mgr inż. Monika Pawłowska

Politechnika Gdańska Wydział Chemiczny Katedra Technologii Leków i Biochemii Rozprawa doktorska ZMIANY W ODPOWIEDZI BIOLOGICZNEJ KOMÓREK NOWOTWOROWYCH INDUKOWANEJ PRZEZ POCHODNE AKRYDONU C-1311 I C-1305 WOBEC PODWYŻSZONEJ EKSPRESJI IZOENZYMÓW CYP3A4 I UGT1A10 mgr inż. Monika Pawłowska Opiekun pracy: dr Ewa Augustin Promotor: dr hab. inż Zofia Mazerska, prof. nadzw. PG Gdańsk 2014

Mamie za to, kim jestem, Tacie za pasję Mężowi za miłość, Synkowi za pokazanie sensu życia

Pragnę serdecznie podziękować: Mojemu Promotorowi, Pani Doktor Zofii Mazerskiej, za ukierunkowanie mojej pracy i pomoc w jej realizacji, za przekazaną wiedzę, cenne rady i życzliwość. Dziękuję również za ogromne wsparcie i wyrozumiałość w chwilach trudnych, niezwiązanych z pracą naukową. Pani Doktor Ewie Augustin, za przekazaną wiedzę i opiekę merytoryczną nad pracą, liczne dyskusje oraz wsparcie naukowe i osobiste, zwłaszcza w trudnych momentach. Pani Doktor Annie Radomińkiej-Pandya, za przekazany zapał do pracy i inspirację do dalszych badań, liczne i cenne rady oraz za życzliwość i uśmiech. Asi Koprowskiej, Agnieszce Potędze, Basi Borowej-Mazgaj i Basi Fedejko-Kap, za wspólne spędzony czas, pomoc w pracy laboratoryjnej, liczne dyskusje naukowe i nie tylko, wsparcie duchowe oraz, po prostu, za przyjażń. Pozostałym członkom Zespołu, zwłaszcza Magdzie Niemira i Ani Skwarskiej, jak również Marcinowi Serockiemu, za życzliwość, pomoc oraz wesołą i miłą atmosferę pracy Szczególne podziękowania kieruje mojej kochanej Mamie, za jej bezgraniczną miłość, cierpliwość i opracie, jakie mi zawsze w życiu dawała. Tacie, który zaraził mnie pasją do biologii, przyrody i sztuki. Moim wspaniałym Teściom, Halinie i Arturowi Pawłowskim, za ich pomoc, dobrą radę, uśmiech i troskę w każdym momencie. Dziękuję mojemu kochanemu Mężowi, za jego miłość i nieustającą wiarę we mnie oraz za to, że zawsze przy mnie jest. Mojemu Synkowi, za pokazanie sensu życia.

Streszczenie Streszczenie Na aktywność i skuteczność działania leków przeciwnowotworowych wpływ ma wiele czynników. Zależą one między innymi od indywidualnego u pacjenta poziomu białek odpowiedzialnych za metabolizm i usuwanie leku poza komórkę, interakcji lek-lek czy od wpływu leku na białka zaangażowane w biotransformację związków oraz szlaki związane z przeżyciem i śmiercią komórki. Pochodne imidazoakrydonu C-1311 i triazoloakrydonu C-1305 to związki o działaniu przeciwnowotworowym, przy czym pierwszy z nich dotarł do II fazy badań klinicznych na pacjentkach z przerzutowym rakiem piersi, zaś drugi jest w zaawansowanych badaniach przedklinicznych. Oba związki sieciują DNA i są inhibitorami topoizomerazy II. W ich metabolizm bezpośrednio nie są zaangażowane enzymy cytochromu P450 (CYP), choć aktywność CYP1A2 i CYP3A4 jest przez nie hamowana. Pochodne C-1305 i C-1311 stanowią substraty dla enzymów z grupy monooksygenaz flawinowych (FMO1 i FMO3) oraz UDPglukuronylotransferaz (głównie UGT1A10). W opracowaniu skutecznej terapii przeciwnowotworowej istotnym jest dokładne poznanie mechanizmu działania związku z uwzględnieniem przemian metabolicznych, jakim on podlega, biorąc również pod uwagę osobnicze różnice w ekspresji białek zaangażowanych w te szlaki. W związku z powyższymi przesłankami założeniem niniejszej pracy doktorskiej jest hipoteza, że podwyższony poziom enzymów metabolizujących może mieć wpływ na odpowiedź komórkową indukowaną przez związki C-1305 i C-1311 w komórkach nowotworowych, nie tylko poprzez działanie podwyższonego stężenia metabolitów pochodnych, ale również poprzez wpływ ekspresji enzymów na poziom innych białek i metabolizm związków endogennych zaangażowanych w funkcjonowanie komórki. Stąd celem pracy było zbadanie wpływu nadekspresji izoenzymu CYP3A4 i UGT1A10 na metabolizm i cytotoksyczność pochodnych C-1305 i C-1311 oraz odpowiedź komórkową przez nie indukowaną. Techniki laboratoryjne jakie w realizacji powyższego celu zastosowałam w swych badaniach to: mikroskopia świetlna i fluorescencyjna, cytometria przepływowa, elektroforeza agarozowa, Western blotting, Real-Time PCR, wysokosprawna chromatografia cieczową, HPLC, spektrometria mas oraz elektroporacja i transfekcja. W początkowym etapie pracy skupiłam się na ocenie możliwości hodowli komórek nowotworowych transfekowanych wektorami białek metabolizujących leki. Do wstępnych badań roli podwyższonego poziomu izoenzymu CYP3A4 wybrałam gotowy model komórkowy oparty o komórki jajnika chomika chińskiego, CHO o wysokiej i stabilnej ekspresji nie tylko izoenzymu CYP3A4, ale również reduktazy cytochromu P450. Z kolei wpływ ekspresji izoenzymu UGT1A10 na metabolizm i odpowiedź komórkową indukowaną przez związki C-1305 i C-1311 badałam w komórkach KB-3, subklonie komórek HeLa. Przejściowo podwyższony poziom izoenzymu

Streszczenie CYP3A4 i UGT1A10 uzyskałam również w komórkach linii MCF-7, H460 i A549. Ważnym etapem pracy było opracowanie komórek MCF-7 o stabilnej nadekspresji izoenzymu CYP3A4 i UGT1A10, które posłużyły do badania wpływu tychże enzymów na metabolizm związków C-1305 i C-1311, ich cytotoksyczność i indukowaną odpowiedź komórkową. Komórki takie są dobrym modelem do badań oddziaływania związków na wewnątrzkomórkowe szlaki związane z biotransformacją leków i związków endogennych, usuwaniem metabolitów poza komórkę oraz śmiercią komórkową. Wykazałam, że C-1305 i C-1311 ulegały glukuronidacji w komórkach CHO i A549 zawierających endogenne enzymy UGT oraz w komórkach KB-3, MCF-7 i H460 po wprowadzeniu do nich izoenzymu UGT1A10. Glukuronidy związków były szybko usuwane poza komórkę i tam ich stężenie było najwyższe. Co więcej, w warunkach stabilnej nadekspresji izoenzymu UGT1A10 glukuronidacja związku C-1305 i jego wydalanie zachodziły znacznie szybciej niż przy przejściowej ekspresji enzymu. Dla C-1311 takiego zjawiska nie obserwowałam. Pochodna imidazoakrydonu C-1311 w warunkach komórkowych (komórki CHO i HepG2) hamowała aktywność izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450, podobnie jak w układach bezkomórkowych, i nie wpływała na jego poziom. W kolejnej części pracy wykazałam, że wpływ badanych związków na odpowiedź komórkową jest zróżnicowany w zależności od typu linii komórkowej. W komórkach CHO pod wpływem działania pochodnej imidazoakrydonu C-1311 dochodziło do bloku cyklu życiowego w fazie G2/M, a ich DNA ulegało degradacji. Uszkodzenie materiału genetycznego prowadziło do indukcji katastrofy mitotycznej, nieprawidłowego przebiegu mitozy, których wynikiem było uruchomienie apoptozy i śmierć komórek. W niewielkim stopniu dochodziło również do onkozy/nekrozy. Komórki CHO o nadekspresji reduktazy cytochromu P450 samej lub w koekspresji z izoenzymem CYP3A4, które nie podlegały śmierci na skutek działania C-1311, ulegały przyspieszonemu starzeniu komórkowemu. W komórkach KB-3 poddanych ekspozycji na C-1305 i C-1311 obserwowałam ich akumulację w fazie S, a następnie zatrzymanie w fazie G2. Degradacja DNA w komórkach KB-3 skutkowała indukcją apoptozy zależnej od kaspazy-3. Z kolei pochodna triazoloakrydonu C-1305 w komórkach MCF-7 prowadziła do silnego zahamowania proliferacji komórek, nie wpływając na ich cykl życiowy i powodując śmierć nekrotyczną w niewielkiej populacji komórek, podczas gdy pochodna imidazoakrydonu C-1311 w komórkach MCF-7 indukowała akumulację komórek w fazie G2/M, degradację DNA oraz śmierć na drodze onkozy. Najważniejszym celem pracy było zbadanie wpływu ekspresji enzymów metabolizujących w komórkach na właściwości cytotoksyczne pochodnych triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 oraz odpowiedź komórkową przez nie indukowaną. Otrzymane wyniki pozwoliły na wyciągnięcie następujących wniosków: (i) wysoka ekspresja reduktazy cytochromu P450 w komórkach CHO poddanych ekspozycji na C-1311 odpowiedzialna była za zwiększoną generację reaktywnych form tlenu, co w konsekwencji

Streszczenie podwyższało cytotoksyczność związku i indukcję śmierci. (ii) nadekspresja izoenzymu CYP3A4 prowadziła do zwiększenia właściwości cytotoksycznych i antyproliferacyjnych pochodnych akrydonu w komórkach CHO, MCF-7, H460 i A549, jak również do indukcji śmierci komórkowej w większej populacji komórek CHO i MCF-7. (iii) glukuronidacja pochodnych C-1305 i C-1311 w obecności izoenzymu UGT1A10 prowadziła do zmiany aktywności cytotoksycznej związków wobec komórek KB-3, MCF-7 i H460 oraz, co istotne, również do zmiany odpowiedzi biologicznej komórek KB-3 i MCF-7 traktowanych tymi związkami; przy czym glukuronid C-1305 był bardziej cytotoksyczny od substratu i indukował apoptozę w większej populacji komórek, co jest obserwacją unikalną, natomiast glukuronid C-1311, w porównaniu z substratem charakteryzowała niższa aktywność cytotoksyczna i słabsza indukcja śmierci komórkowej. Otrzymane w ramach pracy doktorskiej wyniki badań wzbogaciły wiedzę na temat dwóch potencjalnych leków przeciwnowotworowych, ukazując unikalne właściwości jednego z nich, triazoloakrydonu C-1305. Wykazały, że istnieją zależności pomiędzy poziomem enzymów biorących udział w metabolizmie leków a szlakami zaangażowanymi w proliferację komórki, jej śmierć oraz procesy związane z usuwaniem leków poza komórkę. Zależności te muszą być uwzględnione przy projektowaniu nowych analogów związków C-1305 i C-1311 i ewentualnie przy opracowaniu schematów terapii w badaniach klinicznych

Wykaz ważniejszych skrótów Wykaz ważniejszych skrótów A549 AhR linia komórkowa ludzkiego niedrobnokomórkowego raka płuc aryl hydrocarbon receptor, receptor węglowodorów arylowych C-1305 5-dimetyloaminopropyloamino-8-hydroksytriazoloacrydon C-1311 5-dietyloaminoetyloamino-8-hydroksyimidazoakrydon CHO CHO-WT CHO-HR CHO-HR-3A4 CYP CPR DAPI FDA Chinese hamster ovary cell line, linia komórkowa unieśmiertelnionych komórek jajnika chomika chińskiego unieśmiertelnione komórki jajnika chomika chińskiego typu dzikiego unieśmiertelnione komórki jajnika chomika chińskiego z nadekspresją genu kodującego reduktazę cytochromu P450 unieśmiertelnione komórki jajnika chomika chińskiego z nadekspresją genów kodujących reduktazę cytochromu P450 i izoenzym CYP3A4 izoenzym cytochromu P450 cytochrome P450 reductase, reduktaza cytochromu P450 4',6-diamidyno-2-fenyloindol fluorescein diacetate, dioctan fluoresceiny FLT3 Fms-like tyrosine kinase 3, Fms-podobna kinaza tyrozynowa 3 FMO GFP GSH GST H460 HepG2 flavin-containing monooxygenase, monooksygenaza flawinowa green fluorescent protein, białko zielonej fluorescencji glutathione, zredukowany L-glutation gluthation S-transferase, S-transferaza glutationowa linia komórkowa ludzkiego wielkokomórkowego raka płuc human hepatocellular carcinoma cell line, linia komórkowa ludzkiego nowotworu wątroby Hep3A4 linia komórkowa ludzkiego nowotworu wątroby z nadekspresją genu izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450

Wykaz ważniejszych skrótów KB-3 subklon komórek HeLa, linii komórkowej ludzkiego raka szyjki macicy, o zwiększonej oporności na cytostatyki MCF-7 linia komórkowa ludzkiego raka piersi, wyprowadzona z komórek pobranych w Michigan Cancer Insitute (stąd nazwa) MCF-7-WT MCF-7-EV linia komórkowa MCF-7 typu dzikiego linia komórkowa MCF-7 stabilnie transfekowane wektorem zerowym, niekodującym żadnego białka MCF-7-CYP3A4 linia komórkowa MCF-7 z nadekspresją genu kodującego izoenzym CYP3A4 cytochromu P450 MCF-7-UGT1A10 linia komórkowa MCF-7 z nadekspresją genu kodującego izoenzym UGT1A10 UDP-glukuronylotransferazy MDA-MB-231 MDR PI PXR ROS RTK SULT UDP UGT XRE linia komórkowa ludzkiego raka piersi multidrug resistance, białko oporności wielolekowej propidium iodide, jodek propidyny pregnane X receptor, receptor pregnanu X reactive oxygen species, reaktywne formy tlenu receptor tyrosine kinase, reptor kinaz tyrozynowych sulphotransferase, sulfotransferaza kwas urydyno-5 -difosfo-d-glukuronowy UDP-glucuronsyltransferase, UDP-glukuronylotransferaza xenobiotic response element, element odpowiedzi na ksenobiotyki

Spis treści Spis treści 1 Wprowadzenie... 1 1.1 Krótka charakterystyka badanych związków... 3 1.2 Molekularny mechanizm działania pochodnych C-1311 i C-1305... 4 1.3 Biologiczny mechanizm działania związków... 5 1.4 Metabolizm pochodnych C-1311 i C-1305... 6 2 Część teoretyczna... 8 2.1 Ekspresja enzymów metabolizujących ksenobiotyki a odpowiedź komórkowa 8 2.1.1 Izoenzymy cytochromu P450... 9 2.1.2 Reduktaza cytochromu P450... 20 2.1.3 UDP-glukuronylotransferazy (UGT)... 22 2.1.4 Sulfotransferazy (SULT)... 24 2.2 Systemy ekspresyjne enzymów metabolizujących... 26 2.2.1 Pierwsze modele komórkowe o stabilnej ekspresji ludzkich białek metabolizujących ksenobiotyki... 27 2.2.2 Ssacze modele komórkowe o podwyższonej ekspresji enzymów metabolizujących ksenobiotyki... 30 2.2.3 Ludzkie linie komórkowe z nadekspresją białek metabolizujących leki... 34 2.3 Podsumowanie... 41 3 Założenia, cel i zakres pracy... 42 3.1 Założenia pracy... 42 3.2 Cel i zakres pracy... 45 4 Część doświadczalna... 49 4.1 Materiały... 49 4.1.1 Związki przeciwnowotworowe... 49 4.1.2 Odczynniki chemiczne... 49 4.1.3 Barwniki... 49 4.1.4 Markery... 50 4.1.5 Enzymy... 50 4.1.6 Gotowe zestawy analityczne... 50 4.1.7 Bufory... 51 4.1.8 Roztwory i bufory do elektroforezy poliakrylamidowej... 51 4.1.9 Przeciwciała, bufory i inne materiały do techniki Western blotting... 52 4.1.10 Plazmidy i materiały potrzebne do transfekcji... 53 4.1.11 Linie komórkowe i materiały potrzebne do prowadzenia hodowli... 53 4.2 Wykorzystana aparatura... 55 4.3 Metody doświadczalne... 57 4.3.1 Hodowla komórek... 57 4.3.2 Określenie cytotoksyczności pochodnych C-1305 i C-1311... 58 4.3.3 Analiza dystrybucji komórek w cyklu życiowym... 60 4.3.4 Badanie odpowiedzi komórkowej indukowanej przez związki... 61 4.3.5 Badanie poziomu białek zaangażowanych w cykl komórkowy i indukcję apoptozy w komórkach KB-3 traktowanych związkiem C-1305 i C-1311 metodą Western blotting. 66 4.3.6 Analiza poziomu enzymów metabolizujących metodą Western blotting... 67

Spis treści 4.3.7 Analiza aktywności katalitycznej izoenzymu CYP3A4 z zastosowaniem techniki HPLC 68 4.3.8 Badanie metabolizmu związków C-1305 i C-1311 zachodzącego w komórkach z zastosowaniem techniki HPLC... 69 4.3.9 Badanie generacji reaktywnych form tlenu (ROS)... 70 4.3.10 Namnożenie, oczyszczenie i przygotowanie plazmidów do transfekcji komórek ssaczych... 71 4.3.11 Transfekcja komórek... 73 4.3.12 Otrzymanie komórek o stabilnej nadekspresji enzymów metabolizujących... 74 4.3.13 Badanie poziomu ekspresji genów metodą Real-time PCR... 74 4.3.14 Analiza statystyczna wyników... 76 5 Wyniki... 77 5.1 Badanie odpowiedzi biologicznej i metabolizmu w komórkach CHO traktowanych pochodną C-1311... 77 5.1.1 Określenie dawki biologicznie czynnej pochodnej C-1311 wobec komórek jajnika chomika chińskiego CHO... 77 5.1.2 Analiza dystrybucji komórek CHO w cyklu życiowym... 79 5.1.3 Obserwacje mikroskopowe morfologii komórek CHO... 84 5.1.4 Badanie zmian w budowie błony cytoplazmatycznej komórek CHO... 89 5.1.5 Cytometryczna analiza aktywności kaspazy-3 w komórkach CHO... 94 5.1.6 Badanie fragmentacji DNA przy wykorzystaniu elektroforezy agarozowej... 97 5.1.7 Identyfikacja żywych/martwych komórek CHO po traktowaniu C-1311... 98 5.1.8 Badanie procesu starzenia komórkowego w komórkach CHO... 101 5.1.9 Zdolność komórek CHO traktowanych C-1311 do powrotu do proliferacji... 104 5.1.10 Badanie przemian metabolicznych pochodnej C-1311 w komórkach CHO... 105 5.1.11 Generowanie przez C-1311 reaktywnych form tlenu w komórkach CHO... 106 5.2 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom i aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach CHO...110 5.2.1 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom białka CYP3A4... 110 5.2.2 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach CHO przy zastosowaniu techniki HPLC... 112 5.3 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom i aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach HepG2...114 5.3.1 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom białka CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4... 114 5.3.2 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na aktywność białka CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4... 115 5.4 Badanie metabolizmu i odpowiedzi biologicznej w komórkach KB-3 traktowanych pochodnymi C-1305 oraz C-1311...118 5.4.1 Transfekcja komórek KB-3 określenie ekspresji białka GFP... 119 5.4.2 Transfekcja komórek KB-3 określenie poziomu mrna kodującego białka UGT1A10 i UGT2B4... 120 5.4.3 Metabolizm pochodnych C-1305 i C-1311 w komórkach KB-3... 121 5.4.4 Określenie dawki efektywnej pochodnych C-1305 i C-1311 wobec ludzkich komórek raka szyjki macicy, KB-3... 125 5.4.5 Analiza dystrybucji komórek KB-3 w cyklu życiowym... 128 5.4.6 Badanie poziomu białek zaangażowanych w cykl komórkowy i indukcję apoptozy w komórkach KB-3 metodą Western blot... 132 5.4.7 Obserwacje mikroskopowe morfologii jąder komórek KB-3... 134 5.4.8 Identyfikacja żywych/martwych komórek KB-3 traktowanych związkami... 138

Spis treści 5.5 Badanie metabolizmu i cytotoksyczności w komórkach wybranych ludzkich linii nowotworowych o przejściowej nadekspresji CYP3A4 i UGT1A10 traktowanych pochodnymi C-1305 oraz C-1311... 141 5.5.1 Transfekcja komórek linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 analiza ekspresji białka GFP... 142 5.5.2 Transfekcja komórek MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 określenie aktywności katalitycznej izoenzymu CYP3A4... 144 5.5.3 Przemiany metaboliczne pochodnych C-1305 i C-1311 w komórkach linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549... 145 5.5.4 Cytotoksyczność pochodnych C-1305 i C-1311 wobec komórek linii: MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549... 153 5.6 Badanie metabolizmu i odpowiedzi biologicznej w komórkach MCF-7 o stabilnej nadekspresji CYP3A4 i UGT1A10 traktowanych pochodnymi C-1305 oraz C-1311... 156 5.6.1 Otrzymanie komórek MCF-7 o stabilnej nadekspresji izoenzymów CYP3A4 i UGT1A10... 156 5.6.2 Przemiany metaboliczne pochodnych C-1305 i C-1311 w komórkach MCF-7. 158 5.6.3 Cytotoksyczność C-1305 i C-1311 wobec komórek MCF-7... 161 5.6.4 Analiza dystrybucji w cyklu życiowym komórek MCF-7... 163 5.6.5 Identyfikacja żywych/martwych komórek MCF-7 traktowanych związkami... 166 5.6.6 Obserwacje mikroskopowe jąder komórek MCF-7... 168 5.6.7 Zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek MCF-7... 172 6 Dyskusja wyników i wnioski... 176 7 Skrócony opis przeprowadzonych badań... 197 8 Literatura... 202

Wprowadzenie 1 1 Wprowadzenie Choroby nowotworowe to druga, zaraz po chorobach układu krążenia, najczęstsza przyczyna śmierci, na którą z roku na rok umiera coraz więcej osób. Opracowanie skutecznego leku przeciwnowotworowego jest zatem jednym z największych wyzwań, przed którymi stanęła współczesna medycyna. Osiągnięcie tego celu jest ogromnie istotne, ale również niezwykle trudne ze względu na skomplikowaną naturę rozwoju choroby. Nowotwór powstaje wówczas, gdy zdrowa komórka ulega różnym zmianom, w wyniku których zaczyna ona rosnąć i dzielić się w niekontrolowany sposób. Cały proces nowotworzenia porównuje się do teorii ewolucji Darwina jest on długotrwały i wymaga wielu zmian, by komórka w pełni się usamodzielniła i przestała odpowiadać na sygnały zewnętrzne. Robert Weinberg podaje sześć takich zmian: uniezależnienie komórki od sygnałów wzrostowych, brak wrażliwości na sygnały hamujące proliferację, unikanie apoptozy, nieograniczony potencjał replikacyjny, podtrzymywanie angiogenezy oraz inwazja tkanek i przerzutowanie [Hanahan i Weinberg, 2011]. Nie wszystkie z tych procesów muszą się pojawić, aby rozwinęła się choroba nowotworowa. Różna jest także kolejność zachodzenia tych zmian procesy te zależą od typu i miejsca powstającego nowotworu. Szybkie zdiagnozowanie choroby na jej wczesnym etapie jest bardzo trudne, ponieważ początkowo zmiany te mogą być wykryte jedynie na poziomie molekularnym. W przypadku wykrycia nowotworu, często jedyną metodą jego zwalczenia jest chemii oterapia, czyli podanie pacjentowi właściwych leków cytostatycznych. Może to być terapia z wykorzystaniem jednego chemoterapeutyku. Najczęściej jednak stosuje się kombinację preparatów podawanych w tym samym czasie, bądź kolejno po sobie. Dotychczas nie stworzono leku, który byłby w pełni skuteczny w walce z większością typów nowotworów oraz bezpieczny dla pacjenta. Ponadto, każdy z pacjentów ze względu na różnice osobnicze reaguje na zastosowaną terapię w odmienny sposób, co często wynika z polimorfizmu i różnej ekspresji enzymów metabolizujących ksenobiotyki oraz białek kontrolujących cykl komórkowy. Komórki nowotworowe są trudnym i mało specyficznym celem terapeutycznym. Są bardzo podobne do zdrowych komórek pacjenta. Różnice, jakie można między nimi zaobserwować, są niewielkie, co utrudnia stworzenie chemoterapeutyków o wysokiej selektywnej aktywności. Dlatego leki cytostatyczne uszkadzają nie tylko komórki nowotworowe, ale również zdrowe. Celem współczesnej terapii przeciwnowotworowej jest więc stworzenie leku nie tylko o wysokim potencjale terapeutycznym, ale również o obniżonej toksyczności, skierowanego bezpośrednio na komórki nowotworowe i uwzględniającego różnice osobnicze pacjentów. W osiągnięciu powyższych celów mogą pomóc nowe terapie bazujące na immunologii i biologii molekularnej. W terapiach tych wykorzystuje się metody leczenia oparte na

Wprowadzenie 2 przeciwciałach monoklonalnych, inhibitorach transdukcji sygnału, inhibitorach angiogenezy oraz induktorach apoptozy. W połączeniu z tradycyjnymi chemoterapeutykami zabijającymi komórki rakowe, powinny one podnieść skuteczność leczenia, będąc przedmiotem tzw. terapii celowanej (ang. target therapy). Dodatkowo, próbuje się łączyć tradycyjne cytostatyki oraz toksyny i radioizotopy z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko receptorom powierzchniowym komórki, które ulegają nadekspresji w wielu rodzajach nowotworów. Przeciwciała monoklonalne selektywnie łączące się z komórkami nowotworowymi można także wykorzystać do koniugacji z enzymem metabolizującym, który zaktywuje podany pacjentowi prolek. W ten sposób aktywna forma chemoterapeutyku powstanie tylko w miejscu związania się przeciwciała, czyli w tkance nowotworowej [Jain i wsp., 2007]. Odmienny u każdego pacjenta metabolizm i detoksykacja leków przeprowadzane przez liczne w komórce enzymy stały się podstawą do podjęcia prób opracowania tzw. terapii ukierunkowanej (ang. directed therapy lub genotype-directed therapy). Polega ona na zbadaniu u chorego pacjenta ekspresji białek biorących udział w trzech fazach metabolizmu leków i indukcji śmierci komórkowej. W zależności od ekspresji tych białek i ich aktywności następuje zaplanowanie schematu terapii przeciwnowotworowej, co podwyższy jej skuteczność. Takie działanie stosuje się już dla jednego z leków przeciwnowotworowych irinotekanu [O Dwyer i Catalano, 2006] oraz planuje się zastosować w terapiach opartych o stosowanie tamoksyfenu. Irinotekan ulega dezaktywacji i szybkiej detoksykacji poprzez glukuronidację przeprowadzaną głównie przez izoenzym UDP-glukuronylotransferazy UGT1A1. U osób z wariantem *28 enzymu UGT1A1 lek jest dużo wolniej usuwany z organizmu, dlatego tacy pacjenci powinni otrzymywać zmniejszoną dawkę leku. Dodatkowo wykazano, że uzależnianie dawki irinotekanu od aktywności enzymatycznej izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 podnosi skuteczność leczenia i zmniejsza ryzyko neurotropenii [van der Bol i wsp., 2010]. Z kolei w aktywacji drugiego wspomnianego leku, tamoksyfenu, najważniejszą rolę odgrywa izoenzym CYP2D6 cytochromu P450, którego polimorfizm również znacząco wpływa na końcowy efekt terapii [Supernat i wsp., 2010]. Dziedzina nauki zajmująca się badaniem zależności między różnymi wariantami pojedynczych genów a odpowiedzią chorego na lek nosi nazwę farmakogenetyki. Pokrewnym działem nauki, również z pogranicza farmakologii i genetyki jest farmakogenomika, skupiającą się na wpływie całego genomu na efekt terapeutyczny danego leku. Nauki te są podstawą wdrażania w życie spersonalizowanej terapii ukierunkowanej. Co więcej, wykazano, że w tkance zdrowej i nowotworowej poziom ekspresji enzymów metabolizujących jest różny. Tak więc kolejnymi niezbędnymi badaniami do wprowadzenia terapii ukierunkowanej jest dokładne zbadanie metabolizmu leków, ich oddziaływania na enzymy metabolizujące oraz wpływ na szlaki sygnalizacyjne i indukcję śmierci komórkowej. Określenie zależności między nadekspresją wybranych enzymów metabolizujących a odpowiedzią biologiczną komórek nowotworowych indukowaną przez zsyntetyzowane

Wprowadzenie 3 w naszej Katedrze związki przeciwnowotworowe było celem niniejszej pracy doktorskiej. Podjęty temat wpisuje się zatem w zakres opisanej wyżej dziedziny nauki, farmakogenomiki. Do badań wybrano dwa związki: pochodną imidazoakrydonu, C-1311, która dotarła do II fazy badań klinicznych na pacjentkach z przerzutowym rakiem piersi oraz pochodną triazoloakrydonu, C-1305, znajdującą się w zaawansowanych badaniach przedklinicznych. Enzymy metabolizujące, których zmieniona ekspresja mogłaby odgrywać znaczącą rolę w terapii z zastosowaniem powyższych potencjalnych chemoterapeutyków, to: izoenzym CYP3A4 cytochromu P450, będący celem molekularnym obu związków i ulegający pod ich wpływem inhibicji oraz UDP-glukuronylotransferaza UGT1A10, która jest bezpośrednio zaangażowana w II fazę metabolizmu obu pochodnych. 1.1 Krótka charakterystyka badanych związków Pochodne imidazoakrydonu C-1311 oraz triazoloakrydonu C-1305 zostały zsyntetyzowane w Katedrze Technologii Leków i Biochemii Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej w zespole kierowanym przez prof. Jerzego Konopę. Były to kolejne grupy związków opracowane po tym, jak jeden spośród pierwszych związków zsyntetyzowanych w Katedrze, Ledakrin (Ledacrine, Nitracrine, C-283), pochodna 1-nitroakrydyny, został zatwierdzony do stosowania w klinice u pacjentów z nowotworem jajników, otrzewnej oraz niektórych typów raka skóry. Jest to, jak do tej pory, jedyny polski oryginalny lek, który był stosowany u chorych. Po kilku latach podawania go pacjentom lek okazał się zbyt toksyczny i został wycofany z kliniki. Przy opracowywaniu kolejnych grup pochodnych akrydyny, zamierzano stworzyć związki, które posiadałyby podobną aktywność cytotoksyczną jak C-283 i nie wykazywałyby kardiotoksyczności charakterystycznych dla adriamycyn. Tymi właściwościami charakteryzują się przedstawiane pochodne C-1311 oraz C-1305. Oba związki zostały zsyntetyzowane przez dr W. M. Chołodego [Chołody i wsp., 1990a, 1990b, 1992). C-1311 (5-dietylaminoetyloamino-8-hydroksyimidazoakrydon) wykazywał wysoką aktywność wobec eksperymentalnych modeli mysiego i ludzkiego nowotworu okrężnicy in vitro, jak również u zwierząt [Chołody i wsp., 1990b; Burger i wsp., 1996]. Związek pomyślnie przeszedł I fazę badań klinicznych, gdzie był badany na pacjentach z zaawansowanymi nowotworami litymi [Thomas i wsp., 2008; Isambert i wsp., 2010]. Był również efektywny w badaniach II fazy badań klinicznych na pacjentkach z przerzutowym rakiem piersi [Capizzi i wsp., 2008]. Drugi związek, C-1305 (5-dimetyloaminopropyloamino-8-hydroksytriazoloakrydon) również wykazywał wysoką aktywność wobec eksperymentalnych modeli nowotworów u myszy, głównie białaczek i nowotworów jelita grubego [Chołody i wsp., 1990a; Kuśmierczyk i wsp., 1994]. Został on wyselekcjonowany do badań przedklinicznych.

Wprowadzenie 4 O H N N O H N N HO HO N N C-1311 N N N C-1305 Rysunek 1 Struktury chemiczne badanych pochodnych: imidazoakrydonu, C-1311 i triazoloakrydonu, C-1305 [Chołody i wsp., 1990a, 1990b] 1.2 Molekularny mechanizm działania pochodnych C-1311 i C-1305 Pochodne C-1311 i C-1305 należą do związków, których molekularny i cytotoksyczny mechanizm działania oparty jest o uszkodzenie DNA. C-1311 oddziałuje na DNA w różny sposób. Łączy się z DNA niekowalencyjnie, za pomocą interkalacji, wchodząc w mniejszą bruzdę helisy DNA [Burger i wsp., 1999; Dzięgielewski i wsp., 2002; Mazerski i Muchewicz, 2000] oraz kowalencyjnie, po uprzedniej metabolicznej aktywacji enzymatycznej oksydacji związku [Dzięgielewski i Konopa, 1998; Mazerska i wsp., 2001]. W przeciwieństwie do procesu interkalacji C-1311 z DNA, tworzące się addukty związek-dna są odpowiedzialne za właściwości cytotoksyczne chemoterapeutyku. Co istotne, kowalencyjne wiązanie się związku z DNA może zajść tylko po jego wcześniejszej interkalacji i metabolicznej aktywacji [Mazerska i wsp., 2001]. Konsekwencją obu procesów jest wewnątrzcząsteczkowe sieciowanie DNA przez C-1311 [Dzięgielewski i Konopa, 1996; Konopa i wsp., 2005], które jest jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za aktywność przeciwnowotworową związku. Warto nadmienić, że C-1311 ulegając oksydacyjnej aktywacji w obecności peroksydaz, czego następstwem jest N-dealkilacja łańcucha bocznego, tworzy metabolit o strukturze dimeru [Mazerska i wsp., 2001; 2003]. Tworzenie się dimeru w warunkach in vitro odzwierciedla potencjalną wysoką reaktywność związku w warunkach komórkowych, in vivo, czego wynikiem może być tworzenie się kowalencyjnych wiązań z wewnątrzkomórkowymi nukleofilami: nie tylko kwasami nukleinowymi, ale również białkami. Kolejnym celem molekularnym C-1311 jest topoizomeraza II związek jest inhibitorem tego enzymu. Pochodna stymuluje formowanie kowalencyjnego kompleksu DNA-enzym, a następnie stabilizuje powstały kompleks rozszczepialny [Składanowski i wsp., 1996]. Wykazano również, że C-1311 jest inhibitorem receptora kinazy tyrozynowej (RTK, ang. receptor tyrosine kinase), głównie receptora FLT3 (ang. Fms-lke tyrosine kinase 3) [Chau i wsp., 2006; Skwarska i wsp., 2010]. C-1305, podobnie jak C-1311, interkaluje do DNA, wchodząc w większą bruzdę helisy DNA i wykazując duże powinowactwo do regionów DNA bogatych w GC [Lemke i wsp., 2005; Koba i Konopa, 2007]. Co więcej, wykazano, że C-1305 oddziałując z DNA powoduje unikalne

Wprowadzenie 5 zaburzenia w strukturze DNA w regionach trzech sąsiadujących ze sobą reszt guanin. Te zaburzenia mogą mieć istotne znaczenie w molekularnym mechanizmie działania C-1305, tym bardziej, że odcinki bogate w triplety reszt guanin są obecne w funkcjonalnych regionach DNA, w tym w: telomerach, centromerach i promotorach genów o rejonach bogatych w pary GC [Lemke i wsp., 2005]. Dowiedziono również, że C-1305 specyficznie wiąże podwójne nici telomerowego DNA, powodując zmiany w strukturze tripletów GGG i prowadząc do obniżenia powinowactwa białek TRF1 i TRF2 do telomerowego DNA [Bidzińska i wsp., 2009]. Na cytotoksyczne działanie C-1305 wpływ ma także jego zdolność do kowalencyjnego wewnątrzcząsteczkowego sieciowania DNA, które zachodzi tylko w obecności aktywnych wewnątrzkomórkowych enzymów [Koba i Konopa, 2007]. Triazoloakrydon uznawany jest za truciznę topoizomerazy II, wykazując silną zdolność do indukcji rozszczepialnych kompleksów z enzymem, zarówno w warunkach in vitro, jak i w żywych komórkach [Lemke i wsp., 2004]. C-1305, podobnie jak C-1311, jest inhibitorem receptora FLT3 [Augustin i wsp., 2010]. 1.3 Biologiczny mechanizm działania związków Uszkodzenie DNA i inhibicja topoizomerazy II w wyniku działania badanych związków C-1311 i C-1305 prowadzi na poziomie komórkowym do zahamowania proliferacji komórek i bloku cyklu komórkowego w fazie G 2/M. Procesy te wykazano na kilku modelach komórek nowotworowych. C-1311 powodował zahamowanie cyklu życiowego w fazie G 2/M w komórkach mysiej białaczki, L1210 [Augustin i wsp., 1996] oraz ludzkiej białaczki, MOLT4 [Skwarska i wsp., 2007]. Zjawisko to obserwowano również w komórkach nowotworów litych: ludzkim nowotworze szyjki macicy, linii HeLa S [Lamb i Wheatley, 1996], ludzkim nowotworze jajnika, linii OAW42, ludzkim nowotworze kostniakomięsaka, linii U2-OS [Zaffaroni i wsp., 2001], ludzkim nowotworze jelita grubego, linii HT-29 [Hyży i wsp., 2005] oraz ludzkim nowotworze wątroby, linii HepG2 [Augustin i wsp., 2013]. C-1305 indukował blok cyklu komórkowego w fazie G 2/M w ludzkich komórkach białaczki, linii MOLT4 i HL60 [Augustin i wsp., 2006], unieśmiertelnionych komórkach jajnika chomika chińskiego, linii CHO [Augustin i wsp., 2013] oraz w wyizolowanych ze zwierząt laboratoryjnych mysich fibroblastach, komórkach pozbawionych funkcjonalnego białka poli- (ADP-rybozo)polimerazy 1 (PARP-1) i komórkach typu dzikiego [Węsierska-Gądek i wsp., 2004]. Wyniki przeprowadzone na mysich fibroblastach są niezwykle ciekawe, gdyż pokazują, że C-1305 jest zdolny silnie zahamować proliferację komórek nawet w warunkach braku białka PARP-1 odpowiedzialnego za naprawę DNA i utrzymanie stabilności genomu. Konsekwencją bloku cyklu komórkowego w fazie G 2/M indukowanego przez omawiane pochodne C-1311 i C-1305, jest indukcja śmierci komórkowej, najczęściej na drodze apoptozy. Śmierć apoptotyczna obserwowana była w komórkach linii L1210, HeLa S, OAW2 i U2-OS

Wprowadzenie 6 traktowanych pochodną imidazoakrydonu, C-1311 [Augustin i wsp., 1996; Lamb i Wheatley, 1996; Zaffaroni i wsp., 2001]. Z kolei w komórkach linii MOLT4 oraz HT-29 po inkubacji z C-1311 indukowane były zmiany charakterystyczne dla procesu katastrofy mitotycznej [Skwarska i wsp., 2007; Hyży i wsp., 2005], które w przypadku komórek MOLT4 skutkowały aktywacją apoptozy po długotrwałym działaniu związku [Skwarska i wsp., 2007]. W komórkach linii HepG2 pochodna imidazoakrydonu powodowała, obok apoptozy i nekrozy, przyspieszone starzenie komórkowe po długich czasach ekspozycji komórek na chemoterapeutyk [Augustin i wsp., 2013]. Dodatkowo zaobserwowano, że C-1311 wnika do lizosomów, powodując ich degradację i uwalniając enzymy autolityczne, co w konsekwencji prowadzi do śmierci komórki [Burger i wsp., 1999]. Pochodna triazoloakydonu, C-1305 w ludzkich komórkach białaczki, zarówno MOLT4, jak i HL60, indukowała apoptozę. Dodatkowo w komórkach tych po krótkich czasach inkubacji ze związkiem obserwowane były zmiany morfologiczne charakterystyczne dla katastrofy mitotycznej [Augustin i wsp., 2006]. Indukcja katastrofy mitotycznej oraz apoptozy zachodziła również w unieśmiertelnionych komórkach jajnika chomika chińskiego, CHO, traktowanych C-1305. W niewielkiej populacji tychże komórek obserwowana była również nekroza i przyspieszone starzenie komórkowe. Warto zaznaczyć, że w komórkach CHO indukcja śmierci komórkowej była potęgowana w warunkach podwyższonej ekspresji izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 [Augustin i wsp., 2013]. 1.4 Metabolizm pochodnych C-1311 i C-1305 Jak wspomniano powyżej, dla kowalencyjnego wiązania pochodnych C-1311 i C-1305 do DNA i jego wewnątrzcząsteczkowego sieciowania niezbędna jest ich metaboliczna aktywacja. Z tego też względu wiele uwagi poświęcono zbadaniu szlaków metabolicznych omawianych chemoterapeutyków, zarówno w warunkach in vitro, z zastosowaniem enzymów rekombinantowych i mikrosomów szczurzych i ludzkich, oraz in vivo, w ludzkich komórkach nowotworowych wątroby, HepG2. Dotychczas przeprowadzone badania pokazały, że drogi biotransformacji związków C-1311 i C-1305 są do siebie zbliżone. Wykazano, że obie pochodne nie są substratami dla izoenzymów cytochromu P450, takich jak: CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 oraz CYP3A4. Powyższa cecha C-1311 może tłumaczyć brak kardiotoksycznych właściwości pochodnej. Wykazano bowiem, że związek wykazuje niski potencjał mutagenny i w niewielkim stopniu przyczynia się do produkcji ROS [Berger i wsp., 1996]. Co ciekawe, oba związki okazały się inhibitorami dwóch spośród badanych izoenzymów cytochromu P450: CYP1A2 oraz CYP3A4. Dowiedziono tego na podstawie badania zdolności enzymów rekombinantowych do katalizowania przemian ich standardowych substratów, 7-etoksy-

Wprowadzenie 7 kumaryny dla CYP1A2 i testosteronu dla CYP3A4, w obecności różnych stężeń C-1311 i C-1305 [Potęga i wsp., 2011; Fedejko-Kap i wsp., 2011]. Inkubacja pochodnych akrydonu z mikrosomami szczurzymi, jak i ludzkimi oraz z komórkami HepG2 pokazała, że oba związki ulegają pewnym przemianom metabolicznym. Obserwowany metabolit okazał się być produktem biotransformacji katalizowanej przez enzym monooksygenazę flawinową, FMO, a widoczne metabolity to N-tlenkowe pochodne C-1311 i C-1305. Badania z udziałem enzymów rekombinantowych wskazały, że za biotransformację związków do N-tlenków odpowiadają izoenzymy FMO1 i FMO3 [Potęga i wsp., 2011; Fedejko-Kap i wsp., 2011]. Dodatkowo dla związku C-1305 pokazano, że jego N-tlenkowa pochodna w obecności izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 oraz w warunkach hipoksji jest przekształcana do związku wyjściowego [Fedejko-Kap i wsp., 2011]. Badania nad II fazą metabolizmu pochodnych C-1311 i C-1305 pokazały, że oba związki są substratami dla UDP-glukuronylotransferaz, UGT, a glukuronidacji ulega grupa hydroksylowa w pozycji 8 pierścienia [Potęga i wsp., 2011; Fedejko-Kap i wsp., 2012]. Najbardziej aktywnym izoenzymem UGT biorącym udział w glukuronidacji związków był pozawątrobowy UGT1A10. W dużo mniejszym stopniu w biotransformacji brały udział także inne izoenzymy UGT, takie jak: 1A1, 1A3, 1A4, 1A7, 1A8 oraz 1A9. Żaden z izoenzymów UGT z rodziny 2B nie uczestniczył w metabolizmie związków C-1311 i C-1305 [Fedejko-Kap i wsp., 2012]. Powstawanie glukuronidu związku C-1311 sugerowano już wcześniej. W badaniach farmakokinetyki pochodnej imidazoakrydonu przeprowadzonych na myszach, którym podawano C-1311, wykazano, że glukuronid związku obecny był w wysokim stężeniu zarówno w moczu, jak i w osoczu krwi i wątrobie. Zaproponowano, że wysoka koncentracja metabolitu w osoczu krwi, wątrobie, moczu oraz kale może być związana z wewnątrzwątrobowym obiegiem pochodnej C-1311, co prawdopodobnie wpływa na lepszą dystrybucję leku w organizmie. Te same badania pokazały, że w wątrobie obecny był w dużym stężeniu inny metabolit pochodnej C-1311. Wówczas zidentyfikowano go jako produkt oksydacji [Calabrese i wsp., 1999]. Nasze późniejsze wyniki sugerują, że mogła to być pochodna N-tlenku. Przypuszcza się, że podobny schemat eliminacji związków, zarówno C-1311, jak i C-1305, może zachodzić w organizmach pacjentów. Wyniki przedstawionych badań w niniejszej pracy pozwolą bliżej poznać mechanizm działania dwóch pochodnych akrydonu: imidazoakrydonu C-1311 i triazoloakrydonu C-1305. Będą stanowić istotny wkład w wiedzę ogólną dotyczącą terapii ukierunkowanej oraz roli badanych enzymów metabolizujących: izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 i UGT1A10 UDPglukuronylotransferazy w szlakach biotransformacji związków i procesach związanych z przeżyciem i śmiercią komórki. Poszerzą również wiedzę związaną z możliwością zastosowania terapii ukierunkowanej w planowaniu leczenia omawianymi potencjalnymi lekami lub ich analogami.

