Mgr inŝ. Joanna Lewandowska

Mgr inŝ. Joanna Lewandowska KOWALENCYJNE WIĄZANIE SIĘ Z DNA POCHODNYCH 4-METYLO-1-NITROAKRYDYNY C-1748 ORAZ 1-NITROAKRYDYNY C-857 I NIEKTÓRE SKUTKI TAKIEJ MODYFIKACJI DNA. Praca doktorska wykonana w Katedrze Technologii Leków i Biochemii Politechniki Gdańskiej Praca przedłoŝona Radzie Wydziału Chemii Politechniki Gdańskiej w celu uzyskania stopnia doktora Promotor: Prof. dr hab. inŝ. Jerzy Konopa Gdańsk 2009

I. WSTĘP TEORETYCZNY...1 Kowalencyjna modyfikacja DNA i jej wpływ na budowę i funkcję chromatyny...1 1. Budowa chromatyny....1 2. Metylacja DNA...5 2.1. Metody badania metylacji DNA....11 2.2. Choroby a metylacja DNA...15 2.3. Leki przeciwnowotworowe wpływające na metylację DNA...18 3. Wpływ związków kowalencyjnie modyfikujących DNA na strukturę chromatyny...24 II. ZAŁOśENIA, CEL I ZAKRES PRACY...30 III. OMÓWIENIE PRZEPROWADZONYCH BADAŃ I UZYSKANYCH WYNIKÓW...34 1. Wstęp....34 2. Aktywność cytotoksyczna związków C-1748 i C-857 w stosunku do komórek ludzkiego raka jelita grubego HT29 i ludzkiego raka prostaty LNCaP...37 2.1. ZaleŜność efektu cytotoksycznego w stosunku do komórek HT29 i LNCaP od stęŝenia 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 lub 1-nitroakrydyny C-857....39 2.2. ZaleŜność efektu cytotoksycznego wykazywanego przez 4-metylo-1nitrakrydynę C-1748 i 1-nitroakrydynę C-857 w stosunku do komórek HT29 i LNCaP od czasu inkubacji...41 2.3. Porównanie efektu cytotoksycznego w stosunku do komórek LNCaP i LNCaP/A40 indukowanego przez pochodne 1-nitroakrydyny C-1748 i C-857....44 2.4. Znaczenie mono- i difunkcyjnego kowalencyjnego wiązania się pochodnej 4-metylo-1- nitroakrydyny C-1748 i 1-nitroakrydny C-857 z DNA dla ich cytotoksyczności - analiza matematyczna krzywych zahamowania wzrostu badanych typów komórek nowotworowych....47 2.5. Podsumowanie....53 3. Zdolność 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 oraz 1-nitroakrydyny C-857 do tworzenia adduktów DNA w komórkach nowotworowych...54 3.1. Wprowadzenie....54 3.1.1. Zasada prowadzenia detekcji adduktów DNA z uŝyciem metody 32 P-postlabelling....55 3.1.2. Badania zdolności 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 i 1-nitroakrydyny C-857 do tworzenia adduktów DNA w komórkach ludzkiego raka jelita grubego HT29 i ludzkiego raka prostaty LNCaP metodą 32 P-postlabelling....59 3.1.2.1. Izolacja DNA z komórek HT29 lub LNCaP traktowanych związkiem C-1748 lub C-857...60 3.1.2.2. Chromatograficzny rozdział adduktów DNA wyznakowanych izotopem fosforu 32 P tworzonych przez związki Ledakrin i C-1748 w komórkach HT29 w układzie roztworów rozwijających stosowanym we wcześniejszych badaniach...61 3.1.2.3. Chromatograficzny rozdział adduktów DNA wyznakowanych izotopem fosforu 32 P tworzonych przez 4-metylo-1-nitroakrydynę C-1748 i 1-nitroakrydynę C-857 w komórkach HT29 w układzie roztworów rozwijających o podwyŝszonym stęŝeniu mocznika...63

3.1.2.4. Chromatograficzny rozdział adduktów DNA wyznakowanych izotopem fosforu 32 P tworzonych przez 4-metylo-1-nitroakrydynę C-1748 i 1-nitroakrydynę C-857 w komórkach LNCaP w układzie roztworów rozwijających o podwyŝszonym stęŝeniu mocznika....65 3.1.2.5. Podsumowanie....66 3.2. Enzymatyczna analiza restrykcyjna jako alternatywna metoda wykrywania kowalencyjnej modyfikacji DNA przez pochodne 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 oraz 1-nitroakrydyny C-857 w układzie bezkomórkowym....67 3.2.1. Wprowadzenie....67 3.2.2. Detekcja kowalencyjnej modyfikacji DNA (amplikonu 695 pz.) przez nieaktywowane pochodne 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 lub 1-nitroakrydyny C-857 w układzie bezkomórkowym metodą enzymatycznej analizy restrykcyjnej...69 3.2.3. Badania kowalencyjnej modyfikacji amplikonu 695 pz. przez 4-metylo-1-nitroakrydynę C-1748 lub 1-nitroakrydynę C-857 aktywowane ditiotreitolem (DTT): zaleŝność od stęŝenia....70 3.2.4. Kinetyka kowalencyjnej modyfikacji amplikonu 695 pz. przez 4-metylo-1-nitroakrydynę C-1748 lub 1-nitroakrydynę C-857 aktywowane ditiotreitolem (DTT)...73 3.2.5. Badania kowalencyjnej modyfikacji amplikonu 695 pz. przez 4-metylo-1-nitroakrydynę C-1748 lub 1-nitroakrydynę C-857 aktywowane mikrosomami izolowanymi z wątroby szczura...76 3.2.5.1. Opracowanie warunków oddzielania amplikonu 695 pz. od mikrosomów z wątroby szczura przed enzymatyczna analizą restrykcyjną...76 3.2.5.2. Badania kowalencyjnej modyfikacji amplikonu 695 pz. przez 4-metylo-1-nitroakrydynę C-1748 lub 1-nitroakrydynę C-857, aktywowane mikrosomami izolowanymi z wątroby szczura: zaleŝność od stęŝenia....78 3.2.5.3. Kinetyka kowalencyjnej modyfikacji amplikonu 695 pz. przez 4-metylo-1- nitroakrydynę C-1748 lub 1-nitroakrydynę C-857 aktywowane mikrosomami izolowanymi z wątroby szczura...80 3.2.6. Kinetyka kowalencyjnej modyfikacji amplikonu 695 pz. przez 4-metylo-1-nitroakrydynę C-1748 lub 1-nitroakrydynę C-857 aktywowanych frakcją mikrosomalną S9 izolowaną z wątroby szczura...82 3.2.7. Podsumowanie...84 3.3. Badania zdolności pochodnych 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 lub 1-nitroakrydyny C-857 do indukcji cięcia DNA plazmidu pbr322...85 3.3.1. Wprowadzenie....85 3.3.2. Zasada badania indukcji cięcia DNA plazmidu pbr322 przez pochodne 1-nitroakrydyny...87 3.3.3. Indukcja cięcia DNA plazmidu pbr322 przez pochodne 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 i 1-nitroakrydyny C-857 w zaleŝności od stęŝenia badanej pochodnej....88 3.3.4. Kinetyka cięcia DNA plazmidu pbr322 przez pochodne 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 i 1-nitroakrydyny C-857...90 3.3.5. Podsumowanie....92

