PL 215125 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 215125 (21) Numer zgłoszenia: 369099 (22) Data zgłoszenia: 20.08.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 20.08.2002, PCT/DK02/000547 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 27.02.2003, WO03/015812 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/385 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01) (54) Zastosowanie immunogenu, poliaminokwas lub koniugat pochodzący ze zwierzęcego APP lub A, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego i wektor (30) Pierwszeństwo: 20.08.2001, DK, PA200101231 16.04.2002, DK, PA200200558 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.04.2005 BUP 08/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.10.2013 WUP 10/13 (73) Uprawniony z patentu: H. Lundbeck A/S, Valby, DK (72) Twórca(y) wynalazku: PETER BIRK RASMUSSEN, Hørsholm, DK MARTIN ROLAND JENSEN, Hørsholm, DK KLAUS GREGORIUS NIELSEN, Hørsholm, DK PETER KOEFOED, Hørsholm, DK FLORENCE DAL DEGAN, Hørsholm, DK (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska
2 PL 215 125 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie immunogenu, poliaminokwas lub koniugat pochodzący ze zwierzęcego APP lub Αβ, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego i wektor. Rozwiązania według wynalazku dostarczają ulepszeń w leczeniu i zapobieganiu chorobie Alzheimera (AD) i innych chorób charakteryzujących się odkładaniem amyloidu, np. charakteryzujących się złogami amyloidowymi w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS). Niniejszym opisano sposób obniżania poziomu (niepożądanych) złogów amyloidu przez umożliwienie wytwarzania przeciwciał przeciwko odpowiedniemu białku (APP lub Αβ) lub jego składnikom u osobników cierpiących na lub zagrożonych wystąpieniem chorób, których patologia obejmuje złogi amyloidu. Niniejszym przedstawiono również sposoby wytwarzania polipeptydu użytecznego w rozwiązaniach według wynalazku, jak również samego zmodyfikowanego polipeptydu jako takiego. Również objęte obecnym wynalazkiem są fragmenty kwasów nukleinowych kodujących zmodyfikowany polipeptyd jak również wektory obejmujące te fragmenty kwasów nukleinowych. Obecny wynalazek również dostarcza nowy typ sprzężonego peptydowego immunogenu. Podstawa wynalazku Amyloidozą określa się zewnątrzkomórkowe złogi nierozpuszczalnych włókienek białkowych prowadzące do uszkodzenia tkanek i chorób (Pepys, 1996; Tan i wsp., 1995; Kelly, 1996). Włókienka tworzą się gdy normalnie rozpuszczalne białka i peptydy asocjują między sobą w abnormalny sposób (Kelly, 1997). Amyloid jest związany z poważnymi chorobami obejmującymi układową amyloidozę, AD, cukrzycę dorosłych, chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona, demencję czołowo-skroniową i encefalopatie gąbczaste związane z prionami (kuru i choroba Creutzfeldta-Jacoba u ludzi, oraz scrapie i BSE odpowiednio u owcy i bydła), i tworzeniem się płytek amyloidowych, na przykład, w chorobie Alzheimera wydaje się być blisko związane z postępem choroby u ludzi. W modelach zwierzęcych wykazano, że nadekspresja, lub ekspresja zmodyfikowanych form, białek stwierdzonych w złogach, typu białka β-amyloidu, wywołuje różne objawy choroby, np. objawy typu choroby Alzheimera. Nie istnieje specyficzne leczenie amyloidowych złogów i choroby te zwykle są śmiertelne. Podjednostki włókienek amyloidu mogą być typu dzikiego, wariantami lub białkami skróconymi i podobne włókienka mogą być formowane in vitro z oligopeptydów i zdenaturowanych białek (Bradbury i wsp., 1960; Filshie i wsp., 1964; Burke & Rougvie, 1972). Rodzaj składnika włókienka polipeptydowego definiuje charakter amyloidozy. Pomimo dużych różnic w wielkości, natywnej strukturze i funkcji białek amyloidu, wszystkie amyloidowe włókienka są nieokreślonej długości, nierozgałęzione, o średnicy 70 do 120 A i wykazują charakterystyczne barwienie czerwienią Kongo (Pepys, 1996). Mają one charakterystykę struktury krzyżowej β (Pauling & Corey, 1951), w której łańcuch polipeptydowy jest zorganizowany w β-kartkę. Pomimo, że białka amyloidu mają bardzo różne prekursorowe struktury, mogą one wszystkie przechodzić przekształcenie strukturalne, być może zgodnie z podobną ścieżką, do nieprawidłowo złożonej postaci, to jest elementu tworzącego β-kartkę helisy protofilamentu. Ten odmienny wzór budowy doprowadził do amyloidozy, zwanej β-fibrylozą (Glenner, 1980a,b) i fibrylarne białko AD zostało nazwane białkiem β zanim jego drugorzędowa struktura została poznana (Glenner & Wong, 1984). Charakterystyka obrazu dyfrakcyjnego struktury krzyżowej β, razem z wyglądem włókienek i właściwościami barwienia są obecnie akceptowanymi diagnostycznymi cechami charakterystycznymi amyloidu i sugerują, że włókienka, pomimo, że utworzone z całkiem różnych białek prekursorowych, mają podobne w pewnym stopniu właściwości strukturalne i należą do strukturalnej nadrodziny, niezależnie od charakteru ich prekursorowych białek (Sunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MB, Blake CCFJ Mol Biol 1997 Oct 31; 273 (3):729-739). Jedną z najbardziej rozprzestrzenionych i dobrze znanych chorób, w których złogi amyloidowe w ośrodkowym układzie nerwowym, jak się sugeruje, odgrywają główną rolę w postępie choroby, jest AD. Choroba Alzheimera (AD) Choroba Alzheimera (AD) jest nieodwracalną, progresywną chorobą mózgu, która występuje stopniowo i prowadzi do utraty pamięci, zmian behawioralnych i osobowych, i obniżenia zdolności psychicznych. Te zmiany są związane ze śmiercią komórek mózgu i zniszczeniem połączeń pomiędzy nimi. Przebieg tej choroby zmienia się w zależności od osoby, tak jak i szybkość obniżania sprawności. Średnio, pacjenci z chorobą Alzheimera żyją przez 8 do 10 lat od momentu zdiagnozowania, jednakże choroba może trwać do 20 lat.
