Tom Numer 3 4 ( ) Strony

Tom 60 2011 Numer 3 4 (292 293) Strony 459 473 Anna Litwiniec 1, Natasza Borodynko 2, Sandra Cichorz 1, Natalia Rymelska 2, Maria Gośka 1 1 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin Państwowy Instytut Badawczy, Zakład Genetyki i Hodowli Roślin Korzeniowych Powstańców Wielkopolskich 10, 85-090 Bydgoszcz 2 Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy Zakład Wirusologii i Bakteriologii W. Węgorka 20, 60-318 Poznań E-mail: a.litwiniec@ihar.bydgoszcz.pl ŹRÓDŁA I MECHANIZMY ODPORNOŚCI BURAKA CUKROWEGO ORAZ DZIKICH FORM Z RODZAJU BETA NA BNYVV WPROWADZENIE Wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów buraka (ang. Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV), wywołujący rizomanię buraka cukrowego, może przyczyniać się do znaczących strat ilości i jakości plonu w skali światowej (Scholten i Lange 2000, Rush i współaut. 2006). Obecnie choroba ta występuje w większości obszarów uprawy buraka cukrowego. Zgodnie z aktualnym stanem wiedzy, jedyną skuteczną metodą walki w przypadku porażenia pola jest uprawa odmian tolerancyjnych, pozwalająca na ograniczenie namnażania i rozprzestrzeniania wirusa (Lennefors 2006, De Biaggi i współaut. 2010). Jednocześnie, żaden ze znanych genów odporności nie zapobiega całkowicie porażeniu, a w materiałach częściowo odpornych najczęściej dochodzi do asymptomatycznej infekcji o zakresie występowania ograniczonym do tkanki korzenia (De Biaggi i współaut. 2010). CZYNNIKI PATOGENNE ORAZ SYMPTOMY CHOROBY Wirus BNYVV jest przenoszony przez grzybopodobnego pierwotniaka Polymyxa betae występującego w glebie (Keskin 1964). Podczas wzrostu roślin w glebie zawierającej tego patogena dochodzi do uwolnienia pierwotnych zoospor, czyli dwuwiciowych, zdolnych do aktywnego przemieszczania się form pierwotniaka z otoczonych grubą ścianą spor spoczynkowych. Zoospory przyczepiają się do powierzchni korzenia i po utracie wici tworzą cysty, w obrębie których uformowane zostają specjalne elementy umożliwiające penetrację ściany komórkowej. Infekcja wirusowa następuje poprzez wprowadzenie zawartości cysty do komórki korzenia włośnikowego bądź epidermy korzenia. Na tym etapie po raz pierwszy możliwy jest kontakt wirusa z komórką gospodarza. Po zasiedleniu komórek korzenia przez wektor formowane są nieregularne skupiska cyst zwane plazmodiami, przekształcające się w kolejnych etapach w zoosporangia bądź też w skupiska spor spoczynkowych (cystosorusy) (Ryc. 1). W ciągu kilku dni, przy sprzyjających warunkach, zoosporangia dają początek wolnym wtórnym zoosporom, wyprowadzanym na zewnątrz i zdolnym do zasiedlania kolejnych partii korzeni (Keskin 1964). Wirus namna-

460 Anna Litwiniec i współaut. Ryc. 1. Cystosorusy Polymyxa betae w korzeniu odmiany standardowej buraka cukrowego, nie posiadającej odporności na rizomanię. Struktury te występują szczególnie obficie w korzeniach włośnikowych oraz w części wierzchołkowej korzenia głównego (fot. Maria Gośka). miast, szczególnie przy silnych opadach deszczu w połączeniu z wysokimi temperaturami, obserwuje się systemiczne rozprzestrzenianie się wirusa i żółknięcie nerwów liściowych (Scholten i Lange 2000, Rush i współaut. 2006, De Biaggi i współaut. 2010). Na podstawie różnic na poziomie genomu, zidentyfikowanych poprzez analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych oraz polimorfizmu konformacji pojedynczych nici, wyodrębniono trzy główne typy wirusa BNYVV: A, B i P (Kruse i współaut. 1994; Koenig i współaut. 1995, 1997). Jednocześnie zaobserwowano pewne zróżnicowanie w obrębie grupy wirusów posiadających RNA5, tj. typu P pochodzącego z Europy i izolatów z Azji, w związku z czym pojawiły się sugestie dotyczące wyodrębnienia kolejnego typu J (Koenig i współaut. 1997, Schirmer i współaut. 2005). Ponadto, inne odglebowe wirusy buraka cukrowego, w tym: odglebowy wirus buraka (ang. Beet soil-borne virus, BSBV), wirus Q buraka (ang. Beet virus Q, BVQ) oraz odglebowy wirus mozaiki buraka (ang. Beet soil-borne mosaic virus, BSBMV) są przenoszone przez tego samego wektora. BNYVV, BSBV oraz BVQ, również na terenie Polski, występują najczęściej w swoistym kompleksie, stąd też coraz częściej mówi się o występowaniu objawów rizomaniopodobnych (Meunier i współaut. 2003, Borodynko i Pospieszny 2007) (Ryc.2). Wydaje się, że mechanizmy odporności na wymienione wirusy mogą w znacznej mierze pokrywać się w przypadku niektórych źródeł odporności. Gen Rz1, jedno z głównych źródeł odporności na BNYVV, najprawdopodobniej nie nadaje odporności na BSBV (Lennefors 2006). Z jednej strony istnieje przekonanie, że wirus ten ma mniejsze znaczenie dla strat plonu oraz że infekcja nim przebiega asymptomatycznie, z drugiej strony natomiast, doświadczenia szklarniowe prowadzone w Niemczech sugerują znaczące straty plonu (Lennefors 2006, Borodynko i Pospieszny 2007). Różnice te mogą wynikać z innego rodzaju odporności występującej w danym materiale roślinnym. W toku badań polowych poświęconych oddziaływaniu BSBV na plon oraz zawartość cukru odmian wrażliwych i tolerancyjnych buraka cukrowego stwierdzono brak typowych dla rizomanii objawów chorobowych oraz dowiedziono, że wirus ten nie powodował znaczących strat plonu, a jego zawartość w odmianach tolerancyjnych na BNYVV była wyraźnie ograniczona. Wydaje się zatem, że w przetestoważa się w komórkach roślinnych, a następnie podlega akumulacji w plazmodiach wektora (Abe i Tamada 1986, Rysanek i współaut. 1992). W początkowych stadiach cyklu rozwojowego wektora produkowane są głównie zoospory, natomiast w późniejszych etapach dominują spory spoczynkowe, które, wraz z postępującym uszkodzeniem korzeni, rozprzestrzeniają się w glebie. Tam, w odpowiednich warunkach termiczno-wilgotnościowych, z cystosorusów wytwarzane są kolejne generacje pierwotnych zoospor. Powtarzające się etapy zasiedlania i uwalniania wektora sprzyjają jego namnażaniu oraz zwiększają częstotliwość kontaktu wirusa z gospodarzem (Scholten i Lange 2000, Lennefors 2006, Rush i współaut. 2006). Na skutek porażenia roślin podatnych na wirusa dochodzi do wytworzenia obfitego systemu drobnych korzeni włośnikowych wraz z pojawieniem się w miejscach ich intensywnego rozwoju tumorowatych narośli, a jednocześnie następuje zahamowanie wzrostu korzenia głównego, brązowienie wiązek przewodzących w wyniku ich nekrotyzacji, co jest szczególnie widoczne na szczycie korzenia głównego, oraz, ostatecznie, rozwój martwicy tkanki korzenia, obejmującej korzenie boczne i korzeń główny. W tej sytuacji niedostateczny pobór wody i składników odżywczych przyczynia się do występowania chlorozy, przewężenia i pokarbowania blaszek liściowych, utraty turgoru, rzadziej nato-