Część teoretyczna 8 2 Część teoretyczna 2.1 Ekspresja enzymów metabolizujących ksenobiotyki a odpowiedź komórkowa Metabolizm zachodzący w żywym organizmie jest procesem determinującym farmakokinetyczny profil każdego leku. Wiele stosowanych w lecznictwie związków wymaga do swej aktywności metabolicznej aktywacji. Procesy detoksykacyjne również odgrywają istotną rolę, ponieważ wpływają na szybkość eliminacji aktywnych form leku z organizmu pacjenta, a zatem skracają czas działania związków. W niektórych przypadkach metabolizm może prowadzić do powstania dużo bardziej toksycznych produktów, które mogą być odpowiedzialne za niepożądane i niebezpieczne efekty w organizmie. Stąd bardzo ważne dla stosowanych w lecznictwie chemoterapeutyków jest dokładne poznanie procesów metabolicznych i detoksykacyjnych. Wiedza ta pomaga również w przewidywaniu oddziaływań pomiędzy stosowanymi jednocześnie lekami. Interakcje te mogą bowiem prowadzić do inhibicji lub indukcji innych szlaków, nie tylko metabolicznych, ale również zaangażowanych w prawidłowe funkcjonowanie komórki [Kumar i Surapaneni, 2001]. Metabolizm leków dzieli się zasadniczo na dwie fazy: fazę I i fazę II. Enzymy I fazy metabolizmu katalizują reakcje, które prowadzą do zwiększenia reaktywności i dostępności związku poprzez dołączenie polarnej grupy funkcyjnej. Do enzymów tych należą: monooksygenazy cytochromu P450 (CYPy), monooksygenazy flawinowe (FMO), oksydazy monoaminowe (MAO), esterazy, dehydrogenazy, izomerazy czy hydrolazy. Reakcje II fazy metabolizmu zwykle stanowią reakcje sprzęgania pochodnej leku z inną cząsteczką, co prowadzi do tworzenia się związków bardziej rozpuszczalnych, które w łatwy sposób mogą być usunięte z organizmu. Tę grupę enzymów stanowią: UDP-glukuronylotransferazy (UGT), transferazy glutationowe (GST), sulfotransferazy (SULT) i N-acetylotransferazy (NAT) [Kumar i Surapaneni, 2001]. Od niedawna wyróżnia się również III fazę metabolizmu leków, którą obejmują procesy związane z usuwaniem z wnętrza komórki leków bądź ich koniugatów przez białka transportujące [Xu i wsp., 2005]. Ekspresja genów kodujących enzymy metabolizujące ksenobiotyki może być różna u każdego człowieka. Dodatkowo wykazano, że w komórkach nowotworowych poziom enzymów jest odmienny niż w komórkach zdrowych. Poziom tych białek wpływa na metabolizm związków endo- i egzogennych. Coraz więcej prac wskazuje, że różna ekspresja genów enzymów metabolizujących może zmieniać wrażliwość i odpowiedź komórek zarówno zdrowych, jak i nowotworowych na działanie ksenobiotyków, nie tylko poprzez zmianę stężeń metabolitów, ale także poprzez pośredni wpływ na procesy związane z proliferacją i funkcjonowaniem komórki.

Część teoretyczna 9 Stąd bardzo ważne jest dokładne poznanie zależności między zmienioną ekspresją enzymów metabolizujących i metabolizmem ksenobiotyków a odpowiedzią komórek nimi traktowanych. 2.1.1 Izoenzymy cytochromu P450 Kluczową rolę w I fazie metabolizmu leków odgrywają enzymy cytochromu P450. Białka cytochromu P450 tworzą dużą nadrodzinę enzymów zawierających w swej strukturze grupę hemową. Zaangażowane są w oksydacyjny metabolizm wielu różnorodnych pod względem swej budowy i właściwości związków endogennych, takich jak: steroidy i kwasy tłuszczowe oraz egzogennych, do których należą związki ksenobiotyczne: leki, toksyny i związki kancerogenne. Uważa się, że enzymy te są odpowiedzialne za transformację niemal 75% stosowanych w lecznictwie leków [Guengerich, 2006]. Enzymy cytochromu P450 katalizują różnorodne reakcje chemiczne, do których należą: monooksygenacja, peroksydacja, redukcja, dealkilacja, epoksydacja czy dehalogenacja. Reakcje te prowadzą do powstania pochodnych bardziej polarnych, które mogą być bezpośrednio usunięte z organizmu lub dalej być wiązane przez enzymy II fazy metabolizmu. Do tej pory w organizmie człowieka zidentyfikowano 17 grup izoenzymów cytochromu P450 (CYP), kodowanych przez 57 funkcjonalnych genów i 58 pseudogenów. Stwierdzono, że jedynie trzy główne grupy izoenzymów CYP zaangażowane są w metabolizm leków i ksenobiotyków. Są nimi: CYP1, CYP2 oraz CYP3 [Purnapatre i wsp., 2008; Zanger i wsp., 2008; Zhou i wsp., 2009.]. Odpowiedzialne są one za oksydacyjny metabolizm 78% przyjmowanych przez człowieka leków. Izoformami, które najczęściej biorą udział w transformacjach związków są: CYP1A2 (9%), CYP2B6 (4%), CYP2C8 (6%), CYP2C9 (17%), CYP2C19 (10%), CYP2D6 (15%) i CYP3A4/A5 (37%) [Zanger i wsp., 2008]. Pozostałe grupy izoenzymów odpowiadają za metabolizm związków endogennych, odgrywając istotną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu komórki. Przypuszcza się, że produkty pseudogenów mogą spełniać funkcje regulacyjne, podobnie jak RNAi [Purnapatre i wsp., 2008]. CYP1A2 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 Inne P450 Inne enzymy Rysunek 2 Udział izoenzymów cytochromu P450 w biotransformacji leków (na podstawie [Zanger i wsp., 2008])

Część teoretyczna 10 Z punktu widzenia terapii ważną kwestią jest świadomość odmiennego poziomu ekspresji izoenzymów cytochromu P450 w zależności od poszczególnych tkanek u chorych pacjentów (np., CYP2E1, CYP3A4) i ich międzyosobniczego polimorfizmu (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19) [Kumar i Surapaneri, 2001]. Nie można też zapomnieć, że w niektórych nowotworach obserwuje się odmienny poziom ekspresji tychże białek (CYP1B1) [Murray i wsp., 1997]. Bezpośredni wpływ obecności izoenzymu na funkcjonowanie komórki (i całego organizmu) dowiedziono dla izoenzymu CYP1B1 oraz CYP2E1. W przypadku innych izoenzymów wchodzących w skład grupy cytochromów P450 jak dotąd takiego działania nie wykazano jednoznacznie. Pojawiają się jednak prace, które wskazują, że zwiększona lub obniżona ekspresja białek cytochromu P450 może pośrednio regulować odpowiedź komórkową i indukcję śmierci. Co ciekawe, ekspresja enzymów, w zależności od stosowanego związku cytostatycznego, może wzmacniać lub hamować indukcję apoptozy, podstawowej drogi śmierci komórkowej. Kontrola ekspresji izoenzymów cytochromu P450 zachodzi z udziałem receptorów jądrowych, które oddziałują również na inne szlaki życiowe komórki. Stąd przypuszcza się, że ekspresja genów enzymów P450 oraz ekspresja białek indukujących i kontrolujących przeżycie i śmierć komórki są ze sobą powiązane. Powiązanie to może być bezpośrednie i wynikać ze wzrostu stężenia aktywnych metabolitów powstających pod wpływem enzymów wyższej ekspresji. Może być również bardziej skomplikowane, gdzie zaangażowane są szlaki regulatorowe kontrolowane przez odpowiednie receptory jądrowe. Może ono także wynikać ze zmienionego metabolizmu związków endogennych. Poniżej przedstawiłam doniesienia pokazujące, że różny poziom ekspresji izoenzymów cytochromu P450 w różny sposób oddziałuje na procesy zachodzące w żywej komórce może zmieniać metabolizm stosowanych w terapii ksenobiotyków, jak również może w inny (często nieznany) sposób wpływać na odpowiedź traktowanych nimi komórek. a. CYP1A1/CYP1A2 Izoenzymy cytochromu P450 1A1 oraz 1A2 odpowiadają za metabolizm związków kancerogennych, takich jak 7,12-dimetylobenz[a]antracen (DMBA) czy polichlorowane bifenyle (PCB): bezno[a]piren, i 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioksyna (TCDD) [Chung i wsp., 2007]. Zaangażowane są także w transformację kilku leków przeciwnowotworowych, między innymi: eliptycyny, flutamidu i tegafuru, które w ten sposób ulegają aktywacji [Purnapatre i wsp., 2008]. Dla wszystkich tych związków wykazano, że przy podwyższonej ekspresji izoenzymów CYP1A1 oraz CYP1A2 dochodzi do zwiększonego metabolizmu wspomnianych ksenobiotyków, co często skutkuje indukcją apoptozy w większej populacji komórek. Wpływ poziomu białek cytochromu P450 1A1 i 1A2 na aktywację związków kancerogennych został opisany w wielu publikacjach. Jednym z często wspominanych

Część teoretyczna 11 kancerogenów jest benzo[a]piren (B[a]P). Związek ten obecny jest w dymie papierosowym, spalinach samochodowych i zanieczyszczeniach przemysłowych. Reaktywne formy B[a]P powstają w wyniku biotransformacji przeprowadzanej przez CYP1A1. Dokładniejsze badania pokazały, że w kontroli aktywacji tego kancerogenu bierze udział czynnik jądrowy, receptor węglowodorów aromatycznych, AhR (ang. aryl hydrocarbon receptor) [Chung i wsp., 2007]. Mechanizm działania B[a]P zbadano w komórkach Hepa1c1c7 (mysie hepatocyty). Wykazano, że związek ten po wniknięciu do komórki łączy się i aktywuje receptory AhR, które następnie przechodzą do jądra komórkowego jako aktywny kompleks. Tam oddziałują ze specyficznymi elementami promotorowymi, elementami odpowiedzi na ksenobiotyki XREs (ang. xenobiotic-response elements), które indukują geny odpowiedzialne za metabolizm bezno[a]pirenu, w tym izoenzymy cytochromu P450: CYP1A1, CYP1A2 i CYP1B1. Kilka białek odpowiedzialnych jest za biotransformację B[a]P, ale CYP1A1 okazał się najefektywniej przeprowadzać utlenianie związku. Reaktywna forma kancerogenu indukuje w traktowanych nim komórkach apoptozę zależną od p53. W umierających komórkach stwierdzono blok w fazie S cyklu życiowego, wzrost poziomu białka p53 oraz aktywację kaspazy-3. Po aktywacji B[a]P poziom AhR wyraźnie spadał. Z kolei w doświadczeniach przeprowadzonych na komórkach Hepa1c1c7 inkubowanych z inhibitorem CYP1A1, a następnie z bezno[a]pirenem, dochodziło do supresji izoenzymu oraz zahamowania apoptozy [Chung i wsp., 2007]. Podobne doświadczenia do powyższych wykonano również na komórkach innej linii RL95-2 (ludzki gruczolakorak macicy). Uzyskano dla niej zbliżone wyniki [Kim i wsp., 2007]. 7,12-dimetylobenzo[a]antracen, DMBA, to kolejny związek, którego działanie cytostatyczne wymaga obecności zarówno receptora AhR, jak i izoenzymu cytochromu P450 CYP1A1 [Gonzales i Korzekwa, 1995]. Forma aktywna DMBA powstaje dzięki metabolicznej biotransformacji przeprowadzanej przez ten izoenzym. Potwierdziły to badania na myszach pozbawionych genu CYP1A1, których komórki szpiku kostnego nie umierały na drodze apoptozy po traktowaniu DMBA. Z kolei w komórkach pobranych od normalnych zwierząt indukowana była programowana śmierć po inkubacji z DMBA. W kolejnych badaniach wykazano, że pod wpływem związku dochodzi do zwiększenia poziomu receptora AhR i choć jego obecność nie jest wymagana do aktywności ksenobiotyku, to znacznie podwyższa cytotoksyczne działanie DMBA [Heidel i wsp., 1999]. Izoenzymy CYP1A1 oraz CYP1A2 zaangażowane są również w metaboliczną aktywację związków przeciwnowotworowych. Przykładem jest eliptycyna. Lek ten stosowany jest w leczeniu następujących chorób nowotworowych: rak piersi, nerki, nowotwór mózgu czy białaczki. Dużą zaletą stosowania eliptycyny jest indukcja stosunkowo niewielu efektów ubocznych w porównaniu do innych leków przeciwnowotworowych [Stiborova i wsp., 2001]. Molekularny mechanizm jego działania oparty jest na interkalacji do DNA, hamowaniu

Część teoretyczna 12 aktywności topoizomerazy II oraz tworzeniu kowalencyjnych adduktów z DNA. W wyniku zmian w strukturze DNA następuje indukcja apoptozy. Dochodzi do zatrzymania cyklu komórkowego zależnego od ekspresji cykliny B1 i kinazy Cdc2 (fosforylacja białka). Aktywacji ulegają białka Fas oraz z rodziny Bcl-2. Wzrasta poziom białka p53, w wyniku czego dochodzi do inicjacji mitochondrialnego szlaku apoptozy [Poljakova i wsp., 2009]. Za wszystkie te procesy odpowiadają formy aktywne eliptycyny, czyli pochodne 12- i 13-hydroksyeliptycyny, w których tworzeniu biorą udział izoenzymy CYP1A1 oraz CYP1A2, jak również CYP3A4 i CYP2C19. Metabolizm potęgowany jest dodatkowo w obecności cytochromu b5. Wykazano, że inkubacja z mikrosomami bogatymi we wspomniane enzymy powoduje kilkukrotny wzrost stężenia metabolitów, co skutkuje formowaniem się większej liczby adduktów eliptycyny z DNA, przez co dochodzi do indukcji apoptozy w większym stopniu. Zatem wysoki poziom tychże białek jest niezbędny dla przeciwnowotworowego działania leku [Aimova i wsp., 2007; Stiborova i wsp., 2012]. Powyżej przedstawione przykłady pokazują, że istnieje relacja pomiędzy poziomem izoenzymów cytochromu P450 1A1/1A2 i metabolizmem ksenobiotyków a śmiercią traktowanych nimi komórek. b. CYP1B1 Izoenzym CYP1B1 cytochromu P450, podobnie jak wyżej przedstawiona grupa białek CYP1A, odpowiedzialny jest za metabolizm związków kancerogennych. Bierze także udział w transformacji kilku leków przeciwnowotworowych, takich jak: mitoksantron, tamoksyfen oraz docetaksel, choć nie jest ich głównym aktywatorem [Purnapatre i wsp., 2008]. Wiele prac opisuje wpływ CYP1B1 na aktywację kancerogenów. Otrzymywane wyniki są analogiczne, jak dla przedstawionych powyżej dotyczących rodziny białek CYP1A cytochromu P450. W odróżnieniu od większości izoenzymów cytochromu P450, dla białka CYP1B1 wykazano, że jest ono bezpośrednio zaangażowane w procesy zachodzące w komórce jej proliferację i przeżycie. Dzieje się tak, ponieważ izoenzym CYP1B1 odpowiada za transformacje wielu związków endogennych, głównie pochodnych estrogenów. Co więcej, odkryto, że w wielu nowotworach, zwłaszcza powstających u kobiet, dochodzi do nadekspresji tego izoenzymu [Zanger i wsp., 2008]. Wpływ ekspresji izoenzymu CYP1B1 na funkcjonowanie komórki określono dzięki badaniom wykorzystującym technikę sirna, która pozwoliła na wyciszenie ekspresji tego izoenzymu. W ten sposób zbadano, które funkcje komórki uległy zmianie przy braku lub obniżonym poziomie enzymu CYP1B1 [Saini i wsp., 2009]. Izoenzym CYP1B1 metabolizuje estrogeny do ich pochodnych 4-hydroksylowych, które są odpowiedzialne za uszkodzenie DNA i proces nowotworzenia w komórkach endometrialnych.

Część teoretyczna 13 Co ważne, w komórkach tych poziom białka CYP1B1 ulega zmianie. Wpływ ekspresji tego izoenzymu zbadano więc w kilku liniach ludzkich nowotworowych komórek endometrialnych: KLE, Ishikawy, HEC-1-B oraz RL95-2, w których za pomocą sirna obniżono poziom izoenzymu CYP1B1. Spowodowało to zahamowanie proliferacji komórek oraz zatrzymanie progresji cyklu komórkowego w fazie G 0-G 1. Zmniejszył się poziom ekspresji białek związanych z cyklem komórkowym, takich jak: cyklina E1, kinazo-zależne białko 2 fazy S, SKP2 (ang. S-phase kinase-associated protein 2), podjednostka 4 kompleksu utrzymującego minichromosom, MCM4 (ang. minichromosome maintenance complex compartment 4) oraz białko RAD51. Wzrost poziomu nastąpił w przypadku białka p27 Kip1. Izoenzym CYP1B1 wpływał również na białko wiążące cyklinę B, CEPB1 (ang. cyclin-b binding protein). Wyciszenie genu cyp1b1 doprowadziło do indukcji apoptozy w endometrialnych komórkach nowotworowych oraz do wzrostu ekspresji czynnika IFN-β, granzymu A i białka TRAIL (ang. tumor necrosis factor-related apptosis-inducing ligand). Co ciekawe, endometrialne komórki nowotworowe o obniżonym poziomie CYP1B1 traciły zdolność do inwazji, gdyż zmniejszała się ekspresja cząsteczki adhezji, MCAM (ang. melanoma cell adhesion molecule) [Saini i wsp., 2009]. Podsumowując, badania przedstawione powyżej pokazały, że izoenzym CYP1B1 cytochromu P450 odgrywa ważną rolę w procesie nowotworzenia komórek endometrialnych oddziałując na różne szlaki wewnątrzkomórkowe. Zastosowanie inhibitorów białka CYP1B1 może okazać się skuteczną metodą w leczeniu nowotworów pochodzenia endometrialnego. Przy inhibicji enzymu komórki przestają się dzielić i mogą stać się bardziej wrażliwe na działanie innych leków [Saini i wsp., 2009]. Powyższy przykład wskazuje, że ważną rolę w procesie nowotworzenia i terapii przeciwnowotworowej odgrywa nie tylko metabolizm ksenobiotyków, ale również kluczowych dla komórki związków endogennych metabolizowanych przez cytochrom P450. Wybrane reaktywne formy związków endogennych mogą z kolei oddziaływać na procesy zaangażowane w przeżycie i śmierć komórki. c. CYP2D6 Kolejny izoenzym cytochromu P450, na który warto zwrócić uwagę w omawianym aspekcie, to CYP2D6. Jest to białko, którego polimorfizm jest często obserwowany u różnych grup ludzi. Znajomość jego formy oraz poziomu ekspresji może ułatwić planowanie terapii przeciwnowotworowej i pomóc w określeniu jej skuteczności. Izoenzym CYP2D6 bierze udział w metabolizmie około 20% stosowanych leków, nie tylko przeciwnowotworowych. Wykazano, że w zależności od formy białka do zmian w metabolizmie i skuteczności leczenia dochodzi w 30-40% leków metabolizowanych przez enzym CYP2D6, co stanowi 7-10% wszystkich leków [Ingelman-Sundberg, 2005]. Związki przeciwnowotworowe, które są jego substratami to: tamoksyfen, gefitinib czy idarubicyna [Purnapatre i wsp., 2008].

Część teoretyczna 14 Wpływ polimorfizmu izoenzymu CYP2D6 na skuteczność terapii stosującej tamoksyfen został szeroko opisany. Wyniki badań klinicznych dokonanych na podstawie analizy danych z kart historii choroby 225 pacjentek (w wieku po menopauzie) we wczesnym stadium nowotworu piersi wskazały, że 190 spośród nich posiadało allel *4 genu CYP2D6. Obecność tej formy genu powoduje inaktywację enzymu. Im więcej tego allelu, tym słabsza jest aktywność CYP2D6. Jedynie u 13 pacjentek (6%) stwierdzono brak allelu *4 te pacjentki zakwalifikowano jako dobrze metabolizujące. Aż 190 chorych posiadało jedną lub dwie kopie allelu *4 uznano je jako słabo lub nie metabolizujące, PM (ang. poor metabolizers). Obserwacje pozwoliły wysunąć następujące wnioski: pacjentki PM były grupą o najwyższym ryzyku powrotu choroby. Stwierdzono również, że w terapiach stosujących tamoksyfen nie należy stosować leków będących inhibitorami CYP2D6 [Goetz i wsp., 2007]. Podsumowując, znajomość polimorfizmu izoenzymu CYP2D6 jest ważna w terapiach stosujących leki przez niego metabolizowane lub oddziaływujące na jego aktywność. Podwyższona aktywność białka działa bowiem korzystnie na skuteczność stosowanych leków przeciwnowotworowych, których formy aktywne mogą wywołać śmierć większej populacji komórek nowotworowych. CYP2D6 jest zatem izoenzymem, który potwierdza konieczność wdrażania terapii ukierunkowanej. d. CYP2E1 Wpływ na funkcjonowanie komórek został poznany i opisany najlepiej dla izoenzymu CYP2E1 spośród białek cytochromu P450. Enzym ten metabolizuje i przekształca wiele toksycznych substancji do bardziej reaktywnych i niebezpiecznych dla organizmu produktów. Jego substratami są: etanol, acetaminofen, halogenowęglowodory, benzen oraz inne związki aromatyczne. CYP2E1 bierze udział w generacji wolnych rodników tlenowych, które w obecności katalazy przekształcone zostają w bardzo toksyczny rodnik hydroksylowy. Uważa się, że enzym ten jest odpowiedzialny za stres oksydacyjny oraz uszkodzenie wątroby u spożywających alkohol etylowy [Caro i Cederbaum, 2004; Lu i Cederbaum, 2008]. Wiele substratów CYP2E1 może jednocześnie indukować ekspresję tego enzymu. Przedłużone działanie etanolu podwyższa poziom białka, czego skutkiem jest powstawanie większej ilości reaktywnych form tlenu, ROS (ang. reactive oxygen species). Wykazały to badania, gdzie zaobserwowano wzrost poziomu białka oraz peroksydacji lipidów w tkankach uszkodzonych przez alkohol [Nanji i wsp., 1994]. Z kolei dodatek antyoksydantów, do których należy witamina E, ebselen (naśladowca peroksydazy glutationowej) i prekursory glutationu (GSH) zmniejszały toksyczne działanie etanolu. Warto nadmienić, że GSH, które biorą udział w eliminacji toksycznych produktów transformacji metabolicznych przeprowadzanych przez

Część teoretyczna 15 CYP2E1, wydaje się powstać w toku ewolucji jako obrona komórki przed zgubnym działaniem izoenzymów P450 [Lu i Cederbaum, 2008]. Dokładne badania określające wpływ ekspresji CYP2E1 na funkcjonowanie organizmu przeprowadzono na modelach komórkowych. Zastosowano dwie linie rekombinantowych komórek ludzkiego nowotworu wątroby HepG2: komórki E4 7, wykazujące nadekspresję genu CYP2E1 oraz komórki C34, transfekowane tzw. wektorem zerowym niekodującym żadnego białka [Chen i Cederbaum, 1998]. Wykazano, że wzrost i przeżywalność komórek z nadekspresją CYP2E1 były zmienione w stosunku do komórek kontrolnych, C34. Komórki E47 rzadziej się dzieliły, nawet bez dodatku substratów enzymu CYP2E1, charakteryzowały się większą ilością ROS (o 40-50%) i zwiększoną peroksydacją lipidów [Caro i Cederbaum, 2004]. W obecności substratów CYP2E1, takich jak BSO, dochod ziło do znacznego zahamowania wzrostu komórek E47 i ich śmierci. Komórki o obniżonym poziomie GSH jeszcze szybciej były eliminowane przez działanie BSO. Sprawdzono również wpływ koekspresji izoenzymu CYP2E1 i białka Bcl-2 (inhibitor apoptozy) na przeżywalność komórek HepG2. Wykazano, że komórki z nadekspresją zarówno CYP2E1 i Bcl-2 były oporne na działanie BSO, zaś ich przeżywalność bez funkcjonalnego białka Bcl-2 była znacznie obniżona, nawet w stosunku do komórek E47 traktowanych BSO. Na tej postawie stwierdzono, że cytotoksyczne efekty nadekspresji izoenzymu CYP2E1 spowodowane są indukcją apoptozy [Chen i Cederbaum, 1998]. W dalszych badaniach z użyciem BSO wykazano, że produkowane przez CYP2E1 reaktywne formy tlenu uszkadzały mitochondria. Dochodziło do otwarcia megakanału PTP w błonie mitochondrialnej, co powodowało uwolnienie cytochromu c i indukcję apoptozy [Caro i Cederbaum, 2004]. Aktywacji ulegało także białko proteolityczne, kaspaza-3, odpowiedzialne za degradację białek podczas programowanej śmierci komórkowej [Nanji i wsp., 1994]. Podobnych obserwacji dokonano przy użyciu innego substratu CYP2E1, kwasu arachidonowego [Wu i Cederbaum, 2001]. Przeprowadzono szereg kolejnych doświadczeń, które potwierdziły indukcję apoptozy w komórkach E47 traktowanych BSO [Chen i Cederbaum, 1998]. Wykazały one również, że komórki nowotworowe wątroby o podwyższonej ekspresji CYP2E1 inkubowane z BSO umierały na drodze nekrozy [Caro i Cederbaum, 2004; Nanji i wsp., 1994; Caro i Cederbaum, 2001]. Co istotne, indukcji apoptozy i nekrozy nie obserwowano w komórkach linii C34 traktowanych BSO lub kwasem arachidowym. Podsumowując, w komórkach ludzkiego nowotworu wątroby HepG2 wykazujących nadekspresję cytochromu P450 2E1 wzrost i proliferacja zostały zaburzone. W obecności substratów enzymu dochodziło do indukcji apoptozy lub nekrozy. Za procesy te odpowiedzialne były reaktywne formy tlenu (ROS), powstające przy katalitycznym działaniu CYP2E1. Wpływ nadekspresji izoenzymu CYP2E1 na funkcjonowanie komórek zbadano również na myszach transgenicznych. Doświadczenia na zwierzętach, u których ekspresja genu

Część teoretyczna 16 kodującego CYP2E1 była wyciszona, podawany etanol nie powodował uszkodzenia wątroby. Zatem brak izoenzymu CYP2E1 chronił zwierzęta przed powstawaniem szkodliwych form tlenu i oksydacją wewnątrzkomórkowych białek. Pokazano również, że u niektórych myszy z usuniętym genem CYP2E1 dochodziło do indukcji innych izoenzymów cytochromu P450, takich jak: CYP4A10 i CYP4A14, które mogły być odpowiedzialne za produkcję ROS i uszkodzenie wątroby zwierząt [Lu i Cederbaum, 2008]. Wykazano również, że indukcja ekspresji izoenzymu CYP2E1 przez etanol i inne induktory CYP prowadziła do zwiększonej ekspresji białek biorących udział w eliminacji reaktywnych form tlenu. W komórkach E47 dwukrotnie wzrastała transkrypcja genów kodujących: S-transferazę glutationową, GST, katalazę oraz dwa rodzaje ligaz: GCLC i GCLM w stosunku do komórek linii C34. Tym samym rosło stężenie i aktywność powstających białek, które wydajniej mogły wziąć udział w syntezie GSH odpowiedzialnych za neutralizację ROS. Mechanizmy kontrolujące indukcję genów przez stres oksydacyjny obejmowały również aktywację czynników transkrypcyjnych, takich jak: NF-kb, AP-1 i Nrf2. Warto nadmienić, że zastosowanie inhibitorów CYP2E1 oraz antyoksydantów hamowało transkrypcję wspomnianych wcześniej białek, zaś dodatek substratów enzymu ją stymulował [Caro i Cederbaum, 2004]. Procesy te jednak zachodzą na zbyt niskim poziomie, by mogły skutecznie hamować toksyczne efekty indukowane przez izoenzym CYP2E1. Co ciekawe, wykazano, że zwiększona ekspresja izoenzymu CYP2E1 indukuje dodatkowo ekspresję białka TGF-β1, które potęguje powstawanie reaktywnych form tlenu oraz śmierć komórek E47 [Mari i wsp., 2002]. Izoenzym CYP2E1 bierze również udział w metabolizmie i detoksykacji niektórych leków przeciwnowotworowych, takich jak: cisplatyna [Lu i Cederbaum, 2006], metotreksat [Neuman i wsp., 1999], stąd znajomość jego oddziaływań jest istotna nie tylko dla leczenia chorób wątroby, ale również nowotworowych. e. CYP3A4 Izoenzym cytochromu P450 CYP3A4 jest enzymem zaangażowanym w metabolizm aktywacyjny i detoksykacyjny ponad połowy stosowanych w lecznictwie ksenobiotyków, w tym wielu leków przeciwnowotworowych. Zainteresowanie naukowców tym białkiem jest zatem największe. Izoenzym CYP3A4 odpowiada za transformację takich ważnych związków jak: docetaksel, paklitaksel, winblastyna, winkrystyna, imatinib, etopozyd, tamoksyfen czy cyklofosfamid. Poniżej przedstawiłam kilka przykładów zależności między poziomem ekspresji izoenzymu CYP3A4 a śmiercią komórek nowotworowych. W metabolizmie takich leków jak: cyklofosfamid (CPA), paklitaksol (PCT) oraz docetaksol (DTX) bierze udział nie tylko CYP3A4, ale również CYP2B1 i CYP2E1. Wpływ poziomu tychże

Część teoretyczna 17 enzymów na efektywność metabolizmu i toksyczność związków zbadano w komórkach kilku linii: L929 (mysia tkanka łączna), P338D1 (mysie makrofagi) oraz HeLa (ludzki nowotwór szyjki macicy). Poziom enzymów cytochromu P450 podwyższano poprzez inkubację komórek z białkami mikrosomalnymi zawierającymi enzymy danej grupy cytochromu P450. Cyklofosfamid do swej aktywności wymaga metabolicznej transformacji. U człowieka związek ten aktywowany jest głównie przez CYP3A4, a w mniejszym stopniu przez CYP2B6, CYP2C8 i CYP2C9, stąd w przedstawianych badaniach metabolizm leku zachodził tylko wtedy, gdy komórki były uprzednio inkubowane z mikrosomami. Najwyższą cytotoksyczność CPA obserwowano w komórkach P388D1 ze zwiększonym poziomem izoenzymów CYP3A4 oraz CYP2B1. Pozostałe leki: paklitaksol i docetaksol nie wymagają metabolicznej transformacji do swej aktywności. Enzymy zawarte w układzie cytochromu P450 przeprowadzają detoksykację związków, co powoduje obniżenie aktywności leków. W tym wypadku wcześniejsza inkubacja związków z mikrosomami o podwyższonym poziomie izoenzymu CYP3A4 całkowicie niwelowała cytotoksyczność DTX, a cytotoksyczność PCT obniżała [Gut i wsp., 2000]. Podobne wyniki, potwierdzające niekorzystne działanie nadekspresji izoenzymu CYP3A4 prowadzące do obniżenia aktywności PCT przeprowadzono na komórkach HepG2 wykazujących nadekspresję izoenzymu P450 CYP3A4 (linia Hep3A4). Wykazano, że przy podwyższonej ekspresji enzymu dochodziło do wzrostu poziomu białka oporności wielolekowej, p-glikoproteiny. Co ważne, przy zastosowaniu inhibitora izoenzymu CYP3A4, ketokonazolu, toksyczność i proapoptotyczne działanie PCT wzrastało, ponieważ detoksykacyjny metabolizm związku był obniżony [Hołownia i Cederbaum, 2003]. Również w przypadku docetaksolu podjęto próby jednoczesnego podawania leku i inhibitora izoenzymu CYP3A4 [Makhov i wsp., 2012]. Badania przeprowadzono na modelowym ksenoprzeprzeszczepie ludzkiego nowotworu prostaty. Związkiem, który hamował aktywność enzymu, była piperyna. Wyniki pokazały, że jednoczesne podawanie DTX z inhibitorem podwyższało aktywność leku bez wywoływania negatywnych skutków ubocznych u leczonych myszy. Kolejne badania na komórkach linii Hep3A4 przeprowadzono dla innego leku przeciwnowotworowego, tamoksyfenu [Hołownia i Braszko, 2004]. Związek ten jest metabolizowany nie tylko przez wspomniany wcześniej CYP2D6, ale również przez: CYP3A4, CYP1B1, CYP2C9 i CYP2C19 [Purnapatre i wsp., 2008]. Badania na linii Hep3A4 potwierdziły, że przy zwiększonej ekspresji izoenzymu CYP3A4 metabolizm leku zachodził z większą wydajnością, w większej populacji komórek (w porównaniu do komórek z wektorem zerowym o bardzo niskim poziomie izoenzymu CYP3A4) dochodziło do zatrzymania proliferacji komórek i indukcji apoptozy. Co ciekawe, w komórkach Hep3A4 wzrastał poziom innego enzymu metabolizującego sulfotransferazy (SULT), co świadczy o udziale tego enzymu w kolejnych etapach transformacji tamoksyfenu [Hołownia i Braszko, 2004; Mercer i wsp., 2010].

Część teoretyczna 18 Doświadczenia określające wpływ poziomu izoenzymu CYP3A4 prowadzone są nie tylko dla leków przeciwnowotworowych. Podobne eksperymenty wykonano również dla stosowanego kiedyś leku przeciwhistaminowego, terfenadyny [Wang i wsp., 2002]. Terfenadyna (TF) działa jako silny antagonista receptora H1. W stężeniach terapeutycznych nie wykazuje ona niepożądanych skutków ubocznych. Dowiedziono jednak, że w większych dawkach indukuje apoptozę w komórkach kilku linii ludzkich nowotworów (wątroby HepG2, okrężnicy COLO 205 oraz fibroblastów CCD 922SK) szlakiem zależnym od aktywacji ekspresji genów p53, p21/cip1, p27/kip, bax oraz inhibicji ekspresji Bcl-2. Okazało się, że przy jednoczesnym podawaniu terfenadyny i inhibitora receptora H1, ketokonazolu (KT, lek przeciwgrzybiczny) w dawkach terapeutycznych obserwowano również apoptozę przebiegającą podobnym szlakiem. Dowiodło to, że programowana śmierć komórkowa nie jest indukowana przez szlak sygnalizacyjny receptora H1, a poprzez inhibicję izoenzymu CYP3A4, który metabolizuje terfenadynę. Przy obniżonej aktywności enzymu lek nie ulegał biotransformacji, zatem czas jego obecności w komórce przedłużał się, co powodowało indukcję apoptozy i fragmentację DNA. W komórkach traktowanych terfenadyną inkubowaną wcześniej z mikrosomami o wysokim poziomie enzymu CYP3A4 indukcja apoptozy w komórkach HepG2 została całkowicie zahamowana. Co ciekawe, komórki o wadliwym genie p53 w mniejszym stopniu ulegały apoptozie, co wskazywało na aktywację śmierci przez TF przebiegającą również szlakiem niezależnym od białka p53 [Wang i wsp., 2002]. Opisane powyżej badania wyjaśniły, dlaczego z pozoru bezpieczne leki w połączonej terapii okazały się toksyczne. Obecność ketokonazolu prowadziła do inhibicji CYP3A4 odpowiedzialnego za metabolizm terfenandyny. Przedłużone działanie TF powodowało indukcję apoptozy. Jest to kolejny dowód, że poziom ekspresji enzymów cytochromu P450 ma istotny wpływ na metabolizm leków, ich interakcje i odpowiedź biologiczną traktowanych nimi komórek. Warto nadmienić, że ketokonazol jest już stosowany jako inhibitor CYP3A4 w terapiach, gdzie obecność tego enzymu ma niekorzystny wpływ na leczenie [Wang i wsp., 2002]. Coraz liczniejsze badania wskazują, że izoenzym CYP3A4 może być zaangażowany w promocję nowotworu piersi [Mitra i wsp., 2006] i jego podwyższona ekspresja daje gorsze prognozy dla terapii [Haas i wsp., 2006]. Wykazano, że przy zmniejszonej ekspresji białka CYP3A4 proliferacja komórek nowotworowych została zahamowana, zaś przy zastosowaniu induktorów CYP3A4 podział komórek wzrastał [Mitra i wsp., 2006]. Dowiodły tego badania przy zastosowaniu techniki sirna oraz inkubacji komórek z induktorem (rifampicyną) lub inhibitorem (ritonavirem) wspomnianego białka. Badania przeprowadzono na komórkach kilku linii raka piersi: MCF-7, T47D oraz MDA-MB-231. W 2011 roku Ci sami autorzy opublikowali pracę, gdzie dokładnie opisali wpływ podwyższonej ekspresji izoenzymu CYP3A4 na funkcjonowanie komórki nowotworowej. Badania wykonano na komórkach MCF-7. Inhibicja enzymu za pomocą sirna prowadziła do bloku cyklu komórkowego w fazie G 2/M i zahamowania wzrostu komórek.

Część teoretyczna 19 Proces ten był zależny od fosforylacji białka STAT3 (Tyr-705). Z kolei fosforylacja i aktywacja tego białka zależna była od obecności produktów metabolizmu endogennych kwasów arachidonowych, 14, 15-epoksyeikozatrienowych (14,15-EET) powstających z udziałem izoenzymu CYP3A4. Dodanie kwasów 14,15-EET do pożywki przywracało normalny wzrost komórek MCF-7 [Mitra i wsp., 2011]. Co więcej, wykazano, że w komórkach wielu linii nowotworowych piersi poziom ekspresji izoenzymów cytochromu P450 z rodzin CYP3A4 oraz CYP2C8 jest podwyższony [Kapucuoglu i wsp., 2003]. Izoenzym CYP3A4 wskazano także jako jeden z możliwych markerów przeżywalności pacjentów z nowotworem piersi [Murray i wsp., 2010]. Zatem izoenzym CYP3A4 w związku z metabolizmem kwasów epoksyeikozatrienowych może być również pośrednio zaangażowany w proces wzrostu nowotworu, podobnie jak to wykazano dla wcześniej opisanego izoenzymu CYP1B1 [Saini i wsp., 2009]. Najnowsze badania pokazały, że ekspresja genu CYP3A4, obok 10 innych genów kodujących białka cytochromu P450, jest indukowana przez białko p53. Badania wykonano na dwóch ludzkich liniach nowotworu wątroby: HepG2 i Huh6 oraz na pierwotnych hepatocytach wyizolowanych od pacjentów. W przeprowadzonych eksperymentach białko p53 wiązało się do elementów odpowiedzi na p53, p53res (ang. p53-responsive element) w specyficznych regulatorowych regionach DNA, wzmagając transkrypcję genów kodujących rodzinę białek CYP3A. Indukcja zależna od białka p53 obserwowana była również w warunkach ekspozycji komórek na znane chemoterapeutyki przeciwnowotworowe, cisplatynę, etopozyd i doksorubicynę. Pod wpływem działania leków dochodziło do aktywacji białka p53, które podwyższając ekspresję izoenzymów cytochromu P450, przyspieszało metabolizm leków prowadząc do ich szybszego usunięcia z komórki [Goldstein i wsp., 2013]. Jak widać na podstawie powyższych przykładów różny poziom ekspresji izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 może wpływać na procesy zachodzące w traktowanej lekiem komórce na czterech poziomach: 1. zmieniać sam metabolizm chemoterapeutyku i ilość powstających metabolitów; 2. oddziaływać na procesy związane ze śmiercią komórki indukowane poprzez powstające z jego udziałem metabolity leków; 3. bezpośrednio modyfikować ekspresję innych białek, np. biorących udział w szlakach warunkujących przeżycie i śmierć komórki; 4. wpływać na metabolizm endogennych związków, które zaangażowane są w proliferację komórki i proces nowotworzenia.

