Badanie składników kwasów nukleinowych Cel ćwiczenia Ćwiczenie ma na celu poznanie niektórych reakcji barwnych charakterystycznych dla kwasów nukleinowych. Na ćwiczeniu zostaną wykonane reakcje pozwalające na wykrycie: pentozy (reakcja Biala), deoksyrybozy (reakcja Dischego), tyminy i reszty kwasu fosforowego. Wprowadzenie Kwasy nukleinowe są podstawowymi składnikami komórek zwierzęcych, roślinnych i drobnoustrojów. Występują one w jądrze komórkowym, chloroplastach, mitochondriach oraz w cytoplazmie. Wśród kwasów nukleinowych wyróżnia się: kwas deoksyrybonukleinowy (DNA), który stanowi informację genetyczną we wszystkich organizmach żywych (wyjątek wirusy RNA) oraz kwasy rybonukleinowe (RNA), które uczestniczą między innymi w ekspresji genów i biosyntezie białka. Kwasy nukleinowe są biopolimerami składającymi się z monomerów, zwanych nukleotydami. Nukleotyd, składa się z: cząsteczki cukru pentozy, zasady azotowej, oraz reszty kwasu fosforowego. Cukier wchodzący w skład nukleotydu to: ryboza (β-d-ryboza), charakterystyczna dla nukleotydów budujących kwasy rybonukleotydowe (RNA) lub deoksyryboza (β-d-2-deoksyryboza) występująca w cząsteczkach DNA. Obie cząsteczki cukru występują w formie hemiacetalowego pierścienia. Deoksyryboza różni się od rybozy tylko brakiem grupy hydroksylowej przy drugim atomie węgla w pierścieniu (rys 1). Rysunek 1. Wzory cukrów występujących w kwasach nukleinowych. Zasady azotowe występujące w kwasach nukleinowych są związkami organicznymi, heterocyklicznymi o charakterze aromatycznym. Zasady te to pochodne purynowe: adenina i guanina oraz pirymidynowe: cytozyna, tymina i uracyl. Zarówno w DNA, jak i RNA występują zasady purynowe adenina (6-aminopuryna) i guanina (2-amino-6- hydroksypuryna) oraz pochodna pirymidynowa cytozyna (2-hydroksy-4-1
aminopirymidyna). Poza tym w RNA występuje pochodna pirymidynowa uracyl (2,4- dihydroksypirymidyna), a w DNA pochodna pirymidynowa tymina (2,4-dihydroksy-5- metylopirymidyna). Wzory tych zasad są podane na rysunku 2. Rysunek 2. Wzory zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych. Zasada azotowa połączona z pentozą wiązaniem N-glikozydowym tworzy nukleozyd. Wyróżniamy następujące nukleozydy: adenozyna, guanozyna, cytydyna, tymidyna i urydyna. Na rysunku 3 pokazano przykładowe nukleozydy. Rysunek 3. Wzory nukleozydów występujących w kwasach nukleinowych. Nukleotydy należą do grupy estrów fosforanowych. Są to estry nukleozydów i kwasu fosforowego. Typowym miejscem estryfikacji jest grupa hydroksylowa przy piątym (C-5) atomie węgla pentozy. Ze względu na rodzaj pentozy wyróżniamy dwa typy nukleotydów: rybonukleotydy zawierają β-d-rybozę, a deoksyrybonukleotydy - β-d-2-deoksyrybozę. Natomiast w zależności od rodzaju zasady azotowej istnieje 5 typów nukleotydów: adenozyno-5'-monofosforan, guanozyno-5'-monofosforan, cytydyno-5'-monofosforan, tymidyno-5'-monofosforan, urydyno-5'monofosforan. Na rysunku 4 pokazano przykładowe nukleotydy. 2