Źródła i mechanizmy odporności buraka cukrowego 461 nych odmianach mechanizmy odporności na BNYVV oraz BSBV mogą być zbieżne (Borodynko i współaut. 2009). Odporność na BNYVV jest utrzymywana, mimo obecności BSBV i BVQ, również w roślinach transgenicznych (Lennefors 2006). Ponadto istnieją doniesienia o możliwości nabycia przez roślinę krzyżowej odporności, przykładowo, na BNYVV poprzez wcześniejszą inokulację wirusem BSBMV bądź odwrotnie (Mahmood i Rush 1999). Natomiast wyniki doświadczeń, w których badano mieszaną infekcję wirusami BNYVV oraz BSBMV wskazują, że gen Rz nie nadaje odporności na BSBMV, ale BNYVV może ograniczać rozwój BSBMV, nawet w odmianach tolerancyjnych na rizomanię. Jednocześnie nie zaobserwowano jednoznacznego wpływu infekcji mieszanej na porażenie BNYVV w stosunku do występowania tego wirusa pojedynczo, chociaż wydaje się, że omawiane wirusy od- działują na siebie antagonistycznie (Wisler i współaut. 2003). Również niektóre izolaty P. betae mogą znacząco przyczyniać się do ograniczenia wzrostu korzeni buraka (Wisler i współaut. 2003, Lennefors 2006). Z drugiej strony, występowanie tzw. brody korzeniowej wskutek nadmiernej proliferacji korzeni bocznych często jest rezultatem ataku innych patogenów, a nawet oddziaływania czynników abiotycznych. Podobne objawy w tkance korzenia obserwowane są przykładowo w wyniku infekcji BBSV, który został zidentyfikowany w USA (ang. Beet black scorch virus) (Weiland i współaut. 2006). Dla dokładnego poznania i zrozumienia interakcji pomiędzy różnymi wirusami przenoszonymi przez P. betae oraz innymi patogenami konieczne wydaje się porównanie tych oddziaływań na tle różnych źródeł odporności na rizomanię. ŹRÓDŁA ODPORNOŚCI NA RIZOMANIĘ Pierwotnie głównym celem hodowli buraka cukrowego, zapoczątkowanej w Europie Północnej, było zwiększenie zawartości oraz poprawa ekstrakcji cukru, natomiast hodowla odpornościowa nie odgrywała znaczącej roli. Z czasem, istotnymi trendami hodowli stały się również jednonasienność oraz wykorzystanie systemu cytoplazmatycznej męskiej sterylności. Kierunki te przyczyniły się do znaczącego zawężenia puli genowej materiałów wyjściowych oraz form uprawnych tego gatunku, podczas gdy wiele cennych genów odporności pozostaje wciąż wśród form dzikich buraka, stąd też zasoby te od początków XX w. zaczęto również wykorzystywać w programach hodowlanych (Szota 1997, Panella i Lewellen 2007). Ponadto, wraz z rozszerzaniem się obszarów produkcji, koniecznością stało się poszukiwanie genów zapewniających dobre plonowanie i uprawę w warunkach występowania różnych chorób i szkodników buraka cukrowego. Do materiałów źródłowych determinujących podwyższoną odporność/tolerancję na działanie BNYVV zaliczyć można nie tylko obiekty buraka cukrowego zaadaptowane i uzyskane w toku procesów hodowlanych, podlegające uprzednio selekcji (np. Holly-1-4), ale również te reprezentujące formy dzikie z rodzaju Beta (np. WB42, WB41) (Scholten i Lange 2000, Rush i współaut. 2006, De Biaggi i współaut. 2010). Odporność zidentyfikowana w wartościowych obiektach hodowlanych najprawdopodobniej wywodzi się także od ich odległych dzikich przodków (Biancardi i współaut. 2002, De Biaggi i współaut. 2010). Identyfikacja kolejnych loci związanych z odpornością, pochodzących z różnych źródeł, umożliwiła komercyjne ich zastosowanie poprzez wprowadzenie do odmian uprawnych, które, dzięki temu, mogą już posiadać cechę uwarunkowaną wielogenowo (Gidner i współaut. 2005, Rush i współaut. 2006, Liu i Lewellen 2007, De Temmerman i współaut. 2009). Natomiast opisy potencjalnie przydatnych obiektów dokonane na podstawie uprzedniej ewaluacji dostępne są w bazach danych, jak np. Międzynarodowa Baza Danych dla Beta (IDBB), co ułatwia wstępny dobór materiałów (Panella i Lewellen 2007). Obecnie możliwe jest ponadto uzyskiwanie transgenicznych roślin odpornych (Lennefors 2006). Występowanie rizomanii odnotowano po raz pierwszy we Włoszech w 1952 r. i tam też później zainicjowane zostało poszukiwanie źródeł odporności przez firmę nasienną Maribo. Z materiałów pochodzenia włoskiego, selekcjonowanych pod kątem odporności na Cercospora beticola, wyprowadzono pierwsze linie posiadające pewien stopień odporności (Scholten i Lange 2000, Biancardi i współaut. 2002). Jednymi z pierwszych odmian posiadających tolerancję na

462 Anna Litwiniec i współaut. rizomanię i bazujących na materiałach tego pochodzenia, były wielonasienna diploidalna odmiana Alba P (Alba), posiadająca odporność uwarunkowaną wielogenowo oraz jednonasienna diploidalna odmiana Rizor (SES) (De Biaggi i współaut. 2010). W toku dalszych prac wyhodowano ulepszone mieszańce, jak np. Rizor 3, w oparciu o udoskonalone zapylacze. Odmiana Rizor, stworzona na bazie podatnej linii CMS, została pierwotnie opisana jako prezentująca odporność jednogenową typu dominującego. Wkrótce jednak utrwalenie odporności w formie homozygotycznej okazało się trudne. Segregacje potomstwa odbiegały od modelu przyjętego dla jednogenowej cechy dominującej i zaczęto rozważać możliwość obecności dodatkowych genów regulujących ekspresję (Biancardi i współaut. 2002). Kolejne materiały uzyskano w toku programu przeszukiwania zasobów prowadzonego w USA w odpowiedzi na rozprzestrzenianie się tam choroby. Odporność, występująca w materiałach pochodzących z firmy Holly Hybrids (Beta vulgaris ssp. vulgaris), została po raz pierwszy odkryta w 1983 r. przez Erichsena w trzech eksperymentalnych mieszańcach bazujących na jednym komponencie CMS, który okazał się być źródłem odporności (Lewellen i współaut. 1987). Zasugerowano jednocześnie, że cecha jest najprawdopodobniej uwarunkowana jednogenowo, dzięki obecności genu Rz, później oznaczonego jako Rz1 (Lewellen i współaut. 1987, Scholten i współaut. 1996). Na podstawie koncentracji wirusa w osobnikach pokolenia F1 uzyskanego z krzyżowania homozygot odpornych z roślinami podatnymi dowiedziono, że odporność dziedziczy się w sposób dominujący (Scholten i współaut. 