Część teoretyczna 20 f. CYP2J2 Izoenzym CYP2J2 cytochromu P450, zwany często epoksygenazą cytochromu P450, odpowiada za transformację związków endogennych, a dokładnie kwasu arachidonowego i jego pochodnych. Zatem bezpośrednio nie jest odpowiedzialny za biotransformację ksenobiotyków. Jednak najnowsze badania dowodzą, że występują różnice w ekspresji tego enzymu między komórkami zdrowymi a nowotworowymi. To z kolei może pośrednio wpływać na działanie leków stosowanych w terapii przeciwnowotworowej. Wiele prac dowodzi, że przy podwyższonej ekspresji izoenzymu CYP2J2 może dojść do nadprodukcji metabolitów kwasu, które działają ochronnie na komórki traktowane związkami przeciwnowotworowymi [Jiang i wsp., 2007]. Wykazano, że nadekspresja epoksygenazy cytochromu P450 zachodziła w wielu ludzkich tkankach nowotworowych, takich jak: nowotwór płuc (różne rodzaje), wątroby, piersi, żołądka, dwunastnicy czy okrężnicy. Również w liniach komórek nowotworowych obserwowana była wysoka ekspresja CYP2J2. Co istotne, w komórkach zdrowych tkanek epoksygenaza nie była wykrywana (metodą immunohistochemii) [Jiang i wsp., 2005]. Przy wyższym poziomie metabolitów kwasów epoksyeikozatrienowych (EET) produkowanych przez epoksygenazę cytochromu P450 dochodziło do wzrostu guza nowotworowego, zwiększenia proliferacji komórek nowotworowych oraz do hamowania apoptozy zależnej od szlaku sygnalizacyjnego PI3-kinaza Akt. Dowiedziono tego na komórkach kilku linii ludzkich nowotworów (MDA-MB-231, HepG2, A549, Tca-8113, Hcl-H446), gdzie za pomocą transfekcji (przy użyciu adenowirusów), zwiększano lub obniżano poziom CYP2J2 [Jiang i wsp., 2005]. W innych badaniach przy zastosowaniu inhibitorów epoksygenazy cytochromu P450 pokazano, że migracja komórek nowotworowych, ich inwazyjność i zdolność do adhezji zostają zahamowane. Co więcej, w tych warunkach komórki były dużo bardziej wrażliwsze na działanie leków przeciwnowotworowych i podatne na proces apoptozy. Inhibicja CYP2J2 prowadziła do zwiększenia aktywności kaspazy-3 oraz zmieniała ekspresję białek z rodzin Bax i Bcl-2 [Chen i wsp., 2009]. Wpływ izoenzymu CYP2J2 na procesy zachodzące w komórce jest kolejnym przykładem pośrednich zależności między poziomem ekspresji białka metabolizującego a funkcjonowaniem komórki. Znajomość poziomu ekspresji epoksygenazy cytochromu P450 (CYP2J2) oraz zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej inhibitorów tego białka jako dodatkowych leków może znacznie podnieść skuteczność całej terapii. 2.1.2 Reduktaza cytochromu P450 Reduktaza cytochromu P450 (CPR) to flawoproteina niezwykle ważna dla funkcjonowania całego systemu cytochromu P450. Dzięki niej dochodzi do przywrócenia niezbędnego dla reakcji przeprowadzanych przez cytochrom P450 kofaktora NADPH

Część teoretyczna 21 [Henderson i wsp., 2003]. CPR może być również bezpośrednio zaangażowany w metabolizm niektórych leków, takich jak: mitomycyna, mitoksantron, adriamycyna i inne doksorubicyny. Poziom i polimorfizm reduktazy cytochromu P450 jest ważny nie tylko dla procesów związanych z działaniem cytochromu P450, ale również dla ukierunkowanej terapii przeciwnowotworowej. Przykładem jest zdolność CPR do transformacji mitoksantronu (MTX). Związek ten stosowany jest w leczeniu zaawansowanych nowotworów piersi, prostaty, chłoniaków i białaczek. Redukcyjna aktywacja mitoksantronu prowadzi do powstania formy odpowiedzialnej za kowalencyjne wiązanie się do DNA, czego następstwem jest istotny wzrost cytotoksyczności leku wobec komórek nowotworowych. Co ważne, takie addukty nie są substratem dla pomp MDR, dlatego też nie dochodzi do pojawienia się oporności komórek na stosowany chemoterapeutyk [Kostrzewa-Nowak i wsp., 2007]. W badaniach na trzech liniach białaczki HL60: dzikiej i dwóch wykazujących nadekspresję p-glikoproteiny lub białka MRP1 inkubowanych z egzogenną rekombinantową reduktazą CPR i traktowanych mitoksantronem dowiedziono, że przy podwyższonym stężeniu egzogennej reduktazy cytochromu P450 i dodatku do pożywki kofaktora NADPH dochodziło do wzrostu antyproliferacyjnego działania MTX. Wrażliwość komórek, zwłaszcza tych z nadekspresją białek oporności, diametralnie wzrastała wobec badanego leku (IC 50 dwukrotnie mniejsza dla linii transfekowanych). Podsumowując, wysoki poziom ekspresji CPR może mieć duże znaczenie w terapiach opartych na lekach metabolizowanych przez ten enzym [Kostrzewa-Nowak i wsp., 2007]. Innym przykładem wpływu poziomu reduktazy cytochromu P450 na stopień przemian metabolicznych jest aktywacja adriamycyny. Badania wykazały, że przy inkubacji komórek MCF-7 z egzogennym rekombinantowym CPR znacząco wzrastała cytotoksyczność adriamycyny wobec tych komórek. Za podniesienie aktywności biologicznej leku odpowiadały metabolity będące alkilowymi pochodnymi adriamycyny [Bartoszek, 2002]. Ciekawe wyniki otrzymano w badaniach metabolizmu mitomycyny C i porfiromycyny oraz innych leków przeciwnowotworowych będących pochodnymi doksorubicyny na rekombinantowej linii komórek CHO wykazującej wysoką ekspresję ludzkiej reduktazy cytochromu P450. Wykazano, że zarówno w warunkach tlenowych, jak i hipoksji transfekowane komórki były dużo bardziej wrażliwe na działanie obu związków niż komórki dzikie, z czego wzrost cytotoksyczności był wyższy w warunkach beztlenowych [Belcourt i wsp., 1996]. W innych badaniach mechanizmu działania mitomycyny C pokazano, że zmiany genetyczne w sekwencji DNA kodującej reduktazę cytochromu P450 mogą mieć wpływ na skuteczność leczenia tym lekiem. Badania przeprowadzono na komórkach CHO wykazujących ekspresję sześciu różnych ludzkich form CPR. Dwie spośród nich zmiana V608F i Y181D powodowały całkowity zanik zdolności reduktazy do aktywacji mitomycyny. Badania te pokazały, jak ważna

Część teoretyczna 22 jest w planowaniu terapii nie tylko znajomość poziomu ekspresji enzymów metabolizujących, ale również ich polimorfizmu [Wang i wsp., 2007]. Najnowsze doniesienia wskazują, że nadekspresja reduktazy cytochromu P450 może również zmieniać właściwości komórek nietraktowanych związkiem. W komórkach CHO o podwyższonej ekspresji CPR obserwowano znaczny wzrost reaktywnych form tlenu, przez co wzrastał stres oksydacyjny, karbonylacja białek i konsumpcja wewnątrzkomórkowego tlenu [Fussell i wsp., 2011]. W innych badaniach wykazano, że poziom ekspresji CPR może również wpływać na aktywność związków, w biotransformacji których reduktaza nie bierze bezpośredniego udziału. Takich obserwacji dokonano dla 5-fluorouracylu (5-FU). Wykazano, że w komórkach MDA-MB-231 o wysokim poziomie CPR zmniejsza się ilość NADPH, który, po pierwsze, niweluje powstawanie ROS, a po drugie, bierze udział w katabolizmie 5-FU. Stąd przypuszcza się, że przy wysokim poziomie CPR detoksykacja 5-FU i procesy naprawcze DNA są zaburzone, a cytotoksyczność leku wzrasta. W tej samej pracy pokazano również, że doksorubicyna w warunkach podwyższonej ekspresji CPR jest dużo bardziej cytotoksyczna [Martinez i wsp., 2008]. Jak widać na podstawie powyższych doniesień różny poziom reduktazy cytochromu P5450 może wpływać nie tylko na metabolizm leków, ale również na funkcjonowanie całej komórki i działanie związków, w biotransformacji których CPR nie bierze udziału. 2.1.3 UDP-glukuronylotransferazy (UGT) Jedną z grup enzymów zaangażowaną w II fazę metabolizmu są UDPglukuronylotransferazy (UGT). Białka te zwiększają polarność detoksyfikowanych związków poprzez dołączenie do ich grup funkcyjnych kwasu glukuronowego pochodzącego z cząsteczki UDPGA. Enzymy UGT zaangażowane są w metabolizm endo- i egzogennych związków, w tym wielu leków często stosowanych w klinice [Fedejko i Mazerska, 2011]. Skupiają one coraz większą uwagę, gdyż jako enzymy detoksykacyjne odpowiedzialne są za usuwanie szkodliwych substancji z komórek, nadmiaru endogennych związków oraz metabolitów wielu ksenobiotyków, a zatem są niezwykle ważne dla funkcjonowania całego organizmu. Coraz więcej jest doniesień pokazujących, że w komórkach nowotworowych ekspresja niektórych izoenzymów UGT zostaje zaburzona. Różny polimorfizm i aktywność tychże białek ma również wpływ na skuteczność przyjętej terapii, gdyż poprzez metabolizm detoksykacyjny leki mogą zostać szybciej usunięte z organizmu, a zatem ich działanie zostaje znacząco ograniczone. Pojawiają się także informacje mówiące, że glukuronidacja związku może zwiększać jego aktywność [Ritter, 2000]. Związki, których glukuronidy są aktywniejsze od wyjściowych form to: retinol, kwas retinowy, naturalne i syntetyczne estrogeny [Ritter, 2000] i najbardziej znana, morfina [Paul i wsp., 1989].

Część teoretyczna 23 Przedstawione poniżej przykłady wpływu ekspresji białek UGT na skuteczności terapii i procesy zachodzące w ciele pacjenta pokazują, że enzymy te pełnią rolę ochronną i wyższa ekspresja ma korzystny wpływ na zdrowie ludzi. a. UGT1A1 Enzymem, w przypadku którego idea terapii ukierunkowanej została już wdrożona, jest UGT1A1 [O Dwyer i Catalano, 2006; Palomaki i wsp., 2009]. Białko to odpowiada za metabolizm detoksykacyjny irinotekanu, leku często stosowanego w leczeniu nowotworu odbytu. UGT1A1 przekształca aktywną formę irinotekanu (SN-38) w glukuronid (SN-38G), który nie wykazuje żadnej aktywności terapeutycznej i nie jest szkodliwy dla organizmu. Zbyt długa ekspozycja organizmu pacjenta na związek SN-38 ma bardzo niekorzystny wpływ na zdrowie chorego. Stąd istotne jest, by wiedzieć, jak szybko podana dawka leku zostanie zmetabolizowana i wydalona. Aktywna forma irinotekanu ulega dezaktywacji głównie przy udziale enzymu UGT1A1. W mniejszym stopniu za metabolizm leku odpowiedzialne są formy: 1A6, 1A7, 1A9 oraz 1A10. Do tej pory zidentyfikowano aż 63 warianty izoenzymu UGT1A1. Zmieniony poziom białka i jego aktywność enzymatyczna ma istotny wpływ na wydajność detoksykacji irinotekanu [Palomaki i wsp., 2009]. Określono kilka form polimorficznych UGT1A1, w przypadku których stopień przemiany leku jest mniejszy, a podawana dawka chemoterapeutyku powinna być zmieniona [Mercuello i wsp., 2009]. Najbardziej znacząca różnica w aktywności UGT1A1 obserwowana jest dla wariantu *28. U osób z tym wariantem izoenzymu UGT1A1 (osoby takie nazywane są TA 7) lek jest dużo wolniej usuwany z organizmu. Dlatego przed podaniem irinotekanu, genotyp pacjentów sprawdzany jest pod kątem obecności wariantu *28 CYP1A1, a chory z homozygotyczną forma polimorficzną enzymu otrzymuje zmniejszoną dawkę leku [O Dwyer i Catalano, 2006]. Nie tylko dla izoenzymu UGT1A1, ale również dla pozostałych białek biorących udział w metabolizmie irinotekanu, jak UGT1A7, UGT1A9 podaje się, że ich genotypowanie może być również przydatne w przewidywaniu skuteczności leczenia nowotworu odbytu z użyciem irinotekanu [Marcuello i wsp., 2009, Carlini i wsp., 2005]. Co ciekawe, na temat jednego z nich, UGT1A7, pojawiło się doniesienie, że jedna z form polimorficznych występuje dość często u pacjentów z nowotworem odbytu i może stać się potencjalnym czynnikiem ryzyka i być w pewien sposób zaangażowana w proces nowotworzenia [Strassburg i wsp., 2002]. W roku 2004 zaproponowano enzym UGT1A1 jako czynnik prognostyczny rozwoju nowotworu macicy. Białko to odpowiada za inaktywację endogennego estradiolu i jego utlenionych metabolitów. Jeden z jego metabolitów, 2-hydroksyestradiol, ma właściwości antyproliferacyjne. Przypuszcza się, że obniżona ekspresja UGT1A1 może zmniejszać ryzyko wystąpienia nowotworu macicy poprzez obniżenie stopnia wydzielania 2-hydroksyestradiolu [Duguay i wsp., 2004]. Do tej pory hipoteza ta jednak nie została zweryfikowana.

Część teoretyczna 24 Pojawiły się jednak doniesienia, że polimorfizm enzymu UGT1A1 może mieć znaczenie przy rozwoju nowotworu piersi. Kobiety homozygoty jednej z form polimorficznych enzymu UGT1A1 charakteryzującej się zmniejszoną aktywnością katalityczną, były bardziej narażone na wystąpienie tego rodzaju raka. Wynika to z faktu, iż forma 1A1 białek UGT jest zaangażowana w glukuronidację estrogenów. Zbyt wysokie stężenie hormonów może przyczyniać się do rozwoju nowotworu. Po menopauzie i wraz z wiekiem aktywność metaboliczna enzymów zmienia się, stąd też starsze kobiety są bardziej narażone na wystąpienie zmian nowotworowych [Guillemette i wsp., 2004]. b. UGT2B15/2B17 Mutacja genów kodujących enzymy UGT2B15 oraz UGT2B17 może być związana z większym ryzykiem wystąpienia niektórych typów nowotworu, a zmniejszona ekspresja i aktywność enzymów może być bezpośrednio zaangażowana w proces nowotworzenia. Enzymy te biorą udział w przekształcaniu hormonów estrogenowych i androgennych w glukuronidy, które są mniej aktywne i bardzo szybko usuwane z komórek. Przy zachwianym poziomie hormonów i ich metabolitów może dojść do rozwoju nowotworów w tkankach, w których hormony te są wydzielane [Guillemette i wsp., 2004]. Zależności między poziomem ekspresji obu enzymów a ryzykiem wystąpienia nowotworu wykazano w przypadku raka prostaty tutaj wyższa aktywność enzymu chroniła tkanki przed wysokimi stężeniami hormonów androgennych, a tym samym przed niepożądanymi zmianami [Barbier, 2009]. U osób, które wykazywały polimorfizm genu UGT2B15 i posiadały formę enzymu o niższej aktywności, ryzyko wystąpienia choroby nowotworowej zwiększało się [Park i wsp., 2004]. W przypadku raka piersi wysoki poziom UGT2B15 zmniejszały ryzyko powrotu choroby nowotworowej oraz zwiększały szanse na przeżycie pacjenta [Harrington i wsp., 2006]. 2.1.4 Sulfotransferazy (SULT) Następnym przykładem enzymów zaangażowanych w II fazę metabolizmu ksenobiotyków, a których poziom może wpływać na śmierć komórek traktowanych lekiem przeciwnowotworowym, jest rodzina sulfotransferaz (SULT). Enzymy te odpowiedzialne są za eliminację z ustroju wielu endo- i egzogennych związków, takich jak: hormony, neurotransmitery, leki czy inne ksenobiotyki, poprzez dołączenie do nich grupy sulfonowej. Reakcja ta zwiększa rozpuszczalność związków, które dużo łatwiej mogą być usunięte przez nerki, choć nie musi to oznaczać, że związek traci swą aktywność. Podobnie jak wykazano to dla enzymów z rodziny UGT, również białka SULT mogą zwiększać cytotoksyczność leków. Wiele badań dowodzi, że

Część teoretyczna 25 różny poziom i polimorfizm sulfotransferaz może również wpływać na prognozę leczenia pacjenta oraz na skuteczność terapii [Dalhoff i wsp., 2005]. a. SULT1A1 Zależność między poziomem ekspresji a skutecznością leczenia nowotworów wykazano dla sulfotransferazy 1A1 (SULT1A1). Dowiedziono, że dla tamoksyfenu podwyższony poziom SULT jest korzystny dla terapii przeciwnowotworowej stosującej ten związek. Obserwacji takich dokonano dla jednej z izoform tego białka, SULT1A1. Enzym ten odpowiada za sulfonację produktu metabolizmu przeprowadzanego przez cytochrom P450 pochodnej 4-hydroksytamoksyfenu (4-OHT). Doświadczenia przeprowadzono na ludzkich komórkach raka piersi, MCF-7 linii kontrolnej z wektorem zerowym, oraz wykazującej nadekspresję SULT1A1. Zaobserwowano, że w rekombinantowych komórkach traktowanych tamoksyfenem w stężeniu fizjologicznym dochodziło do spadku proliferacji komórek o 30%. Przy wyższym stężeniu metabolitu związku (stężenie 4-OHT równe 2 µm) po 24 godzinnej inkubacji następował 80% wzrost populacji komórek, w których indukowana była apoptoza, w stosunku do komórek kontrolnych nie wykazujących nadekspresji. Zaobserwowano również wzrost w poziomie endonukleazy G, która uczestniczy w aktywacji szlaku apoptozy niezależnej od kaspaz. Zatem wyższy poziom sulfotransferazy SULT1A1 przyspieszał śmierć komórek nowotworowych traktowanych tamoksyfenem [Mercer i wsp., 2011]. W związku z przeprowadzanym przez sulfotransferazy metabolizmem hormonów estrogenowych, enzymy te mogą być pośrednio zaangażowane w promocję nowotworu piersi zależnego od obecności estrogenu. Większy poziom SULT1A1, jak również steroidowej sulfatazy (STS) oraz estrogenowej sulfotransferazy 1E1 (EST1E1) zwiększa ryzyko choroby nowotworowej. Podobne korelacje zaobserwowano między poziomem SULT1A1 u pacjentów a ryzykiem wystąpienia u nich raka prostaty [Pare i wps., 2009]. Jak widać na podstawie wyżej przedstawionych badań, również podwyższony poziom enzymów II fazy metabolizmu sulfotransferaz może zmieniać odpowiedź biologiczną komórek traktowanych związkami przeciwnowotworowymi. Co więcej, dla coraz większej liczby typów nowotworów zauważa się zależność między ekspresją tych enzymów a ryzykiem wystąpienia choroby.

Część teoretyczna 26 2.2 Systemy ekspresyjne enzymów metabolizujących Z przedstawionych powyżej doniesień literaturowych jednoznacznie wynika, że poziom enzymów metabolizujących ksenobiotyki ma istotne znaczenie dla szlaków aktywacyjnych i detoksykacyjnych leków, transformacji związków endogennych oraz dla procesów wewnątrzkomórkowych zaangażowanych w przeżycie i śmierć komórki. Zależności te są niezwykle istotne z punktu widzenia terapii, w tym przeciwnowotworowej, a nawet samego procesu nowotworzenia. Dlatego też ważnym jest, by w pogłębianiu wiedzy dotyczącej powyższych zagadnień, posługiwać się odpowiednimi narzędziami eksperymentalnymi. Istnieje kilka systemów in vitro stosowanych do badania metabolizmu leków i ich wpływu na ekspresję enzymów metabolizujących i odpowiedź komórkową. W praktyce stosuje się: mikrosomy wyizolowane z ludzkiej wątroby (ang. human liver microsomes, HLM), frakcję cytozolową oraz frakcję S9 ludzkiej wątroby, a także hepatocyty, głównie pierwotne ludzkie hepatocyty. Każdy z tych systemów ma jednak swoje wady. Najlepsze wyniki osiąga się wykorzystując pierwotne hepatocyty, które w pełni pozwalają odtworzyć szlaki biotransformacji, jakim podlega lek w organizmie chorego. Jednak krótki czas życia oraz genetyczna niestabilność pierwotnych hepatocytów (spadek ekspresji enzymów CYP i innych białek metabolizujących leki) uniemożliwiają prowadzenie badań w szerszym zakresie. Z kolei w wyizolowanych komórkach wątroby lub mikrosomach nie zawsze dochodzi do ekspresji wszystkich enzymów metabolizujących lub ich poziom jest zbyt niski, by efektywnie badać ich rolę [Hariparsad i wsp., 2006]. Powszechnym stało się zatem stosowanie stabilnych linii komórek nowotworowych [Gomez-Lechon i wsp., 2008; Sharma i wsp., 2010]. Najczęściej stosowanymi liniami komórkowymi otrzymanymi z ludzkich nowotworów są: linia HepG2, wyprowadzona z nowotworu wątroby, linia IGROV-1, wyprowadzona z nowotworu jajnika oraz dwie linie wyprowadzone z nowotworu okrężnicy: Caco-2 i LS180 [Brandon i wsp., 2006]. Jednak poziom ekspresji izoenzymów cytochromu P450 w tych komórkach, zwłaszcza w HepG2, jest stosunkowo niski [Westerink i Schoonen, 2007]. Od niedawna coraz częściej stosowaną linią komórkową w badaniach nad metabolizmem i toksycznością leków jest linia HepaRG [Josse i wsp., 2008]. Została ona wyprowadzona z komórek wątroby pacjentki chorej na raka wątroby. Komórki te charakteryzują się wysoką ekspresją najważniejszych izoenzymów cytochromu P450 (CYP1A2, 2B6, 2D6, 2E1, 3A4) oraz enzymów zaangażowanych w II fazę metabolizmu leków i białek transportujących z rodziny ABC [Gomez-Lechon i wsp., 2008; Josse i wsp., 2008]. Oprócz wspomnianych wyżej systemów i linii komórkowych do badania metabolizmu leków i ich wpływu na funkcjonowanie komórki stosuje się wiele innych i różnorodnych komórek, w których w sposób sztuczny uzyskano nadekspresję białek cytochromu P450 lub innych

Część teoretyczna 27 enzymów metabolizujących [Gomez-Lechon i wsp., 2008]. Poniżej przedstawiłam opracowane i opisane dotychczas w literaturze modele komórkowe, w których udało się osiągnąć nadekspresję białek CYP lub innych enzymów zaangażowanych w metabolizm leków. Do systemów tych należą komórki: bakterii, drożdży, komórki owadów oraz komórki ssaków, w tym ludzkie [Purnapatre i wsp., 2008]. Opracowanie rekombinantowych modeli w znaczącym stopniu ułatwiły pracę w badaniach nad metabolizmem leków. 2.2.1 Pierwsze modele komórkowe o stabilnej ekspresji ludzkich białek metabolizujących ksenobiotyki Do badania biotransformacji leków wygodnym modelem są rekombinantowe enzymy. Otrzymuje się je stosując modele komórkowe jako systemy ekspresyjne, do których należą: bakterie, drożdże, komórki owadów oraz ssaków. Pierwszymi modelami komórkowymi, jakie posłużyły do otrzymania rekombinantowych enzymów, były komórki bakteryjne. Później zastosowano komórki drożdżowe i owadzie. Wadą tych systemów jest to, że w nieco inny sposób niż w komórkach ludzkich przebiegają w nich procesy transkrypcji, translacji oraz potranslacyjna modyfikacja białka. Ponadto, poziom pozostałych enzymów metabolizujących leki jest inny lub zmieniony. Niekiedy należało wprowadzić do nich dodatkowe geny, których brak jest w transfekowanym systemie ekspresyjnym [Purnapatre i wsp., 2008]. Mimo wielu wad, jakimi cechują się bakteryjne, drożdżowe i owadzie modele komórkowe, z powodzeniem przeprowadzono na nich wiele badań dotyczących metabolizmu leków i nadal stosuje się je do izolacji rekombinantowych enzymów cytochromu P450 oraz UDP-glukuronylotransferaz [Hariparsad i wsp., 2006]. a. Bakterie Escherichia coli jest szczepem bakterii, który najczęściej służy jako model komórkowy do transfekcji. Inny gatunek bakterii, który stosuje się jako system ekspresyjny to Salmonella typhimurium [Kamataki, 2006]. Dzięki zastosowaniu bakteriofagów wirusów atakujących bakterie, do komórek bakterii można łatwo wprowadzać różne rodzaje wektorów o silnych promotorach. Cały proces transfekcji komórek, aż do osiągnięcia stabilnej ekspresji wprowadzanego białka, jest stosunkowy szybki trwa około 3 miesięcy i jest również mało kosztowny [Pritchard i wsp., 2006]. Podobnie, utrzymanie hodowli komórkowej nie wymaga wysokich nakładów finansowych. Komórki rosną szybko, w zawiesinie o dużej gęstości i w standardowych mediach hodowlanych [Guengerich i Martin, 2006; Hanlon i wsp., 2007], do których należy jedynie dodawać prekursor hemu, niezbędny do katalitycznej aktywności białek cytochromu P450 [Yun i wsp., 2006]. Bakterie służą jako system ekspresyjny przede wszystkim

Część teoretyczna 28 dla białek cytochromu P450. Izolację i oczyszczanie białek CYP można przeprowadzić w łatwy sposób [Guengerich i Martin, 2006]. Główną wadą tego systemu ekspresyjnego jest to, że potranslacyjna modyfikacja białek przebiega inaczej niż w komórkach ludzkich. Wymagana jest tutaj modyfikacja N-terminalnej sekwencji białka (zwiększenie zawartości par AT) [Gillam, 2008; Yun i wsp., 2006]. Modyfikacja ta zapobiega formowaniu się drugorzędowych struktur, co także zwiększa rozpuszczalność białek [Gillam, 2008]. Podczas hodowli komórek należy zapewnić odpowiednią temperaturę i ph w celu inkorporacji hemu i prawidłowego fałdowania się białka. Z kolei do osiągnięcia katalitycznej aktywności białek cytochromu P450 w bakteriach niezbędne jest wprowadzanie dodatkowych wektorów z genami kodującymi białka odpowiedzialne za transfer elektronów reduktazę cytochromu P450 oraz cytochrom b5. Wykazano również, że ekspresja białek CYP w komórkach E. coli zachodzi lepiej przy zapewnieniu niższego stężenia tlenu podczas hodowli (poniżej 1%) [Venkatakrishnan i wsp., 2001], a aktywność katalityczna izoenzymów jest wyższa przy dodatku egzogennej reduktazy cytochromu P450 [Yamazaki i wsp., 2002]. Komórki bakterii posłużyły jako system ekspresji następujących ludzkich białek cytochromu P450: CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4 [Gillam, 2008; Yamazaki i wsp., 2002]. W komórkach E. coli osiągnięto również wysoką nadekspresję niektórych białek z rodziny UDPglukuronylotransferaz: UGT1A6 [Ouzzine i wsp., 1994] oraz UGT2B7 [Miley i wsp., 2007]. b. Drożdże Komórki drożdży, to kolejny system ekspresyjny, w którym udało się uzyskać stabilną i bardzo wydajną ekspresję ludzkich białek cytochromu P450. Gatunki, które poddaje się transfekcji to: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe lub Yarrowia lipolytica (też należący do rodzaju Saccharomyces). Drożdżowy model ma więcej zalet niż opisany wcześniej system bakteryjny. Proces transfekcji przebiega tutaj również szybko (około 3 miesięcy), a hodowla komórek oraz izolacja rekombinantowego białka nie sprawiają większych trudności. Synteza białka, jego fałdowanie i usytuowanie w błonie przebiegają identycznie jak w komórkach ssaków. Dzięki endogennej błonowej sekwencji kotwiczącej białko zostaje zintegrowane z retikulum endoplazmatycznym. Co więcej, nie jest wymagana modyfikacja N-terminalnej sekwencji cdna kodującej białko, jak w systemie bakteryjnym. Mikrosomy otrzymane z drożdży są bogate w enzymy cytochromu P450 [Cheng i wsp., 2006]. Główną wadą drożdżowego systemu ekspresyjnego jest to, że w komórkach tych ekspresja endogennych białek transferu elektronów, czyli reduktazy cytochromu P450 oraz cytochromu b5 zachodzi na zbyt niskim poziomie, by doszło do katalitycznej aktywacji białek CYP. Podobnie jak w systemie bakteryjnym, również do komórek drożdży wprowadza się dodatkowy plazmid kodujący te białka. Niezbędne jest także wzbogacenie podłoża hodowlanego w prekursor hemu [Cheng i wsp., 2006].

Część teoretyczna 29 Mimo wielu zalet, drożdże, w porównaniu do bakterii, są mniej powszechnym modelem komórkowym wykorzystywanym do ekspresji ludzkich białek cytochromu P450. Przyczyną tego może być to, iż hodowla bakterii oraz ich transfekcja jest mniej skomplikowana oraz wymaga mniejszych nakładów finansowych niż hodowla drożdży. Ponadto bakterie nie mają endogennych enzymów cytochromu P450, a ekspresja rekombinantowych CYPów zachodzi na wyższym poziomie niż w drożdżach [Andrews i wsp., 2002; Schroer i wsp., 2010]. Co więcej, w przeciwieństwie do komórek drożdży, komórki bakterii można zastosować do produkcji rekombinantowych ludzkich białek cytochromu P450 na dużą skalę preparatywną, które stosuje się zarówno w badaniach biooksydacyjnych, jak i w produkcji metabolitów [Hanlon i wsp., 2007]. Wiele zespołów naukowych na świecie stosuje jednak drożdżowy model ekspresyjny do badania metabolizmu leków. W komórkach drożdży osiągnięto ekspresję m.in. następujących ludzkich białek CYP: CYP1A1 [Yasuda i wsp., 2010], CYP1A2 [Guo i wsp., 2006], CYP2A6, CYP2B6 [Yasuda i wsp., 2010], CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19 [Narimatsu i wsp., 2006; Yasuda i wsp., 2010], CYP2D6 [Yasuda i wsp., 2010], CYP2E1 [Hanloka i wsp., 2010] oraz CYP3A4 [Andrews i wsp., 2002; Cheng i wsp., 2006; Narimatsu i wsp., 2006; Yasuda i wsp., 2010]. Drożdżowy system ekspresyjny nie jest powszechnie stosowany do transfekcji genami innych białek metabolizujących. c. Komórki owadzie Model ekspresyjny owadzi jest bardzo często stosowany do produkcji białek rekombinantowych, za to nieco mniej powszechny w badaniach laboratoryjnych. Zalety stosowania komórek owadzich są podobne jak w przypadku komórek drożdżowych. Gen kodujący białka cytochromu P450 wprowadza się z użyciem bakulowirusa, a jego inkorporacja zachodzi w prawidłowym miejscu we wnętrzu komórki gospodarza. Sama transfekcja jest łatwa i szybka trwa 2-3 miesiące. Komórki owadzie, które najczęściej używa się do transfekcji, to: Spodoptera frugiperda (Sf9) lub Trichoplusia ni (T.ni). W komórkach owadzich ekspresja białka przebiega podobnie jak w komórkach ludzkich, stąd nie jest wymagana modyfikacja sekwencji cdna [Lee i wsp., 1994]. Poziom ekspresji białek cytochromu P450 lub innych jest analogiczny jak we wcześniej opisanych systemach [Buters i wsp., 1994]. Co więcej, komórki owadzie są pozbawione endogennych białek cytochromu P450, a to zwiększa skuteczność badań nad metabolizmem leków w tym systemie [Hariparsad i wsp., 2006]. Podobnie jak w systemie bakteryjnym i drożdżowym, główną wadą modelu komórkowego opartego na bakulowirusie jest niski poziom endogennych enzymów transferu elektronów, w tym reduktazy cytochromu P450. Problem ten rozwiązano wprowadzając do komórki owadziej drugi wektor niosący gen tego enzymu lub tworząc jeden podwójny wektor, zawierający izoenzym i reduktazę cytochromu P450 [Crespi i Penman, 1997]. Do pożywki hodowlanej dodaje się prekursor hemu, lecz mimo to, w części populacji komórek owadzich może brakować apoproteiny w strukturze hemu

Część teoretyczna 30 [Venkatakrishnan i wsp., 2001]. Buters i wsp. jako pierwsi opracowali komórki owadzie z ludzkimi białkami cytochromu P450 [Buters i wsp., 1994]. Z kolei firma Gentest, obecnie dział firmy BD Biosciences (Woburn, USA) stworzyła komórki owadzie, z których uzyskują mikrosomy większości białek zaangażowanych w metabolizm związków egzo- i endogennych. Handlowa nazwa tych mikrosomów to Supersome. Rekombinantowe białka cytochromu P450, jakie można od nich zakupić to: CYP1A1, CYP1A2, CYP2A5, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C9, CYP2D6, CYP3A4, CYP2E1 [Kazui i wsp., 2010; Pearce i wsp., 2008]. W ofercie firmy znajdują się również mikrosomy bogate w enzymy innych rodzin: monooksygenaz flawinowych (FMO), oksydaz monoaminowych (MAO), UDP-glukuronylotransferaz (UGT) oraz N-acetylotransferaz (NAT) [Catalog information, BD Bioscence]. 2.2.2 Ssacze modele komórkowe o podwyższonej ekspresji enzymów metabolizujących ksenobiotyki Pierwsze komórki ssacze o podwyższonej ekspresji białek cytochromu P450 opracowano w 1986 r. w USA, pod kierunkiem M. Watermana [Zuber i wsp., 1986]. Model komórkowy jaki poddano transfekcji to komórki COS-1, czyli unieśmiertelnione komórki nerki pochodzące od afrykańskiej małpy zielonej. W genomie tych komórek znajduje się materiał genetyczny małpiego wirusa SV40, dzięki czemu łatwiej ulegają one transfekcji tym właśnie wirusem. Od tamtej pory udało się stworzyć wiele innych ssaczych, w tym ludzkich, linii komórkowych o podwyższonej ekspresji nie tylko białek cytochromu P450, ale również enzymów metabolizujących ksenobiotyki z innych rodzin. Główną zaletą każdego systemu ssaczego jest to, że powstające w nim białko ma budowę taką jak w komórce ludzkiej. Wewnątrzkomórkowe mechanizmy pozwalają na odpowiednie umiejscowienie białek cytochromu P450 w retikulum endoplazmatycznym. Są tam obecne enzymy odpowiedzialne za transfer elektronów, a także te biorące udział w II fazie metabolizmu. Dzięki temu można badać transformację leków, ich toksyczność i wpływ na procesy zachodzące w komórce. Nie jest wymagana dodatkowa transfekcja komórek wektorami zawierającymi geny kodujące reduktazę cytochromu P450 oraz cytochromu b5 [Purnapatre i wsp., 2008], chociaż niektóre badania dowodzą, że dla lepszego funkcjonowania izoenzymów cytochromu P450 korzystne jest wprowadzenie dodatkowej egzogennej reduktazy [Ding i wsp., 1997; Gomez-Lachon i wsp., 2008]. Dzięki ludzkim transgenicznym liniom komórkowym można dokładnie śledzić pojedyncze reakcje przeprowadzane przez konkretny enzym. Pozwala to określić wpływ danego białka na biotransformację leku i cytotoksyczność powstających metabolitów. Transfekowane komórki są przydatne w izolacji właściwych aktywnych

Część teoretyczna 31 metabolitów, do określenia ich struktury, charakterystyki farmakologicznej i możliwych interakcji lek lek [Hariparsad i wsp., 2006]. Stosowane od ponad dwóch dekad metody transfekcji można podzielić na dwie grupy: (i) oparte na rekombinantowych nośnikach wirusowych oraz (ii) niewirosowe metody transfekcji. Pierwszy sposób transfekcji jako środek niosący DNA wykorzystuje wirusy. Do najczęściej stosowanych wirusów należą: wirus HSV (ang. herpes simplex virus), adenowirusy (AdV), wirusy zależne od adenowirusów (AAV, ang. Adeno-associated virus), wirusy vacinia czy hepatis. Metoda ta jest bardzo wydajna, skuteczna, jednak istnieje ryzyko rekombinacji genetycznej i mutacji typu insert. Nośniki wirusowe są również bardziej toksyczne dla transfekowanych komórek. Stąd coraz częściej stosowane są systemy oparte na niewirusowych nośnikach. Najbardziej popularne to: kompleksy DNA z fosforanem wapnia (precypitacja z fosforanem wapnia), nośniki liposomalne (np. Lipofektamina ), nośniki polimerowe (polistyren, chitozan, polietylenoimina PEI, polietylen glikolu PEG) czy nanocząstki. Często stosowaną metodą, bardzo wydajną i mało toksyczną dla komórek jest elektroporacja, czyli przejściowe, krótkotrwałe uszkadzanie błony komórkowej pod wpływem przyłożonego wysokiego napięcia [Douglas, 2008; Washobourne i McAllister, 2002]. DNA do komórek wprowadzane jest za pomocą różnych wektorów, które mają początek replikacji, ori (z ang. origin) zarówno prokariotyczny (niezbędny w celu namnożenia plazmidu w komórkach bakterii) oraz eukariotyczny, dzięki czemu geny mogą ulec ekspresji w komórkach Eukariotów. Metody transfekcji wykorzystują wektory oparte na takich wirusach, jak: SV40 do transfekcji komórek COS-1 czy CHO, wirus krowianki do komórek HepG2 lub wirus Epsteina- Barr do ludzkich limfocytów B. Te ostatnie komórki stały się dobrym systemem do przemysłowej produkcji białek cytochromu P450 [Purnapatre i wsp., 2008]. Dostępne są także komercyjne wektory ekspresyjne, jak np. pcdna3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i pcmv (Origene, Rockville, MD, USA), które można stosować do transfekcji przejściowej lub stałej. W sprzedaży są też wektory zawierające geny reporterowe jak GFP czy Myc/DDK. Firma Invitrogen stworzyła również platformę, w której samodzielnie można opracować plazmid ekspresyjny, który będzie nośnikiem genu kodującego wybrane przez klienta białko. Tworzenie ssaczych systemów ekspresyjnych białek metabolizujących jest najtrudniejszą metodą spośród wszystkich opisanych wyżej modeli. Cały proces transfekcji trwa około 6 miesięcy, a jego koszty są stosunkowo wysokie, głównie ze względu na utrzymanie hodowli komórek (wysoka cena podłoży hodowlanych i odczynników do podtrzymania nadekspresji), co jest niewątpliwie wadą tego systemu ekspresyjnego [Hariparsad i wsp., 2006; Purnapatre i wsp., 2008]. Większość z opracowanych transgenicznych linii komórkowych jest jednak równie prosta w hodowli jak linie macierzyste, z których powstały [Gomez-Lachon i wsp., 2008]. Poziom ekspresji białek metabolizujących jest w ssaczym modelu komórkowym dużo

Część teoretyczna 32 niższy niż w systemach opisanych wcześniej. Z tego względu ssacze komórki nie są stosowane do produkcji izoenzymów na skalę komercyjną [Purnapatre i wsp., 2008]. Poziom białek cytochromu P450 czy innych enzymów w transfekowanych liniach jest jednak wystarczająco wysoki, by można przeprowadzać na nich badania metabolizmu w warunkach laboratoryjnych. W Tabeli 1 przedstawiłam ssacze, w tym ludzkie linie komórkowe, w których otrzymano nadekspresję enzymów zaangażowanych w I i II fazę metabolizmu ksenobiotyków. Zastosowanie i metodykę opracowywania poszczególnych linii opisałam w kolejnych podrozdziałach. Tabela 1 Zestawienie linii komórkowych, w których otrzymano nadekspresję enzymów I i II fazy metabolizmu Linia komórkowa Enzymy I fazy metabolizmu Enzymy II fazy metabolizmu V79 CYP: 1A1, 1B1, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 UGT: 1A6, 1A9 CHO CYP: 1A1, 1A2, 2A6, 2A13, 2D6 (+CPR), 3A4 (+CPR) CPR CHL CYP: 1A2, 2E1, 3A4, 3A7 > +CPR LLC-PK1 CYP3A4 (+MDR1) AHH-1 TK+/- CYP: 1A1, 1A2, 2A6, 2B6, 2C6, 2C9, 2D6, 2E1, 3A4 Caco-2 HEK293 (AD-293) HeLa CYP: 2A6, 3A4 CYP: 1A1, 1A2, 2C8, 2C9 CYP2B1 (+CPR) CYP3A4 (+CPR) CYP3A5 (+CPR) CYP3A7 (+CPR) UGT: 1A1, 1A3, 1A4, 1A8, 1A10, 2B4, 2B7, 2B10, 2B11, 2B15, 2B17, 2B28 UGT1A9 HepG2 CYP: 1A1, 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2E1, 3A4 Hep3B CYP: 2D6, 3A4 MCF-7 CYP1A1 CYP: 1A1, 2A6, 2D6, 3A4 > +CPR GST: Alpha 2, Mu SULT1A1 MDA-MB-231 CPR SULT1A1 1847 CYP3A4 +CPR

Część teoretyczna 33 a. Komórki COS Jak już wspomniano wyżej, komórki COS były pierwszą ssaczą linią komórkową o podwyższonej ekspresji izoenzymów cytochromu P450. Najczęściej wykorzystuje się dwie linie: COS-1 i COS-7. Stosując te komórki udało się stworzyć linię o zwiększonej ekspresji 17-α-hydroksylazy cytochromu P450 [Gonzalez i Korzekwa, 1996]. Pojawiło się również kilka doniesień na temat nadekspresji innych hydroksylaz cytochromu P450, brak jest jednak informacji o komórkach COS z nadekspresją enzymów cytochromu P450 zaangażowanych w metabolizm leków. b. Komórki V79 Pierwsza publikacja przedstawiająca zastosowanie komórek chomika chińskiego jako systemu ekspresyjnego białek cytochromu P450 ukazała się w 1988 r. [Doehmer i wsp., 1988]. Komórki linii V79 to fibroblasty płuc chomika chińskiego, które zastosowano ze względu na łatwą i powszechnie wykonywaną w tych komórkach modyfikację genetyczną. Komórki te, choć nie wykazują aktywności enzymatycznej cytochromu P450, mają endogenną reduktazę cytochromu P450. Komórki V79 transfekowano za pomocą wektora psv2 pozostającego pod kontrolą promotora wirusa SV40. Pierwsza linia rekombinantowa wykazywała ekspresję szczurzego izoenzymu P-450IIB1 [Doehmer i wsp., 1988]. W następnych latach opracowano linie V79 z ekspresją następujących ludzkich izoenzymów cytochromu P450 oraz UGT: CYP1A1 [Kushman i wsp., 2007a], CYP1B1 [Kushman i wsp., 2007b], CYP2D6 [Bogni i wsp., 2005], CYP3A4, CYP3A5 [Peng i wsp., 2006], CYP2E1 [Liu i Glatt, 2010], UGT1A6 i UGT1A9 [Ren i wsp., 2000]. c. Komórki CHO Zespół T. Friedberga z Uniwersytetu w Dundee w Szkocji wykorzystał do transfekcji inny typ komórek chomika chińskiego komórki linii CHO, wywodzące się z unieśmiertelnionych komórek jajnika chomika chińskiego. Komórki te są powszechnie stosowane w przemyśle jako system ekspresyjny do produkcji wielu rodzajów białek, dzięki możliwości ich łatwej transfekcji. Wspomniałam wcześniej, że w komórkach ssaczych są obecne enzymy transferu elektronów. Przypuszczano jednak, że mała aktywność metaboliczna białek cytochromu P450 wprowadzanych do komórek może wynikać z niewystarczającej ilości reduktazy, która przywraca równoważniki do reakcji przeprowadzanych przez cytochrom P450. Z tego też względu zwiększono jej pulę wprowadzając egzogenną reduktazę [Ding i wsp., 1997]. Pierwsza opracowana transgeniczna linia komórkowa CHO wykazywała koekspresję ludzkiego izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 i NADPH reduktazy cytochromu P450 [Ding i wsp., 1997]. Opracowano również linie komórkowe wykazujące pojedynczą nadekspresję reduktazy lub