3.4. Badania metodą 32 P-postlabelling zdolności 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 i 1-nitroakrydyny C-857 do tworzenia adduktów DNA w układach bezkomórkowych i identyfikacja zasad azotowych w DNA modyfikowanych przez związek C-1748...93 3.4.1. Wprowadzenie....93 3.4.2. Badania nad tworzeniem adduktów DNA w układzie bezkomórkowym przez pochodne 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 oraz 1-nitroakrydyny C-857 za pomocą metody 32 P-postlabelling...94 3.4.3. Identyfikacja zasad azotowych w DNA zmodyfikowanych przez pochodną 4-metylo-1- nitroakrydyny C-1748 za pomocą metody 32 P-postlabelling....98 3.5.1. Podsumowanie....100 4. Wpływ pochodnych 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 i 1-nitroakrydyny C-857 na poziom kowalencyjnej modyfikacji DNA w badanych komórkach nowotworowych określonej metodą enzymatycznej analizy restrykcyjnej (wg Mateosa)....101 4.1. Wprowadzenie....101 4.2. Zasada oznaczania kowalencyjnych modyfikacji DNA (tworzenia adduktów DNA i metylacji cytozyny) w genomie badanych komórek nowotworowych...102 4.3. Badania wpływu pochodnych 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 i 1-nitroakrydyny C-857 na zmiany kowalencyjnej modyfikacji DNA (tworzenia adduktów DNA i zmian poziomu metylacji cytozyny) w komórkach HT29 i LNCaP...104 4.4. Podsumowanie....108 IV. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA...110 1. Stosowane odczynniki chemiczne i biochemiczne....110 1.1. Stosowane odczynniki chemiczne....110 1.2. Stosowane odczynniki biochemiczne....111 2. Stosowana aparatura....113 3. Badane związki....114 4. Hodowla komórek nowotworowych...114 5. Oznaczanie cytotoksyczności badanych pochodnych 1-nitroakrydyny...115 6. Oznaczanie tworzenia adduktów DNA przez pochodne 1-nitroakrydyny C-1748 i C-857 z uŝyciem metody 32 P-postlabelling....116 6.1. Kowalencyjna modyfikacja DNA...116 6.1.1. Modyfikacja DNA w komórkach ludzkiego raka jelita grubego HT29 i ludzkiego raka prostaty LNCaP przez pochodne 1-nitroakrydyny C-857 lub C-1748...116 6.1.1.1. Izolacja DNA z komórek nowotworowych...116 6.1.2. Kowalencyjna modyfikacja DNA z grasicy cielęcej (ctdna) przez pochodne 1-nitro-9- aminoakrydyny C-857 lub C-1748 w obecności ditiotreitolu (DTT)...118 6.1.3. Kowalencyjna modyfikacja DNA z grasicy cielecej (ctdna) przez pochodne 1-nitro-9- aminoakrydyny C-857 lub C-1748 w obecności mikrosomów izolowanych z wątroby szczura...119

6.1.4. Kowalencyjna modyfikacja homopolimerów DNA przez pochodną 1-nitro-9- aminoakrydyny o symbolu C-1748 w obecności ditiotreitolu (DTT)...120 6.2. Enzymatyczna hydroliza DNA do 3 -monofosforanów deoksyrybonukleotydów...120 6.3. Otrzymywanie 3,5 -[ 32 P]-bisfosforanów deoksyrybonukleotydów...121 6.4. Chromatograficzny rozdział zmodyfikowanych 3,5 -[ 32 P]-bisfosforanów deoskyrybonukleotydów....122 6.5. Chromatograficzny rozdział niezmodyfikowanych 3,5 -[ 32 P]-bisfosforanów deoksyrybonukleozydów....124 6.6. Wyznaczanie stopnia modyfikacji DNA przez badane pochodne 1-nitro-9-aminoakrydyny C-857 i C-1748...125 7. Badanie kowalencyjnej modyfikacji DNA w układzie bezkomórkowym przy pomocy amplikonu 695 pz. oraz enzymów restrykcyjnych MspI i Tru1I....126 7.1. Zasada detekcji kowalencyjnej modyfikacji DNA metodą enzymatycznej analizy restrykcyjnej...126 7.1.1. Otrzymywanie amplikonu 695 pz....127 7.2. Kowalencyjna modyfikacja amplikonu 695 pz. w układzie bezkomórkowym przez pochodne 1-nitroakrydyny C-857 lub C-1748 po aktywacji ditiotreitolem (DTT)...128 7.3. Kowalencyjna modyfikacja amplikonu 695 pz. w układzie bezkomórkowym przez pochodne 1-nitroakrydyny po aktywacji frakcją mikrosomalną S9 izolowaną z wątroby szczura...129 7.4. Kowalencyjna modyfikacja amplikonu 695 pz. w układzie bezkomórkowym przez badane pochodne 1-nitroakrydyny C-857 lub C-1748 po aktywacji mikrosomami izolowanymi z wątroby szczura...130 7.5. Enzymatyczna hydroliza amplikonu 695 pz. zmodyfikowanego przez badane pochodne 1-nitroakrydyny...131 7.6. Elektroforeza amplikonu 695 pz. w 6% Ŝelu poliakrylamidowym (ang. PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)...132 8. Oddziaływanie pochodnych 1-nitroakrydyny C-857 i C-1748 z DNA plazmidu pbr322....135 8.1. Zasada metody badania zdolności pochodnych 1-nitroakrydyny C-857 i C-1748 do cięcia DNA plazmidu pbr322...135 8.2. Kowalencyjna modyfikacja DNA plazmidu pbr322 przez pochodne 1-nitroakrydyny C-857 i C-1748...135 8.3. Elektroforeza DNA plazmidu pbr322 w 1% Ŝelu agarozowym...136 9. Badanie wpływu pochodnych 1-nitroakrydyny C-857 i C-1748 na poziom kowalencyjnej modyfikacji DNA w genomie badanych komórek nowotworowych...137 9.1. Indukcja kowalencyjnej modyfikacji DNA w komórkach nowotworowych przez pochodne 1-nitroakrydyny C-857 lub C-1748...137 9.2. Izolacja DNA z komórek nowotworowych...138

9.3. Hydroliza enzymatyczna genomowego DNA komórek nowotworowych zmodyfikowanego przez badane pochodne 1-nitroakrydyny....139 9.4. Elektroforeza hydrolizatu genomowego DNA w 1% (w/v) Ŝelu agarozowym...140 9.5. Ilościowa analiza poziomu kowalencyjnej modyfikacji genomowego DNA....140 V. STRESZCZENIE I WNIOSKI...142 VI. LITERATURA...147 VII. ZAŁĄCZNIKI...159

Stosowane skróty: amplikon 695 pz. oligonukleotyd o długości 695 par zasad, powstały w wyniku reakcji PCR uŝywany w detekcji kowalencyjnej modyfikacji DNA, ATP (ang. adenosine 5 -triphosphate) adenozyno-5 -trifosforan, ctdna (ang. calf thymus DNA) DNA z grasicy cielęcej, cyt-b cytochalazyna B, DAPI (ang. 4',6-diamidino-2-phenylindole) 4',6-diamidino-2-fenyloindol, DMSO (ang. dimethyl sulfoxide) dimetylosulfotlenek, EC 50, EC 80 (ang. effective concentration) stęŝenia związku powodujące odpowiednio 50% i 80% zahamowanie wzrostu komórek w stosunku do komórek nietraktowanych, EDTA (ang. ethylenediaminetetraacetic acid) kwas etylenodiaminotetraoctowy, frakcja mikrosomalna S9 z wątroby szczura frakcja stanowiąca mieszaninę mikrosomów i cytozolu, zawierająca enzymy fazy I i II, MTT (ang. methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide) bromek 3-(4,5- dimetyltiazolyl-2)-2,5-difenylotetrazoliny, NADPH (ang. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) fosforan dinukleotydu dihydronikotynamidoadeninowego, PBS (ang. phosphate buffered saline) roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami, POPOP (ang. 1,4-bis(5-phenyl-2-oxazolyl)benzene) 1,4-bis(5-fenyloksazolo- 2-yl)benzen, PPO (ang. 2,5-bisphenyloxazole) - 2,5-bisfenylooksazol, SDS (ang. sodium dodecyl sulfate) sól sodowa siarczanu dodecylu, TEMED (ang. N,N,N,N -tetramethylethylenediamine) N,N,N,N - tetrametyloetylenodiamina, test CBMN (ang. Cytokinesis-Block Micronucleus Assay) test mikrojąderkowy, test SCGE (ang. Single Cell Gel Electrophoresis) test kometowy, Tris-base trihydroksymetyloaminometan, Tris-HCl chlorowodorek trihydroksymetyloaminometanu.