1996). Ten gen znalazł następnie szerokie zastosowanie w hodowli i został wprowadzony do wielu komercyjnych odmian (Biancardi i współaut. 2002, De Biaggi i współaut. 2010). Jednocześnie stwierdzono różny stopień podatności występujący w innych materiałach hodowlanych. Podobny poziom odporności, jak w przypadku obecności Rz1, odnotowano przykładowo w liniach hodowlanych C39R oraz C47R, otrzymanych w toku kolejnych cykli selekcji fenotypowej, jednak w materiałach tych pożądana cecha była uwarunkowana w sposób ilościowy, w związku z czym trudniejsze okazało się jej zastosowanie w programach hodowlanych (Rush i współaut. 2006). Obserwacje wpływu występowania Rz1 w diploidalnych i triploidalnych materiałach oraz rozszczepienia uzyskane w pewnych populacjach segregujących wskazują jednak na możliwość niezupełnej dominacji tego allelu i/lub różny stopień penetracji genu bądź też oddziaływanie genów epistatycznych (Pelsy i Merdinglou 1996, Giorio i współaut. 1997, Scholten i współaut. 1997, Wisler i współaut. 1999, Lein i współaut. 2006). Z drugiej strony, w toku kolejnych doświadczeń wykazano zbliżony poziom tolerancji na BNYVV zarówno u homozygot dominujących, jak i u heterozygot pod względem Rz1 (Nouhi i współaut. 2009). Trudno jednoznacznie wskazać przyczyny tych różnic, ale mogą one wynikać przykładowo z nieporównywalnych warunków eksperymentalnych poszczególnych doświadczeń (różnice w koncentracji wirusa w glebie i potencjale jego inokulum, co może wpływać na załamywanie odporności), z różnej dokładności odczytów testu ELISA oraz różnej ilości powtórzeń tego testu na poszczególnych genotypach, z odmiennego stadium roślin w momencie ich porażania bądź też ze specyfiki samych populacji segregujących. Poza tym istotny wydaje się fakt, iż zidentyfikowane zostały pewne analogi genów odporności RGA (ang. resistance gene analogues) na chromosomie III, związane z Rz1 (Hunger i współaut. 2003, Lein i współaut. 2006). Dla niektórych RGA nie stwierdzono jednak współsegregacji z tym genem (Hunger i współaut. 2003), inne RGA zostały natomiast opisane jako blisko związane, a nawet segregujące z Rz1 (Lein i współaut. 2006). Przykładowo, allel określony mianem Rz-C znalazł zastosowanie w odróżnianiu odmian podatnych i odpornych, a jego transkrypt był wykrywany we wszystkich materiałach odpornych poddanych analizom (Lein i współaut. 2006). Mogłoby to sugerować udział dodatkowych genów o mniejszym znaczeniu, potencjalnie warunkujących specyfikę reakcji odporności w danej linii bądź też stanowiących rezerwuar zmienności genetycznej dla nowych genów odporności (Michelmore i Meyers 1998). Lein i współaut. (2006) uważają, że Rz1 mieści się pomiędzy dwoma skupiskami analogów genów odporności i w związku z tym opisują uwarunkowanie dziedziczenia odporności na rizomanię terminem locus cechy ilościowej QTL (ang. quantitative trait locus), a mianowicie Rz1-QTL. Podobne określenie zostało wykorzystane już wcześniej do opisu sekwencji DNA zlokalizowanej pomiędzy dwoma markerami na obszarze 4,6 cm, decydującej o ponad 67%

Źródła i mechanizmy odporności buraka cukrowego 463 obserwowanej zmienności fenotypowej oraz prawie całej zmienności genetycznej, uznanej zatem za odpowiadającą Rz1. Stwierdzono wówczas, że zmienność cechy warunkowanej tym genem jest wynikiem jego ekspresji w danych warunkach środowiskowych, czyli penetracji. Jednocześnie zidentyfikowano markery RAPD związane w istotny statystycznie sposób z poziomem odporności na rizomanię (Pelsy i Merdinoglu 1996). Dalsze badania wydają się wciąż jednak niezbędne dla wyjaśnienia roli genów modulujących, które mogą modyfikować odporność bazującą na Rz1 (De Biaggi i współaut. 2010). R104 jest innym obiektem B. vulgaris ssp. vulgaris, w którym również stwierdzono obecność głównego dominującego genu odporności, najprawdopodobniej identycznego z Rz1 (Scholten i współaut. 1997, 1999). Linia ta wywodzi się z jednorocznej formy dzikiego buraka pochodzenia włoskiego (Scholten i współaut. 1997). Analogicznie, odporność w obiekcie R128 wywodzącym się najprawdopodobniej z Turcji, z formy buraka liściowego, jest również ściśle związana z Rz (Scholten i współaut. 1997). Pomimo braku kompletnej informacji dotyczącej genealogii pierwszych materiałów wykazujących odporność, molekularne analizy różnych genotypów wskazują na możliwość występowania ich wspólnego przodka. Istnieją sugestie, że mógłby nim być jakiś burak nadmorski. Jednak, ze względu na intensywną wymianę materiałów hodowlanych, jaka miała miejsce w latach 60 XX w. między Europą i USA, ostateczna weryfikacja tej hipotezy jest bardzo trudna (Biancardi i współaut. 2002). Rz1 wywodzi się najprawdopodobniej z zasobów genetycznych buraków nadmorskich należących do puli Munerati, które to źródło przypuszczalnie stanowiło podstawę do uzyskania odporności typu Alba, Rizor oraz Holly. Geny odporności typu Rizor i Holly zostały zmapowane bardzo blisko siebie (De Biaggi i współaut. 2010). Badania przeprowadzone z pomocą markerów molekularnych wykazały m.in. obecność pewnych wspólnych sekwencji w tym samym regionie chromosomalnym, związanych z odpornością w materiałach typu Holly oraz liniach wywodzących się z odmian Rizor oraz Golf, jak również w materiałach pochodzących od B. maritima, a także od innych buraków dzikich (Barzen i współaut. 1997, Giorio i współaut. 1997, Scholten i współaut. 1997). Stwierdzono mianowicie obecność markera SCAR F6, którego odległość od genu Rz została oszaco- wana na około 1,3 cm oraz brak fragmentu SCAR N9 występującego u roślin podatnych. Ten zestaw markerów SCAR sugeruje jednorodność źródeł typu Holly i Rizor. Ponadto dzięki zastosowaniu w/w markerów dokonano odróżnienia heterozygot od homozygot pod względem genu Rz w populacjach segregujących w źródle odporności typu Holly (Barzen i współaut. 1997). Analogiczny system markerów znalazł również zastosowanie w ocenie populacji wywodzącej się z odmiany Golf, co potwierdziło możliwość wspólnego źródła odporności w stosunku do Holly, chociaż jednocześnie występowały pewne różnice. Mianowicie, nie zaobserwowano identycznego układu markerów F6 i N9, co nie pozwoliło na jednoznaczne wykluczenie udziału innych genów zlokalizowanych w podobnym obszarze genomu, jednak warunkujących nieco odmienne typy odporności (Giorio i współaut. 