Część teoretyczna 34 izoenzymu CYP3A4. Stworzono także analogiczny system ekspresyjny w komórkach CHO dla izoenzymu CYP2D6 [Smith i wsp., 1998]. Wspomniane linie są nadal powszechnie stosowane [Chen i wsp., 2005; Lu i wsp., 2009]. W innych ośrodkach naukowych opracowano komórki CHO z nadekspresją następujących ludzkich izoenzymów cytochromu P450: CYP1A1 [Bendaly i wsp., 2007], CYP1A2 [Metry i wsp., 2007], CYP2A6, CYP2A13 [He i wsp., 2006], jak również z samą reduktazą [Fussel i wsp., 2011]. d. Komórki CHL Unieśmiertelnione komórki płuc chomika chińskiego linia CHL, to kolejny przykład zastosowania komórek chomika jako systemu ekspresyjnego białek cytochromu P450 [Hashimoto i wsp., 1997]. Komórki CHL transfekowane były plazmidem psr metodą koprecypitacji z fosforanem wapnia. Tutaj również, oprócz izoenzymów cytochromu P450, do komórek dodatkowo wprowadzano reduktazę cytochromu P450 pochodzącą od świnki morskiej. W ten sposób uzyskano komórki CHL z koekspresją reduktazy cytochromu P450 z następującymi ludzkimi izoenzymami: CYP1A2, CYP2E1 [Sawada i Kamataki, 1998], CYP3A4 [Chen i wsp., 2006; Hashimoto i wsp., 1997], CYP3A7 [Hashimoto i wsp., 1997]. e. Komórki LLC-PK1 Kolejny ssaczy model ekspresyjny białek cytochromu P450 to komórki LLC-PK1 świńskie komórki nabłonkowe nerki, do których wprowadzono gen kodujący ludzki izoenzym CYP3A4. Komórki te wybrano do transfekcji ze względu na wysoką ekspresję białka oporności wielolekowej P-glikoproteiny (MDR1). Dzięki temu można było badać interakcje, jakie zachodzą między aktywnością białka CYP3A4 a MDR1. Za pomocą adenowirusa AdV, używając kilku różnych wektorów lub wirusa Epsteina-Barr z wektorem p220.2 z silnym promotorem wirusa CMV, wprowadzono do komórek LLC-PK1 gen CYP3A4 [Crespi i wsp., 2000; Schuetz, 2000], uzyskując bardzo wysoką i stabilną nadekspresję ludzkiego izoenzymu CYP3A4. 2.2.3 Ludzkie linie komórkowe z nadekspresją białek metabolizujących leki Jak dotąd opracowano niewiele ludzkich, w tym nowotworowych linii komórkowych wykazujących nadekspresję izoenzymów cytochromu P450 lub innych enzymów metabolizujących leki. Zakłada się, że poszukiwane obecnie nowe chemoterapeutyki powinny działać selektywnie na komórki nowotworowe, nie na zdrowe, zatem dużo uwagi poświęca się opracowaniu modeli z nadeskpresją enzymów właśnie w liniach nowotworowych. Najwięcej białek metabolizujących, w tym cytochromu P450 znajduje się w wątrobie. Powszechnie dostępna i stosowana linia wyprowadzona z ludzkich komórek nowotworowych wątroby, HepG2

Część teoretyczna 35 charakteryzuje się, jak już wspomniałam wyżej, niskim poziomem i aktywnością enzymów metabolizujących, zwłaszcza izoenzymu CYP3A4 [Westerink i Schoonen, 2007]. Stąd konieczne stało się poszukiwanie innych modeli i ich modyfikacja [Gomez-Lechon i wsp., 2008]. a. Komórki limfoblastyczne B Pierwsza ludzka linia komórkowa, która posłużyła do uzyskania nadekspresji białek cytochromu P450, została wyprowadzona z limfoblastów B [Gonzalez i Korzekwa, 1995]. Komórki limfoblastyczne B, zaprojektowane jako AHH 1 TK+/, to nienowotworowe, nieprzyklejające się komórki, w których w łatwy sposób zachodzi replikacja wprowadzonych do chromosomów wektorów. Komórki te zawierają pojedyncze kopie genów kinazy tymidynowej i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej, dzięki czemu stały się idealne do badań toksykologicznych. Dodatkowo w komórkach AHH-1 TH+/ znajduje się odpowiedni poziom reduktazy cytochromu P450 i cytochromu b5 wspomagających katalityczne działanie cytochromu P450. Do genomu transfekowanej komórki może zostać włączonych 5 40 kopii obcego cdna. W związku z różną liczbą kopii DNA wprowadzanych białek cytochromu P450 rekombinantowe komórki limfoblastów B są niejednorodne, a cały proces transfekcji, aż do osiągnięcia stabilnej linii jest długotrwały i żmudny [Crespi i wsp., 1993]. Wykorzystując wyżej przedstawioną technikę, opracowano komórki limfoblastów B o podwyższonej ekspresji następujących ludzkich izoenzymów: CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1 i CYP3A4. Do komórek wprowadzono dodatkowo gen kodujący mikrosomalną hydroksylazę epoksydową. Udało się otrzymać komórki wykazujące nadekspresję nie tylko pojedynczego białka cytochromu P450, lecz również ich kombinacji [Crespi i wsp., 1993]. Komórki te służą zarówno jako źródło mikrosomów [Staack i Maurer, 2005], jak i model komórkowy, na którym prowadzi się badania metabolizmu ksenobiotyków [Bodreddigari i wsp., 2008]. b. Komórki Caco-2 Zróżnicowane ludzkie komórki nowotworowe nabłonka odbytu Caco-2, to jedna z najpopularniejszych ludzkich linii nowotworowych stosowana do badania leków ich wchłaniania, transportu do wnętrza komórki oraz metabolizmu. W bazach danych można znaleźć stosunkowo najwięcej publikacji opisujących doświadczenia wykonane na tej linii komórkowej. Ze względu jednak na niski poziom endogennych białek cytochromu P450, podjęto próbę wprowadzenia dodatkowych kopii genów poszukiwanych enzymów [Li i Hidalgo, 2006]. Po raz pierwszy dwie transgeniczne linie Caco-2 opisano w 1996 r.: z nadekspresją izoenzymu CYP2A6 oraz CYP3A4. Rolę wektora pełnił plazmid p220.2 z ori replikacji dla wirusa Epsteina- Barr zawierający cdna kodujący wspomniane enzymy i pozostający pod kontrolą promotora

Część teoretyczna 36 wirusa cytomegalii. Oprócz sekwencji kodujących białka cytochromu P450, plazmidy te zawierały gen oporności na higromycynę B, dzięki czemu w łatwy sposób można było wyselekcjonować komórki rekombinantowe. Do wnętrza komórek wektory wprowadzono za pomocą elektroporacji [Crespi i wsp., 1996]. Stosując wyżej opisaną technikę w komórkach Caco-2 uzyskano stabilną nadekspresję izoenzymów CYP2A6 i CYP3A4. W porównaniu do limfoblastów B, komórki Caco-2 charakteryzują się nieco niższą aktywnością CYP3A4. Ze względu na brak stabilności cech związanych z transportem leków do wnętrza komórki, wspomniana linia komórkowa nie jest już obecnie tak powszechnie stosowana [Budziński i wsp., 2008; Cummnis i wsp., 2004]. Dostępna jest również linia Caco-2 z nadekspresją izoenzymu CYP3A4, do stworzenia której wykorzystano metodę przedstawioną dla systemu komórek LLC- PK1, gdzie wektorem był adenowirus AdV [Schuetz, 2000]. Brak jest informacji o podjęciu prób otrzymania komórek Caco-2 z nadekspresją enzymów innych niż z rodziny cytochromu P450. c. Komórki HEK293 (AD-293) Linia wywodząca się z ludzkich komórek embrionalnych nerki, HEK293 to popularna nienowotworowa ludzka linia komórkowa, szeroko stosowana jako system ekspresyjny białek cytochromu P450 oraz z rodziny UGT. Z czasem zmodyfikowano tę linię, zwiększając jej właściwości adherentne, tworząc linię AD-293. Dzięki obecności genu E1 adenowirusa komórki linii AD-293, podobnie jak HEK293, łatwo ulegają modyfikacjom genetycznym. Do transfekcji wykorzystuje się zatem wektory powstałe na bazie adenowirusów pozbawionych genu E1, np. pad, pmt2 czy psvl [Catalog Information, Stratagene]. W 1997 r. przeprowadzono pierwsze doświadczenia na rekombinantowej linii AD-293 [Lacroix i wsp., 1997], która wykazywała stabilną nadekspresję izoenzymów CYP3A4 oraz CYP3A7. Do transfekcji wykorzystano plazmidy pmt2 mające w swojej sekwencji geny kodujące wspomniane białka cytochromu P450. Czynnikiem selekcyjnym była genetycyna, G418. Do wprowadzenia wektora zastosowano metodę precypitacji z fosforanem wapnia. W późniejszych latach opracowano kolejne stabilne linie AD-293 o nadekspresji różnych ludzkich izoenzymów cytochromu P450, takich jak: CYP1A1, CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9. Ponownie stworzono linie komórkowe z nadekspresją białek CYP3A4 i CYP3A7, a także CYP3A5, tym razem w koekspresji z reduktazą cytochromu P450. Podwójną nadekspresję uzyskano dzięki wprowadzeniu drugiego plazmidu z cdna kodującym reduktazę przy zastosowaniu analogicznej metody [Santos i wsp., 2000]. Stworzono również linię komórkową HEK293 o podwójnej nadekspresji ludzkiego izoenzymu CYP2B1 i reduktazy cytochromu P450. Jako wektora użyto plazmid pmcv, a jako czynnika selekcyjnego genetycynę [Lengler i wsp., 2006]. Linia HEK293 posłużyła również do stworzenia komórek o zwiększonej ekspresji enzymów metabolizujących z rodziny UGT. Trzy grupy naukowców z: Universty of Iowa, University of Chicago oraz Laval University stosując metodę precypitacji z fosforanem wapnia lub elektroporacji oraz korzystając

Część teoretyczna 37 z wektorów pcdna3 otrzymali komórki ze stabilną nadekspresją następujących izoenzymów UGT: UGT1A1 [Iyer i wsp., 1998], UGT1A3 [Green i wsp., 1998], UGT1A4 [Green i Tephly, 2006], UGT1A8, UGT1A10 [Cheng i wsp., 1999], UGT2B7 [Hoffman i wsp., 1997], UGT2B4, UGT2B10, UGT2B11, UGT2B15, UGT2B17, UGT2B28 [Turgeon i wsp., 2001]. d. Komórki HeLa Komórki HeLa wywodzące się z nowotworu szyjki macicy to bardzo popularna linia komórkowa stosowana w transfekcji. Komórki te są łatwe w hodowli, prosto ulegają transfekcji i są stosunkowo mało wrażliwe na działania, jakim się je poddaje podczas wprowadzania wektorów ekspresyjnych. Jednakże, jak do tej pory w literaturze można znaleźć zaledwie jeden przykład zastosowania komórek HeLa jako model ekspresyjny dla białek metabolizujących ksenobiotyki. Linia ta posłużyła do osiągnięcia nadekspresji izoenzymu UGT1A9 UDPglukuronylotransferazy, dzięki której można było zbadać wpływ tego enzymu na metabolizm i usuwanie dwóch modelowych flawonoidów: genisteiny i apigeniny [Jiang i wsp., 2012]. e. Komórki HepG2 Do badań metabolizmu i toksyczności leków przez długi czas stosowano ludzkie komórki nowotworowe wątroby HepG2. Ze względu na stosunkowo niski poziom izoenzymów cytochromu P450, a zwłaszcza CYP3A4 [Wiilkening i wsp., 2003; Westerink i Schoonen, 2007], komórki tej linii zmodyfikowano, wprowadzając do nich sekwencje cdna kodujące białka cytochromu P450. Nie znalazłam doniesień o transfekcji komórek HepG2 innymi enzymami metabolizującymi leki. Pierwszą opracowaną transgeniczną linią komórkową HepG2 była linia E47, wykazująca stabilną i wysoką nadekspresję izoenzymu CYP2E1 [Chen i Cederbaum, 1997]. Do transfekcji zastosowano plazmid pcl-neo z promotorem wirusa cytomegalii. W swojej sekwencji wektor ten zawierał gen kodujący enzym CYP2E1 oraz gen oporności na genetycynę, który został wykorzystany jako czynnik selekcyjny do izolacji rekombinantowych komórek. Wektor wprowadzono za pomocą metody z zastosowaniem lipofektaminy. Dla linii E47 opracowano także linię odnośnikową z tzw. wektorem zerowym komórki C34, gdzie do komórek HepG2 wprowadzono wektor niekodujący jakiegokolwiek białka. Dzięki temu, przy porównywaniu wyników toksyczności eliminowano wpływ samego procesu transfekcji komórek [Chen i Cederbaum, 1997]. Kolejna opracowana linia komórkowa, Hep3A4, charakteryzowała się podwyższoną ekspresją izoenzymu CYP3A4. cdna kodujący białko CYP3A4 wprowadzono do komórek HepG2 analogicznie jak przy tworzeniu komórek E47 [Feierman i wsp., 2002]. Opisane wyżej linie są szeroko stosowane przez różne laboratoria na całym świecie [Koch i wsp., 2008; Oliva i wsp., 2011].

Część teoretyczna 38 Wykorzystując analogiczną metodę transfekcji, z zastosowaniem lipofektaminy i stosując wektor pcdna3.1 inny zespól naukowców z Osaki opracował linie komórkowe HepG2 z nadekspresją następujących białek CYP: 1A1, 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2E1 oraz 3A4. Skonstruowano także tzw. linię kontrolną, do której wprowadzono pusty wektor pcdna3.1 [Yoshitomi i wsp., 2001]. Ciekawą strategię czasowej transfekcji komórek HepG2 egzogennymi białkami cytochromu P450 przedstawiła grupa naukowców z Hiszpanii. Opracowali oni adenowirusy zawierające w swym materiale genetycznym geny odpowiednich ludzkich izoenzymów cytochromu P450. Wektory te bardzo szybko wnikają do wnętrza komórek wątroby, gdzie ich DNA ulega ekspresji. Nadekspresja białek CYP utrzymuje się w komórkach przez 3 4 dni. Proces transfekcji jest mało skomplikowany i szybki, choć należy go powtarzać przy każdym kolejnym doświadczeniu. W ten sposób otrzymano komórki z nadekspresją następujących ludzkich izoenzymów cytochromu P450: CYP1A2, CYP2C9 i CYP3A4 [Donato i wsp., 2010]. f. Komórki Hep3B Kolejną linią komórkową wywodzącą się z nowotworowej tkanki wątroby, w której uzyskano stabilną nadekspresję izoenzymów cytochromu P450, to komórki Hep3B. Skonstruowano dwa modele komórkowe: z wysoką ekspresją białka CYP3A4 oraz CYP2D6. Opracowane komórki pozwoliły na wysunięcie ciekawych wniosków dotyczących wpływu nadekspresji izoenzymu CYP3A4 na wzrost i proliferację komórek. Rezultaty te przedstawiłam w jednym z wcześniejszych rozdziałów. Komórki Hep3B transfekowano wektorami pcdna3.1+ zawierającymi odpowiednie sekwencje genów cyp3a4 i cyp2d6 oraz gen oporności na genetycynę. Plazmidy wprowadzono do komórek za pomocą metody z fosforanem wapnia [Oguro i wsp., 2011]. g. Komórki MCF-7 Komórki raka piersi, MCF-7 to kolejny przykład linii komórkowej, która została zastosowana jako model ekspresyjny nie tylko białek cytochromu P450, ale także innych przedstawicieli enzymów metabolizujących ksenobiotyki. Ciekawym i obiecującym modelem komórkowym do badania oddziaływań między poziomem białek metabolizujących leki a ich wpływem na metabolizm i toksyczność leków jest linia MCF-7 wykazująca podwyższoną ekspresję sekwencji ARE (ang. antioxidant redox element) oraz czynnika jądrowego 2 związanego z NF-E2, Nrf2 (ang. nuclear erythroid 2-related factor) zależnego od p45 (Nrf2). Elementy ARE to sekwencje DNA znajdujące się w obrębie promotora, funkcjonujące jako induktory ekspresji białek. Za indukcję białek odpowiada czynnik Nrf2. Badania wykazały, że przy podwyższonej ekspresji białka Nrf2 zachodzi indukcja ekspresji

Część teoretyczna 39 enzymów metabolizujących zawierających w sekwencji promotora element ARE. Dzięki takiemu mechanizmowi przede wszystkim zwiększa się poziom enzymów eliminujących reaktywne formy tlenu (ROS). Może również dojść do stymulacji ekspresji białek cytochromu P450. Wzrost indukcji ekspresji zależnej od elementu ARE można w komórkach linii MCF-7/ARE w łatwy sposób sprawdzać, dzięki obecności lucyferazy, której aktywność również jest zależna od poziomu czynnika Nrf2. Linia MCF-7/ARE stała się bardzo przydatnym modelem komórkowym do badania toksyczności leków przeciwnowotworowych [Wang i wsp., 2006]. W związku z tym, że w komórkach linii MCF-7/ARE w ułatwiony sposób dochodzi do ekspresji białek zaangażowanych w metabolizm leków, komórki te wybrano do transfekcji genami kodującymi białka cytochromu P450. Izoenzymy, których nadekspresję udało się osiągnąć w omawianej linii komórkowej to: CYP1A1, CYP2A6, CYP2D6 oraz CYP3A4 w koekspresji z reduktazą cytochromu P450. Opracowano również linię, która jednocześnie wykazuje nadekspresję wszystkich wymienionych pięciu białek cytochromu P450. Zastosowanie tej linii komórkowej pozwala odróżnić toksyczność leków zależną od funkcjonowania samej komórki oraz toksyczność wynikającą z aktywności enzymów cytochromu P450 [Ding i wsp., 2009]. Inny zespół zastosował do otrzymania stabilnej nadekspresji białka cytochromu P450 niezmienione, dzikie komórki MCF-7. Przygotowano linię MCF-7 wykazującą nadekspresję izoenzymu CYP1A1, która posłużyła do badania toksyczności DMBA. Komórki transfekowano plazmidem pcdna3.1 z zastosowaniem lipofektaminy. Klony wykazujące nadekspresję CYPu wyselekcjonowano za pomocą genetycyny [Leung i wsp., 2007]. Komórki MCF-7 stały się również modelem ekspresyjnym dla kilku przedstawicieli enzymów II fazy metabolizmu. Już w latach 90-tych zespół z Wake Forest Univesity przygotował szereg linii komórek MCF-7 wykazujących nadekspresję transferaz glutationowych (GST). Osiągnięto podwyższony poziom kilku form GST z klas Alpha i Mu [Townsend i wsp., 1992], dzięki czemu można było badać wpływ tychże enzymów na procesy związane z detoksykacją leków i kancerogenów, ich wydalaniem z komórki, a tym samym oporność komórki na toksyny. W związku z niejednoznacznymi wynikami pokazującymi, że przy wysokiej nadekspresji białek ksenobiotyki będące substratami enzymów GST nadal zachowywały toksyczność po biotransformacji, komórki MCF-7 dodatkowo poddano transfekcji białkiem oporności wielolekowej, MRP1. Dzięki temu zabiegowi udało się pokazać, że pełną detoksykację toksyn można osiągnąć dzięki obecności zarówno enzymu odpowiedzialnego za transformację związku do bardziej polarnej formy, jak i pompy błonowej, dla której zmetabolizowana toksyna staje się substratem, a co odpowiedzialne jest za oporność komórki na tę toksynę [Townsend i wsp., 1999].

Część teoretyczna 40 Komórki MCF-7 posłużyły także do osiągnięcia podwyższonej ekspresji jednego z przedstawicieli sulfotransferaz, SULT1A1, o czym już wspominałam w poprzednim rozdziale. Komórki o podwyższonym poziomie SULT1A1 i z wektorem pustym otrzymano za pomocą elektroporacji z zastosowaniem odpowiednich wektorów opartych o pcdna3.1. Zbadano w ten sposób szlaki biotransformacji tamoksyfenu i pokazano, że sulfonowa pochodna tego leku jest bardziej toksyczna od związku wyjściowego, pomimo że enzymy SULT z reguły biorą udział w detoksykacji leków, zmniejszając ich cytotoksyczność [Mercer i wsp., 2010]. h. Komórki MDA-MB-231 Inną linią wywodzącą się z komórek nowotworu piersi, jaką poddano stałej transfekcji jest linia MDA-MB-231. W komórkach tych osiągnięto podwyższony poziom reduktazy cytochromu P450 (CPR). Transfekcję przeprowadzono za pomocą elektroporacji. cdna kodujące CPR wklonowano do wektora pbabe. Komórki o stałej, podwyższonej ekspresji reduktazy wyselekcjonowano za pomocą puromycyny [Patterson wsp., 1997]. Komórki MDA- MB-231 o podwyższonej ekspresji CPR pozwoliły potwierdzić większą toksyczność metabolizowanych form dwóch przedstawicieli przeciwnowotworowych związków tirapazaminy (związek w III fazie badań klinicznych) w warunkach hipoksji [Patterson i wsp., 1997]. Wspomniane komórki zostały zastosowane także do badań nad doksorubicyną i 5-fluorouracylem, o czym wspomniałam wcześniej [Ramji i wsp., 2003]. Komórki MDA-MB-231 poddano transfekcji także enzymem II fazy metabolizmu, sulfotransferazą SULT1A1, czego dokonał zespół z Wiednia. Ci sami naukowcy opracowali także komórki MCF-7 z nadekspresją wspomnianego białka, równolegle do zespołu ze Stanów Zjednoczonych. Do transfekcji komórek plazmidem pcdna3.1(+) zawierającym gen sult1a1 zastosowano jako nośnik lipofektaminę. Badania na powyższych liniach były poświęcone biotransformacji melatoniny [Aust i wsp., 2005]. i. Komórki 1847 Kolejny przykład zastosowania ludzkich nowotworowych linii komórkowych do ekspresji białek cytochromu P450 to linia wywodząca się z komórek nowotworowych jajnika o nazwie 1847 [Baron i wsp., 2001]. Wybrano te komórki ze względu na obecność klonu opornego na działanie paklitakselu, w którym w naturalny sposób doszło do nadekspresji białka oporności wielolekowej, P-glikoproteiny (MDR1). Transfekcji poddano komórki linii dzikiej o niskiej ekspresji genu mdr1, a także linii wykazującej jego nadekspresję. Do komórek wprowadzono gen kodujący izoenzym CYP3A4 oraz reduktazę cytochromu P450. Zastosowana metoda

Część teoretyczna 41 transfekcji była analogiczna, jak opisana nieco wcześniej przy tworzeniu linii CHO-HR-3A4 [Ding i wsp., 1997]. Dzięki takiemu modelowi komórkowemu można było badać oddziaływania między białkami oporności wielolekowej a izoenzymem CYP3A4, których ekspresja jest ze sobą powiązana przez wspólny czynnik jądrowy, PXR [Baron i wsp., 2001]. 2.3 Podsumowanie Z przedstawionych powyżej doniesień literaturowych dotyczących badań biotransformacji ksenobiotyków wyraźnie widać, jak różnorodny może być wpływ zmiennej ekspresji i aktywności enzymów metabolizujących na odpowiedź biologiczną traktowanych lekami komórek nowotworowych i procesy związane z jej proliferacją i śmiercią. Linie komórkowe o stabilnej nadekspresji okazały się bardzo przydatnym narzędziem pracy w powyższych badaniach. Rekombinantowe bakterie i komórki owadzie są rewelacyjnym źródłem mikrosomów bogatych w enzymy I i II fazy metabolizmu, dzięki którym łatwa jest realizacja wstępnych badań nad biotransformacją związków. Z kolei linie ssacze, w tym ludzkie linie komórkowe pozwalają na śledzenie metabolizmu w żywej komórce i określenia ich bezpośredniego wpływu na funkcjonowanie komórki.

Założenia, cel i zakres pracy 42 3 Założenia, cel i zakres pracy 3.1 Założenia pracy Pochodna C-1311 to potencjalny związek przeciwnowotworowy, który został zakwalifikowany do II fazy badań klinicznych prowadzonych na pacjentkach z przerzutowym rakiem piersi. Jak już wspomniałam wcześniej, jest to wiodący związek wśród pochodnych imidazoakrydonu zsyntetyzowanych w Katedrze Technologii Leków i Biochemii w zespole kierowanym przez prof. Jerzego Konopę [Chołody i wsp., 1990a, 1992]. Pochodna ta jest inhibitorem topoziomerazy II [Składanowski i wsp., 1996] oraz receptora kinazy tyrozynowej, FLT3 [Chau i wsp., 2006; Skwarska i wsp., 2010]. C-1311 łączy się z DNA poprzez interkalację [Mazerska i wsp., 2001], a po oksydacyjnej aktywacji tworzy wiązania kowalencyjne, prowadząc do wewnątrzcząsteczkowego sieciowania DNA [Dzięgielewski i Konopa, 1996; Mazerska i wsp., 2002; Konopa i wsp., 2005]. Komórkowy mechanizm działania badanego imidazoakrydonu C-1311 w komórkach nowotworowych oparty jest na bloku cyklu komórkowego w fazie G 2/M. Konsekwencją tego efektu może być śmierć komórek na drodze apoptozy, co wykazano w komórkach: mysiej białaczki, L1210 [Augustin i wsp., 1996], ludzkiej białaczki MOLT4 [Skwarska i wsp., 2007], ludzkiego nowotworu szyjki macicy, HeLa S3 [Lamb i Wheatley, 1996], ludzkiego nowotworu jajnika, OAW42 oraz ludzkiego nowotworu kostniakomięsaka, U2-OS [Zaffaroni i wsp., 2001]. Z kolei w komórkach nowotworu okrężnicy, HT-29 blok cyklu w fazie G 2 prowadził do pojawienia się zmian świadczących o katastrofie mitotycznej. W komórkach litych nowotworów obserwowano również nekrozę [Skwarska, 2008; Augustin i wsp., 2013a], autolizę pod wpływem uwolnionych enzymów lizosomalnych [Burger i wsp., 1999] oraz przedwczesne starzenie [Augustin i wsp., 2013a]. Badania nad metabolizmem związku wykazały, że pochodna C-1311 ulega metabolicznej transformacji pod wpływem szczurzych i ludzkich białek mikrosomalnych. Żaden z testowanych izoenzymów cytochromu P450 (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 i CYP3A4) nie brał udziału w biotransformacji związku. Co więcej, aktywność rekombinantowego izoenzymu CYP1A2 oraz CYP3A4 była przez ten związek hamowana. Pochodna imidazoakrydonu okazała się substratem dla monooksygenazy flawinowej, FMO, głównie formy FMO1, w wyniku czego dochodziło do powstania N-tlenku związku [Potęga i wsp., 2011]. Spośród enzymów II fazy metabolizmu w biotransformacji pochodnej C-1311 biorą udział enzymy należące do rodziny UDP-glukuronylotransferaz, UGT. Najbardziej aktywny w metabolizmie badanego związku jest izoenzym UGT1A10 [Fedejko-Kap i wsp., 2012].

Założenia, cel i zakres pracy 43 Drugi z badanych przeze mnie związków, pochodna triazoloakrydonu C-1305, to wiodąca pochodna wśród zsyntetyzowanych w Katedrze Technologii Leków i Biochemii pochodnych triazoloakrydonu [Chołody i wsp., 1990b]. Związek ten jest obecnie w zaawansowanych badaniach przedklinicznych. Pochodna ta jest trucizną dla topoizoemrazy II [Lemke i wsp., 2004] i inhibitorem kinazy FLT3 [Augustin i wsp., 2010]. C-1305, podobnie jak C-1311, interkaluje do DNA i powoduje wewnątrzcząsteczkowe sieciowanie DNA [Lemke i wsp., 2005; Koba i Konopa, 2007]. Konsekwencją molekularnego mechanizmu działania związku C-1305 jest indukcja bloku cyklu komórkowego w fazie G 2/M i następującej po tym apoptozy, co wykazano w komórkach ludzkich białaczek, MOLT4 i HL60 [Augustin i wsp., 2006] oraz unieśmiertelnionych komórkach jajnika chomika chińskiego, CHO [Augustin i wsp., 2013b]. W metabolizmie pochodnej C-1305 nie biorą udziału enzymy z rodziny cytochromu P450. Za jeden ze szlaków biotransformacji odpowiadają białka FMO1 i FMO3 [Fedejko-Kap i wsp., 2011], tworząc pochodną N-tlenkową. Z kolei w detoksykacyjnych przemianach związku biorą udział enzymy z rodziny UGT, a przede wszystkim forma UGT1A10 [Fedejko-Kap i wsp., 2012]. Z danych literaturowych, jak i badań wstępnych prowadzonych w Katedrze Technologii Leków i Biochemii Politechniki Gdańskiej wynika, że istnieje cały szereg powiązań między szlakami przemian metabolicznych a zmianami w cyklu życiowym i indukcją śmierci komórkowej wywołanymi przez związki o właściwościach przeciwnowotworowych. Podwyższona ekspresja izoenzymów cytochromu P450 oraz innych enzymów metabolizujących w komórkach traktowanych cytostatykiem może wpływać na jej funkcjonowanie w trojaki sposób, poprzez: 1. przyspieszony metabolizm leku katalizowany przez ten enzym; 2. indukcję wzrostu stężenia innych białek w komórce, w tym białek regulatorowych; 3. zmiany w szlakach metabolicznych związków endogennych. Po pierwsze, podwyższony poziom białek cytochromu P450 bezpośrednio modyfikuje procesy związane z metabolizmem i detoksykacją podawanych leków. W przypadku związków, które do swej aktywności wymagają enzymatycznej biotransformacji, wyższy poziom enzymu gwarantuje powstawanie większej ilości aktywnego metabolitu, co zwiększa cytotoksyczność leku. Świadczą o tym wyniki badań przeprowadzonych dla cyklofosfamidu, gdzie podwyższony poziom CYP2B1 i CYP3A4 zwiększał cytotoksyczne działanie leku [Gut i wsp., 2000]. Podobny efekt zaobserwowano dla eliptycyny metabolizowanej przez CYP1A1 i CYP1A2 [Aimova i wsp., 2007], tamoksyfenu będącego substratem CYP3A4 [Hołownia i Braszko, 2004] oraz mitoksantronu [Kostrzewa-Nowak i wsp., 2007], adriamycyny [Bartoszek, 2002] i mitomycyny C [Wang i wsp., 2007] ulegających aktywacji pod wpływem reduktazy cytochromu P450. Niektóre związki przeciwnowotworowe podawane są pacjentowi już w formie aktywnej. W tym wypadku transformacje przeprowadzane przez enzymy cytochromu P450 czy inne enzymy metabolizujące, zwłaszcza II fazy metabolizmu, obniżają aktywność podawanego związku.

Założenia, cel i zakres pracy 44 Takie wyniki, będące efektem procesów detoksykacyjnych, uzyskano dla paklitaksolu i docetaksolu, których aktywność cytotoksyczna była wyraźnie niższa przy podwyższonym poziomie enzymu CYP3A4 [Hołownia i Braszko, 2003; Makhow i wsp., 2012]. Z kolei irinotekan ulegając glukuronidacji pod wpływem enzymu UGT1A1 całkowicie tracił swoją aktywność [Palomaki i wsp., 2009]. Kolejny efekt, który może być obserwowany w traktowanych związkiem cytostatycznym komórkach o podwyższonej ekspresji białek metabolizujących leki to wpływ poziomu tychże enzymów na poziom innych białek. Wykazano np., że wzrost ekspresji CYP2E1 wskutek działania etanolu powoduje wzrost poziomu ekspresji białek zaangażowanych w neutralizację reaktywnych form tlenu produkowanych przez CYP2E1 [Caro i Cederbaum, 2004]. Wzrost poziomu poszczególnych białek może także zachodzić poprzez ich wspólną kontrolę, np. jeden operon czy jeden czynnik transkrypcyjny. Taką funkcję przypisuje się niektórym receptorom jądrowym. Dowiedziono, że receptor PXR nie tylko wpływa na ekspresję izoenzymu CYP3A4, ale również jego podwyższony poziom indukuje transkrypcję białek antyapoptotycznych z rodziny Bcl-2 [Masuyama i wsp., 2007; Zucchinia i wsp., 2005]. Znany jest również czynnik transkrypcyjny Nrf2 (ang. nuclear erythroid 2-related factor), który poprzez wiązanie się z elementami odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE, ang. antioxydative response element) indukuje ekspresję enzymów II fazy metabolizmu [Krajka-Kuźniak, 2007]. Najnowsze badania pokazały także, że podwyższony poziom białka CYP3A4 oraz 10 innych z systemu cytochromu P450 może wynikać z aktywacji białka p53 [Goldstein i wsp., 2013]. Istotnym jest, że powyższe mechanizmy mogą być również obserwowane dla związków, które nie są metabolizowane przez izoenzymy CYP lub inne białka zaangażowane w biotransformacje leków. Trzecie zjawisko, jakie może być obserwowane w komórce o zmienionej ekspresji enzymów metabolizujących to ich wpływ na metabolizm związków endogennych. Niektóre z takich metabolitów mogą funkcjonować w komórce jako cząsteczki sygnalizacyjne, np. jako ligandy białkowych receptorów, które zaangażowane są w szlaki sygnalizacyjne w komórce. Wykazano, że izoenzymy CYP3A4 [Mitra i wsp., 2011] i CYP2J2 [Jiang i wsp., 2005] biorą udział w metabolizmie endogennego kwasu arachidonowego do kwasów epoksyeikozatrienowych (EET). Pochodne 14- i 15-EET funkcjonują w komórce jako cząsteczki sygnalizacyjne. Oddziałują między innymi na białko STAT3, które wpływa na proliferację komórki poprzez regulację przejścia komórki z fazy S do G 2 cyklu komórkowego. Niektóre szlaki biotransformacyjne związków endogennych mogą prowadzić do zmiany toksyczności związków endogennych, co z kolei może indukować zmiany w proliferacji komórek, a nawet prowadzić do jej śmierci. Może być także obserwowany efekt przeciwny, gdzie enzym chroni komórkę przed zgubnym działaniem metabolitów cząsteczek naturalnie występujących w naszym organizmie. Tu dla przykładu można podać działanie prewencyjne i regulacyjne enzymów II fazy metabolizmu z rodziny UGT, które przeprowadzając glukuronidację hormonów estrogenowych i

Założenia, cel i zakres pracy 45 androgennych, kontrolują poziom tychże hormonów. Zbyt wysokie stężenie wspomnianych hormonów może prowadzić do rozwoju nowotworów w tkankach narażonych na estrogeny czy androgeny [Barbier, 2009; Guillemette i wsp., 2004]. Podsumowując przedstawione powyżej doniesienia, założeniem badań prezentowanych w niniejszej pracy jest hipoteza, że podwyższony poziom izoenzymów cytochromu P450 i UDP-glukuronylotransferaz bądź innych enzymów metabolizujących może mieć wpływ na odpowiedź komórkową indukowaną przez związki C-1305 i C-1311 w komórkach nowotworowych, nie tylko poprzez działanie podwyższonego stężenia metabolitów pochodnych, ale również poprzez wpływ ekspresji enzymów na poziom innych białek i metabolizm związków endogennych zaangażowanych w funkcjonowanie komórki. 3.2 Cel i zakres pracy Celem moich badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej było badanie wpływu nadekspresji wybranych enzymów metabolizujących z grupy P450 i UGT z jednej strony na (i) cytotoksyczność pochodnej triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 oraz odpowiedź biologiczną przez nie indukowaną w kilku modelowych liniach komórkowych oraz z drugiej strony na (ii) na przebieg metabolizmu tych związków w badanych liniach. Dla realizacji powyższego celu przeprowadziłam kilka etapów badań, w ramach których realizowałam następujące cele cząstkowe: 1. wybranie i przygotowanie modeli komórkowych do realizacji kolejnych etapów pracy, 2. metabolizm związków C-1305 i C-1311 zachodzący w różnego rodzaju komórkach, 3. wpływ pochodnych na poziom i aktywność izoenzymu CYP3A4 w systemie komórkowym, 4. cytotoksyczność i odpowiedź komórkowa indukowana przez badane związki w różnego rodzaju komórkach nowotworowych; 5. wpływ nadekspresji enzymów metabolizujących leki na odpowiedź komórkową indukowaną przez C-1305 i C-1311. Jak już wspomniałam w części teoretycznej, opracowano niewiele linii komórkowych o nadekspresji enzymów z grupy P450 i UGT. Spośród opisanych linii komórkowych z nadekspresją CYP3A4, komórki linii MCF-7 wydawały się najlepszym modelem do przeprowadzenia badań. Niestety komórki te zostały objęte ochroną patentową i nie są dostępne. Stąd do wstępnych badań wybrałam unieśmiertelnione komórki jajnika chomika chińskiego, CHO, które są łatwe w hodowli i wrażliwe na działanie pochodnych akrydyny. Na

Założenia, cel i zakres pracy 46 początku zbadałam aktywność biologiczną pochodnej C-1311 wobec tychże komórek: linii dzikiej, CHO-WT oraz dwóch rekombinantowych: CHO-HR z nadekspresją reduktazy cytochromu P450 i CHO-HR-3A4 wykazującej koekspresję reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450. Następnie określiłam wpływ związku na cykl życiowy komórek wymienionych trzech linii CHO w oparciu o analizę zmiany w ilości DNA w poszczególnych fazach cyklu techniką cytometrii przepływowej. W kolejnym etapie zbadałam, jaki rodzaj odpowiedzi komórkowej indukowany był przez pochodną C-1311 w komórkach CHO. W tym celu przeprowadziłam następujące doświadczenia: obserwacje i ilościową ocenę zmian morfologii komórek techniką mikroskopii fluorescencyjnej, analizę zmian w budowie błony cytoplazmatycznej w oparciu o wiązanie aneksyny-v i jodku propidyny techniką cytometrii przepływowej, cytometryczną analizę aktywacji kaspazy-3 z użyciem specyficznego dla tego białka przeciwciała, badanie międzynukleosomalnej fragmentacji DNA w żelu agarozowym, ilościowe określenie populacji komórek żywych i martwych za pomocą podwójnego barwienia z dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny, badanie zmian w ekspresji SA-β-galaktozydazy będącej markerem procesu starzenia komórkowego, techniką mikroskopii świetlnej, zdolność traktowanych C-1311 komórek do powrotu do proliferacji po usunięciu związku oraz tworzenie się reaktywnych form tlenu badając fluorescencję barwnika CM-H2DCFDA metodą mikroskopii. Następnie zbadałam metabolizm związku C-1311 w komórkach wszystkich trzech linii CHO. W komórkach CHO sprawdziłam także wpływ pochodnej imidazoakrydonu na poziom izoenzymu CYP3A4 metodą Western blot i jego aktywność katalityczną analizując techniką HPLC przemianę standardowego substratu enzymu. Badanie poziomu i aktywności CYP3A4 wykonałam również w innych komórkach linii ludzkich komórek nowotworu wątroby, HepG2 o normalnym i podwyższonym poziomie izoenzymu CYP3A4. Drugim enzymem metabolizującym ksenobiotyki, którego wpływ na metabolizm i cytotoksyczność pochodnej triazoaloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 oraz odpowiedź biologiczną przez nie indukowaną badałam w ramach niniejszej pracy, był izoenzym UGT1A10. Dane literaturowe wskazują, że została opracowana linia komórek HEK293 o stałej nadekspresji wspomnianego białka. Linia ta wywodzi się jednak z komórek nerki, wobec których pochodna C-1311 wykazuje niską aktywność cytotoksyczną (dane z National Cancer Institute). Dlatego też w kolejnym etapie badań samodzielnie opracowałam linię komórkową o przejściowej nadekspresji izoenzymu UGT1A10. Wybrałam komórki KB-3, subklon komórek HeLa o zwiększonej oporności na leki przeciwnowotworowe i które łatwo ulegają transfekcji i nie posiadają endogennych enzymów UGT [Nakamura i wsp., 2008]. Skuteczność transfekcji potwierdziłam wprowadzając do komórek KB-3 wektor kodujący białko GFP (ang. green fluorescent protein) i dokonując obserwacji morfologii komórek i ilościowej oceny liczby komórek świecących na zielono oraz analizując poziom mrna ugt1a10 techniką Real-Time PCR. W pierwszym etapie badań określiłam dawki IC 50 związków C-1305 i C-1311 wobec komórek

Założenia, cel i zakres pracy 47 KB-3, dzikich oraz transfekowanych izoenzymem UGT1A10 i wektorami kontrolnymi. Następnie zbadałam metabolizm obu związków w tychże komórkach za pomocą analizy HPLC oraz określiłam strukturę głównego metabolitu związków C-1305 i C-1311 techniką spektrometrii mas. W dalszej części pracy zbadałam odpowiedź biologiczną indukowaną przez pochodne akrydonu w komórkach KB-3, przeprowadzając następujące eksperymenty: analiza zmian w cyklu życiowym techniką cytometrii przepływowej, obserwacje mikroskopowe i ilościowa ocena zmian w morfologii jąder komórek, analiza Western blot poziomu białek związanych z progresją cyklu życiowego i indukcją apoptozy, określenie polulacji żywych i martwych komórek techniką mikroskopii fluorescencyjnej w oparciu o podwójne barwienie komórek dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny. W związku z pozytywnymi wynikami uzyskanymi w badaniach na modelowych komórkach CHO o wysokim poziomie ludzkiego izoenzymem CYP3A4 oraz komórkach KB-3 o przejściowej nadekspresji ioenzymu UGT1A10 w kolejnym etapie pracy określiłam wpływ poziomu wspomnianych enzymów na metabolizm i cytotoksyczność pochodnych C-1305 i C-1311 wobec ludzkich komórek nowotworowych, które w badaniach przeprowadzonych przez NCI były wrażliwe na działanie pochodnej imidazoakrydonu. Komórkami tymi były: MCF-7 i MDA-MB-231 wywodzące się z raka piersi oraz H460 i A549 wywodzące się z raka płuc. Podwyższony poziom izoenzymów CYP3A4 i UGT1A10 osiągnęłam w tychże komórkach poprzez przejściową transfekcję odpowiednimi wektorami plazmidowymi (w tym kontrolnymi) stosując technikę elektroporacji. W liniach MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 typu dzikiego i transfekowanych wektorami kodującymi izoenzym CYP3A4 lub UGT1A10 oraz wektorem pustym niekodującym żadnego białka zbadałam przemiany metaboliczne związków C-1305 i C-1311 na przestrzeni kilku dni poprzez analizę RP-HPLC zawartości lizatów komórkowych i pożywki hodowlanej oraz określiłam dawkę pochodnych powodującą zahamowanie wzrostu komórek w 50% (IC 50). W celu głębszego zbadania oddziaływania zmienionej ekspresji izoenzymów CYP3A4 i UGT1A10 na odpowiedź komórkową indukowaną przez związki C-1305 i C-1311 opracowałam linie MCF-7 o stabilnej nadekspresji wspomnianych białek. Otrzymałam również komórki kontrolne, do których wprowadziłam wektor pusty, niekodujący żadnego białka. Komórki MCF-7 transfekowałam przy zastosowaniu metody elektroporacji. Geny kodujące białka CYP3A4 i UGT1A10 zostały wprowadzone za pomocą wektorów opartych o plazmid pcdna3.1. Komórki z poprawnie i stabilnie zintegrowanym plazmidem selekcjonowałam poprzez długotrwałą inkubację z genetycyną, wobec której gen oporności posiadały zastosowane plazmidy. Poziom nadekspresji określiłam analizując wzrost ilości mrna izoenzymów techniką Real-Time PCR, poziom białek CYP3A4 i UGT1A10 metodą Western blot oraz aktywność enzymów poprzez badanie stopnia przemiany substratów tychże izoenzymów. Na opisanym systemie komórkowym: linii kontrolnej, MCF-7-EV oraz dwóch rekombinantowych, MCF-7-CYP3A4

Założenia, cel i zakres pracy 48 i MCF-7-UGT1A10 przeprowadziłam szereg eksperymentów, które miały na celu określenie wpływu tychże nadekspresji na szlaki biotransformacji pochodnych C-1305 i C-1311 oraz rodzaj i siłę indukowanej przez nie odpowiedzi biologicznej. Metabolizm związków zachodzący we wnętrzu komórek oraz zawartość pożywki pohodowlanej badałam techniką HPLC. Następnie określiłam cytotoksyczność omawianych związków w trzech liniach MCF-7 metodą liczenia komórek oraz z zastosowaniem barwnika MTT. Cykl życiowy w oparciu o analizę zmian w ilości DNA w poszczególnych fazach cyklu zbadałam techniką cytometrii przepływowej. W kolejnym etapie sprawdziłam, jaki rodzaj odpowiedzi biologicznej jest indukowany przez pochodne akrydonu w opracowanych liniach MCF-7. Przeprowadziłam obserwacje i ilościową ocenę zmian morfologii jąder komórkowych techniką mikroskopii fluorescencyjnej, analizę zmian w budowie błony cytoplazmatycznej w oparciu o wiązanie anaksyny-v i jodku propidyny techniką cytometrii przepływowej, cytometryczną analizę aktywności kaspazy-3 oraz ilościowe określenie populacji komórek żywych i martwych techniką cytometrii przepływowej stosując podwójne barwienie za pomocą dioctanu fluoresceiny i jodku propidyny.