Wstęp teoretyczny I. WSTĘP TEORETYCZNY Kowalencyjna modyfikacja DNA i jej wpływ na budowę i funkcję chromatyny. Oddziaływania pomiędzy DNA a lekami przeciwnowotworowymi, mutagenami i kancerogenami badane są od wielu lat. Niskocząsteczkowe związki chemiczne mogą oddziaływać fizykochemicznie z podwójną helisą DNA na drodze interkalacji, wiązania się w małym lub duŝym rowku DNA, bądź chemicznie tworząc addukty DNA lub tnąc wiązania fosfodiestrowe. Obecnie bardziej wnikliwie zaczęto przyglądać się interakcjom niskocząsteczkowych związków chemicznych nie tylko z kwasami nukleinowymi, ale takŝe z chromatyną. Ostatnie lata badań dowodzą bowiem kluczowego znaczenia struktury chromatyny nie tylko dla ekspresji genów, co juŝ wcześniej było wiadome, ale takŝe w etiologii szeregu chorób określanych mianem zespołu jednostek chorobowych (np. zespół Retta) oraz dla takich procesów jak kancerogeneza czy przerzutowanie, waŝnych w przypadku chorób nowotworowych. Stąd teŝ rozpoczęto badania nad wpływem mutagenów, kancerogenów oraz leków i potencjalnych związków przeciwnowotworowych na strukturę chromatyny oraz białek i enzymów odpowiedzialnych za jej prawidłową budowę i działanie. 1. Budowa chromatyny. Podwójna helisa DNA jest podstawową makromolekułą, w której zakodowana jest informacja genetyczna. Genom stanowi zbiór genów oraz odcinków niekodujących w DNA znajdujących się w jądrze komórkowym i mitochondrium. Wpływa i kontroluje on procesy komórkowe takie jak metabolizm, podział komórki czy naprawa DNA. Z kolei mutacje czyli zmiany jednego lub wielu nukleotydów w DNA, powodują zmianę sekwencji zasad azotowych w DNA, przyczyniając się do polimorfizmu genów, a zatem róŝnorodności genetycznej. W komórce eukariotycznej jądrowy DNA tworzy kompleks z białkami histonowymi, który nazywany jest chromatyną. Chromatyna jest dobrze poznanym celem molekularnym dla wielu leków, w tym leków przeciwnowotworowych, które oddziałują na kilku poziomach: poprzez hamowanie mechanizmu replikacji lub transkrypcji, oddziaływanie z topoizomerazami lub metylotransferazmi DNA czy acetylotransferazami histonowymi (HAT), deacetylazami histonowymi (HDAC) oraz poprzez wpływanie na funkcję telomerów, co w efekcie moŝe prowadzić do śmierci komórki [Majumder i wsp., 2007]. 1

Wstęp teoretyczny Chromatyna jest podstawowym modułem konstrukcyjnym chromosomu [Waggoner, 2007]. RozróŜnia się dwie konformacje chromatyny: luźną zwaną euchromatyną i upakowaną heterochromatynę. Euchromatyna jest bogata w geny, które podlegają ekspresji w zaleŝności od potrzeb komórki i jej typu. Jest to transkrypcyjnie aktywny DNA, relatywnie słabo związany z histonami, który podlega replikacji podczas wczesnej fazy S cyklu komórkowego. Ten stan euchromatyny jest kontrolowany poprzez odwracalną kowalencyjną modyfikację DNA (metylacja DNA) i histonów (np. acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitynacja), katalizowaną przez enzymy takie jak metylotransferazy, acetylotransferazy i inne. Natomiast heterochromatyna charakteryzuje się transkrypcyjnie nieaktywnym DNA, ściśle związanym z białkami histonowymi. Jest ona silnie skondensowana przez cały cykl komórkowy i zawiera stosunkowo niewiele genów, które bardzo rzadko ulegają ekspresji [Waggoner, 2007], [Kubicek i wsp., 2006]. Nie znaczy to jednak, Ŝe heterochromatyna to niepotrzebny balast bez funkcji. Jest ona bardzo waŝną strukturą, która chroni końce chromosomów, a takŝe determinuje rozdział chromosomów do komórek potomnych podczas mitozy [Kouzarides, 2007]. Rys. I.1. Schemat organizacji chromatyny [Alberts i wsp., 1988]. Chromatyna moŝe być traktowana jako swoisty polimer, którego podstawową jednostką jest nukleosom. Nukleosom zawiera od 165 do 245 par zasad DNA, które 2

Wstęp teoretyczny tworzą kompleks z białkami histonowymi. W nukleosomie moŝna wyróŝnić rdzeń, który stanowi 146 par zasad nawiniętych (1 i ¾ razy) na oktamer histonowy oraz łącznik (ang. linker) - region DNA o długości od 20 do 70 par zasad, łączący nukleosomy i jednocześnie stanowiący miejsce wiązania się histonu H1 oraz białek niehistonowych [Pruss i wsp., 1995], [Kronenberg i wsp., 1982]. Oktamer histonowy składa się z dwóch podjednostek: tetrameru histonów H3 i H4 oraz dwóch dimerów histonów H2A i H2B (rys. I.2) [Pruss i wsp., 1995], [Kronenberg i wsp., 1982]. Stanowi on rdzeń nukleosomu i ma strukturę globularną, za wyjątkiem N-terminalnych końców nazywanych ogonami histonowymi (ang. histon tail) (rys. I.3) [Kubicek i wsp., 2006], [Kouzarides, 2007]. nukleosom Rys. I.2. Struktura nukleosomu [Moralesa i wsp., 2001]. Ogony histonowe są obiektem róŝnych kowalencyjnych modyfikacji potranslacyjnych, które w połączeniu z metylacją DNA, jak to wcześniej wspomniano, wpływają na organizację struktury chromatyny [Narlikar i wsp., 2002]. Rys. I.3. Struktura rdzenia nukleosomu: podwójna helisa DNA nawinięta na centralnie połoŝony oktamer histonowy z rozciągniętymi poza rdzeń nukleosomu ogonami histonowymi [Kornbergand i wsp., 1999]. 3

Wstęp teoretyczny Sumę naturalnie występujących kowalencyjnych modyfikacji w obrębie chromatyny czyli DNA oraz histonów, definiuje się jako epigenom [Kubicek i wsp., 2006]. UwaŜa się, Ŝe moŝe on być nośnikiem większej ilości informacji niŝ kod genetyczny. Epigenom w odróŝnieniu od genomu ma charakter dynamiczny i moŝe ulegać modyfikacjom w sposób odwracalny [Szyf, 2005b]. Szersze spojrzenie na proces ekspresji genów zaowocowało powstaniem nowej dziedziny nauki nazywanej epigenetyką, która obejmuje badania nad modyfikacjami chromatyny wpływającymi na ekspresję genów bez zmiany sekwencji nukleotydów w DNA [Balch i wsp., 2005]. Regulacja genów na drodze epigenetycznych modyfikacji (rys. I.4) moŝe prowadzić tak do wyciszenia jak i aktywacji określonych genów. Na drodze metylacji DNA w obszarze promotorowym danego genu, moŝe dojść do wyciszenia ekspresji tego genu, w przeciwieństwie do acetylacji aminokwasów w obrębie ogona histonu H3 i H4, która jest odpowiedzialna za aktywację transkrypcji, podobnie jak fosforylacja w N-terminalym ogonie histonu H3 [Li i wsp., 2007]. metylacja acetylacja fosforylacja modyfikacje histonu chromatyna nukleosom chromosom metylacja DNA Rys. I.4. Schemat epigenetycznych modyfikacji chromatyny [Rodenhiser i wsp., 2006]. Pomiędzy metylacją DNA i modyfikacją histonów, a strukturą chromatyny jest ścisły związek. Inaktywację chromatyny, a więc przejście euchromatyny w heterochromatynę, poprzedza metylacja DNA w obrębie promotorów pewnych genów, natomiast acetylacja histonów powoduje aktywację chromatyny (przejście w stan rozluźnionej struktury) i demetylację DNA, czyli usunięcie czynnika odpowiedzialnego za wyciszenie ekspresji genów [Szyf, 2005b]. Prócz opisanych powyŝej kowalencyjnych modyfikacji DNA i histonów, na strukturę chromatyny mają wpływ takŝe inne czynniki, np. tzw. ATP-zaleŜne kompleksy remodelujące chromatynę (ang. ATP-dependent remodeling complex) powodujące zmianę oddziaływania pomiędzy histonami a DNA. Ostatnie badania dowodzą, Ŝe takŝe srna (small RNA) 4