Rysunek 4. Wzory nukleotydów występujących w kwasach nukleinowych. Sąsiednie nukleotydy w łańcuchach kwasów nukleinowych połączone są ze sobą wiązaniem 3,5 -fosfodiestrowym. W wiązaniu tym fosforan jest podwójnie zestryfikowany grupami hydroksylowymi cukru. Pierwsze wiązanie estrowe utworzone jest pomiędzy resztą fosforanową, a grupą hydroksylową przy C-3 pentozy jednego nukleotydu. Drugie wiązanie estrowe łączy ten sam fosforan z grupą hydroksylową przy C-5 pentozy następnego nukleotydu. Jest to kowalencyjne wiązanie reszty fosforanowej między grupą 5 - hydroksylową jednej rybozy i 3 hydroksylową następnej. Wyróżnia się dwa sposoby badania składników kwasów nukleinowych. Pierwszy z nich wymaga wcześniejszej hydrolizy tych związków do składników podstawowych, tj. do kwasu fosforowego, pentozy oraz zasady azotowej. Hydrolizę przeprowadza się z udziałem odczynników chemicznych lub enzymatycznie. Degradacja chemiczna zachodzi pod wpływem kwasów i zasad. DNA i oligodeoksyrybonukleotydy ulegają degradacji tylko w środowisku kwaśnym, natomiast RNA i oligorybonukleotydy zarówno w środowisku kwaśnym, jak i zasadowym. W przypadku środowiska alkalicznego, hydrolizie ulegają jedynie wiązania 3,5 -fosfodiestrowe między fosforanem, a grupą hydroksylową. Ponieważ hydroliza ta wymaga wytworzenia wiązania estrowego między fosforanem, a grupą hydroksylową w pozycji 2 cukru, ulega jej tylko RNA i oligorybonukleotydy. Chemicznie najczęściej wykonuje się hydrolizę traktując kwasy nukleinowe mocnymi kwasami mineralnymi np. 60 % kwasem nadchlorowym w temperaturze 100 C przez 1 godzinę. W takich warunkach w pierwszej kolejności hydrolizie ulega wiązanie N-glikozydowe miedzy puryną a pentozą. Uwalniane są wolne puryny i tzw. kwas apurynowy. Dalsza hydroliza prowadzi do rozpadu wiązania estrowego między pentozą, a resztą kwasu fosforowego w efekcie, czego uwalniany jest cukier i fosforan. Następnie hydrolizie ulegają wiązania fosfodiestrowe między nukleotydami zawierającymi zasady pirymidynowe. Pełna hydroliza 3
prowadzi do rozpadu wiązań N-glikozydowych miedzy zasadami pirymidynowymi, a pentozą i wiązań estrowych między tym cukrem a fosforanem. Całkowitą hydrolizę kwasów nukleinowych można też przeprowadzić stosując specyficzne enzymy. Nukleazy hydrolizują wiązanie 3,5 -fosfodiestrowe uwalniając pojedyncze nukleotydy, natomiast glikozydazy hydrolizują wiązania N-glikozydowe, prowadząc do odłączenia zasad azotowych od szkieletu cukrowo-fosforanowego. Fosforan może być uwolniony od reszty cukru przez działanie fosfataz, które hydrolizują wiązania estrowe. Wspólne działanie wszystkich tych enzymów prowadzi do otrzymania mieszaniny wolnych zasad azotowych (puryn i pirymidyn), fosforanu i cukru (β-d-rybozy lub β-d-2- deoksyrybozy). Reakcje barwne, wykonane na ćwiczeniach charakterystyczne dla hydrolizowanych preparatów kwasów nukleinowych to reakcje pozwalające wykryć obecność fosforanów oraz tyminy. Drugi sposób badania składników kwasów nukleinowych związany jest z wykonaniem reakcji barwnych bez konieczności ich hydrolizy. W niehydrolizowany preparacie kwasów nukleinowych można wykryć pentozy dzięki reakcji Biala oraz obecność β-d-2- deoksyrybozy wykonując reakcję Dischego. Odczynniki 1. Wodny roztwór kwasów nukleinowych. 2. 0,1 M NaOH 3. 60% w/o HClO 4 4. Odczynnik Biala 5. 1% w/o roztwór difenyloaminy 6. 10,6% w/o roztwór molibdenianu amonu 7. 5 M NaOH 8. 1,1% w/o Na 2 CO 3 9. Odczynnik diazowy 10. 3 M NaOH 11. 20% w/o roztwór hydroksyloaminy. 12. 96% w/o alkohol etylowy skażony 3% w/o acetonem. 4