Część doświadczalna 49 4 Część doświadczalna 4.1 Materiały 4.1.1 Związki przeciwnowotworowe Pochodna imidazoakrydonu C-1311 związek cytotoksyczny zsyntetyzowany w Katedrze Technologii Leków i Biochemii przez dr M. W. Chołodego [Chołody i wsp., 1990b, 1992]. W przeprowadzonych doświadczeniach stosowałam pochodną C-1311 w postaci roztworu przygotowanego w 50% alkoholu etylowym do badań wykonywanych na komórkach linii: CHO, HepG2, KB-3, MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 lub w niektórych eksperymentach w DMSO do badań na komórkach KB-3 o stężeniu wyjściowym wynoszącym w obu przypadkach 10mM. Pochodna triazoloakrydonu C-1305 związek cytotoksyczny zsyntetyzowany w Katedrze Technologii Leków i Biochemii przez dr M. W. Chołodego [Chołody i wsp., 1990a]. W przeprowadzonych doświadczeniach stosowałam pochodną C-1305 w postaci roztworu przygotowanego w 50% alkoholu etylowym do badań wykonywanych na komórkach linii KB-3, MCF-7, MBA-MB-231, H460 i A549 lub w niektórych eksperymentach w DMSO do badań na komórkach KB-3 o stężeniu wyjściowym wynoszącym w obu przypadkach 10mM. 4.1.2 Odczynniki chemiczne Firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA): akrylamid, β-fosfoglicerol, β-merkaptoetanol, chlorek magnezu, chlorek potasu, chlorek sodu, chlorek wapnia, dimetylosulfotlenek (DMSO), ditiotreitol (DTT), diwodorofosforan potasu, dodecylosiarczan sodu (SDS); EDTA (sól sodowa kwasu etylenodiaminote-traoctowego), fluorek sodu, glicyna, heksacyjanożelazian(iii) potasu (K3Fe(CN)6), heksacyjano-żelazian(ii) potasu (K4Fe(CN)6), HEPES (kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1- piperazynylo]etanosulfonowy, kwas mrówkowy, kwas okadaikowy, mannitol, mrówczan amonu, nadsiarczan amonu (APS), N,N-dimetyloformamid, N,N-metylenobisakrylamid, sacharoza, TEMED (N,N,N,N -tetraetylenodiamina), testosteron, Tris-Base (tris(hydroksymetylo) aminometan), Tris-HCl (chlorowodorek tris(hydroksy-metylo) aminometanu), Triton X-100, Tween 20, wanadan sodu, wodorofosforan dipotasu, wodoro-węglan sodu, wodorofosforan disodu, X-Gal (5-bromo-4-chloro-3- indolilo-β-d-galaktopiranozyd). Firmy POCH (Polskie Odczynniki Chemiczne, Gliwice, Polska): aldehyd glutarowy, alkohol etylowy, alkohol metylowy, formaldehyd, glicerol, kwas octowy, 2-propanol. Firmy Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy): metanol (Gradient Grade for liquid chromatography), acetonitryl (Gradient Grade for liquid chromatography). Firmy Fisher Scientific (Waltham, MA, USA): agar, agaroza, pożywka LB. 4.1.3 Barwniki Bromek etydyny Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.

Część doświadczalna 50 DAPI (4,6-diamino-2-fenyloindol) Sigma-Aldrich, St. Louise, MO, USA. Hoechst 33342 Sigma-Aldrich, St. Lousi, MO, USA. CM-H2DCFDA (ester acetylowy dioctanu 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny) Molecular Probes, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA. Dioctan fluoresceiny Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. Jodek propidyny Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. MTT (1-(4,5-dimetylotiazolo-2-yl)-3,5-difenyloformazan) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. Trypan Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA. Barwnik do nanoszenia próbek na żel poliakrylamidowy, Laemmli Sample Buffer Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA. Barwnik obciążający do rozdziału DNA, Blue/Orange Loading Dye Promega Co., Fitchburg, WI, USA. 4.1.4 Markery Marker wielkości białka firmy Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA) Precision Plus ProteinTM All Blue Standards 161-0373 : 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 kda. Marker wielkości DNA firmy Promega Co. (Fitchburg, WI, USA) 50 bp DNA Ladder #SM0373: 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 500 kda. Lambda Marker Promega Co., Fitchburg, WI, USA. 4.1.5 Enzymy Trypsyna-EDTA Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)/ Cellgro, Mediatech (Manassas, VA, USA). RNaza A (EC 3.1.27.5, aktywność 78 jednostek Kunitza/mg substancji) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; Inhibitory proteaz: aprotinina, leupeptyna, pepstatyna, PMSF Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. Enzym restrykcyjny Xba I Promega Co., Fitchburg, WI, USA. 4.1.6 Gotowe zestawy analityczne Annexin-V-FLUOS Staining Kit: Annexin-V-Fluorescein, Propidium iodide, and Incubation buffer; zestaw do badania zmian w budowie błony cytoplazmatycznej Roche, Basel, Szwajcaria. Active Caspase-3 Apoptosis Kit: phycoerythrin-conjugated polyclonal rabbit anti-active caspase-3 antibody; Cytofix/Cytoperm TM ; Perm/Wash TM ; zestaw do badania aktywności kaspazy-3 BD Pharmingen, San Diego, CA, USA. PI Staining Kit; zestaw do analizy zmian w cyklu życiowym BD Pharmingen, San Diego, CA, USA. Bradford Protein Assay Kit; zestaw do oznaczania stężenia białka Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA. High Pure RNA Isolation Kit; zestaw do izolacji RNA Roche, Mannheim, Niemcy.

Część doświadczalna 51 Transcriptor High Fidelity cdna Synthesis Kit, zestaw do syntezy cdna Roche, Mannheim, Niemcy. FastStart DNA Master SYBR Green I; zestaw do reakcji Real-time PCR Roche, Mannheim, Niemcy. QIAGEN Plazmid Plus Maxi Kit; zestaw do izolacji DNA plazmidowego Qiagen, Hilden, Germany. Plasmid Midi AX Kit; zestaw do izolacji DNA plazmidowego A&A Biotechnology, Gdańsk, Polska. 4.1.7 Bufory Bufor fosforanowy PBS 5x (685 mm NaCl, 7 mm KH2PO4, 40 mm Na2HPO4, 13 mm KCl) przygotowywany samodzielnie. Bufor fosforanowy PBS 1x Cellgro, Mediatech, Manassas, VA, USA. Bufor do RNazy A (10 mm Tris-HCl, 15 mm NaCl, ph=7,5) przygotowany samodzielnie. Bufor do zamykania preparatów (0,1 M bufor NaHPO4, ph=7,6, 33% glicerolu). Bufor TBE (45 mm Tris-HCl, 45 mm kwas borowy, 1 mm EDTA 3Na, ph=8,0) przygotowywany samodzielnie. Bufor TE (1 mm EDTA 3Na, 10 mm Tris-HCl, ph=8,0) przygotowywany samodzielnie. Izoton (135 mm NaCl, 13 mm Na2HPO4, 1 mm EDTA, 5 mm KCl, 5 mm NaH2PO4 2H2O, 7 mm NaF) przygotowywany samodzielnie. Bufor do zawieszania frakcji białkowej izolowanej z całych komórek (10 mm bufor NaHPO4, ph=7,4, 2 mm MgCl2, 2 mm dithiotreitol, 1 mm EDTA 3Na) przygotowywany samodzielnie. Bufor KCL-KPB do izolacji frakcji mikrosomalnej o stężeniu 0,1 M (0,1 M bufor KHPO4, 0,1 mm EDTA, 0,1 mm KCl) przygotowywany samodzielnie. Bufor do przechowywania frakcji mikrosomalnej, Sucrose Buffer o stężeniu 0,25 M (8,55 g sacharozy/100 ml H2Ored) przygotowywany samodzielnie. Faza ruchoma do analizy HPLC bufor mrówczanowy o stężeniu 0,05 M, ph=3,4 (3,15 g HCOONH4/ 1000 ml H2O, ph stabilizowano 88 91 % kwasem mrówkowym) przygotowywany samodzielnie. Bufor D (Buffer D) do reakcji z użyciem enzymu restrykcyjnego Promega, Fitchburg, WI, USA. 4.1.8 Roztwory i bufory do elektroforezy poliakrylamidowej Żel poliakryladmidowy do rozdziału białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE): o 30% roztwór akrylamidów (29% akrylamidu, 1% N,N-metylenobisakrylamidu); o 10% SDS ; o 1,5 M Tris-HCl ph = 8,8; o 0,5 M Tris-HCl ph = 6,8 ; o 10% nadsiarczan amonu; o TEMED; Barwnik do nanoszenia próbek na żel: Laemmli Sample Buffer (161-0737, Bio-Rad), β- merkaptoetanol (Sigma-Aldrich); przygotowanie: 950μl Laemmli + 50μl β-me.

Część doświadczalna 52 Marker wielkości białka firmy Bio-Rad Precision Plus ProteinTM All Blue Standards (161-0373, Bio-Rad) : 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 kda. Bufor do przeprowadzania elektroforezy poliakrylamidowej: bufor Tris-glicyna: 25 mm Tris-Base; 192 mm glicyna, 0,1% SDS, ph = 8,3. 4.1.9 Przeciwciała, bufory i inne materiały do techniki Western blotting Przeciwciała pierwszorzędowe: o CYP3A4: mysie poliklonalne anty-cyp3a4 rozcieńczenie 1:400, 0,5% BSA w TBST Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA; o β-aktyna: mysie monoklonalne anty-β-aktyna (clone AC-15) rozcieńczenie 1:5 000, 0,5% odłuszczone mleko w TBST Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; o o o Cyklina B1: mysie monoklonalne anty-cyklina B1 rozcieńczenie 1:1000, 1% odłuszczone mleko w TBST Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; MMP-2: mysie poliklonalne anty-mmp-2 rozcieńczenie 1:2000, 1% odłuszczone mleko w TBST Millipore Co., Billerica, MA, USA; Fosforylowany histon H3 (Ser10): królicze poliklonalne anti-phospho-histone H3 rozcieńczenie 1:500, 1% odłuszczone mleko w TBST Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA; o Aktywna kaspaza-3: królicze poliklonalne anti-active-caspase-3 rozcieńczenie 1:500, 1% odłuszczone mleko w TBST Millipore Co., Billerica, MA, USA; o Pocięta kaspaza-3: królicze poliklonalne anti-cleaved-caspase-3 rozcieńczenie 1:1000, 1% odłuszczone mleko w TBST Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA; o Prokaspaza-3: królicze monoklonalne anti-procaspase-3 rozcieńczenie 1:1000, 1% odłuszczone mleko w TBST Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA; o o PARP: mysie monoklonalne anty-parp rozcieńczenie 1:2000, 1% odłuszczone mleko w TBST BD Pharmingen, San Diego, CA, USA; GAPDH: mysie poliklonalne anty-gapdh rozcieńczenie 1:5000, 1% odłuszczone mleko w TBST Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA. Przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczenie 1:5000; 0,5% odłuszczone mleko w TBST): o o o królicze anty-mysie skoniugowane z HRP Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA; owcze anty-mysie skoniugowane z HRP Bio-Rad, Hercules, CA, USA; owcze anty-królicze skoniugowane z HRP Bio-Rad, Hercules, CA, USA. Bufor TBST: 10 mm Tris-Base, 150 mm NaCl; 0,05% Tween 20, ph = 7,4. Bufor do elektrotransferu białek z żelu poliakrylamidowego na błonę nitrocelulozową: 192 mm glicyna, 25 mm Tris-base, 20% CH3OH. Błona nitrocelulozowa wielkość porów 0,22 µm (EP2HYA0010) Osmonics, Minnesota, USA. Bibuła MN218B, 3MM Chr 742113 Macherey-Nagel, Duren, Niemcy. Bufor blokujący: 150 mm NaCl, 20 mm Tris-Base, 5% odtłuszczone mleko w proszku, ph = 7,4.

Część doświadczalna 53 4.1.10 Plazmidy i materiały potrzebne do transfekcji Plazmidy zastosowane do transfekcji: o o o o o o o pcdna3.1 wektor pusty, niekodujący żadnego białka, posiadający gen oporności na neomycynę (gentycynę, G418) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; pmono-gfp wektor kodujący białko GFP (ang. green fluorescent protein) Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), udostępniony przez Prof. Timothy iego Chambersa z University of Arkansas for Medical Science (UAMS), Little Rock, AR, USA; pcdna3.39/ugt1a10 plazmid kodujący enzym UGT1A10; wektor pcdna3.1 ze zmienioną częścią miejsca wielokrotnego klonowania na Kozak site 28 [Starlard-Davenport i wsp., 2006], udostępniony przez Prof. Annę Radomińską-Pandya z UAMS, Little Rock, AR, USA; pcdna3/cyp3a4/c-myc/his plazmid kodujący izoenzym CYP3A4, posiadający gen oporności na genetycynę oraz markery obecności plazmidu (białko c-myc, reszty histydynowe), udostępniony przez Dr Petera Espenshade a z Johns Hopkins University School of Medicine z Baltimore, MD, USA; pires/ugt2b4 plazmid kodujący enzym UGT2B4, przygotowany w laboratorium i udostępniony przez Prof. Annę Radomińską-Pandya z UAMS, Littre Rock, AR, USA; pcmv6-xl4-cyp3a4 plazmid kodujący enzym CYP3A4 cytochromu P450 Origene (Rockville, MD, USA; nr kat. SC125488); pcmv6-xl4-por plazmid kodujący reduktazę cytochromu P450 Origene (Rockville, MD, USA; nr kat. SC100401). Bufor do transfekcji: 10 mm HEPES ph 7.2, 150 mm NaCl, 4 mm CaCI2, 0.5 M mannitol; Pożywka Opti-MEM Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA. 4.1.11 Linie komórkowe i materiały potrzebne do prowadzenia hodowli a. Linie komórkowe: CHO (CHO-WT) unieśmiertelnione komórki jajnika chomika chińskiego (ang. wild type, linia dzika). Zastosowany w doświadczeniach i do transfekcji subklon komórek CHO to DUKXB11, który nie posiada genu kodującego białko reduktazy dihydrofolianowej. CHO-HR komórki linii CHO wykazujące nadekspresję ludzkiej reduktazy cytochromu P450. CHO-HR-3A4 komórki linii CHO wykazujące nadekspresję ludzkiej reduktazy cytochromu P450 oraz ludzkiego izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450. Trzy opisane wyżej linie komórkowe pochodzą od dr Thomasa Friedberga (Biomedical Research Centre, Dundee, UK). Komórki z nadekspresją enzymów cytochromu P450 zostały opracowane i stworzone przez zespół naukowców kierowany przez dr Thomasa Friedberga [Ding i wsp., 1997]. HepG2 ludzkie komórki nowotworowe wątroby, HB-8065. Linia komórkowa została wyprowadzona z komórek pobranych od 15-letniego chłopca pochodzenia kaukaskiego.

Część doświadczalna 54 Hep3A4 komórki linii HepG2 wykazujące nadekspresję izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450. Dwie powyższe linie komórkowe pochodzą od dr Adama Hołowni (Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku). Komórki z nadekspresją enzymu CYP3A4 zostały opracowane i stworzone przez zespół naukowców kierowany przez dr Arthura I. Cederbauma i dr Dennisa E. Feiermana [Feierman i wsp., 2002] (Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USA). KB-3 subklon komórek linii HeLa, ludzkich komórek nowotworowych szyjki macicy. Komórki HeLa to pierwsza w historii medycyny wyprowadzona linia komórkowa, którą można było hodować w warunkach laboratoryjnych. Komórki te pobrano 8 lutego 1951 roku od 31-letniej czarnoskórej pacjentki, Henrietty Lacks. Subklon KB-3 to komórki HeLa charakteryzujące się zwiększoną opornością na leki przeciwnowotworowe. Komórki te zostały udostępnione przez dr Timothy iego Chambersa (Department of Biochemistry and Molecular Biology, UAMS, Little Rock, AR, USA). MCF-7 ludzkie komórki raka piersi, HTB-22, estrogeno-zależne. Zostały wyizolowane od 69-letniej pacjentki pochodzenia kaukaskiego w 1970 roku. Linię opracowano w 1973 roku w Michigan Cancer Fundation (stąd ich nazwa). Komórki zostały zakupione z ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VI, USA). MCF-7-EV komórki MCF-7 stabilnie stransfekowane wektorem pustym pcdna3.1. MCF-7-CYP3A4 komórki MCF-7 wykazujące nadekspresję izoenzymu CYP3A4. MCF-7-UGT1A10 komórki MCF-7 wykazujące nadekspresję izoenzymu UGT1A10. Trzy powyższe linie komórkowe zostały opracowane i stworzone samodzielnie w Katedrze Technologii Leków i Biochemii Politechniki Gdańskiej na bazie komórek MCF-7. Komórki linii MCF-7-EV stanowią linię kontrolną dla MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10, co pozwala w badaniach wyeliminować wpływ transfekcji i obecności dodatkowego odcinka DNA w genomie komórek na wzrost komórek w trakcie hodowli w standardowych warunkach oraz na odpowiedź biologiczną komórek po ekspozycji na związki cytostatyczne. MDA-MB-231 ludzkie komórki raka piersi, HTB-26. Pochodzą one od 51-letniej kobiety pochodzenia kaukaskiego. Komórki zostały zakupione z ATCC. H460 (NCI-H460) ludzkie komórki wielkokomórkowego raka płuc, HTB-177, pobrane w 1982 roku z tkanki nowotworowej mężczyzny cierpiącego na wspomniany typ raka. Komórki zostały zakupione z ATCC. A549 ludzkie komórki niedrobnokomórkowego raka płuc, CCL-185. Linia została opracowana w 1972 roku. Komórki pochodziły od 58-letniego mężczyzny pochodzenia kaukaskiego chorego na niedrobnokomórkowy rak płuc. Komórki zostały zakupione z ATCC. b. Materiały potrzebne do prowadzenia hodowli komórkowej Pożywka DMEM (ang. Dulbeccos Modified Eagle's Medium, glukoza [4.5 g/l], L-glutamina) Gibco Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) lub Cellgro, Mediatech (Manassas, VA, USA), lub proszek do

Część doświadczalna 55 samodzielnego przygotowania, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA); pożywka niezbędna do hodowli komórek linii: CHO-WT, CHO-HR, KB-3 oraz MDA-MB-231. Pożywka MEM Alpha Medium (ang. Minimum Essential Medium Alpha Modification, L-glutamina, pozbawiona rybonukleotydów i deoksyrybonukleotydów) - Gibco Life Technologies (Carlsbad, CA, USA), niezbędna do hodowli komórek CHO-HR-3A4. Pożywka MEM (ang. Minimum Essentials Medium) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) proszek, do samodzielnego przygotowania; pożywka hodowlana dla komórek: HepG2 i Hep3A4. Pożywka RPMI-1640 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) proszek, do samodzielnego przygotowania; pożywka hodowlana dla komórek linii: MCF-7 oraz H460. Pożywka F12K Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) proszek, do samodzielnego przygotowania; pożywka hodowlana dla komórek A549. Płodowa surowica bydlęca, FBS (ang. Fetal Bovine Serum) inaktywowana termicznie (56ºC, 30 minut) PAA Laboratories GmbH (Pasching, Austria) lub Cytogen (Łódź, Polska), lub Cellgro, Mediatech (Manassas, VA, USA). Dializowana płodowa surowica bydlęca, FBS dializowana (ang. Fetal Bovine Serum Dialyzed), inaktywowana termicznie (56ºC, 30 minut) Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA, USA. HAT Supplement 50x stężony (hipoksantyna, aminopteryna, tymidyna) Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA, USA. Genetycyna (G418) 50 mg/ml, antybiotyk podtrzymujący nadekspresję w komórkach transfekowanych plazmidem z genem oporności na neomycynę lub do selekcji klonów komórkowych poddanych transfekcji plazmidami z genem oporności na neomycynę Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA, USA. Metotreksat 30 mg/ml, cytostatyk podtrzymujący nadekspresję izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w komórkach CHO-HR-3A4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. Roztwór antybiotyków penicylina/streptomycyna Gibco Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) lub Cytogen (Łódź, Polska), lub Cellgro, Mediatech (Manassas, VA, USA). Antybiotyki: penicylina G (100 000 j/l pożywki = 62,3 mg/l pożywki) i streptomycyna (755 U/mg = 100 mg/l pożywki) Serva Electophoresis, GmbH, Heidelberg, Niemcy. L-glutamina Cellgro, Mediatech, Manassas, VA, USA. Bufor fosforanowy PBS 1x stężony (137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 1,5 mm KH2PO4, 8,0 mm Na2HPO4) sterylny, przygotowywany samodzielnie lub zakupiony z Cellgro, Mediatech (Manassas, VA, USA). Trypsyna-EDTA 10x stężona Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 4.2 Wykorzystana aparatura Aparat do elektroforezy (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Część doświadczalna 56 Chromatograf HPLC Breeze (Waters Co., Milford, Massachusetts, USA): o System pomp: Binary HPLC Pump, Waters 1525; o Inżektor (Rheodyne 7725i); o Detektor: Dual λ Absorbance Detector, Waters 2487; o 717 plus Autosampler. Chromatograf HPLC Millennium (Waters Co., Milford, Massachusetts, USA): o Inżektor (Rheodyne 7725i); o Detektor wielodiodowy 996; o System kontrolny 600E. Chromatograf HPLC HP/Agilent 1050 Series System HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Chromatograf HPLC Agilent sprzężony ze spektrometrem mas LC/MSD (seria 1100) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Cieplarka na 37 ºC. Cytometr przepływowy: Accuri C6 (Becton Dickinson, Franklin Lake, NY, USA). Cytometr przepływowy: FaCS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lake, NY, USA). Cytometr przepływowy: FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lake, NY, USA). Cytowirówka. Czytnik płytek imark TM Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Cell Manipulator (ECM) model T 820 (BTX Harvard Apparatus, Inc. Holliston, MA, USA). Homogenizator ręczny (Wheaton Science Products, Millville, NJ, USA). Inkubatory do prowadzenia hodowli komórek: NUAIRE IR Autoflow CO2 Water-Jacked, modele: NU- 8500, NU-8700(DIE/G) (NuAire, Plymouth, MN, USA). Kolumny chromatograficzne, typu RP (SUPELCO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA): o kolumna analityczna Suplex pkb-100, 25 cm x 4,6 mm, 5 μm; o prekolumna Suplex pkb-100, 2 cm. Komora z przepływem laminarnym do prowadzenia doświadczeń w warunkach sterylnych: NuAire Biological Safety Cabinets, model NO.NU-425-400E (NuAire, Plymouth, MN, USA). Licznik komórek: Z1 Coulter Practicle Counter, Beckam Coulter (Beckman, Fullerton, CA, USA). LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics, Basel, Szwajcaria). Łaźnia ultradzwiękowa Badelin Sonorex, RK52 (Bandelin Electronic, Berlin, Niemcy). Mikroskop fluorescencyjny OLYMPUS BX60, lampa: OLYMPUS U-RFL-T (Olympus, Tokio, Japonia). Mikroskop świetlny: Carl Zeiss, TELAVAL 3 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy). NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). ph-metr ORION, model 710A (Orion, USA).

Część doświadczalna 57 System do oczyszczania wody MiliQ Integral3 (Milipore Co., Billerica, MA, USA). Termoblok Grant (Grant Instruments Ltd., Cambridge, Wielka Brytania). Waga analityczna KERN EG220-3NM (Kern&Sohn GmbH, Balingen, Niemcy). VersaDoc, model 1000 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Wirówka: Eppendorf Centrifuge 5417R (Eppendorf, Westbury, NY, USA). Wirówka: Eppendorf Centrifuge 5810R (Eppendorf, Westbury, NY, USA). Wirówka MiniSpin (Eppendorf, Westbury, NY, USA). Worteks: Yellow Line TTS 2 (IKA, Staufen, Niemcy). Wytrząsarka horyzontalna. Wytrząsarka orbitalna. Zestaw do elektroforezy Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). 4.3 Metody doświadczalne 4.3.1 Hodowla komórek a. Komórki CHO Komórki linii CHO-WT i CHO-HR hodowałam w wysokoglukozowej pożywce DMEM (4,5 g/l glukozy) zawierającej 10% płodowej surowicy wołowej FBS, HAT Supplement (skład końcowy w pożywce: 100 µm hipoksantyna, 0,4 µm aminopteryna, 16 µm tymidyna) oraz roztwór antybiotyków PenStrept (100 j/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny). 24 godziny po pasażowaniu komórek CHO-HR do pożywki hodowlanej dodawałam genetycynę (400 µg/ml) selekcjonującą komórki o nadekspresji reduktazy cytochromu P450. Komórki linii CHO-HR-3A4 hodowałam w pożywce MEM Alpha Medium pozbawionej rybonukleotydów i deoksyrybonukleotydów oraz zawierającej 10% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej oraz roztwór antybiotyków PenStrept. Po 24 godzinach inkubacji komórek do medium hodowlanego dodawałam genetycynę (400 µg/ml) i metotrekstat (0,3 µm) selekcjonujące komórki wykazujące nadekspresję odpowiednio reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4. Komórki wszystkich trzech linii rosły w postaci monowarstwy w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37ºC. Czas ich podziału wynosił w przybliżeniu: dla komórek CHO 18 godzin, CHO-HR 24 godzin i CHO-HR-.3A4 30 godzin b. Komórki HepG2 Komórki linii HepG2 i Hep3A4 hodowałam w pożywce MEM zawierającej 10% płodowej surowicy wołowej oraz antybiotyki (100 j/ml penicyliny; 100 µg/ml streptomycyny). Komórki rosły w postaci monowarstwy. Inkubowane były w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37ºC. Ich podział następował: dla komórek linii HepG2 po 24 godzinach, Hep3A4 po około 30 godzinach.

Część doświadczalna 58 c. Komórki KB-3 Komórki KB-3 (subklon komórek HeLa) hodowałam w wysokoglukozowej pożywce DMEM (4,5 g/l glukozy) zawierającej 10% płodowej surowicy wołowej, roztwór antybiotyków penicyliny (50 j/ml) i streptomycyny (50 µg/ml) oraz 2 mm L-glutaminę. Komórki rosły w postaci monowarstwy. Inkubowane były w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37ºC. Ich podział następował co około 24 godziny. d. Komórki MCF-7 Komórki linii MCF-7 oraz MCF-7-CYP3A4, MCF-7-UGT1A10 i MCF-7-EV ludzkiego raka piersi posiadające receptory estrogeno-zależne hodowałam w pożywce RPMI-1640, zawierającej 10% płodowej surowicy wołowej oraz roztwór antybiotyków penicyliny (100 j/ml) i streptomycyny (100 µg/ml). Komórki rosły w postaci monowarstwy. Inkubowane były w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37ºC. Podział wszystkich czterech typów komórek MCF-7, linii dzikiej i trzech rekombinantowych był zbliżony i następował co 24 godziny. Komórki MCF-7-CYP3A4 dzieliły nieco szybciej. e. Komórki MDA-MB-231 Komórki ludzkiego raka piersi MDA-MB-231 hodowałam w wysokoglukozowej pożywce DMEM (4,5 g/l glukozy), zawierającej 10% płodowej surowicy wołowej oraz roztwór antybiotyków penicyliny (100 j/ml) i streptomycyny (100 µg/ml). Komórki rosły w postaci monowarstwy w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37ºC. Ich podział następował co około 36 godzin. f. Komórki H460 Komórki linii wielkokomórkowego raka płuc, H460 hodowałam w pożywce RPMI-1640, zawierającej 10% płodowej surowicy wołowej oraz roztwór antybiotyków penicyliny (100 j/ml) i streptomycyny (100 µg/ml). Komórki rosły w postaci monowarstwy w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37ºC. Ich podział następował co około 18 godzin. g. Komórki A549 Komórki linii niedrobnokomórkowego raka płuc, A549 hodowałam w pożywce F12K, zawierającej 10% płodowej surowicy wołowej oraz roztwór antybiotyków penicyliny (100 j/ml) i streptomycyny (100 µg/ml). Komórki rosły w postaci monowarstwy w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37ºC. Ich podział następował co około 24 godziny. 4.3.2 Określenie cytotoksyczności pochodnych C-1305 i C-1311 a. Metodą liczenia komórek Efektywne stężenia związków C-1305 i C-1311 wykazujących aktywność cytotoksyczną wyznaczałam metodą liczenia komórek dla komórek modelu CHO: CHO-WT, CHO-HR, CHO-HR-3A4 (tylko związek C-1311) i modelu MCF-7: MCF-7-WT, MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4, MCF-7-UGT1A10. W tym celu zawiesinę komórek będących w logarytmicznej fazie wzrostu wysiewałam na płytki 24-studzienkowe w ilościach podanych w tabeli nr 2. Po 24 godzinach inkubacji (po przyklejeniu się

Część doświadczalna 59 komórek do podłoża) do odpowiednich studzienek dodawałam roztwory związków o 10 różnych stężeniach po dwa razy dla każdego stężenia w ilości 20 µl, zaś do 4 studzienek kontrolnych rozpuszczalnik, 50% alkohol etylowy. Końcowe stężenia związków C-1305 i C-1311 mieściły się w zakresie od 0,0001 do 50 mm. Liczenia komórek dokonałam po 72 godzinach ciągłej inkubacji ze związkiem (warunki standardowe). Dla komórek modelu CHO eksperyment przeprowadziłam także po 48 i 96 godzinnej ekspozycji na związki. Po odessaniu pożywki znad warstwy komórek, odklejałam komórki za pomocą roztworu trypsyny (200 µl/studzienkę) oraz dodawałam pożywkę do objętości 2 ml/studzienkę. Następnie liczyłam ilość komórek w każdej studzience w liczniku Coulter-Counter (Beckman). Średnią liczbę komórek w studzienkach kontrolnych uznałam jako 100%. Pozostałe ilości komórek w poszczególnych studzienkach potraktowałam jako wprost proporcjonalne do wartości kontrolnej. Dzięki uzyskanej zależności ilości żywych komórek od stężenia związku mogłam wyznaczyć wartości IC50, IC80 i IC90, czyli stężenia związku przy których dochodzi do zahamowania proliferacji komórek odpowiednio w 50, 80 i 90%. Tabela 2 Liczba komórek danej linii wysiewana na studzienkę płytki 24-studzienkowej w doświadczeniu badania wrażliwości komórek na działanie związków cytotoksycznych metodą liczenia komórek. Rodzaj komórek CHO-WT CHO-HR CHO-HR-3A4 MCF-7-WT MCF-7-EV MCF-7-CYP3A4 MCF-7-UGT1A10 Liczba komórek wysiewana na studzienkę [tyś.] po danym czasie inkubacji ze związkiem 48 godz. 72 godz. 96 godz. 40 40 40 - - - - 20 20 40 40 40 40 40 10 10 20 - - - - b. Metodą MTT Efektywne stężenia związku C-1305 i C-1311 wyznaczałam metodą z użyciem barwnika MTT dla komórek linii KB-3, MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 typu dzikiego oraz przejściowo transfekowanych dla wszystkich wymienionych linii komórkowych oraz modelu komórek MCF-7: MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4, MCF-7-UGT1A10. W metodzie tej oznaczenie aktywności biologicznej związku opiera się na założeniu, że tylko w komórkach żywych dochodzi do redukcji barwnika, jakim jest MTT, do barwnego, fioletowego produktu. Ilość barwnika oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali emisji 540 nm. Zawiesinę komórek będących w logarytmicznej fazie wzrostu wysiewałam na płytki 96-studzienkowe w ilości 2 tyś./200 µl pożywki dla komórek linii KB-3, MCF-7 (cztery typy), A549 lub 1 tyś./200 µl dla H460, lub 4 tyś./200 µl dla MDA-MB-231. W przypadku komórek poddanych przejściowej transfekcji liczba komórek wysiewanych na studzienkę była dwukrotnie wyższa. Po 24 godzinach inkubacji

Część doświadczalna 60 do odpowiednich studzienek dodawałam 2 µl związku C-1305 lub C-1311 w 10 różnych stężeniach, zaś do studzienek kontrolnych rozpuszczalnik: DMSO do komórek KB-3 lub 50% etanol do komórek pozostałych linii w ilości 2 µl na studzienkę. Każdy z roztworów był dodawany do czterech różnych studzienek. Końcowe stężenia związku C-1305 i C-1311 mieściły się w zakresie od 0,001 do 100 µm. Pośrednie oznaczenie ilości żywych komórek dokonywałam po 72 godzinach ciągłej inkubacji ze związkiem (warunki standardowe). Po zakończonej inkubacji do pożywki dodałam roztwór MTT w stężeniu końcowym 0,2 mg/ml. Płytkę wstawiałam do inkubatora (warunki standardowe) na 3-4 godziny. Po tym czasie odsysałam pożywkę znad warstwy komórek/kryształów formazanu, które rozpuściłam w 150 µl DMSO. Po dokładnym wymieszaniu roztworów mierzyłam absrobancję rozpuszczonego formazanu przy długości fali 540 nm. Średnią absorbancję w studzienkach kontrolnych uznałam jako 100% żywych komórek. Pozostałe absorbancje w danych studzienkach potraktowałam jako wprost proporcjonalne do wartości kontrolnej. Dzięki uzyskanej zależności ilości żywych komórek od stężenia związku mogłam wyznaczyć wartości IC50, IC80 i IC90, czyli stężenia związku przy których dochodzi do zahamowania proliferacji komórek odpowiednio w 50, 80 i 90%. 4.3.3 Analiza dystrybucji komórek w cyklu życiowym Doświadczenie przeprowadziłam wobec komórek CHO: CHO-WT, CHO-HR, CHO-HR-3A4 i MCF-7: MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4, MCF-7-UGT1A10 oraz komórek typu dzikiego i poddanych przejściowej transfekcji linii KB-3 i MCF-7. Badanie dystrybucji komórek w cyklu życiowym wykonałam w oparciu o analizę zawartości DNA w komórkach wybarwionych jodkiem propidyny. Barwnik ten łączy się stechiometrycznie do DNA, dzięki czemu można określić zawartość DNA w poszczególnej komórce, a tym samym wielkość populacji komórek w danej fazie cyklu życiowego. Wyniki odczytałam na cytometrze przepływowym FACScan (Becton Dickinson) w Pracowni Immunologii Komórkowej i Molekularnej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego dla komórek modelu CHO lub na cytometrze przepływowym Accuri C6 (Becton Dickinson) udostępnionym przez firmę Becton Dickinson dla komórek modelu MCF-7, lub na cytometrze przepływowym FACS Calibur w katedrze Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Science dla komórek KB-3 i MCF-7 typu dzikiego i przejściowo transfekowanych. Zawiesinę komórek CHO wysiewałam na 100 mm płytki Petriego w ilości: 2x10 6 komórek dla krótkich czasów inkubacji (3, 6 i 12 godzin), 10 6 dla kontroli i pośrednich czasów (24 i 48 godziny) oraz 8x10 5 dla dłuższych czasów inkubacji (72, 96 i 120 godziny). Komórki MCF-7 wysiewałam na 100 mm płytki Petriego w ilości: 1,2x10 6 dla kontroli i pośrednich czasów (24 i 48 godziny) oraz 10 6 dla dłuższych czasów inkubacji (72, 96 i 120 godziny). Z kolei komórki linii KB-3 i MCF-7 typu dzikiego i poddanych przejściowej transfekcji wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w liczbie 10 6 dla komórek dzikich i 2x10 6 dla przejściowo transfekowanych i poddawałam je ekspozycji na związek przez 24, 48 i 72 godziny. Komórki inkubowałam ze związkami C-1305 i C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80 dla komórek CHO (tylko związek C-1311) i MCF-7, 30xIC50 dla komórek KB-3 oraz 10xIC50 dla komórek MCF- 7 typu dzikiego i przejściowo transfekowanych przez wspomniane czasy. Po zakończonej inkubacji

Część doświadczalna 61 zebraną z płytek zawiesinę komórek wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), dwukrotnie przemywałam zimnym PBS-em i ponownie wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Tak przygotowane komórki zawieszałam w zimnym 80% alkoholu etylowym i utrwalałam w temperaturze -20ºC przez minimum 24 godziny. Po utrwaleniu zawiesinę komórek wirowałam (2500 rpm, 5 min., 4ºC), dwukrotnie płukałam zimnym PBS-em i ponownie wirowałam (1500 rpm, 5 min., 4ºC). Następnie komórki barwiłam roztworem barwiącym przygotowanym samodzielnie (1 ml PBSu, 10 μl jodku propidyny o stężeniu 20 μg/ml H2O, 10 μl RNazy A o stężeniu 10 mg/ml buforu do RNazy A) lub gotowym, PI Staining Kit (BD Pharmingen) przez 15 minut bez dostępu światła. W roztworze barwiącym znajduje się RNaza A ze względu na możliwość łączenia się jodku propidyny nie tylko z DNA, ale również z RNA, co mogłoby zafałszować wynik badania. Pomiar intensywności fluorescencji emitowanej przez jodek propidyny związany z DNA prowadziłam przy zastosowaniu cytometru przepływowego. Długość fali wzbudzenia i emisji dla jodku propidyny wynosiła odpowiednio 488 nm i 617 nm. Każdorazowo analizie poddawałam 10 000 komórek. Uzyskane histogramy przedstawiające rozkład komórek w poszczególnych fazach cyklu życiowego analizowałam z zastosowaniem programu WinMDI (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). 4.3.4 Badanie odpowiedzi komórkowej indukowanej przez związki a. Obserwacje mikroskopowe morfologii jąder komórek Zmiany, jakim może podlegać jądro komórek traktowanych związkiem cytotoksycznym, można łatwo obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po uprzednim wybarwieniu komórek jednym z barwników łączących się z DNA. Do najczęściej używanych barwników należą: DAPI (4',6-diamidyno- 2-fenyloindol) i Hoechst 33342. W swoich doświadczeniach zastosowałam metodę z DAPI. Obserwacje mikroskopowe morfologii jąder komórkowych wykonałam na komórkach modelu CHO i MCF-7 oraz komórkach KB-3 typu dzikiego i przejściowo transfekowanych inkubowanych z badanymi związkami. Zawiesinę komórek CHO wysiewałam na 100 mm płytki Petriego w ilości 1,5x10 6 komórek dla czasów inkubacji 3, 6, i 12 godzin lub 10 6 komórek dla próbki kontrolnej i czasów 24, 48, 72, 96 i 120 godzin na 10 ml pożywki. Komórki MCF-7 wysiewałam na 100 mm płytki Petriego w ilości: 1,2x10 6 dla kontroli i krótszych czasów inkubacji (24 i 48 godzin) oraz 10 6 dla dłuższych czasów (72, 96 i 120 godzin) na 8 ml pożywki. Z kolei komórki KB-3 typu dzikiego i przejściowo transfekowane wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w ilości 10 6 komórek dla próbki kontrolnej i czasów 24, 48 i 72 godzin na 3 ml pożywki. Komórki inkubowałam ze związkiem C-1305 lub C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80 dla komórek CHO i MCF-7 lub 30xIC50 dla komórek KB-3 przez podane czasy. Po zakończonej inkubacji komórki zbierałam z płytek za pomocą trypsyny, dwukrotnie płukałam zimnym PBS-em i wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), zawieszałam w 0,5 do 3 ml PBSu w zależności od wielkości osadu komórek, po czym zawiesinę komórek o objętości 200 μl nawirowywałam na szkiełka mikroskopowe przy użyciu cytowirówki (700 rpm, 4 min.). Uzyskane preparaty utrwalałam przez 15 minut w roztworze Carnoy a (metanol i kwas octowy w stosunku 3:1) i przemywałam PBS-em. Po utrwaleniu komórki barwiłam za pomocą roztworu barwnika DAPI (0,01 μg/ml) przez 5 minut bez dostępu światła i ponownie płukałam w PBS-ie. Na tak przygotowaną warstwę komórek nanosiłam 10 μl buforu do

