb 15 liczba drobnoustrojów wynosi 1,7*10 4 jtk w ml lub 1g produktu
wg PN EN ISO 7218: 10.3.2.2 Metoda obliczania: przypadek dwóch płytek Seminarium STC 2018 10-2 N = 168 10-2 215 10-3 168 + 215 + 14 + 25 422 = 1 2 + 0,1 2 10 2 0,022 14 10-3 25 = 19 182 16 1,9*10 4 jtk w ml lub 1g produktu
wg PN EN ISO 7218: 10.3.2.4 Metoda obliczania: małe liczby 10.3.2.4.1 Przypadek jednej/dwóch płytek (próbka do badań lub zawiesina wyjściowa lub pierwsze rozcieńczenie) zawierających mniej niż 10 kolonii Optymalna precyzja w każdej metodzie - liczba kolonii od 10 do górnego limitu Najniższe średnie stężenie cząsteczek x przypadające na próbkę analityczną, jeżeli oczekiwana standardowa niepewność względna równa się określonej wartości (RSD). 17 Współczynnik zmienności C v = s x s - oszacowane odchylenie standardowe populacji w próbce x średnia dla tej próbki
W przypadku rozkładu Poissona x oblicza się zgodnie z następującym wzorem: x = 1 C v 2 18 Jeżeli C v ustalone jest na 50 % jako akceptowalna wartość graniczna względnej precyzji (która w badaniach mikrobiologicznych wydaje się rozsądna), dolna wartość graniczna oznaczalności będzie liczbą kolonii podaną jako: x = 1 0,50 2 = 4 wyniki mniej niż 4 = obecność drobnoustrojów
Podsumowanie: Jeżeli płytka zawiera mniej niż 10 kolonii, ale co najmniej 4, wynik oblicza się ze wzoru: N E = C V d Jeżeli całkowita liczba kolonii zawarta jest między 3 a 1, precyzja wyniku jest zbyt niska, wynik powinien być podany jako: 1 3 19 Drobnoustroje są obecne, ale w liczbie mniejszej niż 4 V d w ml (produkty płynne) lub w gramie (inne produkty)
wg PN EN ISO 7218: 10.3.2.4 Metoda obliczania: małe liczby 10.3.2.4.2 Przypadek jednej/dwóch płytek (próbka do badań lub zawiesina wyjściowa lub pierwsze rozcieńczenie) niezawierających kolonii Wynik: żadne kolonie nie wyrosły < 1 V d jtk w ml (produkty płynne) lub w gramie (inne produkty) 20 Obecność drobnoustrojów <1 jtk/ml lub /g
wg PN EN ISO 7218: 10.5 Oznaczanie liczby w płynnych pożywkach 21 Próbki analityczne dodawane są do płynnej pożywki, która zapewnia wzrost określonego drobnoustroju lub grup drobnoustrojów i często hamuje wzrost nietypowych drobnoustrojów. Do stwierdzenia, czy wystąpił wzrost stosowane różne kryteria, np. wizualna ocena zmętnienia, produkcja gazu, zmiana zabarwienia, dalsza izolacja drobnoustrojów w selektywnej pożywce agarowej. Stosując takie podejście, jedynie ocena jakościowa np. wynik jest albo dodatni, albo ujemny. Aby oszacować liczbę obecnych drobnoustrojów, konieczne jest zwielokrotnienie posiewów próbki analitycznej i zastosowanie metod statystycznych do określenia najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL).
wg PN EN ISO 7218: 10.5 Oznaczanie liczby w płynnych pożywkach 22 Próbki analityczne dodawane są do płynnej pożywki, która zapewnia wzrost określonego drobnoustroju lub grup drobnoustrojów i często hamuje wzrost nietypowych drobnoustrojów. Do stwierdzenia, czy wystąpił wzrost stosowane różne kryteria, np. wizualna ocena zmętnienia, produkcja gazu, zmiana zabarwienia, dalsza izolacja drobnoustrojów w selektywnej pożywce agarowej. Stosując takie podejście, jedynie ocena jakościowa np. wynik jest albo dodatni, albo ujemny. Aby oszacować liczbę obecnych drobnoustrojów, konieczne jest zwielokrotnienie posiewów próbki analitycznej i zastosowanie metod statystycznych do określenia najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL).
wg PN EN ISO 7218: 10.5.3 Wybór systemu posiewu 23 Istotą metody NPL jest rozcieńczenie próbki do takiego stopnia, że inoculum będzie czasami, ale nie zawsze, zawierało żywe drobnoustroje. Wyniki tj. liczba posiewów wykazująca wzrost w każdym rozcieńczeniu, umożliwia oszacowanie początkowej zawartości bakterii w próbce. mikrobiolodzy stosują serie rozcieńczeń, posiewając kilka probówek (albo płytek, itp.) z każdego rozcieńczenia. NPL drobnoustrojów obecnych w próbce wyjściowej i oszacowanie precyzji, można obliczyć za pomocą metod statystycznych na podstawie liczby dodatnich i ujemnych wyników zaobserwowanych w probówkach po inkubacji.
Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą NPL przykład: 24 http://www.uwm.edu.pl/wnz/mikrobiologia/studenci/stacjonarne/studia-stacjonarne-przedmioty
wg PN EN ISO 7218: 11. Metoda wykrywania obecności (metoda jakościowa) jest metodą, która określa obecność lub nieobecność określonych drobnoustrojów w danej masie produktu. O ile w odpowiedniej Normie Międzynarodowej nie określono inaczej, mieszać (produkty płynne) lub homogenizować (inne produkty) ilość P badanego produktu z 9 x P ml lub z 9 x P g bulionu nieselektywnego i/lub selektywnego. 25
Wykrywanie obecności drobnoustrojów przykład: 26 http://www.uwm.edu.pl/wnz/mikrobiologia/studenci/stacjonarne/studia-stacjonarne-przedmioty