1997). W populacji wywodzącej się od Holly-1-4 opisano z kolei bardziej oddalone markery pozwalające na odróżnienie homozygot od heterozygot pod względem Rz1 (Nouhi i współaut. 2008). Natomiast Scholten i współaut. (1997) zidentyfikowali markery RAPD związane z loci odporności dla populacji segregujących Holly-1-4, R104, R128 oraz WB42, przy czym nie stwierdzono obecności markerów wspólnych dla wszystkich wymienionych obiektów. Pojawiały się natomiast produkty specyficzne jedynie dla części bądź nawet poszczególnych badanych materiałów. Przykładowo, zastosowanie startera OP-01 pozwoliło na odróżnienie sekwencji wspólnych dla Holly-1-4, R104 i R128, podczas gdy inne markery były najsilniej związane z odpornością w przypadku WB42 (Scholten i współaut. 1997). Potwierdza to zatem obecność pewnych wspólnych elementów decydujących o dziedziczeniu odporności w niektórych materiałach pochodzących z odrębnych źródeł, ale jednocześnie może wskazywać na występowanie różnic między nimi, takich jak udział innych loci w przypadku WB42 w stosunku do Holly-1-4. Bazując wyłącznie na markerach molekularnych związanych z locus danego genu, ale nie należących do jego sekwencji, nie można jednak z całą pewnością wykluczyć, że, pomimo obecności wspólnego źródła odporności, w rozwoju filogenetycznym poszczególnych obiektów nie doszło do rozerwania sprzężenia sekwencji markerowych z tym genem. Wspomniany obiekt WB42 należy do dzikich gatunków z rodzaju Beta, stanowiących

464 Anna Litwiniec i współaut. rezerwuar atrakcyjnych genów odporności na różne choroby i szkodniki buraka. Wśród gatunków tych na szczególną uwagę zasługuje B. vulgaris ssp. maritima ze względu na bliskie pokrewieństwo z burakiem uprawnym i, co się z tym wiąże, kompatybilność krzyżowania (Scholten i Lange 2000, Panella i Lewellen 2007). W celu przeniesienia korzystnych właściwości z tego gatunku stosowano dwa główne podejścia: bazujące na selekcji indywidualnych obiektów bądź też na złożonych kolekcjach materiałów (Rush i współaut. 2006, Panella i Lewellen 2007). W pierwszym przypadku, po zidentyfikowaniu odporności w obrębie określonego obiektu, dokonywano krzyżowań wstecznych (ang. backcross) do linii hodowlanych buraka cukrowego. W ten właśnie sposób wprowadzono geny pochodzące z B. vulgaris ssp. maritima WB42 do buraka cukrowego (Lewellen i Whitney 1993, Rush i współaut. 2006). Na podstawie segregacji potomstwa uzyskanego z krzyżowań pomiędzy WB42 oraz Holly-1-4 stwierdzono, że gen odporności w WB42 jest usytuowany w odrębnym, blisko położonym locus w stosunku do Rz1, stąd został on oznaczony jako Rz2. Odległość między tymi genami oszacowano w przybliżeniu na 20 cm. Jednocześnie nie wykluczono udziału dodatkowych genów niosących odporność oraz zaobserwowano, że koncentracja wirusa w testach szklarniowych była niższa w przypadku WB42 w porównaniu z Holly-1-4 oraz R104 (Scholten i współaut. 1994, 1999). Wykazano ponadto większą podatność na infekcję genotypów Rz1rz1 w porównaniu z Rz2rz2, podczas gdy odmiana Angelina łącząca Rz1rz1 z Rz2rz2 była najbardziej odporna (Liu i Lewellen 2007). Kolejne doniesienia wydają się potwierdzać, że WB42 warunkuje wyższy poziom odporności oraz że odporność tego rodzaju podlega kontroli pojedynczego genu dominującego, którego odległość w stosunku do Rz1 (35 cm) została ustalona na podstawie frekwencji rekombinantów posiadających konkretne markery molekularne i dla którego opracowano najbliżej dotychczas położony marker związany z allelem recesywnym. Poprzez zestawienie wartości uzyskanych w teście ELISA oraz segregacji tego markera stwierdzono, że podobny stopień tolerancji występuje w homozygotach dominujących jak w przypadku heterozygot (Amiri i współaut. 2003, 2009). W pracach badawczych, w których oceniano odległość między Rz1 a Rz2 w oparciu o jakościową klasyfikację fenotypu (rośliny po- datne vs. odporne), nie można jednak jednoznacznie wykluczyć przeszacowania frekwencji rekombinacji (Gidner i współaut. 2005). Zmienność stopnia odporności w różnych kombinacjach mieszańców posiadających Rz2 sugeruje z kolei możliwość epistatycznego oddziaływania z genami o mniejszym znaczeniu (Meulemans i współaut. 2003). W innym, atrakcyjnym obiekcie B. vulgaris ssp. maritima WB41 opisano natomiast trzeci ze znanych genów odporności, a mianowicie Rz3. Znajduje się on w sąsiedztwie Rz1 i Rz2, na chromosomie III, w odległości oszacowanej na 5 cm od Rz1. Obserwacje heterozygot wskazują, iż omawiany gen może cechować się niekompletną penetracją. Jednocześnie w źródle WB41 nie wykluczono udziału dodatkowych genów warunkujących odporność oraz stwierdzono konieczność dalszej jednoznacznej weryfikacji odrębności genów Rz2 i Rz3 (Gidner i współaut. 2005). Dokonano już przeniesienia wymienionych genów do materiałów hodowlanych, takich jak linia C48, łącząca w sobie źródła WB41/ WB42, czy do linii C79-3 oraz C79-2 (Lewellen i Whitney 1993, Rush i współaut. 2006, Panella i Lewellen 2007). Wydaje się, że odporność w materiałach B. vulgaris ssp. maritima, podobnie jak w przypadku źródła Holly, podlega kontroli pojedynczego genu dominującego, chociaż dokładne uwarunkowania jej dziedziczenia oraz molekularne mechanizmy nie zostały dotychczas jednoznacznie opisane (Lein i współaut. 2006, Tamada 2007). Warto zaznaczyć, że pomimo hipotezy o wspólnym pochodzeniu materiałów prezentujących różne typy odporności, analizy molekularne przeprowadzone na obiektach Holly-1-4 oraz WB42 nie wskazują na obecność wspólnych markerów związanych z fenotypem (Scholten i współaut. 1997, Nouhi i współaut. 2008, Amiri i współaut. 2009). W toku innych prac badawczych wykazano jednak obecność charakterystycznych dla odporności produktów, jak Rz-C, w różnych odmianach odpornych, niezależnie od występującego w nich układu genów, tj. obecności Rz1, Rz2, bądź też obu tych genów równocześnie. Najprawdopodobniej fragment Rz-C koduje białko zawierające w swej strukturze miejsce wiązania nukleotydów NBS (ang. nucleotidebinding site) oraz domenę bogatą w elementy leucynowe LRR (ang. leucine-rich repeats), które mogą być niezbędne dla zainicjowania odpowiedzi nadwrażliwości i śmierci komórki w miejscu infekcji (Lein i współaut.