PL 215 125 B1 3 AD postępuje etapami, od wczesnego, łagodnego zapominania do ciężkiej utraty funkcji umysłowych. Ta utrata jest zwana demencją. U większości ludzi cierpiących na AD, objawy najpierw występują w wieku po 60, lecz wcześniejsze rozpoczęcie choroby nie jest częste. Wcześniejsze objawy często obejmują utratę pamięci, niewłaściwą ocenę i zmiany osobowości. Często, ludzie z wczesnymi etapami AD myślą mniej jasno i zapominają imiona ludzi bliskich i zwykłych przedmiotów. Później w trakcie choroby, mogą oni zapominać jak należy wykonać nawet proste czynności. Ostatecznie, ludzie cierpiący na AD tracą całkowicie zdolności rozumowania i stają się zależni od innych ludzi pod względem codziennego życia. Ostatecznie, choroba staje się tak otępiająca, że pacjenci są przykuci do łóżka i mogą rozwijać się u nich inne choroby i infekcje. Najczęściej, ludzie cierpiący na AD umierają z powodu zapalenia płuc. Pomimo, że ryzyko rozwoju AD zwiększa się z wiekiem, AD i objawy demencji nie są częścią normalnego starzenia. AD i inne choroby powodujące demencję są powodowane przez choroby, które dotykają mózg. Przy normalnym starzeniu, komórki nerwowe w mózgu nie są tracone w dużej ilości. Przeciwnie, AD przerywa trzy kluczowe procesy: połączenia komórek nerwowych, metabolizm i naprawę. To przerwanie ostatecznie powoduje, że wiele komórek nerwowych przestaje funkcjonować, traci połączenia z innymi komórkami nerwowymi i umiera. Na początku, AD niszczy neurony w częściach mózgu, które kontrolują pamięć, zwłaszcza w hipokampie i pokrewnych strukturach. Gdy komórki nerwowe w hipokampie przestaną funkcjonować właściwie, krótkoterminowa pamięć zawodzi i często, zdolność osoby do wykonywania łatwych i znanych czynności zaczyna się obniżać. AD również atakuje korę mózgową, zwłaszcza obszary odpowiedzialne za język i rozumowanie. Ostatecznie, wiele innych obszarów mózgu jest włączonych w ten proces, wszystkie te regiony mózgu podlegające atrofii (kurczeniu) i pacjent z AD zostaje przykuty do łóżka, nie trzyma moczu i stolca, jest całkowicie bezradny i nie reaguje na otaczający go świat (źródło: National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Wpływ choroby Alzheimera AD jest najczęstszym powodem demencji u ludzi w wieku 65 lat i starszych. Stanowi ona główny problem zdrowotny, ze względu na niezwykły wpływ na osoby, ich rodziny, system opieki zdrowotnej i społeczeństwo jako całość. Naukowcy szacują, że do 4 milionów ludzi obecnie cierpi z powodu choroby i chorobowość podwaja się co 5 lat powyżej 65 lat. Szacuje się również, że w przybliżeniu 360 000 nowych przypadków (wystąpień) pojawi się każdego roku, choć liczba ta ulegnie zwiększeniu wraz ze starzeniem się populacji (Brookmeyer i wsp., 1998). AD nakłada ciężki obowiązek na społeczeństwo. Obecne badanie w Stanach Zjednoczonych wykazało szacunkowo, że roczny koszt opieki nad jednym pacjentem cierpiącym na chorobę Alzheimera wynosi $18 408 dla pacjenta z łagodną AD, $30 096 dla pacjenta z umiarkowaną AD i $36 132 dla pacjenta z ciężką AD. Roczny koszt narodowy opieki dla AD pacjentów w US, jak oszacowano, wynosi niewiele ponad $50 miliardów (Leon i wsp., 1998). W przybliżeniu 4 miliony Amerykanów ma 85 lat lub więcej i w większości uprzemysłowionych państw, ta grupa wiekowa jest jedną z najszybciej rosnących segmentów populacji. Szacuje się, że ta grupa będzie liczyła prawie 8,5 milionów do roku 2030 w US; niektórzy eksperci, którzy badali trendy w populacji sugerują, że liczba ta może być nawet większa. Gdy coraz więcej ludzi żyje dłużej, liczba ludzi dotkniętych chorobami związanymi ze starzeniem, obejmującymi AD, będzie nadal rosła. Na przykład, pewne badania wykazują prawie połowę wszystkich ludzi w wieku 85 i starszych mają pewne postacie demencji. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Główna charakterystyka choroby Alzheimera Dwie anormalne struktury w mózgu są cechami charakterystycznymi choroby Alzheimera: płytki amyloidowe i sploty neurofibrylarne (NFT). Płytki są zwartymi, w dużej mierze nierozpuszczalnymi złogami białka i komórkowego materiału za zewnątrz i dokoła neuronów mózgu. Sploty są nierozpuszczalnymi skręconymi włóknami, które odkładają się wewnątrz neuronów. Występują dwa typy choroby Alzheimera: rodzinna AD (FAD), która występuje zgodnie z pewnym wzorem dziedziczenia i sporadyczna AD, gdzie nie ma oczywistego wzoru dziedziczenia. Ze względu na różnice w wieku, w którym następuje rozpoczęcie choroby, AD jest również opisana jako o wczesnym początku (występująca u ludzi młodszych niż 65) lub o późnym początku (występująca u osób w wieku 65 i starszych). AD o wczesnym początku jest rzadka (około 10 procent przypadków) i ogólnie dotyka ludzi w wieku 30 do 60. Pewne formy AD o wczesnym początku są dziedziczone i przebiegają w rodzinach. AD o wczesnym początku również często postępuje szybciej, niż częstsza, postać o późnym początku.
4 PL 215 125 B1 Wszystkie przypadki FAD znane do tej pory mają wczesny początek i aż 50 procent przypadków FAD obecnie znanych jest powodowanych przez defekty w trzech genach zlokalizowanych na trzech różnych chromosomach. Są to mutacje w genie APP na chromosomie 21; mutacje w genie na chromosomie 14, zwanym genem preseniliny 1; i mutacje w genie na chromosomie 1, zwanym genem preseniliny 2. Nie istnieje żaden dowód, jednakże, że dowolna z tych mutacji odgrywa główną rolę w częstszej, sporadycznej lub nierodzinnej postaci AD o późnym początku. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Płytki amyloidowe W chorobie Alzheimera płytki amyloidowe rozwijają się najpierw w obszarach mózgu wykorzystywanych w funkcjach pamięci i innych funkcjach poznawczych. Składają się one w dużej mierze z nierozpuszczalnych złogów amyloidu beta (tutaj poniżej oznaczony Αβ) - fragment białkowy większego białka zwanego prekursorowym białkiem amyloidu (APP, którego aminokwasową sekwencję przedstawiono jako SEK NR ID: 2) - przeplatającym się z częściami neuronów i z komórkami innymi niż neurony takie, jak komórki mikroglejowe i astrocyty. Nie wiadomo czy płytki amyloidowe same stanowią główną przyczynę choroby Alzheimera lub czy są one produktem ubocznym procesu choroby Alzheimera. Z pewnością, zmiany w białku APP może powodować AD, jak przedstawiono w dziedzicznej postaci choroby Alzheimera powodowanej przez mutacje w genie APP i tworzenie płytek Αβ wydaje się być blisko związane z postępem choroby u ludzi (Lippa C. F. i wsp. 1998). APP APP jest jednym z wielu białek, które są związane z błonami komórkowymi. Po wytworzeniu, APP ulega osadzeniu w błonie komórkowej komórek nerwowych, częściowo wewnątrz i częściowo na zewnątrz komórki. Obecne badania wykorzystujące transgeniczne myszy wykazują, że APP wydaje się odgrywać ważną rolę we wzroście i przeżyciu neuronów. Na przykład, pewne postacie i ilości APP mogą zabezpieczać neurony przeciwko zarówno krótko- jak i długoterminowemu uszkodzeniu i mogą czynić uszkodzone neurony lepiej przygotowanymi do samonaprawy i wspomagać części neuronów we wzroście po uszkodzeniu mózgu. Podczas gdy APP jest osadzone w błonie komórkowej, proteazy działają na szczególne miejsca w obrębie APP, tnąc go na białkowe fragmenty. Jedna proteaza wspomaga cięcie APP z wytworzeniem Αβ, a inna proteaza tnie APP w środku amyloidowego fragmentu, tak że Αβ nie może być utworzone. Utworzone Αβ ma dwie różne długości, krótszą 40 (lub 41) aminokwasową Αβ, która jest stosunkowo rozpuszczalna i agreguje powoli, i nieco dłuższa, 42 aminokwasowa lepka" Αβ, która gwałtownie tworzy nierozpuszczalne skupiska. Podczas gdy Αβ jest tworzony, nie wiadomo jeszcze dokładnie jak, przemieszcza się przez i wokół komórek nerwowych. W końcowych etapach tego procesu, lepki" Αβ agreguje w długie filamenty zewnątrzkomórkowe i wraz z fragmentami martwych i umierających neuronów i komórek mikroglejowych i astrocytów, tworzy płytki, które są charakterystyczne dla choroby Alzheimera w tkance mózgowej. Istnieją pewne dowody, że mutacje w APP powodują, że Αβ będzie z większym prawdopodobieństwem odcięty od prekursorowego APP, zatem powodując wytworzenie więcej całkowitej Αβ lub stosunkowo więcej lepkiej" formy. Również wydaje się, że mutacje w genach kodujących presenilinę mogą brać udział w degeneracji neuronów na przynajmniej dwa sposoby: przez zmodyfikowanie wytwarzania Αβ lub przez wyzwalanie śmierci komórek bardziej bezpośrednio. Inni naukowcy sugerują, że zmutowane preseniliny 1 i 2 mogą brać udział w przyśpieszaniu tempa apoptozy. Można się spodziewać, że gdy choroba postępuje, coraz więcej płytek będzie tworzonych, wypełniając coraz więcej obszarów mózgu. Badania sugerują, że może to być tak, że Αβ ulega agregacji i rozdzieleniu w tym samym czasie, w pewnym rodzaju równowagi dynamicznej. To budzi nadzieję, że może być możliwe zniszczenie płytek nawet po ich utworzeniu. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Uważa się, że Αβ jest toksyczny dla neuronów. W badaniach hodowli tkankowych, naukowcy obserwowali wzrost śmierci w przypadku komórek nerwowych hipokampu, zaprojektowanych tak, że prowadzą nadekspresję zmutowanych form ludzkiego APP w porównaniu do neuronów prowadzących nadekspresję normalnego ludzkiego APP (Luo i wsp., 1999). Ponadto, nadekspresja lub ekspresja zmodyfikowanych form białka Αβ, jak wykazano w modelach zwierzęcych, indukuje objawy typu choroby Alzheimera, (Hsiao K. i wsp., 1998). Wiedząc, że wzrost wytwarzania Αβ, jego agregacja w płytki i wytworzona neurotoksyczność może prowadzić do AD, terapeutycznie jest ważne, aby badać warunki, w jakich agregacja Αβ w płytki mogłaby być spowolniona lub nawet zablokowana.
PL 215 125 B1 5 Preseniliny Mutacje preseniliny-1 (S-180) wyjaśniają niemal 50% wszystkich przypadków o wczesnym początku rodzinnej AD (FAD). Około 30 mutacji zidentyfikowano, jako dające początek AD. Początek choroby Alzheimera zmienia się z mutacjami. Mutacje w presenilinie-2 wyjaśniają znacznie mniejszą część przypadków FAD, lecz nadal jest to znaczący czynnik. Nie wiadomo czy preseniliny biorą udział w sporadycznej nierodzinnej AD. Funkcja presenilin nie jest znana, lecz wydają się brać udział w obróbce APP, w celu otrzymania Αβ-42 (dłuższa, bardziej lepka forma peptydu, SEK NR ID: 2, reszty 673-714), gdyż pacjenci cierpiący na AD z mutacjami w presenilinie mają podwyższone poziomy tego peptydu. Nie jest jasne czy preseniliny również mają udział w wywoływaniu wytwarzania NFT. Pewne badania sugerują, że preseniliny mogą również mieć bardziej bezpośrednią rolę w degeneracji neuronów i śmierci neuronów. Gen kodujący presenilinę-1 jest zlokalizowany na chromosomie 14 podczas gdy presenilinę-2 jest połączony z chromosomem 1. Jeśli u osoby występuje zmutowana wersja tylko jednego z tych genów, to jest niemal pewne, że będzie u osoby tej rozwijała się będzie AD o wczesnym początku. Istnieje niepewność co do tego czy presenilina-1 jest identyczna z hipotetyczną gama-sekretazą biorącą udział w obróbce APP (Naruse i. wsp., 1998). Apolipoproteina E Apolipoproteina E jest zwykle związane z cholesterolem, lecz również została stwierdzona w płytkach i splotach w mózgach osób chorych na chorobę Alzheimera. Podczas gdy allele 1-3 nie wydają się brać udziału w chorobie Alzheimera istnieje znacząca korelacja pomiędzy obecnością allelu ΑΡOΕ- 4 i rozwijaniem się późnej AD (Strittmatter i wsp., 1993). Jest to, jednakże, czynnik ryzyka i nie stanowi bezpośredniej przyczyny, jak ma to miejsce w przypadku preseniliny i mutacji APP, i nie jest ograniczony do rodzinnej AD. Sposoby, w jaki białko ΑPOΕ- 4 zwiększa prawdopodobieństwo rozwoju AD nie są znane z pewnością, lecz jedna z możliwych teorii, polega na tym, że ułatwia nagromadzenie Αβ i bierze udział w obniżaniu wieku początku choroby Alzheimera, lub obecność lub brak pewnych alleli APOE może wpływać na sposób, w jaki neurony odpowiadają na uszkodzenie (Buttini i wsp., 1999). Również wykazano, że Apo A1 jest amyloidogenny. Nienaruszony apo A1 może sam tworzyć włókienka typu amyloidowego in vitro, które są pozytywne względem czerwieni Kongo (Am J Pathol 147 (2): 238-244 (Aug 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, Wisniewski KE, Frangione B). Wydaje się, że istnieją pewne sprzeczne wyniki, wskazujące, że istnieje pozytywny wpływ allelu ΑΡOΕ-ε4 na obniżanie objawów utraty świadomości, w porównaniu do innych alleli (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41). Sploty neurofibrylarne Ta druga cecha charakterystyczna choroby Alzheimera obejmuje anormalne gromadzenie się skręconych nici obecnych wewnątrz komórek nerwowych. Głównym składnikiem splotów jest jedna forma białka zwanego tau ( ). W ośrodkowym układzie nerwowym, białka tau są najlepiej znane pod względem ich zdolności do wiązania i pomocy w stabilizacji mikrotubul, które są jednym składnikiem wewnętrznej szkieletowej