Część doświadczalna 62 zamykania preparatów i przykrywałam szkiełkiem nakrywkowym. Boki szkiełka zamalowywałam lakierem, by zapobiec wypłynięciu buforu. Tak przygotowany preparat był gotowy do obserwacji. Obserwację zmian morfologii jąder komórek prowadziłam przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego OLYMPUS BX60 w świetle UV przy powiększeniu 400x. Komórki liczyłam przy powiększeniu 200x. Każdorazowo zliczałam 500 komórek. Fotografie przygotowanych preparatów wykonałam dzięki kamerze podłączonej do mikroskopu, wykorzystując oprogramowanie Studio Lite (Pixera Corporation, Los Gatos, CA, USA). b. Badanie zmian w budowie błony komórkowej test Aneksyna V/PI Test aneksyna V/jodek propidyny oparty jest o podwójne barwienie. Po pierwsze, pozwala na określenie zaniku asymetrii w rozkładzie fosfolipidów w błonie komórkowej dzięki zdolności białka aneksyny V znakowanej fluoresceiną do wiązania się z fosfatydyloseryną, która w komórce apoptotycznej ulega translokacji z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony komórkowej. Drugi stosowany w teście barwnik jodek propidyny wchodzi i interkaluje do DNA jedynie tych komórek, których błona komórkowa została uszkodzona. Eksperyment przeprowadza się z zastosowaniem cytometru przepływowego i pozwala on na rozróżnienie komórek: niezmienionych, wczesnoapoptotycznych, późnoapoptotycznych i pierwotnie nekrotycznych. Doświadczenie przeprowadziłam wobec komórek modelu CHO i MCF-7 traktowanych związkami C-1305 (CHO, MCF-7) i C-1311 (CHO). Zawiesinę komórek CHO wysiewałam na 100 mm płytki Petriego w ilości 10 6 komórek dla czasów inkubacji: 3, 6, 12 i 24 godziny oraz 8x10 5 komórek dla kontroli i czasów: 48, 72, 96, 120 godzin na 10 ml pożywki. Komórki MCF-7 wysiewałam na 100 mm płytki Petriego w ilości: 1,2x10 6 dla kontroli i krótszych inkubacji czasów (24 i 48 godziny) oraz 10 6 dla dłuższych czasów (72, 96 i 120 godziny) na 8 ml pożywki. Komórki inkubowałam ze związkiem w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80 przez wspomnianą liczbę godzin. Po inkubacji do dalszych badań pobierałam 1,5x10 6 komórek, wirowałam je (1000 rpm, 5 min., 4ºC), dwukrotnie płukałam zimnym PBS-em i ponownie wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Następnie komórki zawieszałam w 50 μl roztworu barwiącego z zestawu Annexin-V-FLOUS Kit firmy Roche (5 μl aneksyny V-FITC, 5 μl jodku propidyny, 290 μl buforu HEPES i inkubowałam przez 15 minut bez dostępu światła. Po inkubacji do zawiesiny komórek dodałam 350 μl buforu HEPES. Tak przygotowane próbki poddałam analizie cytometrycznej. Pomiar intensywności fluorescencji emitowanej przez fluoresceinę skoniugowaną z aneksyną V (fluorescencja zielona, długość fali emisji 518 nm) oraz jodku propidyny (fluorescencja pomarańczowa, długość fali emisji 617 nm) prowadziłam przy fali wzbudzenia o długości 488 nm. Każdorazowo analizie poddawałam 10 000 komórek. Uzyskane cytogramy przedstawiające zmiany w asymetrii i integralności błony komórkowej analizowałam wykorzystując program WinMDI (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). c. Cytometryczna analiza aktywacji kaspazy-3 W komórkach, w których dochodzi do indukcji apoptozy lub również katastrofy mitotycznej aktywacji ulegają specyficzne enzymy, kaspazy. Jednym z głównych enzymów biorących udział

Część doświadczalna 63 w degradacji umierającej komórki jest kaspaza-3 [Porter i Janickie, 1999]. Jej aktywację można zbadać dzięki zastosowaniu odpowiedniego przeciwciała łączącego się z charakterystyczną dla tego białka sekwencją aminokwasów. Wiążące się przeciwciało skoniugowane jest z fikoerytryną, dzięki czemu można z zastosowaniem techniki cytometrii przepływowej wykryć kompleksy enzym-przeciwciało. Użyty przeze mnie zestaw do detekcji kaspazy-3 to Active Caspase-3 Apoptosis Kit firmy BD Pharmingen. Doświadczenie przeprowadziłam na komórkach modelu CHO i MCF-7. Zawiesinę komórek CHO wysiewałam na 100 mm płytki Petriego w ilości 10 6 komórek dla czasów inkubacji: 3, 6, 12 i 24 godziny oraz 8x10 5 komórek dla kontroli i czasów: 48, 72, 96, 120 godzin na 10 ml pożywki, zaś komórki MCF-7 w ilości: 1,2x10 6 dla kontroli i czasu inkubacji 24 godziny oraz 10 6 dla czasu 120 godziny na 8 ml pożywki. Komórki inkubowałam z danym związkiem w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80 przez wspomnianą liczbę godzin. Po inkubacji do dalszych badań pobierałam 10 6 komórek, wirowałam je (1000 rpm, 5 min., 4ºC), dwukrotnie płukałam zimnym PBS-em i za każdym razem wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Następnie zawieszałam komórek w 0,5 ml roztworu utrwalającego i lizującego Cytofix/Cytoperm i inkubowałam je przez 20 minut w lodzie. Po inkubacji wirowałam komórki (1000 rpm, 5 min., 4ºC), dwukrotnie płukałam zimnym roztworem Perm/Wash 1x i za każdym razem ponownie wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Znad zwirowanych komórek odsysałam supernatant i dodawałam do każdej próbki po 120 μl mieszaniny barwiącej (20 μl roztworu przeciwciała anty-kaspaza-3 i 100 μl roztworu Perm/Wash 1x). Komórki pozostawiałam w ciemności na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończonej inkubacji komórki wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC) przemywałam jednokrotnie zimnym roztworem Perm/Wash 1x (0,5 ml) i ponownie wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Na koniec zawieszałam komórki w 0,5 ml roztworu Perm/Wash 1x. Tak przygotowane próbki poddawałam analizie cytometrycznej. Pomiar intensywności fluorescencji emitowanej przez fikoerytrynę skoniugowaną z króliczym przeciwciałem poliklonalnym rozpoznającym odcinek aktywnej kaspazy-3 prowadziłam przy fali wzbudzenia λ = 488 nm. Każdorazowo analizie poddawałam 10 000 komórek. Uzyskane histogramy przedstawiające procentową zawartość komórek z aktywną kaspazą-3 analizowałam wykorzystując program WinMDI (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). d. Badanie fragmentacji DNA przy wykorzystaniu elektroforezy agarozowej Kolejną charakterystyczną cechą komórki umierającej na drodze apoptozy jest międzynukleosomalna fragmentacja DNA. Zjawisko to można uwidocznić poprzez rozdział w żelu agarozowym DNA wyizolowanego z komórek traktowanych związkiem, co objawia się charakterystyczną drabiną [Peitsch i wsp., 1994]. Doświadczenie wykonałam na komórkach modelu CHO. Zawiesinę komórek wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w ilości 5x10 5 komórek na 5 ml pożywki dla linii CHO i CHO-HR oraz w ilości 7x10 5 dla CHO-HR-3A4. Po 24 godzinnej preinkubacji dodawałam do płytek związek C-1311 o stężeniu końcowym odpowiadającemu wartości IC80. Komórki inkubowałam z pochodną C-1311 przez 24, 48, 72, 96 i 120 godzin. Po zakończonej inkubacji zebraną z płytek zawiesinę komórek wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), jednokrotnie przemywałam zimnym PBS-em i ponownie wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Otrzymany osad komórek zawieszałam w 2 ml PBS-u, a następnie przenosiłam po 1 ml do dwóch

Część doświadczalna 64 probówek 1,5 ml typu Eppendorf i wirowałam (2000 rpm, 5 min.). Do otrzymanego osadu komórek dodawałam 100 μl proteinazy K o stężeniu 0,5 mg/ml i inkubowałam w 50ºC przez 1 godzinę. Po tym czasie do każdej z próbek dodawałam 25 μl RNAzy o stężeniu 2 mg/ml i ponownie inkubowałam w 50ºC przez 2 godziny. Po zakończonej inkubacji zawiesinę komórkową wirowałam (2000 rpm, 3 minuty). Uzyskany supernatant przenosiłam do nowych 1,5 ml probówek typu Eppendorf, dodawałam 30 μl 5M NaCl i po wymieszaniu na worteksie wirowałam (2500 rpm, 15 min.). Uzyskany supernatant przenosiłam do nowych probówek i wytrącałam DNA przy pomocy 300 μl zimnego 95% alkoholu etylowego. Tak przygotowane próbki przechowywałam przez noc w temperaturze 20ºC. W kolejnym etapie próbki z wyizolowanym DNA wirowałam (12 000 rpm, 15 min., 4ºC). Uzyskany osad DNA suszyłam w sterylnych warunkach pod wyciągiem przez około godzinę. Osad DNA rozpuszczałam w 20 μl roztworu TE, mieszałam na wytrząsarce typu worteks i poddawałam 30 minutowej inkubacji w 50ºC. Próbki przechowywałam w zamrażarce w temperaturze 20ºC. DNA rozdzielałam elektroforetycznie w 1,8% żelu agarozowym z dodatkiem 5 μl bromku etydyny o stężeniu 50 mg/ml, w buforze TBE 1x przy napięciu 90 V przez 3 godziny. Próbki nanosiłam w ilości 20 μl + 5 μl buforu obciążającego na studzienkę. Następnie fotografowałam i analizowałam w świetle UV żel agarozowy przy użyciu VersaDoc model 1000 firmy Bio-Rad Laboratories (Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, dzięki uprzejmości prof. Józefa Kur). e. Analiza populacji martwych komórek z zastosowaniem barwników FDA i PI Jednym z podstawowych testów wykorzystywanych do odróżnienia komórek martwych od żywych jest tzw. barwienie różnicowe za pomocą dwóch barwników fluorescencyjnych, takich jak jodek propidyny (PI) oraz dioctan fluoresceiny (FDA). Dioctan fluoresceiny jest nie polarną i nie fluoryzującą pochodną fluoresceiny, która posiada zdolność do przenikania przez błonę komórkową. Po wniknięciu do komórki FDA jest hydrolizowany przez wewnątrzkomórkowe esterazy do fluoresceiny związku wykazującego właściwości fluoryzujące. Komórki żywe, przejawiające dużą aktywność esteraz, kumulują znaczne ilości fluoresceiny, co w konsekwencji powadzi do otrzymania intensywnej fluorescencji zielonej. Komórki apoptotyczne i martwe, cechujące się mniejszą aktywnością esteraz oraz słabiej zachowaną integralnością błony komórkowej, słabiej akumulują produkt hydrolizy FDA, co oznacza mniejsze wartości zielonej fluorescencji tychże komórek. Jodek propidyny, ze względu na posiadany ładunek elektryczny, nie przenika przez nieuszkodzoną błonę komórek żywych i wczesnoapoptotycznych. Barwi natomiast na czerwono komórki z uszkodzoną błoną cytoplazmatyczną, a więc nekrotyczne lub znajdujące się w późnych fazach apoptozy [Jones i Senft, 1985]. Doświadczenie wykonałam dla komórek modelu CHO i MCF-7 oraz linii KB-3 typu dzikiego i przejściowo transfekowanych. Zawiesinę komórek wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w ilości 5x10 5 komórek na 5 ml pożywki dla linii CHO-WT, CHO-HR i modelu MCF-7 oraz w ilości 7x10 5 dla linii CHO-HR-3A4. Przygotowałam płytki do inkubacji ze związkiem przez 24, 48, 72, 96 i 120 godzin oraz próbkę kontrolną, nietraktowaną związkiem. Z kolei komórki KB-3 typu dzikiego i przejściowo transfekowane wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w ilości 10 6 komórek dla kontroli i czasów 24, 48 i 72 godzin na 3 ml pożywki. Komórki inkubowałam ze związkiem C-1305 lub C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80 dla komórek modelu CHO i MCF-7 lub 30xIC50 dla komórek KB-3 przez

Część doświadczalna 65 podane czasy. Po zakończonej inkubacji zebraną z płytek zawiesinę komórek wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), dwukrotnie przemywałam zimnym PBS-em i ponownie wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Do otrzymanego osadu komórek dodawałam w zależności od wielkości osadu ok. 100 μl roztworu dioctanu fluoresceiny w PBS-ie (5 μl roztworu dioctanu fluoresceiny w acetonie o stężeniu 1mg/ml na 1 ml PBS-u) i inkubowałam przez 10 minut w 37ºC bez dostępu światła. Po inkubacji do zawiesiny komórek dodawałam 1 μl roztworu jodku propidyny o stężeniu 2 mg/ml H2O. W przypadku komórek modelu CHO kroplę wybarwionej zawiesiny komórek nanosiłam na szkiełko podstawowe i przykrywałam je szkiełkiem nakrywkowym. Tak przygotowany preparat oglądałam przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego OLYMPUS BX60 przy powiększeniu 200x (zakres światła niebieskiego). Komórki liczyłam przy powiększeniu 100x. Każdorazowo zliczałam około 500 komórek. Fotografie przygotowanych preparatów wykonałam dzięki kamerze podłączonej do mikroskopu, wykorzystując oprogramowanie Studio Lite (Pixera Corporation, Los Gatos, CA, USA). Z kolei w przypadku komórek modelu MCF-7 wybarwioną zawiesinę komórek analizowałam cytometrycznie przy zastosowaniu cytometru Accuri C6 (Becton Dickinson). Pomiar intensywności fluorescencji emitowanej przez fluoresceinę i jodek propidyny prowadziłam przy fali wzbudzenia o długości 488 nm. Każdorazowo analizie poddawałam 10 000 komórek. Uzyskane histogramy przedstawiające procentową zawartość komórek żywych i martwych analizowałam wykorzystując oprogramowanie dostarczone przez firmę BD (Beton Dickinson). f. Badanie procesu starzenia komórkowego Komórki, które pod wpływem związku cytotoksycznego nie umierają, mogą podlegać innemu procesowi przyspieszonemu starzeniu komórkowemu. W komórce starzejącej się proliferacja ustaje, ale inne procesy metaboliczne zostają zachowane. Jej morfologia zmienia się i komórka staje się bardziej rozpłaszczona, a w jej cytoplazmie obecne są ziarnistości. Co istotne, komórka przestaje się dzielić nie na skutek skrócenia telomerów, ale w wyniku działania związku. Badanie tego procesu wykorzystuje fakt, że w komórkach ulegających starzeniu komórkowemu, dochodzi do ekspresji SA-β-galaktozydazy uwalnianej do cytoplazmy [Robinson, 2003]. Aktywność tego enzymu można badać poprzez dodanie do pożywki substratu enzymu, jakim jest X-Gal. Cytozolowa SA-β-galaktozydaza w ph = 6,0 rozkłada X-Gal do niebieskiego produktu widocznego pod mikroskopem świetlnym. Zawiesinę komórek CHO wysiewałam na 50 mm płytki Petriego ze szkiełkiem nakrywkowym w ilości 5x10 5 komórek na 5 ml pożywki i inkubowałam ze związkiem C-1311 o stężeniu IC80 przez 24, 48, 72, 96 lub 120 godzin. Po zakończonej inkubacji usuwałam pożywkę znad warstwy komórek, dwukrotnie przemywałam komórki ciepłym (37ºC) PBS-em o ph = 7,2. Następnie na 5 minut zalewałam je 5 ml mieszaniny Fixative Solution (0,5 ml 2% glutaraldehydu, 0,5 ml 20% formaldehydu, 4 ml PBS o ph = 7,2) i ponownie dwukrotnie przemywałam ciepłym (37ºC) PBS-em, tym razem o ph = 6,0. Po odessaniu roztworu przenosiłam szkiełka nakrywkowe z przyklejonymi komórkami na 20 mm płytki Petriego i zalewałam je 2 ml mieszaniny Staining Solution (5 mm K3Fe(CN)6, 5 mm K4Fe(CN)6, 2 mm MgCl2, 150 mm NaCl, 40 mm Na2HPO4) zawierającej X-Gal o stężeniu końcowym 1 mg/ml (1,8 ml Staining Solution + 0,2 ml X-Gal o stężeniu 10mg/ml). Po 16 godzinach inkubacji w temp. 37ºC komórki przemywałam ciepłym PBS-em i oglądałam pod mikroskopem (OLYMPUS BX60) w świetle widzialnym

Część doświadczalna 66 przy powiększeniu 200x. Komórki liczyłam przy powiększeniu 100x. Każdorazowo zliczałam około 500 komórek. Fotografie przygotowanych preparatów wykonałam dzięki kamerze, stosując oprogramowanie Studio Lite (Pixera Corporation, Los Gatos, CA, USA). 4.3.5 Badanie poziomu białek zaangażowanych w cykl komórkowy i indukcję apoptozy w komórkach KB-3 traktowanych związkiem C-1305 i C-1311 metodą Western blotting a. Izolacja frakcji białkowej Zawiesinę komórek linii KB-3 wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w ilości około 0,5x10 6, 1x10 6 oraz 2x10 6 komórek odpowiednio dla czasów inkubacji 24, 48 i 72 godziny oraz 0,5x10 6 dla komórek kontrolnych, nietraktowanych związkiem. Po osiągnięciu około 80% konfluencji (przynajmniej po 24 godzinach od wysiania) do komórek dodawałam związek w stężeniu odpowiadającemu wartości 30xIC50 i inkubowałam przez wspomniane czasy. Po zakończonej inkubacji zawiesinę komórkową wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), dwukrotnie przemywałam zimnym PBS-em i wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Otrzymany osad komórek zawieszałam w około 100 μl (w zależności od wielkości osadu komórek) buforu lizującego (40 mm HEPES, ph=7,4, 120 mm NaCl, 1% Triton-X-100, 1 mm EDTA, 5 mm ditiotreitol, 20 mm β-fosfoglicerol, 1mM Na3VO4, 50 mm NaF, 20 mg/ml aprotininy, 50 mg/ml leupeptyny, 10 mm pepstatyny, 1 mm kwas okadaikowy, 1 mm PMSF). Komórki poddawałam lizie przez 1 godzinę w lodzie. Zawiesinę komórkową wirowałam (12 000 rpm, 15 min., 4ºC), a otrzymany supernatant przenosiłam do nowych probówek. Następnie oznaczyłam stężenie białka metodą Bradford, stosując zestaw Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories). Część zawiesiny białkowej przygotowałam do kolejnego etapu eksperymentu zawieszając 50 μg białka w buforze Laemmli 5x (62,5 mm Tris-HCl ph=6,8, 25% glicerol, 2% SDS, 0,01% błękit bromofenolowy) i poddając denaturacji przez 10 minut w temperaturze 95 C. Tak przygotowane próbki przechowywałam w temperaturze - 20 C. b. Elektroforeza SDS-PAGE Próbki zawierające odpowiednią ilość białka całkowitego (20 µg) nanosiłam na studzienki i poddawałam elektroforezie w żelu poliakrylamidowym (5% żel zagęszczający; 12,5% rozdzielający). Elektroforezę prowadziłam od 2 do 4 godzin (w zależności od wielkości analizowanych białek) przy 100 V w buforze do elektroforezy (25 mm Tris-Base, ph=8,3, 192 mm glicyna, 0,1% SDS). c. Immunowybarwienie (immunoblotting) Po zakończeniu elektroforezy przeprowadzałam transfer białek z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową, wykorzystując w tym celu metodę tzw. elektrotransferu mokrego. Transfer białek, po uprzednim nasączeniu żelu, membrany oraz bibuły Whatman 3 mm w buforze zawierającym 25 mm Tris-Base o ph=8,3, 192 mm glicyny, 20% metanolu, prowadziłam przez noc przy stałym natężeniu prądu 8 ma/cm 2. Po skończonym transferze blokowałam potencjalne miejsca niespecyficznego wiązania przeciwciał poprzez umieszczenie membrany w buforze blokującym (bufor TBST, 10% odtłuszczone

Część doświadczalna 67 mleka w proszku) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce wertykalnej. Następnie membranę płukałam pięciokrotnie po 5 minut w buforze TBST (150 mm NaCl, 0,05% Tween-20, 10 mm Tris-HCl o ph=7,4) i inkubowałam z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym, zawieszonym w buforze TBST z dodatkiem 1% odtłuszczonego mleka w proszku przez noc w temperaturze 4 C na wytrząsarce wertykalnej. Następnie membranę płukałam 5 razy po 5 minut w buforze TBST i poddawałam inkubacji z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym skoniugowanym z peroksydazą chrzanową zawieszonym w buforze TBST z dodatkiem 1% odtłuszczonego mleka w proszku. Inkubację prowadziłam przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, łagodnie wytrząsając. Lokalizację białek na błonie przeprowadzałam stosując substrat luminescencyjny dla peroksydazy chrzanowej (zestaw ECL) z detekcją sygnału po odpowiednim czasie ekspozycji kliszy fotograficznej ECL Hyperfilm (Kodak, Rochester, NY, USA). W celu weryfikacji równomiernego napełnienia studzienek podczas elektroforezy, oznaczałam poziom białka GAPDH. 4.3.6 Analiza poziomu enzymów metabolizujących metodą Western blotting a. Izolacja frakcji białkowej z całych komórek Zawiesinę komórek modelu CHO i MCF-7 oraz linii HepG2 i Hep3A4 wysiewałam na 100 mm płytki Petriego w ilości 2,5x10 6 komórek dla czasów inkubacji: 1, 3, 6, 12 godzin oraz 2x10 6 komórek dla kontroli (komórki nietraktowane związkiem) i czasów: 24, 48, 72, 96, 120 godzin (niekiedy, dla długich czasów inkubacji, gdy komórki pod wpływem związku ulegały silnej degradacji, wysiewałam po dwie płytki Petriego) na 10 ml pożywki i inkubowałam ze związkiem C-1311 o stężeniu końcowym odpowiadającemu wartości IC80 dla linii CHO-HR-3A4 oraz IC50 dla HepG2 i Hep3A4 przez wspomniane czasy. Po zakończonej inkubacji zawiesinę komórkową wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), dwukrotnie przemywałam zimnym PBS-em i znów wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Otrzymany osad komórek zawieszałam w 150 μl buforu NaHPO4 o ph = 7,6 z dodatkiem 2 mm ditiotreitolu, 2 mm MgCl2, 1 mm EDTA 3Na i homogenizowałam w homogenizatorze ręcznym przez 2 minuty. Zawiesinę komórkową wirowałam (13 000 rpm, 15 min., 4ºC), a otrzymany supernatant pozostawiałam w temperaturze 80ºC do kolejnych badań. Przed analizą Western blotting oznaczyłam stężenie białka metodą Bradford, stosując w tym celu zestaw Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories). b. Elektroforeza SDS-PAGE Próbki zawierające odpowiednią ilość białka całkowitego (30 µg) łączyłam z równą objętością buforu Laemmli 2x (62,5 mm Tris-HCl ph=6,8, 25% glicerol, 2% SDS, 0,01% błękit bromofenolowy, 5% β-merkaptoetanol), denaturowałam przez 5 minut w temperaturze 100 C i poddawałam elektroforezie w żelu poliakrylamidowym (5% żel zagęszczający; 12% żel rozdzielający). Elektroforezę prowadziłam przez 15 minut przy 90 V, a następnie przez około 90 minut przy 120 V w buforze zawierającym 25 mm Tris-Base o ph = 8,3, 192 mm glicyny i 0,1% SDS.

Część doświadczalna 68 c. Immunowybarwienie (immunoblotting) Po zakończeniu elektroforezy prowadziłam transfer białek z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową, wykorzystując w tym celu metodę tzw. elektrotransferu półsuchego. Transfer białek, po uprzednim nasączeniu żelu, membrany oraz bibuły Whatman 3 mm w buforze zawierającym 25 mm Tris-Base o ph = 8,3, 192 mm glicyny, 20% metanolu, prowadziłam przez 40 minut przy stałym napięciu prądu 10 V/cm 2. Po skończonym transferze blokowałam potencjalne miejsca niespecyficznego wiązania przeciwciał poprzez umieszczenie membrany w buforze blokującym (50 mm Tris-HCl o ph=7,4, 120 mm NaCl, 10% odtłuszczonego mleka w proszku) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Następnie membranę płukałam 3 razy po 15 minut w buforze TBST (150 mm NaCl, 0,05% Tween-20, 10 mm Tris-HCl o ph=7,4) i inkubowałam z przeciwciałem pierwszorzędowym, zawieszonym w buforze TBST z dodatkiem 0,5% odtłuszczonego mleka w proszku przez noc w temperaturze 4 C na wytrząsarce wertykalnej. Następnie membranę płukałam 3 razy po 15 minut w buforze TBST i poddawałam inkubacji z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym skoniugowanym z peroksydazą chrzanową zawieszonym w buforze TBST z dodatkiem 0,5% odtłuszczonego mleka w proszku. Inkubację prowadziłam przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, łagodnie wytrząsając. Lokalizację białek na błonie przeprowadziłam stosując substrat luminescencyjny dla peroksydazy chrzanowej (zestaw ECL) z detekcją sygnału po odpowiednim czasie ekspozycji kliszy fotograficznej ECL Hyperfilm (Kodak, Polska). W celu weryfikacji równomiernego napełnienia studzienek przed elektroforezą, oznaczałam poziom β-aktyny. Po zakończonej detekcji ECL, membranę płukałam 3 razy po 15 minut w buforze TBST. Następnie powtarzałam procedurę inkubacji błony z przeciwciałem anty-β-aktyna, odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym oraz przeprowadzałam ponowną detekcję ECL. 4.3.7 Analiza aktywności katalitycznej izoenzymu CYP3A4 z zastosowaniem techniki HPLC Aktywność białka CYP3A4 mierzona była na podstawie przemiany standardowego substratu izoenzymu, jakim jest testosteron. Testosteron ulega przekształceniu przy udziale CYP3A4 do 6β-hydroksytestosteronu. Aktywność enzymu CYP3A4 określiłam w komórkach linii: CHO-HR-3A4, HepG2 oraz Hep3A4 traktowanych w zależności od czasu inkubacji ze związkiem (od 24 do 120 godzin) i jego stężeniem (od 0,01 do 50 μm po 24 godzinach inkubacji tylko dla komórek CHO-HR-3A4). Każdorazowo przygotowywałam próbę kontrolną, czyli komórki nietraktowane związkiem, w których stopień przemiany testosteronu w późniejszych obliczeniach stanowił 100% aktywności izoenzymu CYP3A4. Eksperyment ten wykonywałam również dla komórek linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 poddanych przejściowej transfekcji plazmidem zawierającym gen kodujący izoenzym CYP3A4 w celu weryfikacji wydajności transfekcji i poziomu osiągniętej nadekspresji badanego białka. Zawiesinę komórek wysiewałam na 50 mm płytki Petriego w ilości 2x10 6 komórek dla wszystkich czasów i stężeń inkubacji, zaś dla próbek kontrolnych, komórek nietraktowanych związkiem 10 6 komórek. Kolejnego dnia do płytek dodawałam związek C-1311 o stężeniu końcowym odpowiadającemu wartości IC80 dla komórek linii CHO-HR-3A4 oraz IC50 dla HepG2 i Hep3A4 i inkubowałam przez

Część doświadczalna 69 wspomniane czasy. W przypadku komórek CHO-HR-3A4 przygotowywałam serię płytek ze wzrastającym stężeniem C-1311 od 0,001 do 50 μm, gdzie czas ekspozycji na związek wynosił 24 godziny. Po zakończonej inkubacji wymieniałam pożywkę na świeżą, do której dodawałam roztwór testosteronu w DMSO o stężeniu końcowym 50 μm. Komórki inkubowałam z testosteronem przez 24 godziny. Po zakończonej inkubacji zbierałam z płytek pożywkę i poddawałam ją ekstrakcji acetonitrylem przez 5 minut w stosunku 1:1 w temperaturze pokojowej i pozostawiałam w lodzie przez 30 minut dla rozdzielenia faz. Otrzymaną górną fazę poddawałam analizie chromatograficznej metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych RP-HPLC z udziałem wielodiodowego detektora absorbancji z zastosowaniem chromatografu firmy Waters Co. Stosowaną fazą ruchomą w analizie HPLC był mrówczan amonu metanol, której dokładny gradientu składu w czasie podałam w Tabeli 3. Tabela 3 Gradient składu fazy ruchomej zastosowany w analizach chromatograficznych (A mrówczanowy, ph ~ 3,4; B alkohol metylowy, HPLC Grade). 0,05 M bufor Czas [min] Przepływ [ml/min] Skład fazy ruchomej [%] A B Krzywa Zmian - 25 28 30 40 1 1 1 1 1 85 20 0 85 85 15 80 100 15 15-6 6 6 11 4.3.8 Badanie metabolizmu związków C-1305 i C-1311 zachodzącego w komórkach z zastosowaniem techniki HPLC Przemiany metaboliczne związków C-1305 oraz C-1311 zbadałam w komórkach wszystkich badanych linii: CHO-WT, CHO-HR, CHO-HR-3A4, MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4, MCF-7-UGT1A10 oraz KB-3, MCF-7-WT, MDA-MB-231, H460 i A549 typu dzikiego i poddanych transfekcji enzymami metabolizującymi bądź wektorem pustym. Metabolity z komórek oraz pożywkę hodowlaną poddałam analizie stosując technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Do izolacji metabolitów zastosowałam ekstrakcję 60% metanolem w połączeniu z sonifikacją w łaźni ultradźwiękowej. Zawiesinę komórek wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w ilości 1,5x10 6 dla komórek typu dzikiego i rekombinantowych oraz 3x10 6 dla komórek poddanych przejściowej transfekcji. Po 24 godzinnej preinkubacji, zmieniałam pożywkę i dodawałam związek C-1305 lub C-1311 o stężeniu końcowym wynoszącym 25 μm dla komórek modelu CHO i 30 μm dla komórek pozostałych linii. Inkubację ze związkami prowadziłam przez 24, 48 i 72 godziny (w niektórych przypadkach również 3, 6 i 12 godzin). Dla każdej linii przygotowałam próbkę kontrolną stanowiącą komórki nietraktowane związkiem oraz zawierającą samą pożywkę hodowlaną. Po zakończonej inkubacji komórki zbierałam z płytek za pomocą scrapera, a otrzymaną zawiesinę komórkową wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), przemywałam zimnym PBS-em i znów wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Pozostałą pożywkę hodowlaną zebraną znad komórek pozostawiałam do dalszej analizy. Po wirowaniu osad komórek zawieszałam w 200 μl 60% roztworu

Część doświadczalna 70 metanolu. Zawiesinę komórek poddawałam sonifikacji (150W, 15 min., w lodzie) i odstawiałam do lodu na około 1 godzinę. Następnie zawiesinę komórek oraz zebraną pożywkę wirowałam (14 000 rpm, 15 min., 4ºC). Otrzymane supernatanty poddawałam analizie techniką RP-HPLC z zastosowaniem chromatografu firmy HP/Agilent 1050 System HPLC z detektorem DAD w badaniach na komórkach linii KB-3 bądź firmy Waters z udziałem detektora absorbancji Dual λ Absorbance Detector w badaniach dla pozostałych linii komórkowych. Stasowaną fazą ruchomą w analizie HPLC był mrówczan amonu metanol, której skład podałam w tabeli nr 3. 4.3.9 Badanie generacji reaktywnych form tlenu (ROS) Pod wpływem działania związku cytostatycznego na komórki może dochodzić w nich do tworzenia się reaktywnych form tlenu, ROS (ang. reactive oxygen species). Najnowsze badania wykazały, że niektóre z komórek nowotworowych mogą być bardziej narażone na to zjawisko przy podwyższonym poziomie reduktazy cytochromu P450 [Martinez i wsp., 2006, Fussel i wsp., 2011]. Stąd w komórkach modelu CHO, w których osiągnięto nadekspresję reduktazy cytochromu P450, określiłam ich zdolność do generowania ROS pod wpływem działania związku C-1311. Tworzenie się reaktywnych form tlenu w komórkach modelu CHO badałam na podstawie pomiarów zmian fluorescencji utlenionej formy estru acetylowego dioctanu 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'- dichlorodihydrofluoresceiny (CM-H2DCFDA, Molecular Probes) przy zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej. Nie fluoryzująca forma CM-H2DCFDA pod wpływem ROS zostaje zhydrolizowana do fluoresceiny, której zieloną fluorescencję można obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym w zakresie światła niebieskiego. Zawiesinę komórek modelu CHO wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w ilości 0,5x10 6 dla trzech badanych linii. Po 24-godzinnej preinkubacji do komórek dodawałam związek C-1311 w stężeniu końcowym odpowiadającym dawce IC80 i inkubowałam od 24 do 120 godzin. Jednocześnie przygotowałam komórki kontrolne kontrolę negatywną, czyli komórki nietraktowane związkiem oraz kontrolę pozytywną komórki traktowane 200 μm H2O2, który już po 3 godzinach ekspozycji prowadzi do tworzenia się ROS. Po zakończonej inkubacji, komórki zbierałam z płytki, wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), przemywałam zimnym PBS-em i znów wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC). Otrzymany osad komórek zawieszałam w 0,5 ml buforu barwiącego (10 μm CM-H2DCFDA, 2 μg/ml Hoechst 33342, PBS) i barwiłam przez 30 minut w temperaturze 37ºC w ciemności. Następnie płukałam komórki w PBS-ie, wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), zawieszałam w 0,5 ml PBS-u i 200 μl nawirowywałam na szkiełka podstawowe za pomocą cytowirówki (700 rpm, 4 min.). Na warstwę komórek nanosiłam 10 μl buforu do zamykania preparatów, przykrywałam szkiełkiem nakrywkowym i natychmiast oglądałam pod mikroskopem. Obserwację zmian we fluorescencji prowadziłam przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego OLYMPUS BX60 w świetle UV dla Hoechst 33342, niebieskim dla CM-H2DCFDA oraz w świetle widzialnym przy powiększeniu 400x. Fotografie przygotowanych preparatów wykonałam dzięki kamerze podłączonej do mikroskopu, stosując oprogramowanie Studio Lite (Pixera Corporation, Los Gatos, CA, USA).

Część doświadczalna 71 4.3.10 Namnożenie, oczyszczenie i przygotowanie plazmidów do transfekcji komórek ssaczych a. Namnożenie plazmidu Do namnożenia plazmidów, o których mowa w punkcie 4.1.10, zastosowanych do transfekcji przejściowej i stałej komórek ssaczych, wykorzystałam technikę z użyciem komórek kompetentnych. Transformację komórek E. coli, XL-1 Blue Competent Cells (Agilent Technologies) przeprowadziłam zgodnie z załączonym protokołem. W tym celu na jedną próbę pobierałam 25 μl zawiesiny komórek, umieszczałam ją w lodzie i dodawałam 0,4 μl β-merkaptoetanolu. Po delikatnym wymieszaniu inkubowałam komórki przez 10 minut w ludzie, mieszając zawiesinę co 2 minuty. Następnie do komórek dodawałam 1-2 μl plazmidu i inkubowałam próbkę przez 30 minut w lodzie. Po zakończonej inkubacji komórki poddawałam szokowi termicznemu umieszczając je na 45 sekund (długość czasu krytyczna dla wydajności transformacji) w 42ºC, a następnie na 2 minuty w lodzie. Po transformacji do komórek dodawałam 475 μl uprzednio podgrzanej do 42ºC pożywki SOC i umieszczałam próbkę w inkubatorze z rotorem (250 rpm) w temperaturze 37ºC na 1 godzinę. Po zakończonej inkubacji wysiewałam 20 μl zawiesiny komórkowej na 100 mm płytkę Petriego zawierającą agarowe podłoże LB z dodatkiem antybiotyku selekcjonującego (dla większości plazmidów była to ampicylina, stężenie końcowe 100 μg/l, dla plazmidu kodującego GFP kanamycyna o stężeniu 25 μg/l pożywki). Tak przygotowane płytki umieszczałam w cieplarce w 37ºC na całą noc. Kolejnego dnia selekcjonowałam jedną kolonię komórek E. coli i przenosiłam ją do kolby zawierającej 0,5 l pożywki LB z dodatkiem antybiotyku sekcjonującego (ampicylina, 100 μg/l pożywki lub kanamycyna, 25 μg/l pożywki). Następnie umieszczałam kolbę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37ºC na całą noc. Kolejnego dnia otrzymaną zawiesinę komórek bakteryjnych wirowałam (4200 x g, 30 min., 4ºC). Otrzymany osad komórek był gotowy do kolejnego etapu izolacji i oczyszczania plazmidu. b. Izolacja i oczyszczanie plazmidu Izolację i oczyszczanie plazmidu przeprowadzałam z zastosowaniem zestawu QIAGEN Plazmid Plus Maxi Kit (Qiagen) lub Plasmid Midi AX Kit (A&A Biotechnology) według załączonych protokołów. Korzystając z zestawu firmy QIAGEN, osad komórek E. coli zawierający żądany plazmid zawieszałam w 10 ml buforu P1, po czym dodawałam do niego 10 ml buforu lizującego P2 (zawiesina komórek przyjmowała barwę niebieską). Następnie delikatnie mieszałam zawiesinę i odstawiałam na 5 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Po tym czasie do lizatu komórkowego dodawałam 10 ml zimnego buforu P3. W tym momencie roztwór znów stawał się biały. Następnie lizat komórkowy przenosiłam do tubki filtrującej, QIAfilter Cartrige z zamkniętym u dołu ujściem i odstawiałam na 10 minut. Po tym czasie zdejmowałam zatyczkę tubki i filtrowałam zawiesinę za pomocą tłoczka. Do otrzymanego czystego supernatantu dodawałam 2,5 ml buforu ER, którego celem jest eliminacja endotoksyn pochodzących od komórek bakteryjnych. Lizat inkubowałam przez 30 minut w lodzie. W tym czasie przygotowywałam kolumnę wiążącą DNA, QIAGEN-tip 500 poprzez przemycie jej 10 ml buforu QBT. Po zakończonej inkubacji przenosiłam lizat na kolumnę QIAGEN-tip i czekałam aż cały roztwór przejdzie przez kolumnę zgodnie z przepływem grawitacyjnym. Następnie przepłukiwałam kolumnę dwa razy po 30 ml buforem

Część doświadczalna 72 QC. Z tak przygotowanej kolumny związane DNA plazmidowe poddawałam elucji do czystej 50 ml wirówkowej probówki za pomocą 15 ml buforu QN. Do otrzymanego roztworu dodawałam 10,5 ml izopropanolu (o temperaturze pokojowej) w celu precypitacji plazmidu, mieszałam zawartość i wirowałam (15 000 x g, 30 min., 4ºC). Po wirowaniu delikatnie zlewałam supernatant znad osadu DNA, który następnie przemywałam 5 ml 70% etanolu (o temperaturze pokojowej, nie zawierającym endotoksyn), uważając, by nie uszkodzić osadu DNA. Otrzymany czysty osad DNA suszyłam na powietrzu przez około 15 minut, zawieszałam w 200 μl buforu TE i przechowywałam w zamrażarce w temp. -20ºC. c. Sprawdzenie czystości plazmidu i określenie jego stężenia W celu sprawdzenia czystości i określenia stężenia plazmidu poddałam go reakcji restrykcji w unikalnym dla danego plazmidu miejscu, tak aby otrzymać jeden produkt reakcji w formie linowej. Zwykle plazmidy występują w trzech formach: liniowej, kolistej i superkolistej. Po rozdzieleniu plazmidu w żelu agarozowym otrzymuje się zatem trzy prążki. Aby być pewnym otrzymania prawidłowego i czystego plazmidu musi on być poddany analizie w formie liniowej. Dzięki temu łatwo można wykluczyć obecność niespecyficznego i niepożądanego DNA w badanej próbce i oszacować wielkość plazmidu. Liniowa forma plazmidu zapewnia również łatwość poddania go analizie densometrycznej w celu określenia jego stężenia. Każdy z przygotowanych i oczyszczonych plazmidów poddawałam reakcji restrykcji. Dla wszystkich plazmidów: zastosowany enzym restrykcyjny był ten sam: Xba I (Promesa Co.). Skład mieszaniny reakcyjnej był następujący (objętość końcowa 20 µl): 14 µl sterylnej, pozbawionej nukleaz wody 2 µl 10X buforu restrykcyjnego Buffer D 2 µl acetylowanego BSA (1mg/ml) 1 µl DNA plazmidowego zawieszonego w wodzie lub buforze TE 1 µl enzymu restrykcyjny Xba I (1U) Reakcję restrykcji prowadziłam przez 3 godziny w temp. 37ºC. Po jej zakończeniu do próbek dodawałam 4 µl buforu obciążającego Blue/Orange Loading Dye (Promesa Co.). Otrzymane próbki o objętości 6 µl nanosiłam na 0,7% żel agarozowy z dodatkiem bromku etydyny i poddawałam rozdzieleniu (1 godzina, natężenie prądu: 50 V). Jako marker zastosowałam Lambda DNA / Hind III Marker (Promesa Co.). Wyniki reakcji restrykcji i elektroforezy wizualizowałam przy użyciu lampy UV. Zdjęcie żeli wykonywałam przy użyciu aparatu Gel Scanner połączonego z kamerą, z użyciem oprogramowania LabWorks (Winnipeg, MB, USA). Stężenie plazmidu określałam na podstawie porównania intensywności świecenia prążka markera o znanym stężeniu i prążka badanego plazmidu (sposób oznaczenia w trakcie stażu naukowego w University of Arkansas for Medical Science, Little Rock, AR, USA) lub z zastosowaniem aparatu NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) w Katedrze Mikrobiologii Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej dzięki uprzejmości prof. Józefa Kur.