Wstęp teoretyczny wiąŝąc się z ATP-zaleŜnymi kompleksami modyfikującymi chromatynę moŝe oddziaływać na stan upakowania chromatyny [Kouzarides, 2007]. srna stanowi podgrupę niekodującego dwuniciowego RNA (dsrna), w skład której wchodzi m.in. sirna (ang. small interfering RNA), mirna (ang. micro RNA), powodujące wyciszanie lub wyłączanie genów na drodze interferencji RNA (RNAi). Zjawisko interferencji RNA (RNAi), definiuje się jako wyciszanie albo wyłączenie ekspresji genu przez dwuniciowy, krótki (21-27 nukleotydów) RNA o budowie i sekwencji zbliŝonej do sekwencji DNA wyłączanego lub wyciszanego genu. Pierwotnie uwaŝno, Ŝe zjawisko to związane jest z wewnątrzkomórkowym mechanizmem potranskrypcyjnego wyciszania genów, uwaŝanego za mechanizm ochronny komórki przed ekspresją obcego DNA (np. w przypadku infekcji wirusowej) [Yang i wsp., 2008], co zaobserwowano u organizmów takich jak Tetrahymena, Drosophila, a takŝe u ssaków, niemniej jednak szczegóły tego mechanizmu nie zostały jak dotąd poznane [Bernstein i wsp., 2005]. RNAi ma wpływ na degradację mrna, inhibicję procesu translacji, a ostatnie doniesienia naukowe sugerują takŝe jego udział w zmianach struktury chromatyny [Bernstein i wsp., 2005]. Przypuszcza się, Ŝe to sirna oraz mirna wpływają na metylację genów w DNA roślin i ssaków [Morris i wsp., 2004], a sam sirna wpływa bezpośrednio na strukturę heterochromatyny poprzez kompleks białkowy RISC (ang. RNA-induced silencing complex), który wydaje się mieć aktywność remodelująca chromatynę, a nie jak uwaŝano dotychczas aktywność rybonukleazy [Verdel i wsp., 2004]. Ponadto stabilizacja genomu moŝe takŝe zachodzić przez wiązanie się srna do sekwencji transpozonowych DNA i uniemoŝliwienie ich rekombinacji, przeciwdziałając tym samym translokacjom chromosomalnym [Hannon, 2002]. 2. Metylacja DNA. Metylacja DNA jest to naturalnie występująca kowalencyjna modyfikacja DNA. W przypadku niektórych leków przeciwnowotworowych obserwuje się podobny rodzaj oddziaływania z DNA, związany z ich mechanizmem działania, polegający na kowalencyjnym wiązaniu się tych związków z DNA z utworzeniem adduktów DNA. Powszechnie uznaje się, Ŝe taka chemiczna modyfikacja DNA przez chemoterapeutyki w efekcie powoduje głównie zahamowanie replikacji DNA i uruchomienie kaskady sygnałów prowadzących do śmierci komórki [Balch i wsp., 2005], niemniej jednak 5

Wstęp teoretyczny związek pomiędzy zmianą struktury chemicznej DNA, a biologicznymi następstwami takiej modyfikacji jest daleki od zrozumienia. W komórkach eukariotycznych miejscem wspomnianej naturalnie występującej modyfikacji epigenetycznej w obrębie dwuniciowego DNA jest występująca w sąsiedztwie guaniny cytozyna, która ulega metylacji na węglu C 5 (5-mC) [Baylin i wsp., 1998], [Jones, 2002]. Metylacja DNA jest katalizowana przez enzymy zwane metylotransferazami DNA, oznaczanymi skrótem DNMT (ang. DNA methyltransferase), które rozpoznają dwunukleotydową sekwencję palindromową CG. Enzymy te katalizują przeniesienie grupy metylowej z donora jakim jest S-adenozylo- L-metionina (SAM) na 5-ty atom węgla cytozyny (rys. I.5) [Gopisetty i wsp., 2006]. Ta kowalencyjna modyfikacja zachodzi dopiero po replikacji DNA [Bart i wsp., 2005]. Metylacja cytozyny jest takŝe obserwowana poza sekwencjami CG (np. CpA lub CpT), jednak występuje stosunkowo rzadko [Peedicayil, 2006]. NH 2 NH 2 N DNMT N CH 3 O NH S-adenozylo-L-metionina S-adenozylo-homocysteina O NH cytozyna 5-metylocytozyna (5-mC) Rys. I.5. Schemat reakcji metylacji cytozyny. Dotychczas opisano cztery izoenzymy DNA metylotransferaz (DNMT): DNMT1 (ang. DNA cytosine-5-methyltransferase 1), DNMT2 (ang. DNA cytosine-5-methyltransferase 2), DNMT3a (ang. DNA cytosine-5-methyltransferase 3a), DNMT3b (ang. DNA cytosine-5-methyltransferase 3b) [Issa, 2004]. Enzym DNMT1 jest zaangaŝowany w utrzymanie metylacji DNA w hemizmetylowanym DNA, tzn. takim, w którym 5-metylocytozyna (5-mC) jest obecna tylko na jednej, rodzicielskiej nici DNA [Pradhan i wsp., 2003]. Ponadto na nowo syntetyzowanej nici DNA katalizuje metylację cytozyny, która leŝy po przekątnej w stosunku do 5-metylocytozyny na nici rodzicielskiej. DNMT1 jest często obecna w kompleksie replikacyjnym wraz z polimerazą DNA podczas mitozy [Vertino i wsp., 2002]. DNMT3a i 3b odpowiadają za metylację DNA de novo [Pradhan i wsp., 2003], a 6

Wstęp teoretyczny więc zmieniającą schemat metylacji określonych fragmentów genomu. Enzym DNMT3a jest takŝe najprawdopodobniej odpowiedzialny za metylację cytozyny poza sekwencjami CG (CpA, CpT). Metylacja DNA de novo przede wszystkim ma miejsce podczas rozwoju embrionalnego u ssaków, a takŝe odgrywa istotną rolę m.in. w: rodzicielskim piętnie genomowym (ang. genomic imprinting) czyli epigenetycznej modyfikacji jednego z chromosomów rodzicielskich w gamecie lub zygocie, prowadzącej do zróŝnicowanej ekspresji dwóch alleli genu w komórce somatycznej [Robertson, 2005], inaktywacji chromosomu X (ang. X-inactivation) [Jackson-Grusby i wsp., 1997], supresji sekwencji transpozonowych, w tym podtrzymywaniu metylacji w obrębie repetytywnych sekwencji DNA [Szyf, 2005b], procesie kancerogenezy [Robertson, 2005]. Funkcja DNMT2 pozostaje do tej pory nieznana [Wilkins, 2005], niemniej jednak ostatnie doniesienia naukowe podają, Ŝe enzym ten charakteryzuje się wprawdzie słabą aktywnością metylotransferazy DNA in vitro, ale za to efektywnie katalizuje metylację trna [Goll i wsp., 2006]. Metylotransferazy DNA są enzymami odpowiedzialnymi za metylację DNA w komórce zarówno normalnej, jak i zmienionej nowotworowo. W komórkach niezmienionych nowotworowo ekspresja genu metylotransferazy DNMT1 jest tłumiona podczas zatrzymania cyklu komórkowego, natomiast inicjacja replikacji DNA powoduje stymulację ekspresji DNMT1 na granicy faz G1/S. W komórkach nowotworowych ekspresja tego genu zachodzi w innej niŝ G1 fazie cyklu komórkowego, co przyczynia się, na drodze róŝnych interakcji białkowych, do niekontrolowanego wzrostu tych komórek [Szyf, 2003]. W komórkach raków prostaty PC-3, DU145, LNCaP, DuPro, TsuPr1 i ND-1 udokumentowano podniesiony poziom ekspresji białka DNMT1 w porównaniu do tkanki łagodnego rozrostu gruczołu krokowego [Zhang i wsp., 2006]. W kancerogenezie nowotworów pęcherza moczowego, szczególnie w rozwoju inwazyjnego nowotworu pęcherza moczowego, wykazano takŝe korelację pomiędzy odchyleniami w schemacie metylacji DNA, a ekspresją genu białka DNMT1 [Zhang i wsp., 2006]. Ponadto w komórkach nowotworowych hipermetylacja DNA w regionach promotorowych genów nie jest powodowana tylko przez nadekspresję białka DNMT1. MoŜe ona takŝe wynikać z enzymatycznej deaktywacji enzymu demetylazy DNA, którego ekspresja np. w 7