struktury komórki, lub szkieletu. Jednakże, w chorobie Alzheimera tau jest zmienione chemicznie i to zmienione tau nie może dalej stabilizować mikrotubul, powodując, że ulegają one rozpadowi. To załamanie układu transportu może na początku prowadzić do wadliwego funkcjonowania komunikacji pomiędzy komórkami nerwowymi, a później może prowadzić do śmierci neuronów. W chorobie Alzheimera, chemicznie zmienione tau skręca się w sparowane helikalne filamenty - dwie nici tau, które skręcają się dookoła siebie. Te filamenty są główną substancją stwierdzoną w splotach neurofibrylarnych. W jednym z obecnych badań, naukowcy stwierdzili neurofibrylarne zmiany u mniej niż 6 procent neuronów, w szczególnej części hipokampu w zdrowych mózgach, ponad 43 procent takich neuronów u ludzi, którzy zmarli na łagodną postać AD i 71 procent takich neuronów u ludzi którzy zmarli na ciężką postać AD. Gdy badano utratę neuronów, stwierdzono podobny postęp. Dowód tego typu jest poparciem idei, że tworzenie splotów i utrata neuronów postępują razem w czasie choroby Alzheimera. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999). Tauopatie i sploty Kilka neurodegeneracyjnych chorób, innych niż AD, charakteryzuje się agregacją tau w nierozpuszczalne filamenty w neuronach i gleju, prowadząc do dysfunkcji i śmierci. Ostatnio, kilka grup naukowców, którzy badali rodziny o różnych wrodzonych demencjach innych niż AD, stwierdzili jedną mutację w genie kodującym tau w chromosomie 17 (Clark i wsp., 1998; Hutron i wsp., 1998; Poorkaj
6 PL 215 125 B1 i wsp., 1998; Spillantyni i wsp., 1998). W tych rodzinach, mutacje w genie kodującym tau powodują śmierć komórek nerwowych i demencję. Te zaburzenia, które mają pewne wspólne cechy charakterystyczne z AD, lecz różnią się w kilku ważnych aspektach, są razem zwane czołowo skroniową demencją i parkinsonizmem połączonym z chromosomem 17" (FTDP-17). Są to choroby, takie jak choroba Parkinsona, niektóre postacie stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), degeneracja korowopodstawna, progresywne nadjądrowe porażenie i choroba Picka i wszystkie one charakteryzują się anormalną agregacją białka tau. Inne neurologiczne choroby typu AD Występują ważne podobieństwa pomiędzy AD oraz innymi neurologicznymi chorobami, obejmującymi choroby powodowane przez priony (takie jak kuru, choroba Creutzfelda-Jacoba i bydlęce gąbczaste zapalenie mózgu), chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona i demencję czołowo-skroniową. Wszystkie obejmują złogi anormalnych białek w mózgu. AD i choroby powodowane przez priony, powodują demencję i śmierć, i obie są związane z tworzeniem nierozpuszczalnych włókienek amyloidu, lecz z białek błonowych, które są od siebie różne. Naukowcy badając chorobę Parkinsona, drugą co do częstości neurodegeneracyjną chorobę po AD, ujawnili pierwszy gen związany z tą chorobą. Gen ten koduje białko zwane synukleiną, które, niespodziewanie, również jest obecne w płytkach amyloidowych występujących w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera (Lavedan C, 1998, Genom Res. 8(9): 871-80). Badający również ujawnili, że genetyczne defekty w chorobie Huntingtona, kolejnej progresywnej neurodegeneracyjnej chorobie powodującej demencję, powodują, że białko Huntingtona tworzy nierozpuszczalne włókienka bardzo podobne do włókienek Αβ w chorobie Alzheimera i włókienek białkowych w chorobach powodowanych przez priony (Scherzinger E, i wsp., 1999, PNAS U.S.A. 96 (8): 4604-9). Naukowcy również ujawnili nowy gen, który jeśli jest zmutowany, jest odpowiedzialny za brytyjską rodzinną demencję (FBD, ang. familial British dementia), rzadką dziedziczoną chorobę, która powoduje dotkliwe zaburzenia w poruszaniu i progresywną demencję podobną do tej obserwowanej w chorobie Alzheimera. W biochemicznej analizie włókienek amyloidu występujących w płytkach FBD, stwierdzono wyjątkowy peptyd nazwany ABri (Vidal i wsp., 1999). Mutacja w szczególnym punkcie wzdłuż tego genu prowadzi do wytwarzania dłuższego niż normalnie białka Bri. Peptyd ABri, który jest odcięty od zmutowanego końca białka Bri jest gromadzony jako amyloidowe włókienka. Te płytki jak się uważa prowadzą do dysfunkcji neuronów i demencji, która charakteryzuje FBD. Immunizacja Αβ Układ odpornościowy będzie normalnie brał udział w usuwaniu obcego białka i białkowych cząsteczek z organizmu, lecz złogi związane z powyżej wymienionymi chorobami składają się głównie z własnych białek, co czyni rolę układu odpornościowego w kontroli tych chorób mniej oczywistą. Ponadto, złogi są zlokalizowane w obszarze CNS (ośrodkowy układ nerwowy) normalnie oddzielonym od układu odpornościowego, oba fakty sugerują, że każda szczepionka lub immunoterapeutyczne podejście mogą być nieudane. W każdym razie, naukowcy ostatnio próbowali immunizować myszy szczepionką złożoną z heterogenicznego ludzkiego Αβ i substancji znanej, pobudzającej układ odpornościowy (Schenk i wsp., 1999 i WO 99/27944). Szczepionkę badano w częściowym modelu choroby Alzheimera na transgenicznych myszach z ludzkim zmutowanym genem kodującym APP wprowadzonym do DNA myszy. Myszy uzyskiwały zmodyfikowane białko APP i rozwinęły płytki amyloidowe wraz z ich wzrostem z wiekiem. Ten mysi model zastosowano aby zbadać czy szczepienie przeciwko zmodyfikowanemu transgenicznemu ludzkiemu APP miało wpływ na nabudowanie płytki. W pierwszym doświadczeniu, jedna grupa transgenicznych myszy otrzymywała miesięczne iniekcje szczepionki rozpoczynające się od 6 tygodnia życia i kończące się na 11 miesiącu. Druga grupa transgenicznych myszy nie otrzymała iniekcji i służyła jako grupa kontrolna. W wieku 13 miesięcy, myszy w grupie kontrolnej miały płytki obejmujące 2 do 6 procent ich mózgów. Przeciwnie, immunizowane myszy nie miały faktycznie żadnych płytek. W drugim doświadczeniu, naukowcy rozpoczęli iniekcje w 11 miesiącu, gdy pewne płytki już się rozwinęły. Przez okres 7-miesięcy, kontrolne transgeniczne myszy miały 17-krotny wzrost ilości płytek w ich mózgach, podczas gdy te otrzymujące szczepionkę miały 99-procentowe obniżenie w porównaniu do 18-miesięcznych kontrolnych transgenicznych myszy. U pewnych myszy, niektóre z istniejących uprzednio złogów płytkowych wydawały się usunięte w wyniku leczenia. Również stwierdzono, że inne uszkodzenia związane z płytkami, takie jak zapalenie i anormalne procesy w komórkach nerwowych, zmniejszyły się w wyniku immunizacji.