Część doświadczalna 73 4.3.11 Transfekcja komórek Transfekcję komórek linii KB-3, MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 prowadziłam stosując technikę elektroporacji. W metodzie tej wykorzystuje się pole elektryczne, które prowadzi do odwracalnego uszkodzenia błony komórkowej. W trakcie trwania impulsu do wnętrza komórki może wniknąć plazmid niosący gen kodujący białko, którego dodatkową ekspresję chcemy uzyskać w badanych komórkach. Jest to jeden z najwydajniejszych sposobów transfekcji komórek nie tylko ssaczych, ale również bakteryjnych, grzybowych i roślinnych (wówczas proces zwany transformacją). W trakcie stażu na Uniwersytecie UAMS komórki poddawałam transfekcji również inną metodą, z zastosowaniem Lipofectaminy (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jednak ten sposób był dużo mniej wydajny. Aparat, na którym przeprowadzałam elektroporcję to Elektro Cell Manipulator (ECM): model 830 (w trakcie stażu naukowego w UAMS) lub model T 820 firmy BTX (BTX Harvard Apparatus). Do jednorazowej transfekcji pobierałam 12 mln komórek będących w logarytmicznej fazie wzrostu, których konfluencja nie przekraczała 80%. Komórki po odklejeniu od podłoża pojemnika hodowlanego (za pomocą trypsyny) wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC), przemywałam zimnym PBS-em, ponownie wirowałam (1000 rpm, 5 min., 4ºC) i zawieszałam w 400 µl buforu do elektroporacji (10 mm HEPES, ph=7,2, 150 mm NaCl, 4 mm CaCI2, 0.5 M mannitol) lub pożywki OptiMEM (Gibco Life Technologies). Do zawiesiny komórek dodawałam plazmid w ilości 10 µg/400 µl zawiesiny komórkowej. Tak przygotowane komórki przenosiłam do sterylnych kuwetek z 2 mm szczeliną specjalnie przeznaczonych do elektroporacji (2-mm gap cuvette firmy Eppendorf), umieszczałam w elektrodzie i poddawałam elektroporacji. Parametry, przy jakich prowadziłam elektroporację dla komórek poszczególnej linii, przedstawiłam w Tabeli 4. Tabela 4 Parametry elektroporacji wyznaczone i stosowane do transfekcji badanych linii komórek. Parametr Linia komórkowa Natężenie prądu [V] Długość impulsu [MS] KB-3 150 20 MCF-7 120 20 MDA-MB-231 120 15 H460 160 20 A549 150 20 Po elektroporacji komórki z kuwety szybko przenosiłam do wcześniej przygotowanej sterylnej płytki ze świeżą, ciepłą pożywką (czas od elektroporacji do umieszczenia komórek w świeżej pożywce bardzo istotny dla kondycji komórek, w przypadku zawieszenia komórek w buforze do elektroporacji). Jeśli wymagał tego kolejny eksperyment, zawiesinę transfekowanych komórek dzieliłam na większą ilość płytek Petriego lub innych płytek hodowlanych i uzupełniałam pożywką do odpowiedniej objętości. Tak przygotowane płytki umieszczałam w inkubatorze w 37ºC i 5% CO2. Następnego dnia komórki były gotowe do kolejnych eksperymentów. Wydajność i warunki elektroporacji sprawdzałam przygotowując jedną próbkę z komórkami transfekowanymi plazmidem zawierającym gen kodujący białko GFP, którą po 24

Część doświadczalna 74 godzinach od eletroporacji oglądałam pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu zaobserwowania zielonej barwy tranfekowanych komórek. 4.3.12 Otrzymanie komórek o stabilnej nadekspresji enzymów metabolizujących Stabilną nadekspresję izoenzymów CYP3A4 i UGT1A10 w komórkach linii MCF-7 osiągnęłam poddając komórki transfekcji według procedury opisanej w poprzednim punkcie. Do komórek za pomocą elektroporacji wprowadzałam plazmid kodujący gen badanego enzymu oraz gen oporności na neomycynę (genetycynę, G418). Przygotowałam również linię kontrolną zawierającą wektor pusty, niekodujący żadnego białka, ale posiadający gen oporności na antybiotyk selekcyjny. Dzięki obecności genu oporności możliwe jest wyselekcjonowanie komórek, w których doszło do prawidłowej inkorporacji plazmidu z genomem transfekowanej komórki, poprzez działanie odpowiednim antybiotykiem. Po elektroporacji komórki wysiewałam na płytki 6-dołkowe w ilości 1,5x10 6 komórek/dołek i uzupełniałam pożywką do 4 ml. 48 godzin po transfekcji wymieniałam pożywkę na świeżą i dodawałam antybiotyk selekcyjny, genetycynę G418 o stężeniu końcowym 500 µg/ml. Co 4-5 dni wymieniałam pożywkę na świeżą, za każdym razem dodając G418. Selekcję komórek z prawidłowo zintegrowanym plazmidem z genomem komórki prowadziłam przez około 2 tygodnie do momentu utworzenia się widocznych kolonii komórek. Po tym czasie z każdego dołka zbierałam komórki i przenosiłam je do nowych pojemników hodowlanych i uzupełniałam świeżą pożywką z dodatkiem G418 (200 µg/ml). Około 1 mln komórek każdego klonu wysiewałam na 60 mm płytkę Petriego w celu określenia aktywności danego enzymu. Aktywność izoenzymu CYP3A4 badałam za pomocą metody opisanej w punkcie 4.3.7. Zdolność katalityczną UGT1A10 sprawdzałam według procedury opisanej dla analizy metabolizmu związków C-1311 i C-1305 (punkt 4.3.8) wykorzystując fakt, iż obie badane pochodne akrydyny są substratem tego enzymu UGT. Jednocześnie wysiewałam komórki typu dzikiego (MCF-7- WT), do których dodawałam genetycynę o tym samym stężeniu, w celu potwierdzenia cytotoksycznego działania antybiotyku wobec komórek niepoddanych transfekcji i nieposiadających plazmidu. Po analizie wyselekcjonowanych klonów komórek wybierałam ten, charakteryzujący się najwyższą aktywnością enzymatyczną izoenzymu CYP3A4 i UGT1A10. Wybrany klon komórkowy namnażałam i mroziłam według standardowej procedury. W komórkach tych dokładnie sprawdzałam poziom ekspresji danego izoenzymu techniką Real-Time-PCR (metoda opisana w następnym punkcie) oraz poziom białka metodą Western blotting. Tak przygotowane i scharakteryzowane komórki były gotowe do dalszych badań będących przedmiotem opisywanej rozprawy doktorskiej. 4.3.13 Badanie poziomu ekspresji genów metodą Real-time PCR a. Izolacja RNA Pierwszym etapem podczas całościowej analizy Real-time PCR jest wyizolowanie całkowitego RNA. W tym celu komórki KB-3 typu dzikiego i poddanych przejściowej transfekcji oraz modelu MCF-7

Część doświadczalna 75 wysiewałam na 60 mm płytki Petriego w ilości 2x10 6. Po 24-godzinnej inkubacji komórki przemywałam dwukrotnie zimnym PBS-em (1000 rpm, 5 min., 4 C) i przeprowadzałam izolację RNA według instrukcji zawartej w zestawie High Pure Isolation Kit (Roche Diagnostics). Komórki zawieszałam w 200 μl buforu PBS, dodawałam 400 µl buforu lizującego (Lysis Buffer) znajdującego się w zestawie i lizowałam komórki przez 15 s. Tak przygotowane lizaty komórkowe nanosiłam na kolumny i wirowałam (15 s, 8 000 x g). Następnie na kolumny nanosiłam roztwór DNazy w celu eliminacji z próbek zawartego DNA i inkubowałam przez 15 min w temp. pokojowej. W kolejnych etapach płukałam kolumnę roztworami Wash Buffer I (raz po 500 µl) i Wash Buffer II (2 razy po 700 i 500 µl) za każdym razem wirując (2 x 15s, 8 000 x g; 1 x 2 minuty, 13 000 x g). Na koniec przeprowadziłam elucję RNA poprzez dodanie na złoże kolumny 50 μl buforu do elucji (Elution Buffer). Ilość wyizolowanego RNA i jego czystość określiłam z zastosowaniem spektrofotometru UV-Vis, model NanoDrop 2000 (Termo Scientific), dzięki uprzejmości prof. Józefa Kur, w Katedrze Mikrobiologii Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej. b. Synteza cdna Syntezę cdna przeprowadziłam na matrycy otrzymanego RNA. Całą procedurę wykonałam pod komorą laminarną, w lodzie, według protokołu dołączonego do zestawu Transcriptor High Fidelity cdna Synthesis Kit (Roche Diagnostics). W pierwszym etapie reakcji syntezy, do 1 μg RNA dodałam 1 μl starterów oligo(dt)18 (stężenie wyjściowe 50 pmol/μl) i uzupełniłam wodą wolną od RNaz do objętości 13 μl. Zawartość probówki inkubowałam w temp. 65 C przez 10 minut. Następnie próbkę przeniosłam do lodu na 1 min, wirowałam, ponownie umieszczałam w lodzie i dodawałam następujące składniki: 4 μl buforu Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer 5x zawierającego 40 mm MgCl2; 0,5 μl inhibitora rybonukleaz, RNaz, Protector RNase Inhibitor zawierający 8 mm DTT (stężenie wyjściowe 40 U/μl); 2 μl mieszaniny deoksyrybonukleotydów, Deoxynucleotide Mix (stężenie 10 mm); 0,5 μl odwrotnej transkryptazy, Transcriptor Reverse Transcriptase (stężenie 20 U/μl); Probówkę delikatnie wytrząsałam i umieszczałam w termobloku. Syntezę cdna prowadziłam przez 30 minut w temperaturze 55 C. Po zakończeniu syntezy próbki poddałam działaniu temperatury 85 C przez 5 minut w celu zatrzymania reakcji. Po zakończeniu reakcji probówki z cdna przechowywałam w 4 C. Uzyskany cdna wykorzystałam jako matryca do reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. Real-Time PCR). c. Real-time PCR określenie względnego poziomu ekspresji badanych genów Dla oszacowania zmian w poziomie ekspresji badanych genów zastosowałam reakcję łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym z użyciem specyficznych par starterów (Genomed, Polska) komplementarnych do fragmentu kodującego, pozwalające na uzyskanie specyficznego produktu reakcji wyłącznie z cdna badanych przez nas genów. Reakcję PCR prowadziłam w czasie rzeczywistym w szklanych kapilarach z wykorzystaniem cdna pozyskanego w reakcji odwrotnej transkrypcji oraz zestawu FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnosctics). Do amplifikacji wykorzystałam aparat LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics), dzięki

Część doświadczalna 76 uprzejmości prof. Józefa Kur z Katedry Mikrobiologii Wydziały Chemicznego Politechniki Gdańskiej. Dołączone do aparatu oprogramowanie pozwoliło na analizowanie uzyskanych wyników oraz porównanie względnych różnic ilości początkowej matrycy. Poziom analizowanych transkryptów standaryzowano względem genu referencyjnego GAPDH należącego do rodziny housekeeping gene, którego poziom ekspresji jest stały w warunkach eksperymentu. Reakcję dla badanych genów prowadziłam w warunkach określonych poniżej. Skład mieszaniny reakcyjnej na pojedynczą próbę przygotowywanej w celu amplifikacji transkryptów genu UGT1A10, UGT2B4 i CYP3A4: 2 μl cdna 0,8 μl MgCl2 0,2 μl starter Forward (stężenie końcowe 0,2 μm) 0,2 μl starter Reverse (stężenie końcowe 0,2 μm) 2 μl LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I 10x H2O wolna od RNaz objętość stanowi uzupełnienie mieszaniny reakcyjnej do 20 μl. Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym obejmowała kilka następujących po sobie etapów i przebiegała w określonych poniżej warunkach (Tabela 5): Tabela 5 Parametry Warunki reakcji PCR w czasie rzeczywistym Liczba cykli Proces Temperatura Czas Preinkubacja 1 95 C 10 min. Amplifikacja 45 Denaturacja Hybrydyzacja Wydłużanie łańcucha 95 C 59 C 72 C 10 s. 15 s. 20 s. Chłodzenie 1 40 C 30 s. Uzyskane wyniki pochodzące z dwóch niezależnych doświadczeń standaryzowałam wobec genu referencyjnego GAPDH, po czym przedstawiłam je jako wartość względną w odniesieniu do grupy niepoddanej transfekcji. Dzięki temu, że wydajność amplifikacji badanych genów i genu referencyjnego była w przybliżeniu taka sama w zakresie badanych ilości DNA, zastosowałam obliczenia względnej ilości produktu PCR z użyciem porównywalnej metody 2 -ΔΔCt [Livak i Schmittgen, 2001]. 4.3.14 Analiza statystyczna wyników Wszystkie zaprezentowane w niniejszej pracy eksperymenty zostały wykonne minimum dwukrotnie. Uzyskane wyniki przedstawiłam jako średnią i odchylenie standardowe (SD). Dla oceny różnic pomiędzy dwoma niezależnymi parametrami zastosowałam test t-studenta. Przyjęłam istotną różnicę statystyczną przy wartościach: * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,001.

Wyniki 77 5 Wyniki 5.1 Badanie odpowiedzi biologicznej i metabolizmu w komórkach CHO traktowanych pochodną C-1311 5.1.1 Określenie dawki biologicznie czynnej pochodnej C-1311 wobec komórek jajnika chomika chińskiego CHO Pierwszym etapem badania wpływu związku przeciwnowotworowego na odpowiedź komórkową jest wyznaczenie jego biologicznie efektywnej dawki. Wartości stężeń, jakie najczęściej określa się z zależności ilości żywych komórek od logarytmu stężenia związku to IC 50, IC 80 i IC 90. Są to dawki odpowiadające stężeniu związku, przy którym dochodzi do zahamowania proliferacji komórek odpowiednio w 50, 80 i 90% w stosunku do komórek kontrolnych (nietraktowanych związkiem). Efektywne stężenia pochodnej imidazoakrydonu C-1311 wyznaczałam metodą liczenia komórek po 72 godzinach inkubacji. Doświadczenie przeprowadziłam dla komórek trzech linii jajnika chomika chińskiego: linii dzikiej, CHO-WT oraz rekombinantowych: CHO-HR (ze stabilną nadekspresją reduktazy cytochromu P450) i CHO-HR-3A4 (ze stabilną nadekspresją reduktazy cytochromu P450 oraz izoenzymu CYP3A4) (Rysunek 3). Liczba komórek vs kontrola [%] 120 100 80 60 40 20 CHO-WT CHO-HR CHO-HR-3A4 0 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 Stężenie C-1311 [μm] Rysunek 3 Zależny od dawki wpływ pochodnej C-1311 na proliferację komórek linii CHO-WT, CHO- HR oraz CHO-HR-3A4 wyrażony jako procent żywych komórek traktowanych testowanym związkiem w stosunku do komórek kontrolnych, nieinkubowanych ze związkiem. Wykresy zostały opracowane na podstawie minimum trzech niezależnych doświadczeń. Uzyskane wyniki pokazują, że imidazoakrydon C-1311 hamował proliferację komórek linii CHO w sposób zależny od stężenia (Rysunek 3). Dla trzech badanych linii komórkowych obliczone stężenia (IC 50, IC 80, IC 90) były stosunkowo niskie, co świadczy o dużej wrażliwości komórek CHO na działanie C-1311. Związek wykazywał najwyższą cytotoksyczność wobec komórek linii CHO-HR o nadekspresji reduktazy cytochromu P450 (IC 80 = 0,032 μm). Najniższą wrażliwość posiadały komórki linii dzikiej, CHO-WT, gdzie IC 80 wynosiło 0,078 μm. Natomiast komórki linii z podwójną nadekspresją, CHO-HR-3A4 cechowały się pośrednią wrażliwością na poziomie 0,057 μm (Tabela 6). Obliczone dawki IC 50 przedstawiały podobną zależność między liniami. Dla komórek CHO-HR-3A4 trudne było wyznaczenie dawki IC 90, gdyż nawet przy

Wyniki 78 wysokich stężeniach związku C-1311 około 20% populacji komórek pozostawała żywa. Dlatego też do przeprowadzenia kolejnych doświadczeń wybrałam stężenie związku, które w przybliżeniu odpowiadało wartości IC 80. Przyjęte dawki pochodnej C-1311 wobec komórek danej linii wynosiły: CHO-WT 0,09 μm, CHO-HR 0,03 μm, CHO-HR-3A4 0,06 μm. Tabela 6 Wartości aktywności cytotoksycznej C-1311 (IC50, IC80 i IC80) wobec komórek trzech linii jajnika chomika chińskiego: CHO-WT, CHO-HR i CHO-HR-3A4 wyznaczone po 72-godzinnej inkubacji ze związkiem. Stężenie CHO-WT CHO-HR CHO-HR-3A4 IC 50 [μm] 0,019 ± 0,005 0,0087 ± 0,0003 0,015 ± 0,005 IC 80 [μm] 0,078 ± 0,006 0,032 ± 0,002 a* 0,057 ± 0,012 a*,b* IC 90 [μm] 0,115 ± 0,008 0,051 ± 0,004 a* Wartości IC50, IC80 i IC90 przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie minimum trzech niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t- Studenta. a statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-WT, b statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-HR, gdzie * P < 0,05. W celu szerszego zanalizowania wpływu nadekspresji reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4 na aktywność biologiczną pochodnej imidazoakrydonu C-1311 wobec komórek modelu CHO, wartości aktywności cytotoksycznej związku wyznaczyłam również po 48 i 96 godzinach inkubacji z C-1311 (Tabela 7). Tabela 7 Wartości aktywności cytotoksycznej C-1311 (IC50, IC80 i IC80) wobec komórek trzech linii jajnika chomika chińskiego: CHO-WT, CHO-HR i CHO-HR-3A4 wyznaczone po 48- i 96-godzinnej inkubacji z C-1311. Stężenie CHO-WT CHO-HR CHO-HR-3A4 48 godzin inkubacji IC 50 [μm] 0,024 ± 0,003 0,0094 ± 0,0002 a** 0,012 ± 0,005 a* IC 80 [μm] 0,085 ± 0,006 0,060 ± 0,007 a* 0,060 ± 0,012 a* IC 90 [μm] 0,168 ± 0,008 0,113 ± 0,017 a* 96 godzin inkubacji IC 50 [μm] 0,008 ± 0,001 0,004 ± 0,0006 a* 0,003 ± 0,001 a* IC 80 [μm] 0,031 ± 0,003 0,017 ± 0,001 a** 0,011 ± 0,002 a***,b* IC 90 [μm] 0,048 ± 0,006 0,043 ± 0,009 0,031 ± 0,004 a** Wartości IC50, IC80 i IC80 przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie minimum trzech niezależnych eksperyment ów. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t-studenta. a statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-WT; b statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-HR, gdzie * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Badanie aktywności biologicznej C-1311 w komórkach CHO po 48-godzinnej inkubacji ze związkiem wykazało, że komórki linii dzikiej, CHO-WT były najmniej wrażliwe na działanie

Wyniki 79 pochodnej imidazoakrydonu (dawki IC 50, IC 80 i IC 90) w porównaniu do obu rekombinantowych linii komórek CHO. Cytotoksyczność C-1311 wobec komórek CHO-HR i CHO-HR-3A4 była zbliżona dla wyznaczonych dawek efektywnych związku. Ponownie, niemożliwe było określenie wartości IC 90 dla komórek CHO-HR-3A4. 96-godzinna inkubacja komórek CHO ze wzrastającym stężeniem związku pokazała, że do zahamowania proliferacji komórek najwyższa dawka C-1311 wymagana była znów dla komórek CHO-WT. Komórki obu rekombinantowych linii, CHO-HR i CHO-HR-3A4 były bardziej wrażliwe na działanie związku (dla dawek IC 50 i IC 80). Co istotne, cytotoksyczność C-1311 wobec komórek z koekspresją reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 była najwyższa: IC 80 dla CHO-WT wynosiło 0,031 μm, CHO-HR 0,017 μm zaś dla CHO-HR-3A4 zaledwie 0,011 μm. Różnice między wszystkimi przytoczonymi wartościami były statystyczne istotne. Warto zwrócić uwagę, że dawki IC 90 wyznaczone po 96-godzinnej inkubacji dla komórek linii CHO-WT i CHO-HR były tym razem do siebie zbliżone (brak istotnych różnic). Komórki linii CHO-HR-3A4 po 96 godzinach inkubacji z pochodną C-1311 były wyraźnie najbardziej wrażliwe na działanie związku. Wynik ten jest odmienny w porównaniu do rezultatów uzyskanych z badania cytotoksyczności po krótszych czasach ekspozycji na chemoterapeutyk. 5.1.2 Analiza dystrybucji komórek CHO w cyklu życiowym Badanie dystrybucji komórek w danej fazie cyklu życiowego pozwala na określenie mechanizmu działania związku wobec traktowanych nim komórek nowotworowych. Test ten przeprowadza się stosując analizę cytometryczną. Badanie oparte jest o zdolność do ilościowego łączenia się jodku propidyny z DNA. W poszczególnych fazach cyklu życiowego ilość materiału genetycznego ulega zmianie. W fazie G 1 komórki posiadają 2n chromosomów, w fazie S ich ilość stopniowo wzrasta, osiągając wartość 4n w fazie G 2 i mitozie. Komórki, które zawierają DNA mniej niż 2n, uległy zniszczeniu lub ich materiał genetyczny został pofragmentowany, również do tzw. ciałek apoptotycznych. Ostatni wspomniany efekt może świadczyć o indukcji apoptozy. Również w tym zakresie mogą znajdować się komórki, które uległy rozpadowi pod wpływem stosowanego związku (np. komórki nekrotyczne) lub komórki ulegające katastrofie mitotycznej posiadające liczne małe jądra o pofragmentowanej chromatynie. Badając dystrybucję komórek w cyklu życiowym uzyskuje się również dane na temat procentowej zawartości komórek poliploidalnych, czyli tych, których chromosomów jest więcej niż 4n. W tym przedziale mogą również znajdować się komórki umierające na drodze katastrofy mitotycznej, a także te, w których doszło do zaburzeń w przebiegu mitozy.

Wyniki 80 a. Linia CHO-WT Rysunek 4 Histogramy obrazujące zmiany w dystrybucji komórek CHO-WT w cyklu życiowym, inkubowanych z pochodną C-1311 (0,09 μm) przez podaną liczbę godzin. Oś X intensywność fluorescencji jodku propidyny określającego zawartość DNA. Oś Y ilość komórek. Przedstawione histogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Tabela 8 Procentowa zawartość komórek linii CHO-WT w poszczególnej fazie cyklu życiowego po określonym czasie inkubacji z pochodną C-1311 (0,09 μm). Sub-G 1 ± G 1 ± S ± G 2/M ± Poli ± Kontrola 0,98 0,20 47,46 5,38 15,03 2,57 27,80 3,39 8,79 0,43 3 godz. 1,41 0,21 42,29 0,87 19,40 2,11 30,14 1,95 7,38 0,06 6 godz. 1,93 0,85 29,60 1,38 25,15 4,28 36,66 1,67 7,49 0,69 12 godz. 1,47 0,35 6,38 2,97 23,31 3,77 54,28 7,61 11,73 2,81 24 godz. 2,99 1,13 2,91 2,08 3,71 0,68 80,34 5,37 10,33 1,57 48 godz. 14,71 6,89 5,81 3,08 4,36 2,06 63,87 8,69 12,35 2,74 72 godz. 22,59 6,27 6,96 1,69 5,43 1,22 51,98 11,65 13,36 2,45 96 godz. 42,89 8,96 5,16 1,13 3,78 0,78 39,08 5,37 9,34 2,51 120 godz. 60,99 8,87 6,28 1,99 4,18 1,85 20,79 2,27 7,96 3,43 Wartości przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe na podstawie minimum 3 niezależnych doświadczeń. Uzyskane na podstawie przeprowadzonych doświadczeń wyniki wskazały, że pochodna C-1311 powodowała przejściowy blok cyklu życiowego komórek CHO-WT w fazie G 2/M (Rysunek 4). Wzrostowi populacji komórek o 4n chromosomów towarzyszył spadek frakcji ko mórek będących w fazie G 1 i S cyklu życiowego. Zatrzymanie cyklu w fazie G 2/M następowało po 12 godzinach ekspozycji komórek na związek, a maksymalny efekt obserwowany był po

Wyniki 81 24 godzinach (80%, Tabela 8). Liczba komórek w fazie G 2/M utrzymywała się na wysokim poziomie jeszcze do 72 godzin inkubacji ze związkiem, a po 120 godzinach zmniejszyła się do 20%. Jednocześnie, począwszy od 48 godzin inkubacji, stopniowo wzrastała frakcja komórek o zdegradowanym DNA (tzw. frakcja sub-g 1), w której po 120 godzinach ekspozycji na związek znajdowało się około 60% komórek CHO-WT. b. Linia CHO-HR Rysunek 5 Histogramy obrazujące zmiany w dystrybucji komórek CHO-HR w cyklu życiowym, inkubowanych z pochodną C-1311 (0,03 μm) przez podaną liczbę godzin. Oś X intensywność fluorescencji jodku propidyny określającego zawartość DNA. Oś Y ilość komórek. Przedstawione histogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Tabela 9 Procentowa zawartość komórek linii CHO-HR w poszczególnej fazie cyklu życiowego po danym czasie inkubacji z pochodną C-1311 (0,03 μm). Sub-G 1 ± G 1 ± S ± G 2/M ± Poli ± Kontrola 2,21 0,67 31,14 7,44 13,20 4,62 32,02 3,90 21,80 7,01 3 godz. 2,04 0,20 26,64 1,72 13,48 2,82 31,42 1,34 25,49 3,48 6 godz. 2,12 0,65 19,21 0,74 18,34 1,46 30,08 3,31 30,93 5,19 12 godz. 2,38 0,45 8,68 1,61 9,73 2,71 37,60 5,46 42,93 0,50 24 godz. 5,64 1,96 4,48 2,99 5,18 1,55 38,17 4,55 47,10 0,47 48 godz. 26,25 3,10 3,06 0,28 3,97 0,79 25,82 5,35 40,38 4,07 72 godz. 59,11 0,68 6,28 1,94 6,01 0,97 11,36 1,29 14,46 5,22 96 godz. 77,55 1,85 4,88 1,24 4,95 0,29 6,06 0,36 6,70 0,36 120 godz. 84,13 2,98 3,87 1,23 3,57 0,85 3,69 0,32 4,39 1,07 Wartości przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe na podstawie minimum 3 niezależnych doświadczeń.

Wyniki 82 W komórkach linii CHO-HR pochodna C-1311 powodowała nieznaczną i przejściową akumulację komórek w fazie G 2/M cyklu komórkowego (Rysunek 5). Po 12 i 24 godzinach inkubacji ze związkiem frakcja komórek posiadających 4n chromosomów wzrosła do około 38% (Tabela 9), przy jednoczesnym spadku liczby komórek będących w fazach G 1 i S cyklu życiowego. Równocześnie, pomiędzy 6 a 48 godziną ekspozycji na związek wzrastała populacja komórek poliploidalnych o wyraźnie zarysowanym na histogramach piku o wartość 8n chromosomów (do 47%), a od 48 godzin również populacja komórek z zawartością DNA mniejszą od 2n (frakcja sub-g 1). Po dłuższym czasie traktowania komórek pochodną C-1311 populacja komórek poliploidalnych malała, przy jednoczesnym znacznym wzroście frakcji sub- G 1 (do około 85% po 120 godzinach inkubacji). Efekt ten był wyraźniejszy dla komórek z nadekspresją reduktazy niż dla komórek linii dzikiej. Otrzymane wyniki świadczą o wysokim stopniu degradacji komórek CHO-HR przez pochodną C-1311. c. Linia CHO-HR-3A4 Rysunek 6 Histogramy obrazujące zmiany w dystrybucji komórek CHO-HR-3A4 w cyklu życiowym, inkubowanych z pochodną C-1311 (0,06 μm) przez podaną liczbę godzin. Oś X intensywność fluorescencji jodku propidyny określającej zawartość DNA. Oś Y ilość komórek. Przedstawione histogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. W komórkach linii CHO-HR-3A4 wykazujących nadekspresję reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4 pod wpływem działania pochodnej C-1311 dochodziło do przejściowej akumulacji komórek w fazie G 2/M cyklu życiowego, przy czym efekt ten był najsłabszy w porównaniu do wyników uzyskanych dla komórek dwóch pozostałych linii (Rysunek 6). Po 12 i 24 godzinach inkubacji frakcja komórek o 4n DNA wynosiła około 35% (Tabela 10). W tym czasie wzrastała również ilość komórek poliploidalnych do około 26%. Wzrostowi wspomnianych populacji towarzyszył spadek liczby komórek będących w fazach G 1 i S cyklu życiowego. Począwszy od 3 godzin inkubacji rosła populacja komórek CHO-HR-3A4

Wyniki 83 o zdegradowanym materiale genetycznym, czyli tzw. frakcja sub-g 1. Frakcja ta po 120 godzinach inkubacji z pochodną C-1311 wynosiła ponad 70%. Świadczy to o silnym oddziaływaniu związku na funkcje życiowe komórek linii CHO-HR-3A4. Należy podkreślić, że cytotoksyczny wpływ pochodnej imidazoakrydonu w tych komórkach obserwowany był dużo szybciej (już od 6 godzin inkubacji) w porównaniu do komórek pozostałych badanych linii CHO. Warto zwrócić uwagę, że w komórkach CHO-HR-3A4 najtrudniej było rozróżnić populacje komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego. Niemalże całkowita degradacja materiału genetycznego tychże komórek następowała już po 48 godzinach inkubacji, co wyraźnie widać na przedstawionych histogramach (Rysunek 6). Tabela 10 Procentowa zawartość komórek linii CHO-HR-3A4 w poszczególnej fazie cyklu życiowego po określonym czasie inkubacji z pochodną C-1311 (0,06 μm). Sub-G 1 ± G 1 ± S ± G2/M ± Poli ± Kontrola 3,24 0,46 39,19 4,33 18,69 1,20 23,07 1,66 16,29 3,19 3 godz. 6,84 2,81 34,20 2,76 17,98 0,49 24,69 2,19 16,74 2,80 6 godz. 9,46 7,98 27,72 1,64 19,33 3,14 26,04 2,10 18,05 1,39 12 godz. 11,46 3,47 17,16 5,06 13,98 1,50 31,34 3,92 22,20 2,24 24 godz. 23,10 10,40 6,98 1,82 8,80 1,28 36,90 9,42 24,48 5,40 48 godz. 54,68 5,11 11,56 3,96 10,61 3,91 11,43 3,92 11,90 4,33 72 godz. 56,46 4,47 11,90 1,72 11,23 1,89 8,76 1,55 11,88 2,24 96 godz. 66,79 10,58 8,84 3,30 9,16 4,88 6,38 1,56 8,94 0,59 120 godz. 71,44 7,28 6,78 3,34 6,66 3,74 6,08 0,73 9,13 0,61 Wartości przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe na podstawie minimum 3 niezależnych doświadczeń. d. Zestawienie Na Rysunku 7 przedstawiłam wykresy obrazujące ilościowy udział komórek trzech linii CHO w danej fazie cyklu komórkowego, zaś na Rysunku 8 wielkości populacji komórek danej linii znajdujących się we frakcji sub-g 1 oraz w fazie G 2/M. Wyraźnie widać, że DNA komórek obu rekombinantowych linii CHO ulegało degradacji na skutek działania pochodnej imidazoakrydonu C-1311 w większym stopniu niż komórek typu dzikiego. Co więcej, proces ten indukowany był najszybciej w komórkach z koekspresją reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450. Blok cyklu komórkowego najsilniej zachodził w komórkach CHO-WT, zaś w przypadku pozostałych linii można mówić jedynie o przejściowej akumulacji. W komórkach CHO-HR o nadekspresji reduktazy liczba komórek poliploidalnych była wysoka przez pierwsze dwie doby ekspozycji na związek w porównaniu do komórek pozostałych linii.

Wyniki 84 Rysunek 7 Procentowy rozkład komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego dla wszystkich trzech linii CHO inkubowanych z pochodną C-1311 w stężeniu IC80. Wykres uwzględnia procentową zawartość komórek w fazach: G1, S i G2/M oraz frakcję komórek sub-g1 i poliploidalnych (Poli). A B Rysunek 8 Liczba komórek CHO znajdująca się we frakcji sub-g1 (A) lub G2/M (B) cyklu komórkowego po inkubacji z pochodną C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80. Wartości są średnią z trzech niezależnych doświadczeń. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t-studenta. a statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-WT; b statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-HR, gdzie * P < 0,05, ** P < 0,001. 5.1.3 Obserwacje mikroskopowe morfologii komórek CHO Kolejnym etapem określenia biologicznego mechanizmu działania leku przeciwnowotworowego jest zbadanie szlaków indukowanej śmierci komórkowej. W komórkach, w których dochodzi do indukcji danego rodzaju śmierci, struktura jądra komórkowego ulega zmianie. Niektóre z tych zmian można obserwować stosując technikę mikroskopii fluorescencyjnej. Pofragmentowane jądro tworzące tzw. ciałka o silnym sygnale fluorescencji świadczy o kondensacji chromatyny i jest typowe dla indukcji apoptozy. Położenie kilku niewielkich jąder (mikrojąder) bardzo blisko siebie o średnim sygnale fluorescencji jest charakterystyczne dla katastrofy mitotycznej. Komórki o takiej morfologii jądra nazywa się komórkami wielojądrzastymi. Mocno powiększone i rozpłaszczone jądra mogą świadczyć o indukcji nekrozy. Z kolei na nieprawidłowy przebieg procesu mitozy mogą wskazywać skondensowane chromosomy nieregularnie ułożone, jak również wszelkie inne zmiany w strukturze jądra, których nie można przypisać wcześniej opisanym procesom.

Wyniki 85 W celu określenia zmian świadczących o indukcji danego typu śmierci komórki trzech badanych linii jajnika chomika chińskiego CHO barwiłam fluorescencyjnym barwnikiem DAPI, a następnie oglądałam w świetle UV przy 400-krotnym powiększeniu. Poniżej zamieściłam zdjęcia jąder komórek CHO inkubowanych z pochodną imidazoakrydonu C-1311 przez podane czasy (bez próbki 3 godziny) w stężeniu odpowiadającemu wartości IC 80. a. Linia CHO-WT Pierwsze zmiany w morfologii jąder komórek CHO-WT traktowanych pochodną C-1311 pojawiły się po 24 godzinach inkubacji (Rysunek 9). Były nimi: kondensacja chromatyny, pojedyncze ciałka apoptotyczne i mikrojądra, a także uszkodzone chromosomy. Wraz z wydłużaniem się czasu inkubacji jądra komórek ulegały silniejszym zmianom, które dotyczyły coraz większej populacji komórek. Zwiększała się także objętość jąder komórkowych, które po 120 godzinach traktowania komórek badanym związkiem były 2-krotnie większe od jąder komórek kontrolnych. Kontrola 6 godzin 12 godzin 24 godziny 48 godzin 72 godziny 96 godzin 120 godzin Rysunek 9 Morfologia jąder komórek linii CHO-WT traktowanych pochodną C-1311 (0,09 μm), wybarwionych DAPI i oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w świetle UV przy powiększeniu 400x. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Gruba strzałka wskazuje apoptozę, cienka strzałka katastrofę mitotyczną, grot nieprawidłową mitozę.

Liczba komórek [%] Wyniki 86 Zasadniczy efekt wywierany przez pochodną imidazoakrydonu C-1311 na komórki CHO-WT to powstawanie tzw. mikrojąder (komórek wielojądrzastych), świadczących o indukcji katastrofy mitotycznej. Proces ten obserwowany był już od 24 godzin inkubacji komórek ze związkiem. Liczba komórek wielojądrzastych rosła wraz z czasem inkubacji i osiągnęła swoje maksimum po 96 godzinach 21% (Rysunek 9), po czym zaczęła maleć. Począwszy od 72 godzin można było zauważyć także pojedyncze zmiany charakterystyczne dla apoptozy: silnie skondensowaną chromatynę i tworzące się ciałka apoptotyczne. Wielkość populacji komórek apoptotycznych wzrastała z czasem inkubacji po 120 godzinach frakcja ta wynosiła nieco ponad 22%. Niektóre ze zmian morfologicznych jąder widoczne po dłuższych czasach traktowania komórek pochodną C-1311 trudno przypisać konkretnemu rodzajowi śmierci komórkowej. Mogą one świadczyć o nieprawidłowym przebiegu mitozy. Podsumowując, komórki linii dzikiej, CHO-WT pod wpływem działania związku ulegały śmierci komórkowej na drodze katastrofy mitotycznej oraz apoptozy (Rysunek 10). 70 60 50 40 30 20 10 0 Apoptoza Katastrofa mitotyczna Nieprawidłowa mitoza K 3 6 12 24 48 72 96 120 Czas inkubaci [godz.] Rysunek 10 Procentowy rozkład komórek CHO- WT inkubowanych z pochodną C-1311 (0,09 μm) przez określone czasy o typowych dla danego procesu zmianach jądra komórkowego. Wykres uwzględnia populację komórek o jądrach ze zmianami charakterystycznymi dla apoptozy, katastrofy mitotycznej i nieprawidłowej mitozy. Obliczenia (minimum 500 komórek) zostały wykonane na podstawie zdjęć z mikroskopu fluorescencyjnego w świetle UV przy powiększeniu 200x. Wynik jest średnią z trzech niezależnych doświadczeń. b. Linia CHO-HR Zmiany w morfologii jąder komórek CHO-HR pojawiły się już po 12 godzinach ich inkubacji z pochodną C-1311 (Rysunek 11). Na zdjęciach widoczne były charakterystyczne dla apoptozy ciałka apoptotyczne o skondensowanej chromatynie oraz tworzące się mikrojądra będące markerem katastrofy mitotycznej. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji komórek z badanym związkiem zmianom ulegała coraz większa populacja komórek. Zwiększała się również objętość jąder komórkowych. Po 120 godzinach jądra były około 2-krotnie większe od jąder komórek kontrolnych. Najwięcej komórek wielojądrzastych było po 72 godzinach około 17%, po czym ich populacja zaczynała spadać (Rysunek 12). Począwszy od 24 godzin inkubacji przybywało komórek umierających na drodze apoptozy. Po 120 godzinach traktowania komórek CHO-HR pochodną C-1311 liczba komórek o zmianach charakterystycznych dla śmierci apoptotycznej wynosiła prawie 35%.

Wyniki 87 Kontrola 6 godzin 12 godzin 24 godziny 48 godzin 72 godziny 96 godzin 120 godzin Rysunek 11 Morfologia jąder komórek linii CHO-HR traktowanych pochodną C-1311 (0,03 μm), wybarwionych DAPI, oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w świetle UV przy powiększeniu 400x. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Gruba strzałka wskazuje apoptozę, cienka strzałka katastrofę mitotyczną, grot nieprawidłową mitozę. Rysunek 12 Procentowy rozkład komórek CHO- HR inkubowanych z pochodną C-1311 (0,03 μm) przez określone czasy o charakterystycznych dla danego procesu zmianach jądra komórkowego. Wykres uwzględnia komórki o jądrach ze zmianami charakterystycznymi dla apoptozy, katastrofy mitotycznej i nieprawidłowej mitozy. Wynik jest średnią z trzech niezależnych doświadczeń. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t- Studenta. a statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-WT, gdzie * P < 0,05. Wykonane obserwacje mikroskopowe jąder komórkowych pozwoliły stwierdzić, że pod wpływem działania C-1311 mechanizmy śmierci (apoptoza, katastrofa mitotyczna) były uruchamiane szybciej i dotyczyły większej populacji w przypadku komórek rekombinantowej linii CHO-HR wykazującej nadekspresję reduktazy cytochromu P450 (suma zmienionych komórek po 120 godz. 50,5%) niż w przypadku komórek linii dzikiej, CHO-WT (44,2%).

