Endonukleazy restrykcyjne molekularne nożyczki
Inżynieria genetyczna nauka o technikach (narzędziach) biologii molekularnej pozwalających na świadomą i zamierzoną ingerencję w materiał genetyczny organizmów w celu wyizolowania i charakterystyki określonych fragmentów DNA (np. genów) oraz zmiany ich właściwości dziedzicznych Dzięki technikom inżynierii genetycznej możemy : izolować z komórki fragmenty materiału genetycznego (geny) powielać geny (klonowanie molekularne) i całe organizmy wprowadzać zmiany do informacji genetycznej przenosić fragmenty DNA (geny) do komórek innego organizmu
Nie należy utożsamiać inżynierii genetycznej z biotechnologią Biotechnologia to pojęcie szersze, obejmujące wszelkie manipulacje żywymi organizmami (zwłaszcza mikroorganizmami) w celu osiągnięcia określonych korzyści. Inżynieria genetyczna istnieje od ok. 50 lat, biotechnologia od niepamiętnych czasów Współczesna biotechnologia opiera się w dużej mierze na technikach inżynierii genetycznej. Dzięki nim możliwa jest: heterologiczna ekspresja genów kodujących określone białka zmiana (optymalizowanie) poziomu ekspresji konkretnego genu wprowadzanie celowych zmian sekwencji nukleotydowych powodujących zmiany aminokwasów a co za tym idzie modyfikacje właściwości białka, często ulepszenie funkcjonowania transgeneza bakterii, roślin i zwierząt organizmy genetycznie zmodyfikowane (GMO) terapia genowej
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja rekombinowanej insuliny w bakteriach Ekspresja ludzkiej insuliny w bakteriach Enzym restrykcyjny ludzkie cdna linker Zrekombinowane DNA plazmidowe Wektor plazmidowy Klonowanie molekularne bakteria chromosom Tranfsormacja rekombinowana insulina rekombinowana insulina
Aby manipulować materiałem genetycznym (np. genami) niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce). Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne, ligazy, wektory Wszelkie zabiegi na materiale genetycznym muszą rozpocząć się od jego wyizolowania z komórki. Cząsteczki DNA są następnie dzielone na mniejsze odcinki za pomocą enzymów restrykcyjnych w celu pozyskania konkretnych fragmentów DNA
Odkrycie enzymów restrykcyjnych 1962 r. Arber i Dussoix wyjaśnili zjawisko restrykcji ograniczenie rozwoju fagów w E. coli. Zidentyfikowali endonukleazę, która trawiła niechroniony (o innym wzorcu metylacji), obcy DNA. Metylacja charakterystyczna dla gospodarza bakteryjnego chroniła jego własne DNA przed restrykcją (trawieniem) 1968 r. Arber i Linn oczyścili enzym EcoB i wykazali jego działanie in vitro. Enzym ten trawił DNA E. coli K ale nie trawił E. coli B. 1968 r. Smith, Wilcox, Kelly (John Hopkins University) wyizolowali pierwszy enzym II klasy i określili charakterystykę miejsca rozpoznania dla Hind II 1972 r. Enzym ten został użyty do sporządzenia pierwszej mapy restrykcyjnej wirusa SV40 prez D. Nathansa 1978 r. Nagroda Nobla dla Arbera, Smitha i Wilcoxa za odkrycie enzymów restrykcyjnych
Enzymy restrykcyjne jako narzędzie w inżynierii genetycznej i biologii molekularnej Podstawowe zastosowanie enzymów restrykcyjnych w inżynierii genetycznej 1. Izolacja (pozyskiwanie) fragmentów DNA (liniowych cząsteczek) do rekombinacji in vitro i klonowania molekularnego 2. Mapowanie fizyczne genomów 3. Diagnostyka (np. chorób) i identyfikacja (np. ustalanie pokrewieństwa
Enzymy restrykcyjne (restryktazy) (ER) pod względem biochemicznym to endonukleazy przecinają szkielet cukierfosforan w DNA Restryktazy działają na określone sekwencje w DNA: żeby strawić DNA enzym restrykcyjny musi zobaczyć określony ciąg nukleotydów (miejsce rozpoznania) Nazewnictwo enzymów (Smith i Nathans) Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera się na literowych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymują liczby rzymskie Enzym Pochodzenie Miejsce trawienia 5' -->3' Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T Hpa I Haemophilus parainflenzae G T T * A A C Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C Mbo I Moraxella bovis *G A T C Mbo I Moraxella bovis *G A T C Pst I Providencia stuartii C T G C A * G Sma I Serratia marcescens C C C * G G G SstI Streptomyces stanford G A G C T * C Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G
Podział systemów restrykcyjnych na klasy I, II i III Główne różnice pomiędzy klasami systemów restrykcyjnych dotyczą: 1) wzajemnej lokalizacji aktywności restryktazy i metylazy DNA W klasie I i III te dwie aktywności są w obrębie jednego kompleksu enzymatycznego, złożonego z dwóch lub trzech heterologicznych podjednostek, w klasie II są rozdzielone na dwa odrębne białka 2) lokalizacji miejsca trawienia względem miejsca rozpoznania DNA 3) Enzymy poszczególnych klas różnią się także wymaganiami co do kofaktorów potrzebnych do ich aktywności in vitro