PL 215 125 B1 7 Powyższe stanowi zatem wstępne badanie u myszy i na przykład, naukowcy muszą określić czy szczepione myszy pozostają zdrowe w innych aspektach i czy pamięć tych szczepionych myszy pozostaje normalna. Ponadto, ponieważ mysi model nie w pełni stanowi reprezentację choroby Alzheimera (zwierzęta nie rozwijają splotów neurofibrylarnych ani nie wiele z ich neuronów umiera), dodatkowe badania będą potrzebne aby określić czy ludzie mają podobne czy różne reakcje jak myszy. Drugą sprawą, którą trzeba rozważyć, jest że sposób może ewentualnie leczyć" amyloidowe złogi ale nie zatrzyma rozwoju demencji. Techniczne rozwiązania również stanowią duże wyzwanie. Na przykład, jest mało prawdopodobne, że jest to nawet możliwe, stosując tę technologię, stworzenie szczepionki, która umożliwi ludziom wytworzenie przeciwciał przeciwko ich własnym białkom. Tak liczne problemy bezpieczeństwa i skuteczności będą musiały być rozwiązane zanim wszelkie testy u ludzi mogą być rozważane. Praca Schenka i wsp. zatem wykazała, że jeśli byłoby możliwe wytworzenie silnej odpornościowej odpowiedzi na własne białka w białkowych złogach w ośrodkowym układzie nerwowym, takie jak płytki utworzone w chorobie Alzheimera, to również byłoby możliwe zapobieganie tworzeniu złogów, jak również usuwanie już utworzonych płytek. Ostatnio, testy kliniczne wykorzystujące powyżej omówione szczepionki Αβ zostały zakończone ze względu na szkodliwe działania uboczne: pewna liczba szczepionych osobników rozwinęła chroniczne zapalenie mózgu, które może być wynikiem niekontrolowanej autoimmunizacji przeciwko Αβ w CNS (ośrodkowym układzie nerwowym). Cel wynalazku Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie autoszczepionki przeciwko amyloidowi, w celu otrzymania nowego sposobu leczenia AD i innych patologicznych zaburzeń w których rolę odgrywają złogi amyloidowe. Streszczenie wynalazku Opisano poniżej zastosowanie technologii autoszczepienia do wytwarzania silnych odpornościowych odpowiedzi przeciwko w inny sposób nie-immunogennym APP i Αβ. Opisano również sposoby wytwarzania takich szczepionek do zapobiegania, możliwie leczenia lub złagodzenia objawów chorób związanych z odkładaniem amyloidu. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie immunogenu, który a) jest poliaminokwasem składającym się z przynajmniej jednej kopii podsekwencji reszt 672- -714 z SEK NR ID: 2, przy czym co najmniej jeden obcy epitop pomocniczy T (epitop T H ) jest włączony poprzez addycję aminokwasu i/lub insercję i/lub delecję i/lub podstawienie, podsekwencja jest wybrana z grupy składającej się z reszt 1-40, reszt 1-39, reszt 1-35, reszt 1-34, reszt 1-28, reszt 1-12, reszt 1-5, reszt 13-28, reszt 13-35, reszt 17-28, reszt 25-35, reszt 35-40, reszt 36-42 i reszt 35-42 sekwencji aminokwasowej składającej się z reszt aminokwasowych 673-714 z SEK NR ID: 2, a Phe w pozycji 19 reszt aminokwasowych 673-714 z SEK NR ID: 2 może być ewentualnie podstawiona, korzystnie Pro; lub b) jest koniugatem zawierającym szkielet polihydroksypolimerowy, z którym oddzielnie jest sprzężony poliaminokwas określony w a); lub c) jest kwasem nukleinowym kodującym poliaminokwas określony a); lub d) jest niepatogennym mikroorganizmem lub wirusem niosącym fragment kwasu nukleinowego, który koduje i umożliwia ekspresję poliaminokwasu określonego w a), do wytwarzania preparatu farmaceutycznego zawierającego immunogen do leczenia, zapobiegania lub polepszania stanu zwierzęcia cierpiącego na chorobę Alzheimera lub inne choroby charakteryzujące się złogami amyloidowymi. Korzystnie poliaminokwas lub koniugat stanowiące immunogen zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmuje: - przynajmniej jedno pierwsze ugrupowanie cząsteczkowe, które powoduje skierowanie poliaminokwasu do komórek prezentujących antygen (APC) lub limfocytu B, i/lub - przynajmniej jedno drugie ugrupowanie cząsteczkowe, które stymuluje układ odpornościowy, i/lub - przynajmniej jedno trzecie ugrupowanie cząsteczkowe, które optymalizuje prezentację poliaminokwasu układowi odpornościowemu. Korzystniej pierwsze i/lub drugie i/lub trzecie ugrupowanie cząsteczkowe poliaminokwasu lub koniugatu jest/są przyłączone jako grupa boczna, kowalencyjnym lub niekowalencyjnym wiązaniem, do odpowiednich chemicznych grup w sekwencji APP lub Αβ.
8 PL 215 125 B1 Jeszcze korzystniej poliaminokwas lub koniugat stanowiące immunogen zawiera polipeptyd fuzyjny. Również korzystnie poliaminokwas lub koniugat stanowiące immunogen do zastosowania według wynalazku obejmuje podwojenie przynajmniej jednego epitopu APP lub Αβ limfocytów B i/lub wprowadzenie haptenu. Ponadto korzystnie obcy epitop limfocytu T jest immunodominujący u zwierzęcia, korzystniej jest wspólny, tak jak obcy epitop limfocytu T, który jest wybrany spośród naturalnego wspólnego epitopu limfocytu T i sztucznej sekwencji peptydu wiążącego MHC-II, a najkorzystniej naturalny epitop limfocytu T jest wybrany spośród epitopu anatoksyny tężca, takiego jak P2 lub P30, epitopu anatoksyny błonicy, epitopu hemaglutyniny wirusa grypy i epitopu CS P. falciparum. W korzystnej postaci wykonania poliaminokwas lub koniugat stanowiące immunogen do zastosowania według wynalazku obejmuje epitopy limfocytów B, które nie są eksponowane do fazy zewnątrzkomórkowej, gdy są obecne w związanej z komórką postaci prekursora polipeptydu Αβ. Również korzystnie poliaminokwas lub koniugat nie ma przynajmniej jednego epitopu limfocytu B, który jest eksponowany do fazy zewnątrzkomórkowej, gdy jest obecny w związanej z komórką postaci prekursora polipeptydu Αβ. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku immunogen z punktu (a) obejmuje lub składa się z poliaminokwasu wybranego z grupy składającej się z: - reszt aminokwasowych epitopu P2 anatoksyny tężca, po których następują reszty aminokwasowe 1-28 Αβ, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca; - reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 13-28 Αβ; - reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 1-12 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 1-12 Αβ; - reszt aminokwasowych 13-28 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 13-28 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 13-28 Αβ; - reszt aminokwasowych 1-12 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 13-35 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 36-42 Αβ; - reszt aminokwasowych 1-28 Αβ, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe 1-28 Αβ, reszty aminokwasowe epitopu P2 anatoksyny tężca oraz reszty aminokwasowe 1-28 Αβ; i - reszt aminokwasowych 1-43 Αβ, przy czym Phe 19 została zastąpiona Pro, a Met 35 została zastąpiona Lys, po których następują reszty aminokwasowe epitopu P30 anatoksyny tężca, a następnie reszty aminokwasowe epitopu P2, przy czym wszystkie sekwencje aminokwasowe są wyszczególnione w kierunku od końca N do C. W kolejnej korzystnej postaci wykonania przynajmniej dwie kopie poliaminokwasu lub koniugatu są połączone kowalencyjnie lub niekowalencyjnie z cząsteczką nośnika zdolną do przeprowadzenia prezentacji wielokrotnych kopii determinant antygenowych. Zgodnie z korzystną postacią wykonania zastosowania według wynalazku w immunogenie z punktu (b) poliaminokwas jest połączony do polihydroksypolimeru za pośrednictwem wiązania amidowego, a polihydroksypolimer jest wielocukrem. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku poliaminokwas lub koniugat przygotowano w formie z adiuwantem, co ułatwia przełamanie autotolerancji na autoantygeny. Korzystnie preparat farmaceutyczny otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania drogą wybraną spośród podawania pozajelitowego, takiego jak podawanie śródskórne, podskórne i domięśniowe; podawania dootrzewnowego; podawania doustnego; podawania dopoliczkowego; podawania podjęzykowego; podawania nadtwardówkowego; podawania dordzeniowego; podawania doodbytniczego i podawania wewnątrzczaszkowego. Korzystniej taki preparat farmaceutyczny zawiera skuteczną ilość poliaminokwasu lub koniugatu wynoszącą od 0,5 μg do 2000 µg. W innej korzystnej postaci zastosowania według wynalazku preparat farmaceutyczny obejmujący kwas(y) nukleinowy(e) kodujący(e) poliaminokwas lub koniugat zgodnie z punktem (c) jest prze-
PL 215 125 B1 9 znaczony do wprowadzenia tego kwasu nukleinowego do komórek zwierzęcia i w ten sposób otrzymywania in vivo ekspresji w komórkach, do których wprowadzono kwas(y) nukleinowy(e). Korzystniej wprowadzony(e) kwas(y) nukleinowy(e) jest/są wybrane spośród nagiego DNA, DNA przygotowanego z naładowanymi lub nienaładowanymi lipidami, DNA przygotowanego w liposomach, DNA włączonego do wektora wirusowego, DNA przygotowanego z ułatwiającym transfekcję białkiem lub polipeptydem, DNA przygotowanego z ukierunkowującym białkiem lub polipeptydem, DNA przygotowanego z wapniowymi środkami strącającymi, DNA sprzężonego z obojętną cząsteczką nośnika, DNA kapsułkowanego w chitynie lub chitozanie i DNA przygotowanego z adiuwantem. W innej korzystnej postaci wykonania zastosowania według wynalazku preparat farmaceutyczny jest przeznaczony do podawania przynajmniej w jednym, przynajmniej 2, przynajmniej 3, przynajmniej 4, przynajmniej 6 i przynajmniej 12 podaniach/wprowadzeniach na rok. Ponadto preparat farmaceutyczny zgodny z zastosowaniem według wynalazku jest korzystnie przeznaczony do obniżenia poziomu APP lub Αβ w takim stopniu, aby całkowita ilość amyloidu była obniżona lub aby szybkość tworzenia amyloidu była obniżona w stopniu klinicznie istotnym. Przedmiotem wynalazku jest również poliaminokwas lub koniugat pochodzący ze zwierzęcego APP lub Αβ, jak określono powyżej, do którego wprowadzono modyfikację, w wyniku której immunizacja zwierzęcia poliaminokwasem lub koniugatem indukuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko autologicznym APP lub Αβ zwierzęcia. Ponadto przedmiotem wynalazku jest immunogenna kompozycja zawierająca immunogennie skuteczną ilość poliaminokwasu lub koniugatu według wynalazku oraz ponadto farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub zaróbkę oraz ewentualnie adiuwant. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest fragment kwasu nukleinowego, który koduje poliaminokwas lub koniugat według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor niosący fragment kwasu nukleinowego według wynalazku, przy czym wektor ten jest zdolny do autonomicznej replikacji. Korzystnie wektor według wynalazku jest wybrany z grupy składającej się plazmidu, faga, kosmidu, mini-chromosomu i wirusa. Zatem, rozwiązania według wynalazku dostarczają środków do obniżania in vivo poziomu białka prekursorowego amyloidu (APP) lub amyloidu beta (Αβ) u zwierzęcia, łącznie z człowiekiem, obejmującego przeprowadzenie prezentacji układowi odpornościowemu zwierzęcia immunogennie skutecznej ilości przynajmniej jednego analogu APP lub Αβ, który ma włączony do tej samej cząsteczki przynajmniej jeden epitop limfocytów B APP i/lub Αβ i przynajmniej jeden obcy epitop pomocniczych limfocytów T (epitop T H ) tak, że immunizacja zwierzęcia analogiem wywołuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko autologicznym APP lub Αβ zwierzęcia. Obecny uprawiony wcześniej zgłosił międzynarodowe zgłoszenia patentowe dotyczące bezpiecznych strategii szczepienia przeciwko amyloidogennym polipeptydom, takim jak APP i Αβ, patrz WO 01/62284. Zgłoszenie to nie zostało opublikowane do dnia zgłoszenia obecnego zgłoszenia patentowego, a ponadto nie zawiera szczegółów dotyczących powyżej wymienionych użytecznych analogów APP i Αβ. Legenda do figur Fig. 1: Schematyczne przedstawienie wariantów Autovac pochodzących z prekursorowego białka amyloidu w celu wytworzenia odpowiedzi przeciwciał przeciwko białku Αβ Αβ-43 (lub C-100). Przedstawiono APP schematycznie na górze figury i pozostałe schematyczne konstrukty wykazały, że modelowe epitopy P2 i P30 są podstawione lub wprowadzono różne skrócenia APP. Na figurze, czarny wzór wskazuje na sekwencję sygnałową APP, podwójne zakreskowanie krzyżowe odpowiada zewnątrzkomórkowej części APP, ciemne zakreskowanie pionowe określa transbłonową domenę APP, jasne pionowe zakreskowanie określa międzykomórkową domenę APP, grube podwójne zakreskowanie krzyżowe wskazuje epitop P30 i drobne krzyżowe zakreskowanie wskazuje epitop P2. Prostokąt obwiedziony pełną linią wskazuje Αβ-42/43 i prostokąt obwiedziony linią nieprzerywaną i linią kropkową razem wskazują C-100. Abeta" oznacza Αβ. Fig. 2: Schematyczne przedstawienie rozwiązania syntezy ogólnie stosowanych immunogennych koniugatów. Peptyd A (o dowolnej antygenowej sekwencji, np. sekwencja Αβ opisana tutaj) i peptyd B (aminokwasowa sekwencja obejmująca obcy epitop pomocniczych limfocytów T) zsyntetyzowano i zmieszano. Następnie kontaktowano je z odpowiednim aktywowanym polihydroksypolimerem, peptydy A i B przyłączono poprzez aktywację grup w częściach odpowiadających wstępnym stosunkom pomiędzy tymi dwoma substancjami w peptydowej mieszaninie. Patrz Przykład 4 opisujący to szczegółowo.