Wstęp teoretyczny nowotworze prostaty jest zahamowana na poziomie translacji. Zmniejszona szybkość usuwania grup metylowych z 5-mC w efekcie prowadzi do hipermetylacji DNA [Zhang i wsp., 2006]. Badania ostatnich lat wskazują, Ŝe metylacja cytozyny w DNA reprezentuje modyfikację chromatyny, która jest wiernie odwzorowywana podczas podziału komórki (rys. I.6) [Zardo i wsp., 2005]. Poczynione obserwacje pozwalają ponadto sądzić, Ŝe rozkład 5-mC w DNA jest niezmienny i dziedziczony z pokolenia na pokolenie, w przeciwieństwie do modyfikacji histonów, które są labilne i nie podlegają dziedziczeniu (rys. I.6). Ostatnio ukazało się doniesienie naukowe opisujące proces metylacji i demetylacji sekwencji CpG w DNA jako zjawisko cykliczne. Cykliczność występowania tych procesów zaobserwowano w obrębie sekwencji promotorów genów ER-α, TFF3, receptora glutaminianu, GRM4 oraz J8-KCNJ8 w ludzkich komórkach nowotworowych. Wykazano, Ŝe proces metylacji DNA w obrębie wymienionych promotorów jest inicjowany pod koniec procesu transkrypcji, co wiąŝe się z obecnością m.in. białek MeCP2, DNMT1, DNMT3a i 3b, które katalizują proces przywrócenia schematu metylacji DNA. Po około 100 minutach następuje proces demetylacji DNA charakteryzujący się m.in. obecnością białka TDG (ang. Thymine DNA Glycosylase), którego aktywność jest stymulowana poprzez wiązanie się z enzymami DNMT3a i 3b, w wyniku czego następuje demetylacja DNA i rozpoczęcie procesu transkrypcji danego genu [Kangaspeska i wsp., 2008]. Na tym etapie badań trudno jednak rozstrzygnąć czy podobna cykliczność procesu metylacji i demetylacji DNA występuje takŝe w komórkach niezmienionych nowotworowo. niezmetylowany DNA metylacja de novo (DNMT3a, DNMT3b) zmetylowany DNA przywrócenie metylacji DNA przeprogramowanie epigenetyczne (embriogeneza) kompleks tłumiący (deacetylacja histonów, metylacja histonu H9K9, białko HP1) wyciszenie hemizmetylowany DNA DNMT1 replikacja DNA Rys. I.6. Przebieg metylacji DNA w cyklu komórkowym [Issa, 2004]. 8

Wstęp teoretyczny Schemat metylacji DNA jak wspomniano powyŝej ustala się podczas rozwoju embrionalnego i dla utrzymania właściwego funkcjonowania komórki powinien on być utrzymywany w niezmienionej formie przez całe Ŝycie komórki, pomimo lokalnej dostępności dla róŝnych enzymów czy czynników transkrypcyjnych w skondensowanej chromatynie [Zardo i wsp., 2005]. Mając na uwadze fakt, Ŝe nie wszystkie wyspy CpG w DNA danej komórki są metylowane, a róŝne sekwencje genomu mogą być w róŝnym zakresie metylowane, tworzony jest charakterystyczny schemat i poziom metylacji DNA, specyficzny dla określonych genów i tanek [Szyf, 2003], co definiuje się jako metylom [Feinberg, 2001]. W zdrowej komórce 5-metylocytozyna (5-mC) stanowi średnio 0,75 1% wszystkich nukleotydów w DNA, z czego od 60 do 90% znajduje się w obrębie wysp CpG (ang. CpG islands), [Espada i wsp., 2007]. Wyspy CpG to regiony bogate w dwunukleotydy CG, które definiuje się jako sekwencje obejmujące powyŝej 500 par zasad, o zawartości dwunukleotydów CpG powyŝej 55% na 5 -końcach regionów promotorowych genów oraz egzonu 1 [Zardo i wsp., 2005], [Waggoner, 2007], [Espada i wsp., 2007]. Niski poziom metylacji genomowego DNA w komórce jest prawdopodobnie efektem modyfikacji 5-metylocytozyny, poprzez spontaniczną deaminację, w wyniku której powstaje tymina, która zostaje trwale wbudowana do genomu i powielana w trakcie replikacji DNA. [Laird i wsp., 1996], co moŝe tłumaczyć wyŝszą ogólną zawartość par AT niŝ GC w genomach organizmów wyŝszych. Opierając się na całkowitej zawartości par CG w ludzkim genomie oszacowano, Ŝe zawiera on około 29 tys. wysp CpG [Balch i wsp., 2005]. W komórkach normalnych wyspy CpG są tylko sporadycznie metylowane i stanowią miejsce wiązania się białek odpowiedzialnych za inicjację transkrypcji DNA [Waggoner, 2007], [Laird i wsp., 1996], w przeciwieństwie do komórek nowotworowych charakteryzujących się wysokim poziomem metylacji wysp CpG. Szacuje się, Ŝe w komórkach nowotworowych jest średnio 600 regionów bogatych w wyspy CpG o zmienionym schemacie metylacji DNA w porównaniu do komórek zdrowych [Teodoridis i wsp., 2004]. Jak juŝ nadmieniono powyŝej metylacja DNA jest obserwowana takŝe poza wyspami CpG [Espada i wsp., 2007] w sekwencjach CpNpG, CpA lub CpT. Szacuje się, Ŝe ten rodzaj modyfikacji stanowi około 20% całkowitego poziomu metylacji DNA [Zardo i wsp., 2005] i moŝe pełnić kluczową rolę w wyciszaniu sekwencji pasoŝytniczego DNA (ang. silencing parasitic DNA sequences) jak np. transpozony 9