Endonukleazy restrykcyjne I klasy Aktywność metylazy i restryktazy są w tym samym kompleksie białkowym Przykłady sekwencji rozpoznawanych przez enzymy I klasy: CfrA1 EcoAI EcoBI EcoKI GCANNNNNNNNGTGG GAGNNNNNNNGTCA TGANNNNNNNNTGCT AACNNNNNNGTGC Ogólnie: 3 nt/6-8 N/4-5 nt - sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna przecinają obydwie nici w pewnej odległości (kilkadziesiąt-kilkaset pz) od rozpoznanej sekwencji Do swojej aktywności wymagają S-adenozylo-metioniny (SAM), Mg +2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne III klasy Substratem jest dsdna Aktywność metylazy i restryktazy są w tym samym kompleksie białkowym Rozpoznają asymetryczne miejsca 5-7 nukleotydowe: EcoP I EcoP 15I Hinf III AGACC CAGCAG CGAAT przecinają DNA w odległości 24-26 nt od miejsca rozpoznania Wymagają do działania jonów Mg +2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne II klasy Posiadają rozdzieloną aktywność restryktazy i metylazy (dwa odrębne białka), ich geny zwykle sąsiadują w genomie Enzymy typu II trawią DNA w obrębie miejsca rozpoznania - krótkiej sekwencji zazwyczaj 4-8 nt (niekiedy 12 nt) do aktywności in vitro bezwzględnie wymagają jedynie jonów Mg
Właściwości miejsca rozpoznania ER klasy II Większość miejsc rozpoznania jest ścisłym palindromem z symetrią rotacyjną ma długość najczęściej 4, 5, 6, 7, 8 nt Niekiedy palindrom może być przerwany przez serię 1-9 dowolnych nt np. Sfi I GGCCNNNNNGGCC Długość sekwencji rozpoznawanej warunkuje częstość trawienia DNA np.: (zakładając że G+C = 50%) enzymy z 8 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co ok. 65 kpz (służą np. do konstrukcji bibliotek genomowych) z 6 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co 4096 bp (4 6 ) (wygodne do izolowania odcinków DNA obejmujących pojedyczne geny) 4 nt sekwencją rozpoznania trawioną DNA z częstością co 256 bp (4 4 ) (tworzenie tzw. odcisków palca DNA fingerpinting)
Enzymy rzadkotnące: Rozpoznają 7-8 nukleotydowe sekwencje np.: SapI 5 - GCTCTTC -3 Sgf1 5 - GCGATCGC -3 Enzymy, które rozpoznają sekwencje bogate w pary GC albo AT SmaI rozpoznaje 5 CCCGGG -3, trawi co 78 kb; NotI rozpoznaje 5 GCGGCCGC 3, trawi co 10 Mpz
Niektóre enzymy pochodzące z różnych bakterii rozpoznają identyczne sekwencje, są to tzw. izoschizomery i mogą przecinać te sekwencje w dokładnie taki sam sposób Neoizoschizomery enzymy rozpoznające taką samą sekwencję, ale przecinające ją w inny sposób. Przykłady: SmaI XmaI 5 CCC GGG 3 5 C CCGGG 3
Trawienie enzymami restrykcyjnymi tworzy wolne końce DNA Lepkie końce mogą być różnej długości (zwykle są 2 lub 4 nt, ale mogą być także 1 lub 3 nt) i mogą mieć nadmierności typu 5 lub 3, w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego. Mogą też tworzyć tępe końce Większość enzymów trawi DNA generując końce z 5 - fosforanem lub 3 OH (wyjątek np. Nci I tworzy końce: 3 -fosforan i 5 -OH)
Jeśli lepkie końce są komplementarne, ligaza może je bardzo łatwo połączyć niezależnie od pochodzenia DNA, tworząc zrekombinowane DNA in vitro Możemy łączyć in vitro również tępe końce DNA ale jest nieco mniej wydajne zrekombinowane DNA
BamHI 5'-G^G A T C C-3 3'-C C T A G^G-5' BglII 5'-A^G A T C T-3 3'-T C T A G^A-5' Uwaga! Nie zostają zachowane miejsca restrykcyjne ani rozpoznawane przez BamHI ani rozpoznawane przez BglII!!!
Inne zastosowania enzymów restrykcyjnych klasy II Mapowanie restrykcyjne Mapa restrykcyjna zawiera dokładną lokalizację miejsc restrykcyjnych w obrębie fragmentu (cząsteczki) DNA. Najprostszą metodą jest trawienie próbek DNA pojedynczymi enzymami, a następnie parami tych enzymów. Produkty trawienia są rozdzielane w żelu agarozowym dla określenia wielkości fragmentów, a następnie odtwarza się kolejność ułożenia enzymów danym fragmencie lub cząsteczce. Pojedyncze trawienie zwykle mówi ile jest fragmentów restrykcyjnych w badanym DNA, a podwójne trawienie mówi o kolejności i orientacji fragmentów Mapy restrykcyjne konstruuje się wtedy, gdy nie znamy sekwencji DNA. Jeśli sekwencja jest znana wystarczy wstawić tę sekwencję do programu komputerowego i uzyska się b. dokładną mapę restrykcyjną
Zastosowanie enzymów w analizie polimorfizmu DNA zróżnicowania genetycznego RFLP restriction fragment length polymorphism (różnice w długości fragmentów restrykcyjnych tworzonych po cięciu DNA restryktazami II typu. Wykrywa się głównie przez trawienie DNA amplifikowanego w reakcji PCR i elektroforezę agarozową produktów reakcji (PCR-RLFP). Polimorfizm restrykcyjny może być stosowany np. do oznaczania ojcostwa
Zastosowanie enzymów w diagnostyce chorób genetycznych: Wykrywanie mutacji przy pomocy enzymów restrykcyjnych np.: anemia sierpowata Normalny gen globiny CTGAG GACTC Zmutowany gen globiny CTGTG GACAC Trawienie enzymem Dde I Elektroforeza agarozowa Dwa fragmenty o dłg: 201 i 175 bp Jeden fragment o dłg. 376 bp