Źródła i mechanizmy odporności buraka cukrowego 465 2006). Zatem, powszechne występowanie niektórych genów, takich jak analogi genów odporności może odzwierciedlać pewne uniwersalne mechanizmy leżące u jej podstaw. Jednocześnie istnieją doniesienia wskazujące, że współwystępowanie Rz1 i Rz3 uzyskane w wyniku odpowiednich krzyżowań może wzmagać odporność roślin na wirusa oraz że rośliny posiadające Rz2 charakteryzują się większą tolerancją w porównaniu z innymi, zawierającymi jedynie Rz1 (Paul i współaut. 1993, Scholten i współaut. 1999, Amiri i współaut. 2003, Gidner i współaut. 2005), co z kolei sugeruje, że odrębne i niezależne lub częściowo uzupełniające się elementy genetyczne uczestniczą w regulacji bardziej wyspecjalizowanych mechanizmów odporności. Presja selekcyjna patogena na geny rośliny-gospodarza w warunkach populacji naturalnych może znacząco odbiegać od analogicznych oddziaływań w środowisku roślin uprawnych, co z pewnością nie pozostaje bez wpływu na tempo mutacji oraz w konsekwencji na ewolucję różnych typów odporności. Inne podejście związane z przeniesieniem genów z gatunków dzikich polega na ocenie całych kolekcji pod kątem odporności na rizomanię, po czym wybrane obiekty są włączane do jednego programu hodowlanego, niejednokrotnie bez określania czynników sprawczych, tj. wyodrębniania konkretnych genów (Rush i współaut. 2006, Panella i Lewellen 2007). Równolegle wciąż prowadzone są prace związane z identyfikacją czynników determinujących korzystne właściwości dzikich form buraka. Przykładowo, w populacji mapującej R36, wywodzącej się z materiałów uzyskanych w toku złożonego krzyżowania około 60 obiektów B. vulgaris ssp. maritima z burakiem cukrowym, zidentyfikowano QTL posiadający główny wpływ na odporność w stosunku do BNYVV, opisany jako Rz4. Został on zmapowany na chromosomie III, podobnie jak wszystkie uprzednio poznane loci Rz, i podobnie jak one jest odpowiedzialny za częściową odporność (Grimmer i współaut. 2007). Jednocześnie, właściwe testy alleliczności wydają się konieczne dla zweryfikowania odrębności/tożsamości genów Rz1, Rz2, Rz3 i Rz4. Dzięki takim testom ustalono przykładowo, że odporność w obiektach Holly-1-4 oraz WB42 jest warunkowana przez niealleliczne, ale związane ze sobą loci (Scholten i współaut.1999, Amiri i współaut. 2003). Wśród innych zidentyfikowanych dotychczas źródeł odporności wy- różnić można również: C28, R04, R05, C50, WB151, WB169 i WB258 (Lennefors 2006, Grimmer i współaut. 2008). W większości przypadków odporność pochodząca z tych obiektów nie została jak dotąd w pełni scharakteryzowana pod względem genetycznym, a pojedyncze przeprowadzone doświadczenia mapowania wskazują, że może być ona determinowana przez czynniki alleliczne w stosunku do opisanych uprzednio genów. Grimmer i współaut. (2008) określili na chromosomie III pozycję Rz5, czyli genu głównego wywodzącego się ze źródła WB258 oraz zasugerowali, że wraz z Rz4 i Rz1 geny te stanowią prawdopodobnie serię alleli. Odporność na BNYVV została również opisana dla innych, dzikich gatunków z rodzaju Beta, m.in. B. patellaris, B. procumbens oraz dla wybranych obiektów B. corolliflora, B. macrorhiza, B. lomatogona, czy też B. intermedia (Luterbacher i współaut. 2005). Odrębnym kierunkiem hodowli odpornościowej może być poszukiwanie materiałów wyróżniających się odpornością na P. betae. Częściowa tolerancja na wektor została stwierdzona dla B. maritima, natomiast kompletna dla buraków z sekcji Procumbentes: B. patellaris, B. procumbens i B. webbiana (Barr i współaut. 1995, Mesbah i współaut. 1997, Scholten i Lange 2000, Kingsnorth i współaut. 2003, Asher i współaut. 2009). Obiekty należące do gatunków B. corolliflora, B. intermedia, B. trygina, B. lomatogona oraz B. macrorhiza z sekcji Corollinae również wykazywały odporność (Scholten i Lange 2000). Chociaż bariery krzyżowalności ograniczają potencjalne praktyczne wykorzystanie większości wymienionych gatunków w tradycyjnej hodowli, klonowanie genów może stać się narzędziem ułatwiającym ich wprowadzenie (Szota 1997, Scholten i Lange 2000). Kombinacja odporności na wirus i wektor jednocześnie może znacząco obniżać ilość wirusa w roślinie (Mesbah i współaut. 1997, Asher i współaut. 2009). Z drugiej strony, przeniesieniu poprzez krzyżowania korzystnych cech z form dzikich rodzaju Beta towarzyszy najczęściej introgresja pewnych niepożądanych właściwości, jakimi są: niska koncentracja i ekstrakcyjność sacharozy, jednoroczność, obecność czerwonego pigmentu w korzeniu oraz jego nietypowy kształt. Wymaga to prowadzenia dodatkowych krzyżowań wypierających (Panella i Lewellen 2007). Innym rozwiązaniem zapewniającym odporność może być bezpośrednie przeniesie-

466 Anna Litwiniec i współaut. nie pewnych genów wirusowych na drodze transformacji genetycznej, np. genów białka płaszcza, replikazy czy też genu kodującego białko decydujące o przemieszczaniu się wirusa (Ehlers i współaut. 1991, Scholten i Lange 2000, Lennefors i współaut. 2006). Najczęściej wykorzystywanymi strategiami dla buraka cukrowego wydają się dwa pierwsze z wymienionych zastosowań. W szczególności natomiast zestawienie odporności transgenicznej z naturalnie występującymi źródłami skutkuje bardziej skuteczną ochroną w warunkach silnego porażenia (Mannerlöf i współaut. 1996, Scholten i Lange 2000, Lennefors i współaut. 2006). Ekspresja genu pochodzącego od wirusa może, zgodnie z koncepcją odporności pochodzącej od patogena (Sanford i Johnston 1985), powodować zakłócenia w jego prawidłowym rozwoju, np. na drodze posttranskrypcyjnego wyciszenia RNA. Mechanizm ten stwierdzono przykładowo w transgenicznych burakach z fragmentem replikazy wstawionym w orientacji odwróconej, w których odnotowano bardzo małe ilości mrna transgenu, a jednocześnie znaczący poziom odpowiadającego mu sirna w korzeniach (Lennefors i współaut. 2006). Transgeniczna odporność tego typu prezentowała się bardzo korzystnie w porównaniu do źródeł konwencjonalnych, także w warunkach porażenia szczególnie wirulentnym typem P BNYVV oraz izolatem pochodzącym z USA (ang. Imperial Valley, IV-BNYVV), przełamującym odporność bazującą na Rz1 (Lennefors 2006). Ponadto, w przeciwieństwie do odporności typu Holly, znaczący poziom odporności transgenicznych hemizygot wskazywał na model pełnej dominacji (Lennefors i współaut. 2006). Obecnie dokonano już znaczącego postępu w hodowli odmian odpornych na rizomanię w porównaniu do odmian pierwszej generacji, które w warunkach braku porażenia wykazywały wyraźnie niższe plony w stosunku do odmian nieodpornych (Scholten i Lange 2000, Biancardi i współaut. 