Wstęp teoretyczny [Espada i wsp., 2007]. Transpozonowy DNA to rozległe, skondensowane regiony heterochromatyny w chromosomach [Loden i wsp., 2005], w których promotory genów są na ogół metylowane w obrębie wysp CpG [Balch i wsp., 2005], [Zardo i wsp., 2005]. Elementy transpozonowego DNA są głównie rozprzestrzenione w sekwencjach repetytywnych [Zardo i wsp., 2005]. Jedna z hipotez sugeruje, Ŝe metylacja regionów repetytywnych DNA w zdrowych komórkach stanowi mechanizm obronny słuŝący tłumieniu potencjalnie szkodliwej ekspresji sekwencji samolubnego repetytywnego DNA, jak sekwencje Alu (krótkie powtórzone sekwencje DNA) czy LINE-1 (długie powtórzone sekwencje DNA) [Bestor, 1998]. Według innej hipotezy jest to ochrona genomu przed wirusowymi i pasoŝytniczymi sekwencjami [Zardo i wsp., 2005] podobnie jak u Procaryota, gdzie metylacja DNA jest podstawą rozróŝnienia własnego i obcego DNA w obronie przeciw bakteriofagom [Bart i wsp., 2005]. Metylacja cytozyny w DNA, jako Ŝe jest wyjątkowo stabilną chemicznie modyfikacją stanowi jeden z głównych epigenetycznych mechanizmów odpowiedzialnych za hamowanie ekspresji genów. Znane są dwa mechanizmy wyciszania ekspresji genów na drodze metylacji wysp CpG [Szyf, 2005b], [Klose i wsp., 2006]. Pierwszym z nich jest hamowanie łączenia się czynników transkrypcyjnych, wiąŝących się w obrębie wysp CpG [Klose i wsp., 2006]. Powoduje to, Ŝe od stopnia metylacji wysp CpG w regionach promotorowych i genach regulatorowych uzaleŝniony jest poziom ekspresji genów (rys. I.7 a) [Zardo i wsp., 2005]. Drugi mechanizm polega na rozpoznawaniu metylacji DNA przez białka MBPs (ang. Methylated DNA Binding Proteins), do których przyłączają się korepresory. Powstały w ten sposób kompleks białkowy powoduje bezpośrednie wyciszenie genu (rys. I.7 b) [Klose i wsp., 2006]. Rys. I.7. Mechanizmy hamowania ekspresji genów na drodze metylacji DNA a. poprzez hamowanie łączenia się czynników transkrypcyjnych (TF) z metylowanym DNA, b. poprzez tworzenie kompleksu białka MBP z metylowaną sekwencją DNA [Klose i wsp., 2006]. Białko MBP2 (ang. Methylated Binding Protein) lub MeCP2 (ang. Methylated CpG binding Protein) naleŝące do grupy białek MBD (ang. Methyl-Binding-Domain Proteins), rozpoznają metylowane sekwencje CpG i wiąŝą się z kompleksem modyfikującym chromatynę NurD, w skład którego wchodzą m.in. deacetylazy 10

Wstęp teoretyczny histonowe HDAC [Gopisetty i wsp., 2006], [Szyf, 2003]. W konsekwencji dochodzi do wytworzenia nieaktywnej struktury chromatyny w obrębie miejsca wiązania białka MBD2 i tym samym zahamowania ekspresji genów [Klose i wsp., 2006]. Wykazano takŝe, Ŝe na wydajność procesu transkrypcji moŝe wpływać poziom metylacji nieregulatorowych wysp CpG rozprzestrzenionych w całym genomie [Zardo i wsp., 2005]. Wprawdzie wiadomo, Ŝe metylacja DNA związana jest z nieaktywnym transkrypcyjnie stanem chromatyny, niemniej jednak dokładny mechanizm oddziaływania metylacji wysp CpG na transkrypcyjną aktywność chromatyny jest ciągle niejasny [Espada i wsp., 2007]. 2.1. Metody badania metylacji DNA. W kaŝdym jądrze komórkowym znajduje się około dwa metry DNA, stanowiącego podstawową pulę genów, które w czasie Ŝycia komórki mogą lub nie ulegać ekspresji. O tym czy i w jakim stopniu zachodzić będzie ekspresja danego genu decydują m.in. mechanizmy epigenetyczne. Jednym z takich waŝnych mechanizmów mających wpływ na hamowanie ekspresji genów jest jak juŝ wspomniano metylacja DNA w obrębie wysp CpG sekwencji promotorowych genów. Na poziomie genomu tworzy ona pewien charakterystyczny, odmienny dla kaŝdej tkanki wzór, który po procesie replikacji jest odtwarzany na potomnej nici DNA. UwaŜa się, Ŝe pewne zmiany w metylomie, a więc i zmiany poziomu ekspresji genów, mogą być przyczyną wielu chorób, co jest najlepiej udokumentowane dla chorób nowotworowych. MoŜliwość śledzenia zmian schematu metylacji DNA w komórce na poziomie globalnym jak i pojedynczych genów, moŝe być zatem bardzo waŝna dla zrozumienia powstawania i rozwoju tych chorób, w tym dla poznania tzw. markerów nowotworowych tzn. zmian w profilu metylacji DNA genów charakterystycznych dla danego nowotworu. Wykrycie ich obecności moŝe mieć, przełoŝenie na wczesną i trafną diagnostykę. Metody badania metylacji DNA z załoŝenia muszą mieć zdolność precyzyjnego rozróŝniania cytozyny od cytozyny metylowanej (5-mC). Na tym opierają się trzy obecnie najpowszechniej stosowane strategie detekcji metylacji DNA (rys. I.8). Są to: hydroliza DNA przez endonukleazy restrykcyjne wraŝliwe i niewraŝliwe na metylację cytozyny, chemiczna modyfikacja cytozyny przez wodorosiarczan sodu, immunoprecypitacja 5-mC [Callinan i wsp., 2006]. 11

Wstęp teoretyczny PowyŜsze drogi postępowania w badaniach nad metylacją DNA zostały w ostatnim czasie sprzęŝone z wieloma nowoczesnymi technikami jak mikromacierze DNA czy HPLC, czego wynikiem są metody pozwalające bardzo precyzyjnie badać schemat metylacji DNA, tak w skali genomu, jak i na poziomie pojedynczego genu. Rys. I.8. Najczęściej stosowane podejścia metodyczne pozwalające badać metylację genomowego DNA [Schones i wsp., 2008]. Schematycznie pokazano trzy strategie detekcji metylacji DNA z zastosowaniem: a) enzymów restrykcyjnych, b) wodorosiarczanu sodu, c) immunoprecypitacji. Szczegółowy opis znajduje się w tekście. Do pierwszej grupy metod badania metylacji DNA opierającej się na wykorzystaniu enzymów restrykcyjnych zalicza się m.in.: metodę RLGS (ang. Restriction Landmark Genome Screening) oraz metodę HELP (ang. HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR), której schemat postępowania przedstawiono na rysunku I.8a. Metoda HELP opiera się na wykorzystaniu enzymów restrykcyjnych do cięcia genomowego DNA na mniejsze fragmenty z uwzględnieniem sekwencji metylowanego lub niemetylowanego DNA. Są to: enzym HpaII (C^CGG) wraŝliwy na metylację DNA, który nie hydrolizuje DNA w obrębie swojej sekwencji restrykcyjnej w przypadku występowania w niej metylowanej cytozyny, enzym MspI (C^CGG) niewraŝliwy na metylację DNA oraz (w niektórych przypadkach) enzym MseI (T^TAA) pozwalający ciąć DNA poza sekwencjami metylowanego DNA. DNA wyizolowany z komórki, bądź tkanki (zmienionej nowotworowo lub nie) poddaje się hydrolizie za pomocą enzymu HpaII. W wyniku działania endonukleazy HpaII uzyskuje się fragmenty DNA o wielkości około 40 kpz. [Waalwijk i wsp., 1978]. Następnie DNA moŝe być poddany działaniu enzymu MseI, co pozwala zmniejszyć rozmiar fragmentów DNA bez utraty metylowanych sekwencji. Próbka kontrolnego DNA (np. z tkanki zdrowej) poddawana jest natomiast działaniu izoschizomeru MspI, 12