Wykonanie Wszystkie barwne reakcje studenci wykonują na ćwiczeniach 4 godzinnych indywidualnie, na ćwiczeniach 3 godzinnych wykonują parami. Natomiast wytrącanie etanolem kwasów nukleinowych z roztworu wodnego oraz ich hydrolizę kwaśną w grupach czteroosobowych. 1. Wytrącanie etanolem kwasów nukleinowych z roztworu wodnego. Do cylindra o objętości 100 ml zawierającego 20 ml wodnego roztworu kwasów nukleinowych (1) został wlany po bagietce alkohol etylowy (12). Wytrącony w tych warunkach osad kwasów nukleinowych należy nawinąć na bagietkę, nadmiar alkoholu usunąć, przyciskając bagietkę z nawiniętym osadem do ścianki cylindra. Delikatnie obracając bagietkę rozpuścić preparat kwasów nukleinowych w 3 ml 0,1 M NaOH (2). Tak otrzymany preparat kwasów nukleinowych podzielić na dwie części. Do szklanej probówki odpipetować 1 ml kwasów nukleinowych i dodać 4 ml 0,1 M NaOH (2). Otrzymany w ten sposób rozcieńczony preparat zostanie wykorzystany do przeprowadzenia reakcji Biala i reakcji Dischego. Pozostałą część preparatu wykorzystać do hydrolizy. 2. Hydroliza kwasów nukleinowych. Do probówki zawierającej 2 ml roztworu kwasów nukleinowych w 0,1 M NaOH dodać 2 ml HClO 4 (3) (hydrolizat, próba pełna). Do drugiej probówki odpipetować 2 ml 0,1 M NaOH (2) i 2 ml HClO 4 (3) (próba odczynnikowa). Zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. Następnie obie probówki inkubować we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę, do probówek włożyć chłodniczki, które zapobiegają parowaniu zawartości probówek. Po zakończonej hydrolizie do czystej probówki odpipetować 2 ml hydrolizatu, a do kolejnej probówki 2 ml roztworu próby odczynnikowej, obie próby zobojętnić dodając 2 ml 5M NaOH (7). Zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. Otrzymane zobojętnione roztwory wykorzystać do wykonywania reakcji na obecność tyminy. Do pozostałych niezobojętnionych 2 ml hydrolizatu i 2 ml próby odczynnikowej dodać po 4 ml wody. Otrzymane w ten sposób zhydrolizowane, kwaśne roztwory wykorzystać do wykonania reakcji na obecność kwasu fosforowego. 3. Reakcje wykonywane na preparacie DNA niehydrolizowanym. a. Reakcja charakterystyczna dla pentoz reakcja Biala. W reakcji Biala pentozy połączone z zasadami purynowymi występujące w nukleotydach podczas ogrzewania z odczynnikiem Biala przekształcają się w furfural. Powstały furfural 5
tworzy z orcyną w obecności jonów Fe 3+ kompleks o trwałej barwie zielonej (rys. 5). W tych warunkach β-d-2-deoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej od rybozy. Rysunek 5. Reakcja Biala. Do dwóch probówek odmierzyć po 2,5 ml odczynnika Biala (4) i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml rozcieńczonego preparatu kwasów nukleinowych (próba pełna), do drugiej probówki 0,5 ml 0,1-M NaOH (2) (próba odczynnikowa). Zawartość obu probówek dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. b. Reakcja charakterystyczna dla β-d-2-deoksyrybozy reakcja Dischego. Reakcja Dischego pozwala odróżnić dwa typy kwasów nukleinowych (DNA i RNA). W środowisku kwaśnym deoksyryboza tworzy z difenyloaminą produkt kondensacji o barwie niebieskiej. Ta reakcja barwna jest konsekwencją powstania aldehydu ω- hydroksylewulinowego z β-d-2-deoksyrybozy pod wpływem działania kwasu siarkowego i octowego. Rysunek 6. Reakcja Dischego. 6
Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml rozcieńczonego preparatu kwasów nukleinowych (próba pełna), do drugiej probówki 0,5 ml 0,1 M NaOH (2) (próba odczynnikowa). Następnie do obu probówek dodać po 2 ml roztworu difenyloaminy (5), dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. 4. Reakcje wykonywane na preparacie hydrolizowanym DNA. a. Wykrywanie tyminy. Reakcja służąca do wykrywania tyminy, odróżniająca oba typy kwasów nukleinowych (DNA i RNA), polega ona na wytworzeniu przez tyminę z diazową pochodną kwasu sulfanilowego kompleksu o barwie czerwono-różowej, dodatek hydroksyloaminy, w środowisku zasadowym wzmacnia barwę kompleksu. Do dwóch probówek odmierzyć po 2,5 ml Na 2 CO 3 (8) i po 1 ml odczynnika diazowego (9), zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. Następnie do jednej z tych probówek dodać 0,5 ml zobojętnionego hydrolizatu kwasów nukleinowych (próba pełna), a do drugiej 0,5 ml zobojętnionego roztworu próby odczynnikowej, zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do obu probówek dodać po 1 ml 3 M NaOH (10) i 2-3 krople hydroksyloaminy (11), zawartość probówek dokładnie wymieszać i po 5 min obserwować zabarwienia roztworów w próbie pełnej i odczynnikowej. b. Wykrywanie reszt fosforanowych. Reakcja charakterystyczna dla fosforanów polega na łączeniu się molibdenianu amonu z jonem fosforanowym, w wyniku czego powstaje żółty osad fosfomolibdenianu amonu. Do jednej probówki odmierzyć 1 ml rozcieńczonego kwaśnego hydrolizatu kwasów nukleinowych, a do drugiej 1 ml rozcieńczonego kwaśnego roztworu próby odczynnikowej. Następnie do obu probówek dodać po 2 ml roztworu molidbenianu amonu (6), zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. Opracowanie wyników W sprawozdaniu należy podać otrzymane zabarwienia po przeprowadzeniu poszczególnych reakcji oraz opisać zasady metod wykorzystywanych w tych reakcjach. Wyjaśnić celowość wykonywania prób odczynnikowych. Pytania 1. Napisać i podać wzory zasad purynowych i pirymidynowych. Podać ich nazwy systematyczne. 7
2. Co to jest nukleozyd, a co nukleotyd? Jakie charakterystyczne typy wiązań w nich występują? Nazwać i przedstawić wzory nukleozydu i nukleotydu, zawierających odpowiednio β-d-rybozę i β-d-2-deoksyrybozę. 3. Z jakich jednostek strukturalnych zbudowany jest kwas deoksyrybonukleinowy, a z jakich kwas rybonukleinowy? 4. Jak można hydrolizować kwasy nukleinowe i w jaki sposób była wykonana hydroliza na ćwiczeniach? 5. Jakie związki uwalniają się w wyniku całkowitej hydrolizy DNA, a jakie po hydrolizie RNA? 6. Jakie reakcje charakterystyczne są wspólne dla DNA i RNA, a które pozwalają odróżnić te związki? Literatura: J. Marmur (1961) A procedure for the isolation of DNA from microorganisms. J Mol Biol 3: 208-218. Z. Dische, E.Borenfreund (1951) A new spectrophotometric method for the detection and determination of keto sugars and trioses. J. Biol. Chem. 192: 583-587. Z. Dische, E. Landsberg (1957) A color reaction of pentose phosphate esters substituted in position 5. Biochimica et Biophysica Acta 24: 193-195. G Miller, R Golder, E Miller (1951) Determination of Pentoses. Effect of Varying Proportions of Components of Bial's Color Reagent. Anal. Chem. 23: 903 905. G. Hunter (1936) A test for thymine, with observations on the keto-enolic type of diazo-test. Biochem J. 30: 745 749. 8