2002, Gidner i współaut. 2005, De Biaggi i współaut. 2010). Jednocześnie, doświadczenia szklarniowe dotyczące stopnia porażenia wirusem wskazują, że odmiany kolejnych generacji są bardziej wyrównane w kontekście odpowiedzi na wirus (Scholten i Lange 2000). Uprawa takich odmian może ograniczać tempo namnażania się wirusa i rozprzestrzeniania choroby. Jednakże, w przypadku odmian bazujących na jednym typie odporności, jak przykładowo Holly, które to źródło wciąż jest powszechnie stosowane, istnieje podwyższone ryzyko załamywania się odporności (Lennefors 2006, De Biaggi i współaut. 2010). Dlatego też w najnowszych odmianach wykorzystuje się kombinację różnych źródeł odporności (Biancardi i współaut. 2002, De Biaggi i współaut. 2010). PRZAŁAMYWANIE ODPORNOŚCI PRZEZ WIRUS Ze względu na pojawianie się nowych szczepów wirusa, wykazujących zdolność do przełamywania dotychczasowej częściowej odporności, wciąż aktualne wydaje się poszukiwanie nowych jej źródeł. Identyfikacja kolejnych związanych z odpornością loci pozwala na wytwarzanie odmian łączących różne jej typy, oparte na odmiennych mechanizmach. W trakcie tego procesu wykorzystuje się markery molekularne umożliwiające selekcję materiałów wyjściowych i dobór komponentów rodzicielskich posiadających odpowiednie geny odporności w stanie homozygotycznym, co zapewnia skrócenie czasu niezbędnego dla wytworzenia nowej odmiany (Scholten i współaut. 1999, De Biaggi i współaut. 2010). Z drugiej strony natomiast, długotrwała uprawa roślin posiadających odporność jednego rodzaju może sprzyjać ewolucji nowych form patogena poprzez zwiększoną presję selekcyjną. Świadczą o tym obserwacje dokonane w dolinie Imperial Valley w USA, gdzie przez dłuższy czas ze względu na powszechne występowanie BNYVV uprawiano odmiany z odpornością warunkowaną przez Rz1 i gdzie następnie odnotowano pojawianie się nowych szczepów wirusa, zdolnych do przełamywania tego źródła odporności (Rush i współaut. 2006, Panella i Lewellen 2007). Potwierdzają to spostrzeżenia Liu i współaut. (2005) wskazujące na znaczące podobieństwo szczególnie zjadliwych izolatów IV-BNYVV do znanego już typu A izolatów tego wirusa. Ponadto, porównywalną zdolność do przełamywania odporności bazującej na Rz1 stwierdzono w Hiszpanii dla BNYVV typu A, co sugeruje funkcjonowanie analogicznych mechanizmów w przypadku geograficznie niezależnych zdarzeń selekcyjnych (Pferdmenges i współaut. 2009). W populacjach BNYVV poddanych presji selekcyjnej związanej z oddziaływaniem źródła od-

Źródła i mechanizmy odporności buraka cukrowego 467 porności Rz1 stwierdzono zmiany struktury genetycznej polegające na selekcji wariantów wirusa najbardziej zdolnych do pokonywania bariery odporności (Acosta-Leal i współaut. 2008). O znaczącym zróżnicowaniu w populacji wirusa zdolnej do pokonywania odporności, ale pochodzącej z jednego pola świadczyć może również szeroki zakres objawów indukowanych wskutek mechanicznej inokulacji roślin (Liu i współaut. 2005). Wśród innych znanych izolatów o znaczącej agresywności na uwagę zasługują te zawierające RNA 5, w szczególności zaś pochodzące z Azji oraz reprezentujące typ P występujący we Francji, w Wielkiej Brytanii i Kazachstanie (Schirmer i współaut. 2005). Z drugiej strony, obecność dodatkowych alleli warunkujących odporność, np. Rz2 może nadać częściową odporność na te szczepy wirusa, co stwierdzono np. w przypadku oddziaływania izolatów IV-BNYVV na odmianę Angelina, posiadającą zarówno Rz1, jak i Rz2 (Liu i współaut. 2005, Liu i Lewel- len 2007). Stąd też jedynym rozwiązaniem wydaje się uprawa odmian bazujących na różnorodnych źródłach odporności, najlepiej dostosowanych do warunków lokalnych. Ponadto, zastosowanie strategii uprawy na jednym polu odmian zróżnicowanych pod względem genetycznej determinanty odporności, mogłoby w znaczącym stopniu przyczynić się do osłabienia populacji wirusa oraz ograniczyć zjawisko wyodrębniania się szczególnie wirulentnych podtypów (Acosta- Leal i współaut. 2008). Badania wykazują jednak, że nie bez znaczenia dla przełamywania odporności mogą być również inne, pozagenetyczne czynniki, takie jak ilość wirusa w glebie oraz pozostałe warunki środowiska glebowego, zwłaszcza temperatura i wilgotność, czy też interakcje z innymi patogenami, stadium rozwoju rośliny w momencie kontaktu z patogenem oraz jej fizjologiczna kondycja (Rush i współaut. 2006, Lennefors 2006). MOŻLIWE MECHANIZMY ODPORNOŚCI Istnieją różne potencjalne możliwości funkcjonowania mechanizmów odporności. Z jednej strony, mogą one dotyczyć odporności na wektor P. betae, z drugiej strony zaś, na wirus BNYVV (Scholten i Lange 2000). W przypadku odporności na wektor zidentyfikowanej u osobników z sekcji Procumbentes (B. procumbens, B. patellaris) w korzeniach tych roślin nie zaobserwowano spor spoczynkowych (Paul i współaut. 1992, Barr i współaut. 1995). Ponieważ jednak wykazano przyczepianie się zoospor do epidermy oraz początkowe etapy infekcji, ale nie stwierdzono obecności struktur infekcyjnych, jakimi są plazmodia, wydaje się, że opisywane mechanizmy są aktywne już w bardzo wczesnym stadium penetracji oraz że ograniczenie rozprzestrzeniania się patogena następuje wskutek reakcji nadwrażliwości (Barr i współaut. 1995). Analizy linii monosomicznych zawierających chromosomy przeniesione z B. procumbens wskazują, że geny odporności na P. betae mieszczą się na chromosomach IV i VIII (Paul i współaut. 1992). Również inne dzikie gatunki buraków, np. z sekcji Corollinae, czy też pewne obiekty B. vulgaris ssp. maritima mogą posiadać tego typu mechanizmy (Kingsnorth i współaut. 2003). Ostatnio, dzięki opracowaniu przeciwciał pozwalających na detekcję P. betae, trwają intensywne prace poświęcone identyfikacji i selekcji materiałów niosących odporność na tego wektora (Kingsnorth i współaut. 2003, Asher i współaut. 2009). Podejście takie wydaje się uzasadnione, ponieważ, niektóre zidentyfikowane dotychczas geny Rz mogą być w stosunku do siebie alleliczne (Grimmer i współaut. 2008) bądź blisko związane, co ogranicza możliwości udoskonalenia odporności na drodze rekombinacji. Asher i współaut. (2009) wyselekcjonowali obiekty B. vulgaris ssp. maritima charakteryzujące się odpornością na P. betae, a następnie uzyskali odpowiednią populację segregującą. Dzięki temu zidentyfikowane zostały genetyczne determinanty współdziałające w wykształceniu cechy: QTL Pb1 na chromosomie IV oraz QTL Pb2 na chromosomie IX. Jednocześnie stwierdzono addytywny efekt tego źródła odporności w kombinacji z Rz1 w odniesieniu do redukcji BNYVV po przeniesieniu jej do buraka cukrowego na drodze krzyżowania (Asher i współaut. 2009). W drugim przypadku, tj. odporności na wirus, wyodrębniono głównie mechanizmy związane z hamowaniem jego namnażania bądź też rozprzestrzeniania się w roślinie (Scholten i współaut. 1994, Tamada i współaut. 1999). Genom wirusa składa się z kilku (4 5) komponentów RNA, które decydują o