10 PL 215 125 B1 Szczegółowe ujawnienie wynalazku Definicje Poniżej pewna liczba terminów zastosowanych w obecnym opisie i zastrzeżeniach zostanie zdefiniowana i wyjaśniona szczegółowo, w celu szczegółowego wyjaśnienia granic i zakresu wynalazku. Terminy amyloid" i białko amyloidu", które są zastosowane wymiennie tutaj oznaczają klasę białkowych nierozgałęzionych włókienek nieokreślonej długości. Amyloidowe włókienka charakteryzują się tym, że ulegają barwieniu czerwienią Kongo i mają wspólną strukturę krzyżową-β, w której łańcuch polipeptydowy jest zorganizowany w β-kartkę. Amyloid ogólnie pochodzi z amyloidogennych białek, które mają bardzo różne prekursorowe struktury, lecz które mogą wszystkie przechodzić przekształcenie strukturalne do nieprawidłowo złożonej postaci, która jest elementem budującym protofilamentu - helisy β-kartki. Zazwyczaj, średnica włókienka amyloidu waha się od około 70 do około 120 Å. Termin amyloidogenne białko" ma oznaczać polipeptyd, który bierze udział w tworzeniu amyloidowych złogów, zarówno poprzez stanowienie części złogów jako taki lub poprzez uczestniczenie w ścieżce biosyntezy prowadzącej do utworzenia złogów. Zatem, przykłady amyloidogennych białek obejmują APP i Αβ, lecz również białka biorące udział w metabolizmie tych, być może, amyloidogennych białek. Polipeptyd amyloidu" ma tutaj oznaczać polipeptyd zawierający aminokwasową sekwencję powyżej omówionych amyloidogennych białek pochodzących od ludzi lub innych ssaków (lub obcięte fragmenty mające wspólną zasadniczą ilość limfocytów B z nienaruszonym amyloidogennym białkiem) - amyloidogenny polipeptyd może zatem, np. zawierać zasadnicze części prekursora amyloidogennego polipeptydu (w przypadku Αβ, możliwy polipeptyd amyloidu może pochodzić z APP). Również nieglikozylowane postacie amyloidogennego polipeptydu, które wytworzono w prokariotycznym układzie są objęte w obrębie zakresu terminu, tak jak postacie mające różne schematy glikozylacji ze względu na zastosowanie, np. drożdży lub innych niessaczych eukariotycznych układów ekspresji. Należy, jednakże, zauważyć, że gdy stosując termin amyloidogenny polipeptyd" zamierzonym jest, aby polipeptyd rozpatrywany był normalnie nieimmunogenny, gdy przedstawiony zwierzęciu, które ma być leczone. Innymi słowy, amyloidogenny polipeptyd jest własnym białkiem lub jest analogiem takiego własnego białka, które nie będzie normalnie wywoływać odpowiedzi odpornościowej przeciwko amyloidogennym białkom rozpatrywanego zwierzęcia. Analog" oznacza cząsteczkę pochodzącą z APP lub Αβ, która ma włączoną jedną lub kilka zmian w jej strukturze molekularnej. Taka zmiana może, np., być w postaci fuzyjnych poliaminokwasów APP lub Αβ z odpowiednim fuzyjnym partnerem (to jest zmiana pierwszorzędowej struktury wyłącznie obejmująca C- i/lub N-końcowe addycje reszt aminokwasowych) i/lub może być w postaci insercji i/lub delecji i/lub podstawień w polipeptydowej sekwencji aminokwasowej. Również objęte terminem są pochodne cząsteczki pochodzące z APP lub Αβ, patrz omówienia poniżej dotyczące modyfikacji APP lub Αβ. W pewnych przypadkach analog może być tak skonstruowany, aby był mniej zdolny lub nawet niezdolny do wywoływania przeciwciał przeciwko normalnemu prekursorowemu białku(om) amyloidu, przez co unika się niepożądanego oddziaływania z (fizjologicznie normalną) niezagregowaną formą polipeptydu będącą prekursorowym białkiem amyloidu. Należy zauważyć, że zastosowanie jako szczepionki u człowieka kseno-analogu (np. psi lub świński analog) ludzkiego APP lub Αβ można sobie wyobrazić, że doprowadzi do pożądanej odporności przeciwko APP lub Αβ. Takie zastosowanie kseno-analogu do immunizacji jest również rozważane. Termin polipeptyd" w obecnym kontekście ma oznaczać zarówno krótkie peptydy od 2 do 10 reszt aminokwasowych, oligopeptydy od 11 do 100 reszt aminokwasowych i polipeptyd o więcej niż 100 resztach aminokwasowych. Ponadto, termin również ma obejmować białka, to jest funkcjonalne cząsteczki biologiczne zawierające przynajmniej jeden polipeptyd; gdy zawierają przynajmniej dwa polipeptydy, mogą one tworzyć kompleksy, być kowalencyjnie połączone, lub mogą być niekowalencyjnie połączone. Polipeptyd(y) w białku może być glikozylowany i/lub lipidowany i/lub zawierać prostetyczne grupy. Również, termin poliaminokwas" jest równoważny z terminem polipeptyd". Terminy limfocyt T" i komórka T" zostanie użyty wymiennie dla limfocytów pochodzących z grasicy, które są odpowiedzialne za różne zachodzące za pośrednictwem komórek odpowiedzi odpornościowe, jak również za aktywność pomocniczą w humoralnej odpowiedzi odpornościowej. Podobnie, terminy limfocyt B" i komórka B" zostanie użyty wymiennie dla limfocytów wytwarzających przeciwciała.
PL 215 125 B1 11 Termin podsekwencja" oznacza dowolny, ciągły obszar o przynajmniej 3 aminokwasach lub, jeśli ma to zastosowanie, o przynajmniej 3 nukleotydach, pochodzących bezpośrednio z odpowiednio naturalnie występującej aminokwasowej sekwencji amyloidu lub sekwencji kwasu nukleinowego. Termin zwierzę" w obecnym kontekście ogólnie ma oznaczać gatunek zwierzęcia (korzystnie ssaka), takiego jak Homo sapiens, Canis domesticus, itp., a nie tylko jedno pojedyncze zwierzę. Jednakże, termin również oznacza populację takich zwierzęcych gatunków, gdyż jest ważne, aby immunizowane osobniki wszystkie wykazywały zasadniczo takie same APP lub Αβ, pozwalając na immunizację zwierząt tym samym immunogenem(immunogenami). Będzie jasne dla specjalisty w dziedzinie, że zwierzę w obecnym kontekście oznacza żywe stworzenie, które ma układ odpornościowy. Korzystnie zwierzę jest kręgowcem, takim jak ssak. Termin obniżanie in vivo poziomu APP lub Αβ" jest tutaj rozumiany jako obniżenie w żywym organizmie całkowitej ilości białka amyloidu w złogach (lub amyloidu jako takiego) odpowiedniego typu. Obniżanie poziomu (regulacja w dół) może być otrzymana za pośrednictwem kilku mechanizmów: z czego najprostszy polega oddziaływaniu z amyloidem przez wiązanie przeciwciałami, tak aby zapobiegać nieprawidłowej agregacji. Jednakże, wiązanie przeciwciał może również prowadzić do usunięcia amyloidu przez komórki żerne (takie jak makrofagi i inne fagocytowe komórki) oraz przeciwciała mogą oddziaływać z innymi amyloidogennymi polipeptydami pośredniczącymi w tworzeniu amyloidu. Dalsza możliwość jest taka, że przeciwciała wiążą się z Αβ poza CNS (ośrodkowym układem nerwowym), przez co Aβ jest skutecznie usuwany z CNS poprzez prostą zasadę działania mas. Wyrażanie prowadzenie prezentacji... w układzie odpornościowym" ma oznaczać, że układ odpornościowy zwierzęcia jest poddany immunogennej prowokacji w kontrolowany sposób. Jak będzie zrozumiałe z ujawnienia poniżej, taka prowokacja układu odpornościowego może być uzyskiwana na wiele sposobów, z których najważniejsze to szczepienie polipeptydem zawartym w farmaszczepionkach" (ang. pharmaccines) (to jest szczepionkach, które są podawane do leczenia lub łagodzenia trwającej choroby) lub szczepienie farmaszczepionką" z kwasem nukleinowym. Ważnym wynikiem, który ma być osiągnięty, jest to, że kompetentne komórki odpornościowe u zwierzęcia są konfrontowane z antygenem w immunologicznie skuteczny sposób, podczas gdy precyzyjny sposób uzyskiwania tego wyniku ma mniejsze znaczenie w wynalazczej idei stanowiącej podstawę obecnego wynalazku. Termin immunogennie skuteczna ilość" ma swoje typowe w dziedzinie znaczenie, tj. jest