Wstęp teoretyczny który tnie DNA niezaleŝnie od obecności lub nie metylowanej cytozyny w obrębie sekwencji restrykcyjnej. W efekcie uzyskuje się DNA w postaci fragmentów wielkości około 5 kpz. [Waalwijk i wsp., 1978]. Tak powstałe fragmenty DNA powielane są w reakcji PCR z wykorzystaniem primerów DNA, w zaleŝności od stosowanego enzymu (HpaII lub MspI), bogatych w sekwencje CpG lub nie. Aplifikowany i hydrolizowany DNA jest następnie rozdzielany elektroforetycznie w Ŝelu agarozowym i barwiony lub teŝ jest znakowany fluoresceiną i hybrydyzowany z badaną sekwencją lub genomowym DNA na mikromacierzy DNA, która zawiera genomowy DNA [Callinan i wsp., 2006]. Porównanie wyników próbek DNA pozwala ocenić poziom metylacji DNA np. w tkance zmienionej i niezmienionej nowotworowo. Nieco odmienną metodą badania metylacji DNA z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych jest metoda RLGS. W metodzie tej genomowy DNA jest cięty za pomocą enzymów restrykcyjnych rozpoznających 8- lub 6-nukleotydową sekwencję np. enzymu NotI (CG^GGCCGC), który jest wraŝliwy na metylację cytozyny w obrębie sekwencji restrykcyjnej, a zatem obecność 5-mC powoduje zahamowanie cięcia DNA w obrębie tak zmodyfikowanej sekwencji. Uzyskane fragmenty DNA są znakowane radioaktywnie, cięte na mniejsze fragmenty za pomocą innego enzymu restrykcyjnego niewraŝliwego na metylację cytozyny w obrębie sekwencji restrykcyjnej np. EcoRV lub rzadziej PstI czy PvuI i rozdzielane w jednym kierunku za pomocą elektroforezy w Ŝelu agarozowym. Następnie w Ŝelu prowadzi się hydrolizę DNA kolejnym enzymem restrykcyjnym (HinfI, MboI lub DpnII), a uzyskane fragmenty poddaje się elektroforezie w drugim kierunku w Ŝelu poliakrylamidowym. Po autoradiografii otrzymywany jest dwuwymiarowy audioradiogram plam odpowiadających określonym fragmentom DNA. Jako Ŝe niemetylowane sekwencje DNA są hydrolizowane tylko za pomocą enzymu NotI, obecność lub brak na autoradiogramie pewnych plam, umoŝliwia ocenę schematu metylacji badanych sekwencji DNA pochodzących z róŝnych źródeł [Ushijima, 2005]. Druga grupa metod pozwalających badać metylację DNA, to metody wykorzystujące wodorosiarczan sodu, pod wpływem którego zachodzi hydrolityczna deaminacja cytozyny do uracylu (rys. I.9). Obecność grupy metylowej w pozycji 5 cytozyny powoduje, Ŝe tak zmodyfikowana cytozyna nie ulega reakcji. 13

Wstęp teoretyczny cytozyna uracyl Rys. I.9. Reakcja hydrolizy cytozyny do uracylu pod wpływem wodorosiarczanu sodu [Schumacher, 2007]. W tej grupie moŝna wyróŝnić metodę COBRA (ang. Combined Bisulfite Restriction Analysis), metodę MSP (ang. Methylation-Specyfic Analysis) [Toyooka i wsp., 2004] oraz metodę MethylLight [Callinan i wsp., 2006], których podstawowy plan postępowania pokazano na rysunku I.8 b. Pierwszym, wspólnym etapem metod wchodzących w skład tej grupy jest deaminacja niezmodyfikowanej cytozyny do uracylu pod wpływem wodorosiarczanu sodu. Następnie, z wykorzystaniem primerów DNA zawierających (metoda MSP) lub niezawierających określonej sekwencji w obrębie wysp CpG (metoda COBRA) prowadzona jest reakcja PCR, w wyniku której niezmodyfikowana cytozyna przekształcona w uracyl zostaje amplifikowana jako tymina, a 5-mC jako cytozyna. W metodzie COBRA (rys. I.10) amplifikowany DNA jest poddawany działaniu enzymu restrykcyjnego np. enzym BstUI tnącego DNA w obrębie sekwencji CG^CG (a więc sekwencji pierwotnie metylowanego DNA) i rozdzielany elektroferetycznie w Ŝelu poliakrylamidowym. Wizualizacja uzyskanych fragmentów DNA moŝe odbywać się na dwa sposoby: poprzez barwienie DNA w Ŝelu poliakrylamidowym za pomocą np. EtBr lub poprzez przeniesienie hydrolizowanych produktów reakcji PCR na membranę za pomocą elektroblottnigu i ich hybrydyzację z znakowanymi promieniotwórczo oligonukleotydami. Uzyskany autoradiogram jest odzwierciedleniem ilościowej zawartości metylowanego lub niemetylowanego DNA w obrębie danego regionu genomowego DNA [Xiong i wsp., 1997]. a) niemetylowany DNA niemetylowany DNA niepotrawiony DNA potrawiony DNA b) metylowany DNA NaHSO 3 metylowany DNA BstUI hybrydyzacja z 32 P znakowaną sondą Rys. I.10. Schemat metody COBRA pozwalającej badać metylację DNA, a- DNA niemetylowany, b- DNA metylowany [Havlis i wsp., 2002]. 14

Wstęp teoretyczny W metodzie MethylLight poza wodorosiarczanem sodu, wykorzystuje się metodę fluorescencyjnego PCR w czasie rzeczywistym (ang. Real-Time PCR), z wykorzystaniem primerów bogatych w cytozynę lub uracyl. Metoda ta pozwala określić, na podstawie intensywności sygnału fluorescencyjnego, poziom metylacji DNA w obrębie genomu, co m.in. pozwala na ilościową analizę metylacji sekwencji DNA w obrębie alleli badanego genu [Callinan i wsp., 2006]. Trzecia grupa metod badających metylację DNA wywodzi się od techniki immunoprecypitacji chromatyny tzw. ChIP (ang. Chromatin Immunoprecypitation) rys. I.8 c, na bazie której powstała m.in. metoda MeDIP (ang. Methylated DNA Immunoprecypitation), wykorzystująca przeciwciała anty-5mc. Pierwszy etap metody to pofragmentowanie genomowego DNA, np. poprzez sonifikację. Następnie DNA jest denaturowany, w celu otrzymania jednoniciowego DNA, do którego wiąŝą się specyficzne przeciwciała rozpoznające 5-mC. Kompleks DNA-przeciwciało jest oddzielany od reszty mieszaniny poprzez wirowanie, a przeciwciało usuwane z wykorzystaniem kolumny wypełnionej odpowiednim złoŝem. Wydzielone w ten sposób fragmenty DNA poddaje się reakcji PCR i znakowaniu fluoresceiną. Wyznakowane fragmenty DNA są hybrydyzowane z mikromacierzą zawierającą genomowy DNA. Metoda ta pozwala ilościowo ocenić poziom metylacji genomowego DNA, a jednocześnie ustalić sekwencje DNA, które ulegają takiej modyfikacji [Callinan i wsp., 2006]. WyŜej wymienione techniki to tylko główne przykłady metod pozwalających badać metylację DNA, a poniewaŝ epigenomika jest bardzo pręŝnie rozwijającą się obecnie gałęzią nauki to moŝliwości badawcze poszerzają się wraz z nią. 2.2. Choroby a metylacja DNA. Badania ostatnich lat pokazały, Ŝe nieprawidłowości na poziomie epigenetycznym mogą leŝeć u podłoŝa szeregu chorób. Coraz więcej danych wskazuje, Ŝe z aberracjami schematu metylacji węgla C 5 cytozyny w obrębie wysp CpG w DNA związane są takie procesy jak starzenie, przewlekłe zapalenia, infekcje wirusowe czy choroby nowotworowe [Gopisetty i wsp., 2006]. Jak wspomniano wcześniej, charakterystyczną cechą kancerogenezy są właśnie odchylenia metylacji DNA w obrębie rejonów promotorowych, co w efekcie prowadzi do wyciszenia pewnych genów [Espada i wsp., 2007], [Cairns, 2001], [Waggoner, 2007], jak i niestabilności chromosomalnej [Szyf, 2003]. 15