468 Anna Litwiniec i współaut. Ryc. 2. Występowanie wirusów BNYVV, BVQ oraz BSBV w kompleksie potwierdzone za pomocą reakcji multipleks RT-PCR z zastosowaniem specyficznych starterów (Borodynko i Pospieszny 2007). Wielkość produktów typowych dla poszczególnych wirusów: BNYVV 545 pz, BSBV 399 pz, BVQ 291 pz (fot. Natasza Borodynko, Natalia Rymelska). różnych aspektach infekcji, takich jak przenoszenie wirusa przez wektor, namnażanie i rozprzestrzenianie się w roślinie, stopień wirulencji. Przykładowo, RNA1 oraz RNA2 kodują białka istotne dla replikacji, enkapsydacji i przemieszczania się wirusa między komórkami, natomiast RNA3, RNA4 oraz RNA5 są związane z infekcją i rozwinięciem się choroby w korzeniach buraka. Te ostatnie elementy kodują bowiem białka zaangażowane w procesie patogenezy, przemieszczania się wektora oraz hamowania wyciszenia genów przez systemy obronne gospodarza (Tamada i współaut. 1999, Rahim i współaut. 2007, Tamada 2007). Najprawdopodobniej zatem różne mechanizmy odporności są związane z odpowiedzią gospodarza na poszczególne komponenty genomu patogena. Geyl i współaut. (1995) zidentyfikowali ekotyp S023 B. vulgaris ssp. maritima, który był podatny na P. betae, ale odporny na BNYVV już w początkowych stadiach infekcji. Jednocześnie w komórkach i tkankach roślin odpornych, jak i podatnych odnotowano podobne rozmieszczenie cystosorusów i plazmodiów P. beate oraz występowanie antygenu wirusowego w części kortykalnej aż do granicy endodermy, jak również potwierdzono zdolność wirusa do krótkodystansowej migracji oraz do namnażania w izolowanych protoplastach. Brak wirusa w korzeniach poddanych mechanicznej inokulacji może wskazywać z kolei na tkankowo-specyficzne zahamowanie replikacji bądź przemieszczania wirusa (Geyl i współaut. 1995). Podobnie odporność na rizomanię w odmianach Alba i Rizor, jak również w materiałach typu Holly zdefiniowano jako związaną z oddziaływaniem roślina-wirus, a nie roślina-wektor (Paul i współaut. 1993). Ogólny schemat interakcji w przypadku odmiany podatnej zakłada przemieszczanie się wirusa od zainfekowanej komórki epidermy poprzez parenchymatyczne komórki korowe, endodermę aż do parenchymatycznych komórek ksylemu, skąd dalej wirus mógłby migrować do korzenia głównego poprzez indukcję śmierci kolejnych komórek (Acosta-Leal i współaut. 2008). Wykazano jednak różnice w lokalizacji i rozprzestrzenianiu się wirusa w roślinie w materiałach częściowo odpornych w zależności od źródła odporności zaobserwowano odmienny przebieg wymienionych procesów dla obiektów Holly, WB42, jak również Rizor (Scholten i współaut. 1994, Chiba i współaut. 2008), co sugeruje funkcjonowanie niezależnych mechanizmów. W przypadku WB42 wirus występował w niewielkich skupiskach ograniczonych zasięgiem do epidermy oraz niektórych korowych komórek parenchymatycznych, podczas gdy rozmieszczenie wirusa w obiekcie Holly oraz częściowo odpornej odmianie Rima sięgało poza endodermę aż do śródmiąższowej parenchymy, jednak rzadko identyfikowano wirus w wiązkach przewodzących, co przedstawiało się podobnie w przypadku odmiany podatnej (Scholten i współaut. 1994). Może to być odzwierciedleniem załamywania odporności w warunkach silnej infekcji w materiałach o niższym stopniu tolerancji. Z kolei na histologicznych przekrojach genotypów Alba obserwowano wyraźną reakcję na BNYVV rozproszony w wiązkach ksylemu. Analogicznie w odmianie Rizor stwierdzono zahamowanie transmisji BNYVV poprzez wiązki przewodzące, co utrudnia dalsze rozprzestrzenianie się wirusa w roślinie. Wydaje się, że w materiale tym może jednocześnie dochodzić do zakłóceń w przebiegu cyklu rozwojowego P. betae, na co wskazuje niewielka liczba obserwowanych zoosporangiów (Biancardi i współaut. 2002). Tamada i współaut. (1999) zasugerowali natomiast, iż odporność w odmianie Rizor może być związana z zahamowaniem replikacji RNA3, ponieważ w głównym korzeniu nie wykryli obecności tego komponentu, pomimo występowania tam wirusa. Najprawdopodobniej

Źródła i mechanizmy odporności buraka cukrowego 469 zaangażowany jest w tym przypadku mechanizm wyciszenia RNA bazujący na selektywnym niszczeniu docelowego RNA wirusowego z udziałem specyficznych elementów aparatu genetycznego, tzw. sirna (ang. small interfering RNA), które decydują o destrukcji odpowiednich komplementarnych sekwencji poprzez oddziaływanie w zawierającym nukleazę kompleksie wyciszającym indukowanym RNA (ang. RNA-induced silencing complex, RISC) (Hammond 2005). Jakkolwiek mechanizmy tego typu mogą funkcjonować bardziej efektywnie w liściach niż w korzeniach (Andika i współaut. 2005), hipoteza powyższa wydaje się jednak uzasadniona, zważywszy że w początkowym etapie wirus namnaża się w tkance korzenia, ale jego przemieszczanie się do korzenia głównego oraz dalsze powielanie pozostają ograniczone wraz z postępującym rozwojem systemu korzeniowego (Tamada i współaut. 1999). Analogiczne zjawisko obserwowane jest w transgenicznych roślinach, w których początkowo dochodzi do infekcji, jednak stopniowo pojawia się odporność - nowo rozwinięte liście są już pozbawione wirusa, a niski poziom mrna transgenu przy niezmienionym tempie transkrypcji wskazuje na wykształcenie specyficznego mechanizmu dezaktywacji tej sekwencji (Lindbo i współaut. 1993, Andika i współaut. 2005). Jednocześnie istnieją sugestie, że mechanizmy wyciszenia RNA funkcjonują efektywnie również w tkance korzenia transgenicznych buraków odpornych na BNYVV i że wcześniejsze doniesienia wskazujące na ich ograniczony zakres w korzeniu mogą wynikać z innego rodzaju zastosowanych form transgenu - ssrna vs. dsr- NA (Lennefors 2006). Analizy zmian proteomu w odpowiedzi na infekcję BNYVV sugerują natomiast udział reakcji systemicznej w przypadku odporności bazującej na Rz1 oraz wskazują na znaczenie fitohormonów w rozwoju symptomów choroby (Larson i współaut. 