to ilość immunogenu, który jest zdolny do indukowania odpowiedzi odpornościowej, która znacząco angażuje patogenne czynniki mające wspólne z immunogenem właściwości immunologiczne. Stosując wyrażenie, że APP lub Αβ został zmodyfikowany" tutaj rozumiane jest to jako chemiczna modyfikacja polipeptydu przeprowadzona w APP lub Αβ. Taką modyfikacją może, np., być utworzenie pochodnej (np. alkilacja) pewnych reszt aminokwasowych w sekwencji, lecz jak będzie można docenić z ujawnienia poniżej, korzystne modyfikacje zawierają zmiany pierwszorzędowej struktury sekwencji aminokwasowej. Omawiając autotolerancję wobec APP lub Αβ" zrozumiałe jest, że ponieważ polipeptyd jest białkiem własnym w populacji, która ma być szczepiona, normalne osobniki w populacji nie zwiększają odpowiedzi odpornościowej przeciwko polipeptydowi; nie można wykluczyć, jednakże, że sporadyczne przypadki osobników w populacji zwierząt mogą być w stanie uzyskać przeciwciała przeciwko natywnemu polipeptydowi, np. jako część zaburzeń autoimmunizacyjnych. W każdym razie, zwierzę będzie prawidłowo jedynie autotolerancyjne względem własnego APP lub Αβ, lecz nie można wykluczyć, że analogi pochodzące z innych gatunków zwierząt lub z populacji mających różne fenotypy mogą również być tolerowane przez to zwierzę. Obcy epitop limfocytu T" (lub obcy epitop komórki T") oznacza peptyd, który jest w stanie wiązać się z cząsteczką MHC i który stymuluje limfocyty T u gatunków zwierząt. Korzystnie obce epitopy limfocytów T według wynalazku są wspólnymi" (ang. promiscuous) epitopami, to jest epitopami, które wiążą się z zasadniczą frakcją szczególnej klasy cząsteczek MHC u gatunków lub populacji zwierząt. Jedynie bardzo ograniczona liczba takich wspólnych epitopów limfocytów T jest znana i zostaną one omówione szczegółowo poniżej. Wspólne epitopy limfocytów T są również oznaczone jako powszechne" (ang. universal) epitopy limfocytów T. Należy zauważyć, że aby immunogeny, które są stosowane w rozwiązaniach według wynalazku były skuteczne w tak dużym ułamku populacji zwierząt jak to możliwe, może być konieczne aby 1) wprowadzić kilka obcych epitopów limfocytów T w tym samym analogu lub 2) przygotować kilka analogów, gdzie każdy analog ma wprowadzony różny wspólny epitop. Należy zauważyć również, że idea obcych epitopów limfocytów T obejmuje ponadto zastosowanie ukrytych epitopów limfocytów T, to jest epitopów, które pochodzą z własnego białka
12 PL 215 125 B1 i które jedynie wykazuje immunogenne zachowanie, gdy występuje w wyodrębnionej postaci, nie będącej częścią rozpatrywanego własnego białka. Obcy epitop pomocniczego limfocytu T" (obcy epitop T H ) oznacza obcy epitop limfocytu T, który wiąże się z cząsteczką MHC z Klasy II i może być prezentowany na powierzchni komórki prezentującej antygen (APC) związanej z cząsteczką MHC klasy II. Część funkcjonalna" (bio)cząsteczki w obecnym kontekście ma oznaczać część cząsteczki, która jest odpowiedzialna za przynajmniej jedno z biochemicznych lub fizjologicznych działań wywoływanych przez cząsteczkę. Doskonale wiadomo w dziedzinie, że wiele enzymów i innych cząsteczek efektorowych ma aktywne miejsce, które jest odpowiedzialne za działania wywoływane przez tę cząsteczkę. Inne części cząsteczki mogą służyć do zwiększania stabilizacji lub rozpuszczania, i dlatego mogą być nieuwzględnione, jeśli te cele nie odnoszą się do kontekstu pewnych rozwiązań wynalazku. Na przykład, jest możliwe zastosowanie pewnych cytokin jako reszt modyfikujących w APP lub Αβ (patrz szczegółowe omówienie poniżej) i w takim przypadku, problem stabilności może nie mieć zastosowania, gdyż sprzęganie z APP lub Αβ może zapewnić konieczną stabilność. Termin adiuwant" ma swoje zwykłe znaczenie w dziedzinie szczepionek, i oznacza substancję lub kompozycję, która 1) sama nie jest zdolna do zwiększania specyficznej odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogennej szczepionce, lecz która 2) w każdym razie jest zdolna do wzmacniania odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi. Bądź, innymi słowy, szczepienie samym adiuwantem nie zapewnia odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi, szczepienie immunogenem może lub nie zapoczątkować odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi, lecz połączone szczepienie immunogenem i adiuwantem indukuje odpowiedź odpornościową przeciwko immunogenowi, która jest silniejsza niż ta indukowana przez sam immunogen. Ukierunkowanie" (ang. targeting) cząsteczki w obecnym kontekście ma oznaczać sytuację, w której cząsteczka w wyniku wprowadzenia do zwierzęcia będzie pojawiać się preferencyjnie w pewnej tkance(kach) lub będzie szczególnie związana z pewnymi komórkami lub typami komórek. Działanie może być uzyskane rożnymi sposobami obejmującymi preparat cząsteczki w kompozycji ułatwiającej ukierunkowanie, lub przez wprowadzenie do cząsteczki grupy, która ułatwia ukierunkowanie. Te problemy omówiono szczegółowo poniżej. Stymulacja układu odpornościowego" oznacza, że substancja lub kompozycja według wynalazku wykazuje ogólne, niespecyficzne immunostymulatorowe działanie. Wiele adiuwantów i domniemanych adiuwantów (takich jak pewne cytokiny) ma wspólną zdolność do stymulacji układu odpornościowego. Wynikiem stosowania czynnika immunostymulacyjnego jest zwiększenie czujności" układu odpornościowego oznaczające, że równoczesna lub kolejna immunizacja immunogenem indukuje znacząco bardziej skuteczną odpowiedź odpornościową w porównaniu do osobnego zastosowania immunogenu. Produktywne wiązanie" oznacza wiązanie peptydu z cząsteczką MHC (Klasy I lub II) tak, aby stymulować limfocyty T, które angażują komórkę, która prezentuje peptyd związany z cząsteczką MHC. Na przykład, peptyd związany z cząsteczką MHC klasy II na powierzchni APC jest uważany za produktywnie związany, jeśli ta APC będzie stymulować limfocyt T H, który wiąże się z prezentowanym kompleksem peptyd-mhc klasy II. Obniżanie poziomu amyloidu Korzystnie analog zastosowany jako immunogen w sposobie tu opisanym jest zmodyfikowaną cząsteczką APP lub Αβ, o przynajmniej jednej zmianie obecnej w sekwencji aminokwasowej APP lub Αβ, ponieważ w ten sposób szanse istotnego przełamania autotolerancji są znacząco zwiększone - jest to, na przykład, widoczne na podstawie wyników przedstawionych w przykładzie 2 w niniejszym opisie, w którym immunizacja cząsteczkami typu dzikiego Αβ jest porównana z immunizacją wariantem cząsteczki Αβ. Wykazano (w pracy Dalum I i wsp., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), że potencjalnie autoreaktywne limfocyty B, rozpoznające własne białka są fizjologicznie obecne u normalnych osobników. Jednakże, w celu indukowania tych limfocytów B, w celu rzeczywistego uzyskania przeciwciał reaktywnych z istotnymi własnymi białkami, konieczna jest pomoc od wytwarzających cytokiny pomocniczych limfocytów T (komórki T H lub limfocyty T H ). Normalnie pomoc ta nie jest dostarczona, ponieważ limfocyty T ogólnie nie rozpoznają epitopów limfocytów T pochodzących z własnego białka, gdy są prezentowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Jednakże, przez dostarczenie elementu obcości" we własnym białku (to jest przez wprowadzenie immunologicznie znaczącej modyfikacji), limfocyty T rozpoznające obcy element są aktywowane w wyniku rozpoznawania obcego epitopu na APC (takiego jak, początkowa jednojądrowa komórka). Poliklonalne limfocyty B (które są rów-