Wstęp teoretyczny Jak juŝ wspomniano genom komórek nowotworowych charakteryzuje się hypometylacją DNA czyli obniŝonym ogólnym poziom metylacji cytozyny, w porównaniu do komórek zdrowych, czemu towarzyszy lokalna hipermetylacja DNA tzn. podwyŝszony poziom metylacji cytozyny w obrębie wysp CpG. Jest to szczególnie charakterystyczne dla etapu inicjacji i rozwoju nowotworu [Jones, 2002]. Dodatkową cechą nowotworów jest takŝe hypometylacja wysp CpG sekwencji repetytywnych LINE-1, które w komórkach niezmienionych nowotworowo są silnie metylowane [Szyf, 2005a] oraz centromerów i mikrosaltelitarnego DNA, co jest takŝe źródłem niestabilności genomu i prawdopodobnie moŝe przyczyniać się do rozwoju choroby nowotworowej [Erlich, 2002]. W komórkach zmienionych nowotworowo metylacja promotorów genów supresorowych powoduje wyłączenie mechanizmów takich jak: niekontrolowany podział komórek, zdolność do naciekania i przerzutowania, unikanie apoptozy czy podtrzymywanie angiogenezy, które są odpowiedzialne za hamowanie rozwoju nowotworów [Gopisetty i wsp., 2006], [Balch i wsp., 2005]. Za przykład posłuŝyć mogą geny supresorowe CDKN2A, VHL czy BRCA1, które w komórkach nowotworowych są nieaktywne, właśnie wskutek metylacji ich promotorów [Ushijima, 2005]. Inną cechą nowotworów jest oporność na leki przeciwnowotworowe wynikająca z wyciszenia, na drodze metylacji DNA, genów promujących apoptozę m.in. PTEN, kaspaza-9 czy Apat-1 [Garcia i wsp., 2004]. Epigentyczne wyciszenie genu hmlh1, kodującego enzym biorący udział w naprawie nieprawidłowo sparowanych nukleotydów w DNA (ang. mismatch repair) mechanizm odpowiedzialny za rozpoznawanie i usuwanie uszkodzeń DNA opisany np. dla adduktów DNA tworzonych przez związki platyny - powoduje on obniŝenie odpowiedzi komórkowej na drodze apoptozy, co jest prawdopodobnie przyczyną powstawania oporności komórkowej na pochodne platyny [Balch i wsp., 2005]. PodwyŜszony poziom metylacji DNA w obrębie wysp CpG wpływa takŝe na wyciszenie genów zaangaŝowanych m.in. w odpowiedź hormonalną czy adhezję komórek [Gopisetty i wsp., 2006]. Aberracje w obrębie metylomu są bardzo często związane z konkretnymi typami nowotworów juŝ we wczesnej fazie ich powstawania, co moŝe jednocześnie słuŝyć jako potencjalny marker danej jednostki chorobowej [Balch i wsp., 2005]. Określenie rozmieszczenia metylowanych miejsc w obrębie promotorów genów, pozwoliło na zdefiniowanie swoistych map genowych, które mogą stanowić marker danego typu nowotworu. Przykłady podano w tabeli I.1. 16

Wstęp teoretyczny Tabela I.1. Geny wyciszone na skutek metylacji DNA w wybranych typach nowotworów [Baylin, 2005], [Paluszczak i wsp., 2006] Geny ulegające hypermetylacji w wybranych typach nowotworów Rb (Retinoblastoma) APC (Adenomatosis Polyposis Coli) p14 ARF (Alternative Reading Frame) p15/cdkn2b (Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2B) p16/cdkn2a (Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A) BRCA1 (Breast Cancer 1) VHL (vonhippel-lindau tumor suppressor) hmlh1 (Human mutl Homolog1) ER-α (Estrogen Receptor-α) Myf-3 (myoblast determination protein) Funkcja regulacja cyklu komórkowego przekazywanie sygnału regulacja cyklu komórkowego regulacja cyklu komórkowego regulacja cyklu komórkowego naprawa DNA supresor nowotworowy naprawa DNA typu mismatch estrogenowy receptor-α róŝnicowanie komórek mięśniowych Typ nowotworu nabłoniak nerwowy (retinoblastoma) rak jelita grubego i inne nowotwory rak jelita grubego białaczki róŝnorodne nowotwory rak piersi, rak jajnika nowotwór nerki rak piersi, rak Ŝołądka, rak trzonu macicy rak piersi, rak sutka i inne nowotwory rak sutka E-cadherin adhezja komórek róŝnorodne nowotwory H-cadherin adhezja komórek rak płuc Bcr-abl (c-abl oncogene 1) GSTP1 (glutathione S-transferase pi) PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) RARβ (retinoic acid receptor) HIC1 (encoding hypermethylated in cancer 1) DAPK (encoding death-associated protein kinase 1) ATM (ataxia telangiectasia mutated) regulacja róŝnicowania i podziału komórek detoksykacja regulacja wzrostu komórki i apoptozy regulacja cyklu komórkowego czynnik transkrypcyjny regulacja apoptozy odpowiedź komórkowa na uszkodzenie DNA ostra białaczka szpikowa rak prostaty, nerek, wątroby, sutka rak prostaty rak płuc, prostaty, wątroby, sutka, białaczki białaczki róŝnorodne nowotwory białaczki, rak sutka Wykazano, Ŝe w złośliwych nowotworach hematologicznych geny supresorowe np. geny kodujące komórkowe czynniki adhezyjne oraz białka regulujące wzrost są bardzo często nieaktywne właśnie w wyniku hipermetylacji DNA [Baylin, 2005]. Podobny 17

Wstęp teoretyczny efekt opisano u pacjentów z ostrą białaczką limfocytową, gdzie bardzo często obserwuje się metylację promotora genu supresorowego p53 [Gopisetty i wsp., 2006]. Natomiast w nowotworze wątroby, białaczkach oraz raku jelita grubego często obserwuje się hypometylację protoonkogenów [Richardson, 2003]. Poza wyciszeniem promotorów genów supresorowych, wydaje się, Ŝe jedną z przyczyn rozwoju nowotworów, są takŝe mutacje w obrębie tych genów, np. mutacje genu p53. Gen supresorowy p53 jest obecny w ponad 50% ludzkich nowotworów litych, którego mutacje w 1/4 obserwowanych przypadków są wynikiem wspomnianej juŝ samorzutnej deaminacji (tranzycji) 5-mC T właśnie w obrębie sekwencji mcpg tego genu. Zaburzenia metylacji DNA są takŝe czynnikiem prowadzącym do rozwoju innych jednostek chorobowych, będących głównie złoŝonym zespołem zaburzeń np. nieprawidłowości w metylacji DNA jednej z kopii chromosomu X u kobiet powodują wrodzone zaburzenia m.in. zespół Pradera-Williego (niski wzrost, opóźnienie umysłowe oraz otyłość przy jednoczesnym ciągłym niepohamowanym uczuciu głodu), zespół Angelmana (m.in. upośledzenie umysłowe, ataksja, padaczka) czy zespół Beckwitha-Wiedemanna (m.in. przepuklina pierścienia pępkowego, przerost języka, duŝa masa urodzeniowa). Innym przykładem choroby wynikającej z zaburzeń epigenetycznych jest syndrom ICF, który jest zespołem jednostek chorobowych, prowadzący do niedoboru odporności (Immunodeficiency), niestabilności centromerów (ang. centromere instability) oraz nieprawidłowej budowy twarzy (ang. facial anomalies) [Richardson, 2003]. Jest to wynikiem mutacji genu białka DNMT3b, powodującej hypometylację DNA. Podobnie w zespole Retta charakteryzującym się opóźnieniem umysłowym dotykającym dziewczynki, stwierdzono mutację genu kodującego białko MeCP2 w chromosomie X [Richardson, 2003]. Ostatnie doniesienia naukowe wskazują, Ŝe podłoŝem pewnych chorób psychicznych np. schizofrenii, moŝe być takŝe hipermetylacja w tym przypadku promotora genu RELN [Rodenhiser i wsp., 2006]. 2.3. Leki przeciwnowotworowe wpływające na metylację DNA. Ze względu na swoje kluczowe znaczenie dla funkcjonowania komórki epigenom stał się obiecującym celem dla leków przeciwnowotworowych. Przy obecnym stanie wiedzy podstawowym problemem przy projektowaniu potencjalnych leków przeciwnowotworowych, funkcjonujących właśnie na poziomie epigenomu, jest rozpoznawanie celów molekularnych, które wymagają zmian epigenetycznych w 18