2008). W badaniach tych, z zastosowaniem blisko izogenicznych linii różniących się pod względem Rz1/rz1, dowiedziono, że pewne białka podlegały odmiennej indukcji głównie w formie odpornej. Do tej grupy należały w szczególności białka związane z odpowiedzią obronną jak chitynaza, glukanaza czy defensyna oraz białka związane z odpowiedzią oksydacyjną, np. transferaza glutationu-s, oksydaza szczawianowa oraz oksydaza polifenolowa. Bez względu na odpowiadający mechanizm, w odmianach/materiałach posiadających częściową odporność odnotowuje się wyraźnie niższe stężenia wirusa w korzeniach w porównaniu do odmian/materiałów podatnych, co, łącznie z ograniczeniem utraty plonu oraz brakiem charakterystycznych symptomów choroby w warunkach porażenia, stanowi podstawę do ich klasyfikacji (Tamada i współaut. 1999, Wisler i współaut. 1999, Amiri i współaut. 2003). Badania poświęcone podatności ekotypów B. vulgaris ssp. maritima o różnym pochodzeniu na inokulację BNYVV poprzez liście wykazały, że odpowiedź rośliny jest odzwierciedleniem patogeniczności różnych izolatów wirusa. Szczególnie istotne dla infekcji systemicznej okazały się komponenty RNA3 oraz RNA5 (Tamada 2007). Wyjątkowe znaczenie specyficznych komponentów RNA3 i RNA5 uwydatnia także fakt, iż zmienność w strukturze kodowanych przez nie białek p25 i p26 wpływa na regulację transkrypcji, a w konsekwencji na współdziałanie wymienionych komponentów w indukcji symptomów, patogeniczność i zdolność szczepów wirusa do przełamywania odporności (Link i współaut. 2005, Acosta-Leal i Rush 2007, Klein i współaut. 2007, Chiba i współaut. 2008). Przykładowo, zidentyfikowano reszty aminokwasowe obecne w białku p25 zakodowanym komponentem RNA3, istotne w specyficznej dla gospodarza odpowiedzi na porażenie danym typem wirusa, decydujące o jego wirulencji/awirulencji, wpływające na oligomeryzację białka oraz rodzaj występujących objawów (Klein i współaut. 2007, Chiba i współaut. 2008). Analogicznie wydaje się, że kluczową rolę dla reakcji odporności mogą również pełnić obecne w genomie buraka sekwencje RGA związane z Rz1, a przede wszystkim plastyczność tych sekwencji w toku oddziaływań z wirusem (Lein i współaut. 2006). Stwierdzono ponadto znaczące zróżnicowanie odpowiedzi i objawów pomiędzy odrębnymi obiektami, liniami, a nawet genotypami B. maritima, co wskazuje, iż w poszczególnych roślinach mogą wykształcać się nieco odmienne mechanizmy odporności, która powinna zatem być postrzegana jako specyficzna interakcja pomiędzy podlegającymi ekspresji genami gospodarza i patogena w danych warunkach (Tamada 2007, Chiba i współaut. 2008). Wyniki badań poświęconych ekspresji genów wskazują również na występowanie pewnych różnic w odpowiedzi na porażenie BNYVV w zależności od gatunku rośliny (Schmidlin i współaut. 2008).

470 Anna Litwiniec i współaut. PODSUMOWANIE Ze względu na pojawianie się izolatów BNYVV przełamujących odporność roślin, poszerzenie bazy materiałów wyjściowych do hodowli oraz wzbogacenie ich o nowe źródła odporności wydaje się niezbędne dla zapewnienia ciągłej produkcji konkurencyjnych odmian, umożliwiających plonowanie w warunkach występowania wirusa oraz dla zapobiegania rozprzestrzeniania się patogena. Dlatego też wciąż uzasadniona jest charakterystyka genetyczna, jak również fizjopatologiczna niezidentyfikowanych dotychczas materiałów, w tym również form dzikich niosących odporność oraz łączenie różnych jej źródeł w jednej odmianie. Podstawę do tego stanowi identyfikacja markerowych sekwencji funkcjonalnych, które znajdują zastosowanie w selekcji wspomaganej markerami molekularnymi, co pozwala na szybkie i jednoznaczne stwierdzenie obecności danego genu bez konieczności prowadzenia kosztownych i długotrwałych testów związanych z porażeniem materiału roślinnego. Analiza występowania tych sekwencji może jednocześnie przyczynić się do wyjaśnienia wykształcenia się oraz mechanizmów odporności na rizomanię. ŹRÓDŁA I MECHANIZMY ODPORNOŚCI BURAKA CUKROWEGO ORAZ DZIKICH FORM Z RODZAJU BETA NA BNYVV Streszczenie Rizomania jest chorobą buraka cukrowego wywoływaną przez wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów buraka BNYVV, który powoduje znaczące jakościowe i ilościowe straty plonu tej ekonomicznie istotnej rośliny w skali światowej. Za najbardziej skuteczną metodę walki z rozprzestrzenianiem choroby, umożliwiającą uprawę w warunkach porażenia uznaje się stosowanie odmian wyprowadzonych w toku hodowli odpornościowej. Jednakże żaden z dotychczas opisanych genów nie warunkuje całkowitej odporności, a jedynie tolerancję na wirus. Jednocześnie z powodu pojawiania się szczepów zdolnych do przełamywania odporności, przeszukiwanie zasobów dzikich form z rodzaju Beta jest kluczowe dla dalszej identyfikacji nowych źródeł odporności, a w konsekwencji dla utrzymania ciągłej produkcji konkurencyjnych odmian buraka cukrowego. W niniejszej pracy dokonano przeglądu znanych obecnie źródeł odporności, jak również przedstawiono podstawowe mechanizmy istotne dla jej wykształcenia. THE RESISTANCE OF SUGAR BEET AND ITS WILD RELATIVES FROM THE GENUS BETA TO BNYVV SOURCES AND MECHANISMS Summary Rhizomania is a disease of sugar beet induced by Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) that has been responsible for both quantitative and qualitative significant yield losses of this economically important crop worldwide. The most effective method of protection that enables production under infestation conditions is believed to be resistance breeding. However, none of the genes identified thus far seems to be able to condition a fully resistant genotype. Additionally, due to the appearance of resistance-breaking strains of the virus, screening of wild relatives is crucial for further identification of new resistance sources and, consequently, for continuous production of competitive sugar beet cultivars. This review presents an overview of currently known resistance sources as well as highlights some basic mechanisms involved in resistance expression. LITERATURA Abe H., Tamada T., 1986. Association of beet necrotic yellow vein virus with isolates of Polymyxa betae Keskin. Ann. Phytopath. Soc. Japan 52, 235 247. Acosta Leal R., Rush C. M., 2007. Mutations associated with resistance-breaking isolates of Beet necrotic yellow vein virus and their allelic discrimination using TaqMan technology. Phytopathology 97, 325 330. Acosta Leal R., Fawley M. W., Rush C. M., 2008. Changes in the intraisolate genetic structure of Beet necrotic yellow vein virus populations associated with plant resistance breakdown. Virology 376, 60 68. Amiri R., Moghaddam M., Mesbah M., Sadeghian S. Y., Ghannadha M. R., Izadpanah K., 2003. The inheritance of resistance to beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) in B. vulgaris subsp. mari-