Wyniki 88 c. Linia CHO-HR-3A4 Kontrola 6 godzin 12 godzin 24 godziny 48 godzin 72 godziny 96 godzin 120 godzin Rysunek 13 Morfologia jąder komórek linii CHO-HR-3A4 traktowanych pochodną C-1311 (0,06 μm), wybarwionych DAPI, oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w świetle UV przy powiększeniu 400x. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Gruba strzałka wskazuje apoptozę, cienka strzałka katastrofę mitotyczną, grot nieprawidłową mitozę. Na wykonanych zdjęciach (Rysunek 13) jąder komórek CHO-HR-3A4 widać, że pierwsze zmiany w ich morfologii pojawiły się już po 6 godzinach inkubacji z pochodną C-1311. Widoczne były uszkodzone chromosomy, charakterystyczne dla apoptozy ciałka apoptotyczne oraz pojedyncze mikrojądra świadczące o indukcji katastrofy mitotycznej. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji z badanym związkiem przybywało komórek z uszkodzonym jądrem. Po 24 godzinach komórek z niezmienionym jądrem pozostało około 70%, zaś po 96 godzinach jedynie nieco ponad 20% komórek. Liczba komórek, w których dochodziło do indukcji katastrofy mitotycznej rosła najszybciej wraz z upływem czasu ekspozycji na C-1311. Najwięcej komórek wielojądrzastych obserwowało się po 48 i 72 godzinach inkubacji (niecałe 50%). Po tym czasie ich liczba malała, a w ich miejsce przybywało komórek apoptotycznych oraz komórek z uszkodzeniami jądra powstałymi w wyniku nieprawidłowego przebiegu mitozy. Komórek o morfologii jądra typowej dla indukcji apoptozy najwięcej widocznych było po 96 i 120 godzinach około 37%. Analizując zmiany w czasie wielkości populacji komórek o morfologii jąder

Wyniki 89 charakterystycznych dla apoptozy i katastrofy mitotycznej (wykres na Rysunku 14) nasuwa się stwierdzenie, że indukcja apoptozy jest następstwem zmian charakterystycznych dla katastrofy mitotycznej. Podobnych obserwacji można było dokonać już dla komórek dwóch wcześniej opisanych linii, choć efekt ten nie był tak wyraźnie widoczny. Rysunek 14 Procentowy rozkład komórek CHO-HR-3A4 inkubowanych z C-1311 (0,06 μm) przez podane czasy o charakterystycznych dla danego procesu zmianach jądra komórkowego: apoptoza, katastrofa mitotycza i nieprawidłowa mitoza. Obliczenia zostały wykonane na podstawie zdjęć wykonanych przy powiększeniu 200x. Wynik jest średnią z 3 niezależnych doświadczeń. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t- Studenta. a statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-WT; b statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-HR, gdzie * P < 0,05, ** P < 0,001. d. Zestawienie Podsumowując, obserwacje morfologii jąder komórek CHO pozwoliły stwierdzić, że C-1311 najsilniej oddziaływał na komórki linii CHO-HR-3A4 wykazującej nadekspresję reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w porównaniu do komórek pozostałych linii (Rysunek 15). Po 120 godzinach inkubacji ze związkiem komórek CHO-HR-3A4 o zmianach jądra charakterystycznych dla katastrofy mitotycznej, apoptozy lub innych procesów prowadzących do śmierci komórki było łącznie 77%. Liczba komórek [%] 100 80 60 40 20 0 CHO-WT CHO-HR CHO-HR-3A4 K 3 6 12 24 48 72 96 120 Czas inkubaci [godz.] Rysunek 15 Liczba komórek CHO ze zmianami jądra komórkowego charakterystycznymi dla apoptozy, katastrofy mitotycznej lub nieprawidłowej mitozy (suma) powstałymi na skutek inkubacji z pochodną C-1311 w stężeniu odpowiadającemu dawce IC80 przez określone czasy. Wynik jest średnią z trzech niezależnych doświadczeń. 5.1.4 Badanie zmian w budowie błony cytoplazmatycznej komórek CHO Celem badania było określenie, czy pochodna C-1311 powoduje zmiany w budowie błony komórkowej, które mogą świadczyć o indukcji określonego rodzaju śmierci komórkowej. Test ten polega na podwójnym barwieniu komórek: białkiem aneksyną-v skoniugowaną z fluoresceiną oraz jodkiem propidyny. Białko aneksyna-v ma zdolność do łączenia się

Wyniki 90 z fosfatydyloseryną, która w prawidłowych komórkach znajduje się po wewnętrznej stronie błony. Gdy zostaje uruchomiona apoptoza, dochodzi do translokacji fosfatydyloseryny do zewnętrznej warstwy błony. Jest to jeden z biochemicznych markerów procesu apoptozy. Drugim stosowanym w doświadczeniu barwnikiem był jodek propidyny. Związek ten interkaluje do DNA. Może on wnikać do jądra tylko tych komórek, których błona komórkowa została uszkodzona. Utrata integralności błony obserwowana jest w przypadku późnej apoptozy oraz nekrozy, a czasem także dla katastrofy mitotycznej. Badanie wykonałam dla komórek trzech linii CHO. Otrzymane wyniki analizy cytometrycznej przedstawiłam poniżej w postaci histogramów. W lewym dolnym obszarze rysunków znajdują się komórki żywe (A-/PI-). Komórki, w których doszło do związania się aneksyny z fosfatydyloseryną, położone są w prawym dolnym kwadracie histogramu (A+/PI-) i są to komórki wczesnoapoptotyczne. Komórki wykazujące fluorescencję w zakresie jodku propidyny i fluorochromu połączonego z aneksyną znajdują się w prawym górnym obszarze (A+/PI-). Są to komórki późnoapoptotyczne, wtórnie nekrotyczne lub też ulegające katastrofie mitotycznej. W lewym górnym kwadracie cytogramu widoczne są komórki wybarwione jedynie jodkiem propidyny (A-/PI+), czyli ulegające nekrozie lub również późnej katastrofie mitotycznej. a. Linia CHO-WT Rysunek 16 Zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek CHO-WT: kontrolnych i traktowanych pochodną C-1311 (0,09 μm) przez podane czasy. Oś X fluorescencja pochodząca od fluoresceiny skoniugowanej z aneksyną- V. Oś Y fluorescencja pochodząca od jodku propidyny. Pole A komórki niezmienione (A, PI ), pole B komórki wczesnoapoptotyczne (A+, PI ), pole C komórki późnoapoptotyczne, wtórnie nekrotyczne (A+, PI+), pole D komórki nekrotyczne (A, PI+). Przedstawione cytogramy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. W komórkach linii CHO-WT pierwsze zmiany w budowie błony komórkowej obserwowane były po 48 godzinach traktowania związkiem C-1311 (Rysunek 16). Po tym czasie pojawiły się komórki późnoapoptotyczne, ulegające katastrofie mitotycznej lub wtórnej nekrozie

Wyniki 91 (A+/PI+), jak również komórki nekrotyczne wybarwione jedynie jodkiem propidyny (A-/PI+). Wraz ze wzrostem czasu inkubacji rosła liczba komórek obu wspomnianych populacji, przy czym nieznacznie szybciej przybywało komórek wybarwionych dwoma barwnikami. Po 120 godzinach inkubacji z pochodną C-1311 komórek z niezmienioną błoną cytoplazmatyczną (A-/PI-) pozostało niecałe 60% (Tabela 11). Pozostałą część 40% stanowiły komórki z uszkodzoną błoną komórkową, czyli komórki martwe. Wśród nich znajdowało się około 20% komórek będących w późnej apoptozie, katastrofie mitotycznej lub nekrozie. Kolejne 17% stanowiły komórki pierwotnie nekrotyczne (A-/PI+). Frakcja komórek wczesnoapoptotycznych (A+/PI-) dla wszystkich czasów inkubacji utrzymywała się na niskim poziomie, maksymalnie 3% po 120 godzinach ekspozycji. Tabela 11 Wpływ czasu inkubacji komórek linii CHO-WT z pochodną C-1311 (0,09 μm) na zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej. A-/PI- ± A+/PI- ± A+/PI+ ± A-/PI+ ± Kontrola 91,41 1,66 0,83 0,27 4,11 0,64 2,44 0,30 24 godz. 91,66 2,74 0,81 0,37 4,18 0,01 2,86 1,65 48 godz. 86,90 2,21 3,08 0,44 8,72 2,58 3,83 0,11 72 godz. 78,21 2,93 3,70 0,76 10,79 0,83 6,27 1,86 96 godz. 60,82 8,20 3,23 0,94 19,48 5,64 14,31 0,42 120 godz. 58,17 10,79 3,03 1,47 20,51 3,23 16,93 2,86 Wartości w tabeli przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie dwóch niezależnych eksperymentów. A aneksyna-v, PI jodek propidyny. Otrzymane wyniki korelują z wcześniej przeprowadzonymi obserwacjami mikroskopowymi morfologii jąder komórkowych, gdzie wykazałam, że po 120 godzinach inkubacji komórek apoptotycznych i ulegających katastrofie mitotycznej jest łącznie 40%. b. Linia CHO-HR Pierwsze wyraźne zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek linii CHO-HR wykazujących nadekspresję reduktazy cytochromu P450 obserwowane były po 48 godzinach traktowania komórek pochodną C-1311 (Rysunek 17, Tabela 12). Wraz ze wzrostem czasu inkubacji ze związkiem znacznie przybywało komórek późnoapoptotycznych, ulegających katastrofie mitotycznej i wtórnej nekrozie (A+/PI+) oraz komórek nekrotycznych wybarwionych jedynie jodkiem propidyny (A-/PI+). Populacja komórek wybarwionych dwoma barwnikami rosła znacznie szybciej niż populacja komórek barwiących się jedynie jodkiem propidyny. Po 120 godzinach inkubacji z C-1311 komórek z niezmienioną błoną cytoplazmatyczną pozostało około 36% (A-/PI-), a w 42% populacji komórek CHO-HR doszło do indukcji późnej apoptozy, katastrofy mitotycznej lub wtórnej nekrozy (frakcja A-/PI+). Podobne wyniki otrzymałam na

Wyniki 92 podstawie obserwacji mikroskopowych jąder komórkowych. Na wykonanych zdjęciach wyraźnie widoczne były charakterystyczne dla katastrofy mitotycznej mikrojądra oraz liczne ciałka apoptotyczne o skondensowanej chromatynie będące markerem apoptozy. Liczba komórek o takiej morfologii wynosiła 44,5%. W komórkach CHO-HR po dłuższych czasach inkubacji około 9% komórek barwiła się jedynie aneksyną-v, (wczesna apoptoza), a 11% populacji komórek CHO-HR stanowiły komórki pierwotnie nekrotyczne (A-/PI+). Rysunek 17 Zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek CHO-HR kontrolnych i traktowanych pochodną C-1311 (0,03 μm) przez podane czasy. Oś X fluorescencja pochodząca od fluoresceiny skoniugowanej z aneksyną- V. Oś Y fluorescencja pochodząca od jodku propidyny. Pole A komórki niezmienione (A, PI ), pole B komórki wczesnoapoptotyczne (A+, PI ), pole C komórki późnoapoptotyczne, wtórnie nekrotyczne (A+, PI+), pole D komórki nekrotyczne (A, PI+). Przedstawione cytogramy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Tabela 12 Wpływ czasu inkubacji komórek linii CHO-HR z pochodną C-1311 (0,03 μm) na zmiany w ich budowie błony cytoplazmatycznej. A-/PI- ± A+/PI- ± A+/PI+ ± A-/PI+ ± Kontrola 94,62 3,95 0,87 0,35 2,91 1,68 2,91 1,68 24 godz. 91,78 0,27 1,25 0,18 3,62 0,03 3,35 0,48 48 godz. 78,55 3,21 5,07 0,69 11,99 4,29 4,40 0,39 72 godz. 51,67 2,38 6,81 1,05 33,45 2,81 8,08 0,62 96 godz. 35,66 2,91 9,15 2,88 44,09 5,37 10,81 0,01 120 godz. 39,10 0,42 8,60 3,39 41,34 0,35 10,97 2,62 Wartości w tabeli przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie dwóch niezależnych eksperymentów. A aneksyna-v, PI jodek propidyny. c. Linia CHO-HR-3A4 Pochodna C-1311 indukowała znaczące zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek linii CHO-HR-3A4, podobnie jak w komórkach CHO-WT i CHO-HR, także po 48

Wyniki 93 Rysunek 18 Zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek CHO-HR-3A4 kontrolnych i traktowanych pochodną C-1311 (0,06 μm) przez podane czasy. Oś X fluorescencja pochodząca od fluoresceiny skoniugowanej z aneksyną-v. Oś Y fluorescencja pochodząca od jodku propidyny. Pole A komórki niezmienione (A, PI ), pole B komórki wczesnoapoptotyczne (A+, PI ), pole C komórki późnoapoptotyczne, wtórnie nekrotyczne (A+, PI+), pole D komórki nekrotyczne (A, PI+). Przedstawione wykresy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Tabela 13 Wpływ czasu inkubacji komórek linii CHO-HR-3A4 z pochodną C-1311 (0,06 μm) na zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej. A-/PI- ± A+/PI- ± A+/PI+ ± A-/PI+ ± Kontrola 90,92 3,49 2,83 1,53 2,62 0,27 3,63 2,23 24 godz. 88,74 2,11 3,73 0,69 4,23 1,03 3,31 1,77 48 godz. 91,70 0,15 11,71 0,69 22,97 0,86 3,63 1,70 72 godz. 45,20 3,51 11,34 4,86 35,99 3,13 7,48 4,47 96 godz. 25,72 0,53 20,85 6,94 43,94 0,92 10,50 5,92 120 godz. 23,14 2,31 25,62 10,06 42,27 7,26 10,72 3,32 Wartości w tabeli przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie 2 niezależnych eksperymentów. A aneksyna-v, PI jodek propidyny. godzinach inkubacji ze związkiem (Rysunek 18). Jednak po tym czasie populacja komórek późnoapoptotycznych (A+/PI-) wynosiła już około 23% (Tabela 13). Co więcej, frakcja komórek wczesnoapoptotycznych (A+/PI-) stanowiła istotną część całkowitej populacji komórek CHO-HR-3A4 i była rzędu 12%, co wyraźnie odróżniało te komórki od pozostałych. Wraz ze wzrostem czasu ekspozycji liczba komórek obu populacji wybarwionych fluoresceiną skoniugowaną z aneksyną-v wzrastała i po 120 godzinach traktowania komórek CHO-HR-3A4 pochodną wynosiła aż 68%. Zbliżony wynik otrzymałam na podstawie obserwacji mikroskopowych morfologii jąder komórkowych, gdzie po tym samym czasie komórek, w których

Liczba komórek [%] Liczba komórek[%] Liczba komórek [%] Wyniki 94 dochodziło do indukcji apoptozy lub katastrofy mitotycznej było około 61%. Procentowy udział komórek nekrotycznych wybarwionych jedynie jodkiem propidyny w komórkach linii CHO-HR-3A4 był niewielki. Komórki pierwotnie nekrotyczne pojawiały się dopiero po 72 godzinach inkubacji z C-1311, w kolejnych dobach ich liczba rosła osiągając wartość 11%. d. Zestawienie CHO-WT 70 60 50 40 30 20 10 0 A+/PI- A+/PI+ A-/PI+ K 24 48 72 96 120 Czas inkubacji [godz.] CHO-HR 70 60 50 40 30 20 10 0 A+/PI- A+/PI+ A-/PI+ a* a* K 24 48 72 96 120 Czas inkubacji [godz.] a* CHO-HR-3A4 70 60 50 40 30 20 10 0 A+/PI- A+/PI+ A-/PI+ b* a* a* b** `a** b* a** a** b* a* K 24 48 72 96 120 Czas inkubacji [godz.] a* b* a* a* Rysunek 19 Wpływ czasu inkubacji komórek linii CHO-WT, CHO-HR oraz CHO-HR-3A4 z pochodną C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80 na zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej. a statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-WT, b statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii CHO-HR, gdzie * P < 0,05, ** P < 0,001. Podsumowując, pochodna C-1311 najsilniej indukowała odpowiedź biologiczną w komórkach linii CHO-HR-3A4 z koekspresją reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 spośród wszystkich badanych komórek CHO (Rysunek 19). Dominującymi procesami indukowanymi przez imidazoakrydon w tych komórkach była apoptoza i katastrofa mitotyczna. 5.1.5 Cytometryczna analiza aktywności kaspazy-3 w komórkach CHO W czasie indukcji procesu apoptozy dochodzi do aktywacji specyficznych enzymów trawiących wewnątrzkomórkowe białka. Są nimi proteazy serynowo-treoninowe, kaspazy. Jedną z najczęściej aktywowanych proteaz jest kaspaza-3. W literaturze pojawiają się doniesienia, że białko to może być aktywne również przy indukcji katastrofy mitotycznej [Maddika i wsp., 2007]. Dlatego też kolejnym krokiem w wyjaśnieniu komórkowego mechanizmu działania pochodnej C-1311 w komórkach CHO było zbadanie aktywności kaspazy-3

Wyniki 95 Rysunek 20 Histogramy przedstawiające rozkład komórek CHO-WT, CHO-HR, CHO-HR-3A4 kontrolnych i inkubowanych z pochodną C-1311 w stężeniu IC80 przez podane czasy otrzymane z cytometrycznej analizy aktywności kaspazy-3. Populacja komórek z aktywnym białkiem to zakres M2. Oś X fluorescencja pochodząca od fluoresceiny skoniugowanej z przeciwciałem anty-kapsaza-3. Oś Y liczba komórek. Przedstawione histogramy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. W doświadczeniu zastosowałam specyficzne przeciwciało łączące się jedynie z aktywną kaspazą-3. Eksperyment przeprowadziłam z zastosowaniem cytometrii przepływowej wykorzystując fakt, że przeciwciało zostało skoniugowane z fluorochromem (fikoerytryną). Badanie wykonałam dla trzech linii CHO. Komórki traktowałam pochodną C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC 80 przez: 24, 48, 72, 96, i 120 godzin. Wyniki przedstawiłam na Rysunku 20. Pod wpływem działania pochodnej C-1311 na komórki linii CHO-WT dochodziło do aktywacji kaspazy-3, a tym samym do indukcji apoptozy (lub także katastrofy mitotycznej) Rysunek 20 i Tabela 14. Aktywne białko kaspaza-3 pojawiło się po 48 godzinach inkubacji komórek CHO-WT z pochodną. W miarę wzrostu czasu traktowania komórek badanym związkiem, zwiększała się populacja komórek z aktywną kaspazą-3. Po 120 godzinach inkubacji populacja ta wynosiła około 34%. Otrzymany wynik koreluje z obserwacjami mikroskopowymi morfologii jąder komórek CHO-WT, gdzie przy dłuższych czasach traktowania komórek

Wyniki 96 związkiem obserwowane były zmiany świadczące o indukcji apoptozy lub katastrofy mitotycznej w około 40% populacji. Zatem w komórkach CHO-WT traktowanych pochodną C-1311 indukowana była śmierć komórkowa zależna od aktywacji kaspaz. Tabela 14 Wpływ czasu inkubacji komórek CHO-WT z pochodną C-1311 (0,09 μm) na aktywność kaspazy-3. Aktywna kaspaza-3 Kontrola 24 godz. 48 godz. 72 godz. 96 godz. 120 godz. 0,15 ± 0,08 0,50 ± 0,12 2,54 ± 1,77 14,79 ± 6,75 25,96 ± 7,74 33,68 ± 8,51 Wartości przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie 2 niezależnych doświadczeń. W komórkach CHO-HR wykazujących nadekspresję reduktazy cytochromu P450 traktowanych pochodną C-1311 również dochodziło do aktywacji kaspazy-3 (Rysunek 20). Indukowana była zatem śmierć na drodze apoptozy (lub katastrofy mitotycznej). Aktywne białko pojawiło się już po 48 godzinach inkubacji komórek CHO-HR ze związkiem. Populacja komórek z aktywną kaspazą-3 wzrastała przez kolejne 3 doby traktowania ich pochodną, po czym pozostała na podobnym poziomie. Po 96 godzinach komórek z aktywną kaspazą-3 było około 47% (Tabela 15). Otrzymany wynik pokrywa się z obserwacjami mikroskopowymi morfologii jąder (łącznie 45% komórek apoptotycznych i wielojądrzastych) oraz testem badającym zmiany w budowie błony komórkowej (50% komórek wybarwionych aneksyną-v). Tabela 15 Wpływ czasu inkubacji komórek linii CHO-HR z pochodną C-1311 (0,03 μm) na aktywność kaspazy-3. Aktywna kaspaza-3 Kontrola 24 godz. 48 godz. 72 godz. 96 godz. 120 godz. 0,39 ± 0,12 1,36 ± 0,13 14,09 ± 0,13 37,37 ± 1,70 47,01 ± 0,81 46,21 ± 0,85 Wartości przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie 2 niezależnych doświadczeń. W komórkach linii CHO-HR-3A4 z koekspresją reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 aktywacja kaspazy-3 obserwowana była od 48 godzin inkubacji z pochodną imidazoakrydonu C-1311 i dotyczyła prawie 29% populacji komórek (Rysunek 20, Tabela 16). Wraz ze wzrostem czasu traktowania komórek badanym związkiem frakcja komórek z aktywnym białkiem proteolitycznym systematycznie rosła. Po 120 godzinach inkubacji 63% populacji komórek CHO-HR-3A4 posiadało aktywną kaspazę-3, co ponownie świadczyło o indukcji w tychże komórkach procesu apoptozy, jak również katastrofy mitotycznej. Dla porównania, obserwacje mikroskopowe wykazały zmiany w morfologii jądra typowe dla apoptozy i katastrofy mitotycznej w 65% komórek (120 godzin inkubacji), zaś badanie zmian w budowie błony cytoplazmatycznej translokację fosfatydyloseryny (aneksyna-v/pi+) w 68%. Tabela 16 Wpływ czasu inkubacji komórek CHO-HR-3A4 z pochodną C-1311(0,06 μm) na aktywność kaspazy-3 Aktywna kaspaza-3 Kontrola 24 godz. 48 godz. 72 godz. 96 godz. 120 godz. 2,36 ± 0,54 5,48 ± 0,11 28,68 ± 2,40 46,22 ± 0,79 57,56 ± 1,37 63,25 ± 3,80 Wartości przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie 2 niezależnych doświadczeń.

Wyniki 97 Poniżej (Rysunek 21) przedstawiłam zbiorczy wykres obrazujący procent komórek trzech linii jajnika chomika chińskiego CHO z aktywną kaspazą-3: Rysunek 21 Wpływ czasu inkubacji komórek trzech linii CHO z pochodną C-1311 (stężenie IC80) na aktywację kaspazy-3. Podsumowując, odsetek komórek z aktywną kaspazą-3 był najwyższy w przypadku komórek CHO-HR-3A4. Zatem indukcja śmierci komórkowej (apoptozy lub również katastrofy mitotycznej) przez pochodną C-1311 w tych komórkach przebiegała na najwyższym poziomie w porównaniu do komórek pozostałych linii. Toksyczny wpływ pochodnej C-1311 wobec komórek jajnika chomika chińskiego potęgowany jest zatem w warunkach zwiększonej ekspresji izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450. 5.1.6 Badanie fragmentacji DNA przy wykorzystaniu elektroforezy agarozowej Międzynukleosomalna fragmentacja jądra komórkowego obok morfologicznych zmian (kondensacji chromatyny i tworzenia ciałek apoptotycznych), translokacji fosfatydyloseryny do zewnętrznej warstwy błony komórkowej, spadku potencjału mitochondrialnego i aktywacji kaspaz wykonawczych jest jednym z głównym markerów procesu apoptozy. Degradacja DNA przebiega w kilku następujących po sobie etapach. W pierwszym z nich powstają duże fragmenty DNA osiągające wielkość od 300 do 50 tyś. par zasad. W kolejnym etapie DNA może ulec fragmentacji do krótkich odcinków, będących wielokrotnością około 200 par zasad. Stosując technikę elektroforezy w żelu agarozowym można rozdzielić DNA, które uległo degradacji na mono- i oligonukleosomy. Fragmenty te układają się na elektroforegramie w charakterystyczną drabinkę. Do fragmentacji DNA dochodzi w wyniku aktywacji specyficznych endonukleaz, takich jak DFF40/CAD oraz endonukleaza G czy lizosomalna DNaza II [Peitsch i wsp., 1994]. Badanie wykonałam dla komórek trzech linii jajnika chomika chińskiego CHO. DNA izolowałam z komórek inkubowanych wcześniej z pochodną C-1311 przez 24, 48, 72, 96 i 120 godzin oraz komórek nietraktowanych związkiem (kontrola). DNA rozdzieliłam w żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Barwnik ten wiąże się z DNA i w świetle UV daje silną fluorescencję. Przedstawione poniżej zdjęcia elektroforegramów wyizolowanego DNA (Rysunek 22) wykonałam przy zastosowaniu aparatury VersaDoc.

Wyniki 98 Rysunek 22 Zdjęcie elektroforegramów wykonanych po rozdzieleniu w żelu agarozowym DNA wyizolowanego z komórek trzech linii: CHO-WT, CHO-HR i CHO-HR-3A4 uprzednio traktowanych pochodną C-1311 w stężeniu odpowiadającemu IC80. DNA widoczne dzięki zastosowaniu bromku etydyny. Zdjęcie wykonane przy zastosowaniu urządzenia VerscaDoc. M marker wielkości DNA (niewidoczne 3 ostatnie prążki), K próbka kontrolna: komórki nietraktowane związkiem. Pokazane elektroforegramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Zamieszczone powyżej elektroforegramy pokazują, że jedynie w komórkach rekombinantowej linii CHO-HR-3A4 o nadekspresji reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4 dochodziło do międzynukleosomalnej fragmentacji DNA na skutek działania pochodnej C-1311. Charakterystyczna dla procesu apoptozy drabinka widoczna była po 48 godzinach inkubacji ze związkiem. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi doświadczeniami, które również wykazały, że w komórkach CHO-HR-3A4 dochodziło do znaczącej indukcji tego procesu po 48-godzinnej ekspozycji komórek na C-1311 i w miarę wzrostu czasu populacja komórek apoptotyczych zwiększała się, osiągając po 96 i 120 godzinach prawie 40%. W prezentowanych wcześniej doświadczeniach komórki pozostałych linii: CHO-WT i CHO-HR również ulegały apoptozie, ale w mniejszym stopniu, stąd możliwy brak widocznych na elektroforegramach międzynukleosomalnych fragmentów DNA. 5.1.7 Identyfikacja żywych/martwych komórek CHO po traktowaniu C-1311 Dotychczas przedstawione przeze mnie badania pokazały, że część komórek CHO-WT, CHO-HR i CHO-HR-3A4 pozostawała żywa, a część umierała po traktowaniu pochodną imidazoakrydonu C-1311. W celu jednoznacznego określenia liczby komórek martwych

Wyniki 99 pozostałych po ekspozycji na związek przeprowadziłam barwienie różnicowe, pozwalające w prosty sposób odróżnić komórki żywe i martwe. W barwieniu tym zastosowałam dwa barwniki dioctan fluoresceiny (FDA) oraz jodek propidyny. FDA jest niepolarną i niefluoryzującą pochodną fluoresceiny, która posiada zdolność do przenika przez błonę komórkową. Po wniknięciu do komórki FDA jest hydrolizowany przez wewnątrzkomórkowe esterazy do fluoresceiny związku wykazującego właściwości fluoryzujące. Komórki żywe, przejawiające dużą aktywność esteraz, kumulują znaczne ilości fluoresceiny, co w konsekwencji powadzi do otrzymania intensywnej fluorescencji zielonej. Komórki apoptotyczne i martwe, cechujące się mniejszą aktywnością esteraz oraz słabiej zachowaną integralnością błony komórkowej, słabiej akumulują produkt hydrolizy FDA, co oznacza mniejszą intensywność zielonej fluorescencji w tychże komórek. Jodek propidyny, ze względu na posiadany ładunek elektryczny, nie przenika przez nieuszkodzoną błonę komórek żywych i wczesnoapoptotycznych. Barwi on na czerwono komórki z uszkodzoną błoną cytoplazmatyczną, a więc nekrotyczne lub znajdujące się w późnych fazach apoptozy [Jones i Senft, 1995]. Poniżej zamieściłam zdjęcia z mikroskopu fluorescencyjnego komórek trzech badanych linii jajnika chomika chińskiego CHO inkubowanych przez podane czasy (24, 48, 72, 96 i 120 godzin) z pochodną imidazoakrydonu C-1311 w stężeniu o wartości IC80, a następnie wybarwionych dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny. a. Linia CHO-WT Rysunek 23 Zdjęcia komórek linii CHO-WT traktowanych pochodną C-1311 (0,09 μm), wybarwionych dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 200x w świetle niebieskim. Przedstawione obrazy są reprezentatywne dla trzech wykonanych doświadczeń. Cyfra w dolnym prawym rogu oznacza procent populacji komórek martwych. Pierwsze martwe komórki pojawiły się po 24 godzinach inkubacji komórek linii CHO-WT z pochodną C-1311, a ich populacja wynosiła 5% (Rysunek 23). Wraz ze wzrostem czasu ekspozycji komórek wybarwionych na czerwono przybywało i po 120 godzinach ich liczba

Wyniki 100 wynosiła niecałe 35%. Wynik ten koreluje z rezultatem uzyskanym w doświadczeniu Aneksyna V/PI, gdzie procent komórek wybarwionych jedynie jodkiem propidyny wynosił 37%. b. Linia CHO-HR Pierwsze komórki z uszkodzoną błoną komórkową pojawiły się w przypadku komórek CHO-HR wykazujących nadekspresją ludzkiej reduktazy cytochromu P450 po 24 godzinach inkubacji z C-1311 (Rysunek 24). Ich populacja w porównaniu do komórek linii CHO-WT była nieco większa i wynosiła 7%. Liczba komórek martwych w kolejnych godzinach ekspozycji na związek rosła i po 120 godzinach osiągnęła wartość 47%. Zatem pochodna C-1311 po 5 dniach inkubacji spowodowała śmierć blisko 50% populacji komórek CHO-HR, co jest wynikiem niemalże identycznym z tym otrzymanym z cytometrycznej analizy integralności błony komórkowej. Co ciekawe, na zdjęciach wyraźnie widać, że niektóre z jąder martwych komórek tworzą charakterystyczne ciałka apoptotyczne o skondensowanej chromatynie, co świadczy o późnej fazie apoptozy. Rysunek 24 Zdjęcia komórek linii CHO-HR traktowanych pochodną C-1311 (0,03 μm), wybarwionych dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 200x w świetle niebieskim. Przedstawione obrazy są reprezentatywne dla trzech wykonanych doświadczeń. Cyfra w dolnym prawym rogu oznacza procent populacji komórek martwych. c. Linia CHO-HR-3A4 Wykonane zdjęcia i obliczenia dla komórek linii CHO-HR-3A4 pokazały (Rysunek 25), że po 24 godzinach inkubacji ze związkiem populacja martwych komórek wynosiła około 7%. Ich liczba znacząco wzrosła po 72 godzinach do prawie 40% i stale zwiększała się. Po 120 godzinach liczba komórek wybarwionych na czerwono jodkiem propidyny wynosiła około 67%. Wynik ten nieco różni się od rezultatu z testu Aneksyna V/PI, gdzie około 53% komórek była wybarwiona jodkiem propidyny. Należy jednak zwrócić uwagę, że wspomniane doświadczenie wykazało również, że 25% komórek znajdowało się we wczesnej fazie apoptozy. Obie analizy:

Wyniki 101 cytometryczna i mikroskopowa pokazały zatem, że komórki linii CHO-HR-3A4 są najbardziej wrażliwe na działanie pochodnej C-1311. Rysunek 25 Zdjęcia komórek linii CHO-HR-3A4 traktowanych pochodną C-1311 (0,06 μm), wybarwionych dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 200x. Przedstawione obrazy są reprezentatywne dla trzech wykonanych doświadczeń. Cyfra w dolnym prawym rogu oznacza procent populacji komórek martwych. d. Zestawienie Liczba komórek [%] 80 60 40 20 0 CHO-WT CHO-HR CHO-HR-3A4 b* a* b** a** a* a* b** a** K 24 48 72 96 120 Czas inkubacji [godz.] a* b** a** a* b** a** b** a** Rysunek 26 Wpływ czasu inkubacji komórek trzech linii modelu CHO z pochodną C-1311 (stężenie IC80) na wielkość populacji martwych komórek. Pochodna C-1311 wykazywała najsilniejszy efekt cytotoksyczny wobec komórek linii CHO-HR-3A4 z nadekspresją ludzkiej reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450, prowadząc do śmierci największą liczbę komórek. 5.1.8 Badanie procesu starzenia komórkowego w komórkach CHO Na postawie dotychczasowych badań stwierdziłam, że pochodna C-1311 indukowała w komórkach jajnika chomika chińskiego CHO śmierć na drodze apoptozy, katastrofy mitotycznej lub nekrozy. Procesy te dotyczyły większości populacji komórek i były zależne od czasu inkubacji ze związkiem i ekspresji reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450.

Wyniki 102 Należy zwrócić uwagę, że po 120 godzinach traktowania komórek wszystkich trzech linii CHO pochodną C-1311 nadal utrzymywała się frakcja komórek żywych. Pojawiło się zatem pytanie, jakie są losy tej populacji komórek. W związku z tym przeprowadziłam doświadczenie mające na celu sprawdzenie, czy komórki CHO ulegają procesowi przyspieszonego starzenia pod wpływem działania pochodnej C-1311. Na skutek stopniowego skracania telomerów wraz z każdym cyklem podziałowym w komórkach dochodzi do indukcji starzenia replikacyjnego. W komórkach somatycznych najczęściej następuje to po około 50 podziałach komórki, tzw. limit Hayflick a. Do indukcji przyspieszonego starzenia komórkowego może dojść również na skutek uszkodzenia komórki, np. poprzez działanie leku. W tym przypadku nie następuje skrócenie długości telomerów i aktywacja telomerazy. Uważa się obecnie, że starzenie komórkowe jest, obok apoptozy, jednym z mechanizmów obronnych komórki przed zmianami nowotworowymi. Zarówno starzenie replikacyjne, jak i przyspieszone charakteryzuje się podobnymi zmianami morfologicznymi. Starzejące się komórki są zwykle powiększone i spłaszczone, a w ich wnętrzu widoczne są liczne ziarnistości. W przypadku przyspieszonego starzenia komórkowego dochodzi do uwolnienia SA-β-galaktozydazy z lizosomów do cytoplazmy. Enzym ten jest aktywny w ph = 6,0. Dodając do pożywki substrat dla SA-β-galaktozydazy, X-Gal, można dzięki niebieskiemu produktowi rozkładu związku w łatwy sposób sprawdzić, w których komórkach doszło do indukcji starzenia komórkowego [Roninson, 2003]. Opisany powyżej proces jest jak dotąd jedynym biochemicznym markerem starzenia komórkowego. Marker ten zastosowałam do określenia, czy pod wpływem działania pochodnej C-1311 dochodzi do indukcji przyspieszonego starzenia w komórkach jajnika chomika chińskiego, liniach: CHO-WT, CHO-HR i CHO-HR-3A4. Komórki traktowałam związkiem w stężeniu odpowiadającemu wartości IC 80 przez podane czasy, a następnie inkubowałam z X-Gal em i oglądałam pod mikroskopem w świetle widzialnym. Otrzymane zdjęcia przedstawiłam na Rysunku 27, a obliczenia w Tabeli 17. Tabela 17 Wpływ czasu inkubacji komórek linii CHO-HR i CHO-HR-3A4 z pochodną C-1311 w stężeniu IC80 na indukcję procesu przyspieszonego starzenia komórkowego. Komórki starzejące się Kontrola 24 godz. 48 godz. 72 godz. 96 godz. 120 godz. CHO-HR 0,33 ± 0,0 0,84 ± 0,23 3,79 ± 0,93 11,76 ± 0,74 18,73 ± 3,26 26,92 ± 11,84 CHO-HR-3A4 0,50 ± 0,13 1,10 ± 0,14 2,37 ± 0,19 13,42 ± 6,62 28,38 ± 11,67 40,22 ± 0,13 Wartości przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie 2 niezależnych doświadczeń.

Wyniki 103 Rysunek 27 Indukcja procesu przyspieszonego starzenia w komórkach CHO-WT, CHO-HR, CHO-HR-3A4 przez pochodną C-1311 w stężeniu IC80. Niebieskie zabarwienie świadczy o obecności SA-β-galaktozydazy rozkładającej X-Gal na barwny produkt. Ekspresja tego enzymu towarzyszy procesowi przyspieszonego starzenia komórkowego. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla dwóch niezależnie wykonach doświadczeń. W komórkach linii CHO-WT traktowanych pochodną C-1311 nie obserwowałam niebieskiego produktu rozkładu X-Gal u, a zatem nie dochodziło do indukcji przyspieszonego starzenia komórkowego (Rysunek 27). Z kolei w komórkach obu rekombinantowych linii, CHO-HR i CHO-HR-3A4 począwszy od 72 godzin inkubacji z imidazoakrydonem widoczne było niebieskie zabarwienie komórek. W komórkach tych dochodziło zatem do uwolnienia SA-β-galaktozydazy z lizosomów do cytoplazmy, co świadczy o indukcji przyspieszonego starzenia komórkowego. Po 72 godzinnej ekspozycji komórek starzejących się było 12% w przypadku komórek linii CHO-HR oraz 13% w przypadku CHO-HR-3A4. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji ze związkiem frakcja komórek żywych o niebieskim zabarwieniu wzrastała i po 120 godzinach wynosiła 27% i 40% odpowiednio dla komórek CHO-HR i CHO-HR-3A4 (Tabela 17). Należy zwrócić uwagę, że intensywność barwy produktu rozkładu X-Galu w komórkach CHO-HR z nadekspresją reduktazy była słaba, co może świadczyć, że proces starzenia komórek przebiegał ze stosunkowo niską intensywnością. Z kolei komórki starzejące się linii CHO-HR-3A4 były wyraźnie bardziej niebieskie. Na zdjęciach widać również, że komórki, w których dochodziło do przyspieszonego starzenia, stawały się w miarę wzrostu czasu inkubacji coraz większe i ulegały rozpłaszczeniu. Dodatkowo we wnętrzu komórek pojawiły się liczne ziarnistości.

Wyniki 104 Należy zwrócić uwagę, że przedstawione zdjęcia mikroskopowe i obliczenia dotyczą komórek przyklejonych do podłoża płytki hodowlanej. Większość komórek linii CHO-HR, a zwłaszcza CHO-HR-3A4 po 120 godzinach traktowania pochodną C-1311 uległa śmierci komórkowej i odkleiła się od powierzchni płytki. Podsumowując, proces przyspieszonego starzenia komórkowego przebiegał z największą intensywnością w komórkach CHO z koekspresją reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w porównaniu do komórek pozostałych badanych linii. 5.1.9 Zdolność komórek CHO traktowanych C-1311 do powrotu do proliferacji Kolejną istotną cechą określającą wrażliwość komórek na badany związek cytotoksyczny jest zdolność traktowanych komórek do powrotu do proliferacji. W przypadku, gdy związek silnie oddziałuje na komórki, nie są one zdolne do ponownego podziału, nawet gdy przywróci im się prawidłowe warunki wzrostowe bez obecności leku. Właściwość tą bada się sprawdzając zdolność komórek do tworzenia kolonii po wymianie pożywki na świeżą bez dodatku związku. Badanie przeprowadziłam dla trzech linii CHO. Ich zdolność do powrotu do proliferacji oznaczyłam po uprzednim traktowaniu ich związkiem C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC 80 przez 24 do 120 godzin. Rysunek 28 przedstawia liczbę utworzonych kolonii po dwutygodniowej post-inkubacji bez dodatku związku około 300 traktowanych wcześniej komórek pochodną C-1311: Liczba kolonii 300 0 CHO-WT CHO-HR CHO-HR-3A4 K 24 48 72 96 120 Czas inkubacji [godz.] Rysunek 28 Zdolność komórek CHO traktowanych związkiem C-1311 (dawka IC80) przez podane czasy do tworzenia kolonii po dwutygodniowej post-inkubacji bez dodatku związku. Jednorazowo badaniu zostało poddanych około 300 komórek. Z przedstawionych powyżej obliczeń wynika, że jedynie komórki CHO-WT typu dzikiego były zdolne do ponownego dzielenia się po usunięciu związku C-1311 z pożywki hodowlanej. Z około 300 pobranych komórek po 24- i 48-godzinnej inkubacji połowa była zdolna do utworzenia kolonii, a zatem do proliferacji. Po 72 godzinach traktowania związkiem jedynie 2 komórki podlegały podziałowi. Proliferacja komórek obu linii rekombiantowych, CHO-HR i CHO- HR-3A4 o nadekspresji reduktazy CPR samej lub w koekspresji z izoenzymem CYP3A4 została całkowicie zahamowana i żadne kolonie nie tworzyły się.

Wyniki 105 5.1.10 Badanie przemian metabolicznych pochodnej C-1311 w komórkach CHO Dotychczas przedstawione badania wykazały, że istnieją wyraźne różnice w rodzaju i wielkości zmian świadczących o indukcji śmierci komórkowej w komórkach CHO wykazujących różny poziom ekspresji ludzkiej reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4. Jedną z przyczyn odmiennej odpowiedzi i wrażliwości komórek trzech linii CHO na pochodną imidazoakrydonu C-1311 może być różny profil przemian metabolicznych badanego związku w tychże komórkach. Przy podwyższonej ekspresji reduktazy lub izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 mogą powstawać dodatkowe metabolity pochodnej akrydonu, które w większym stopniu niż związek wyjściowy oddziałują na traktowane nim komórki. Biotransformację C-1311 w komórkach typu dzikiego, CHO-WT, o nadekspresji reduktazy cytochromu P450 (CHO-HR) oraz z koekspresją reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochrom P450 (CHO-HR-3A4) zbadałam poprzez analizę RP-HPLC metanolowych lizatów komórkowych po uprzedniej inkubacji z 25 μm związkiem przez 24, 48 i 72 godziny. Rysunek 29 przedstawia otrzymane z analizy chromatogramy. CHO-WT Rysunek 29 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1311 w komórkach trzech linii CHO przy długości fali 380 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1311, M1 do M5 poszczególne metabolity związku C-1311. Przedstawione chromatogramy są reprezentatywne dla czterech niezależnych doświadczeń. Metabolizm pochodnej imidazoakrydonu C-1311 w komórkach CHO wszystkich trzech linii zachodził w niewielkim stopniu. Substrat, czyli wyjściowa forma związku, widoczny był na chromatogramach około 16 minuty czasu retencji. Po 24 godzinach inkubacji pojawiały się

Wyniki 106 w okolicach substratu inne piki będące metabolitami badanej pochodnej. Takich produktów można wyróżnić 5. Jednakże ich stężenia po wszystkich czasach inkubacji i w każdej z linii pozostawały na niskim poziomie. Stężenia metabolitów nr 1, 2 oraz 5 w komórkach trzech linii CHO były bardzo podobne. Poziom metabolitu M4 był nieco wyższy w komórkach CHO-WT typu dzikiego niż w komórkach rekombinantowych. Z kolei stężenie metabolitu M3 różniło się między poszczególnymi liniami. Najwyższy pik tego produktu obecny był w komórkach CHO-HR-3A4 z koekspresją reduktazy i izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450, a zdecydowanie najniższy w komórkach CHO-WT. Jego stężenie wzrastało wraz ze wzrostem czasu inkubacji komórek ze związkiem. Całkowita konwersja związku C-1311 po 72 godzinach inkubacji z komórkami trzech linii CHO do 5 wyróżnionych metabolitów wynosiła dla każdej z linii: CHO-WT 0,02%, CHO- HR 0,04%, CHO-HR-3A4 0,07%. Obliczony stopień transformacji chemoterapeutyku jest zatem bardzo niewielki. Pomimo obserwowanych nieznacznych różnić w poziomie produktów metabolizmu pochodnej imidazoakrydonu C-1311 pomiędzy trzema liniami jajnika chomika chińskiego CHO charakteryzującymi się różnym poziomem reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4 można stwierdzić, że odmienna odpowiedź biologiczna indukowana w tychże komórkach przez badany związek nie wynikała z obecności któregoś z metabolitów, z uwagi na niewielki stopień biotransformacji związku. Przyczyna różnic w obserwowanej drodze śmierci komórek trzech linii CHO ma zatem inne, bardziej skomplikowane podłoże i może wynikać z wpływu ekspresji wspomnianych enzymów metabolizujących na inne białka zaangażowane w przeżycie i śmierć komórki lub transformację związków endogennych. 5.1.11 Generowanie przez C-1311 reaktywnych form tlenu w komórkach CHO W danych literaturowych pojawiły się doniesienia mówiące, że nadekspresja reduktazy cytochromu P450 przyczyniała się do tworzenia w komórce reaktywnych form tlenu (ROS). Konsekwencją tego procesu był zwiększony stres oksydacyjny objawiający się wyższym poziomem karbonylacji białek i konsumpcją wewnątrzkomórkowego tlenu. Badania wykonano na komórkach CHO, typu dzikiego i z nadekspresją reduktazy cytochromu P450, nietraktowanych żadnym związkiem [Fussel i wsp., 2011]. Wykazano również, że w warunkach podwyższonego poziomu reduktazy cytochromu P450 niektóre ze stosowanych leków przeciwnowotworowych wykazują wyższą cytotoksyczność. Takich obserwacji dokonano dla 5- fluorouracylu i doksorubicyny. Jako przyczynę przedstawionego efektu podano zwiększoną generację ROS [Martinez i wsp., 2008]. W związku z powyższymi doniesieniami, kolejnym etapem badań nad mechanizmem odpowiedzi komórkowej indukowanej w komórkach CHO przez pochodną imidazoakrydonu

Wyniki 107 C-1311 było sprawdzenie, czy przyczyną obserwowanych różnic w cytotoksyczności związku i zwiększonej populacji komórek umierających na drodze apoptozy lub katastrofy mitotycznej obserwowane przede wszystkim między komórkami linii CHO-WT (typu dzikiego) i CHO-HR (z nadekspresją CPR) była generacja reaktywnych form tlenu. Detekcję reaktywnych form tlenu w cytoplazmie komórek traktowanych chemoterapeutykiem najczęściej przeprowadza się stosując niefluoryzującą sól fluoresceiny, która w obecność ROS rozkładana jest do pochodnej fluoresceiny o zielonej fluorescencji. W swoich doświadczeniach zastosowałam związek dioctan 5 i 6-chlorometylo-2,7 - dichlorodihydrofluoresceiny (CM-H 2DCFDA). Eksperyment przeprowadziłam wobec komórek trzech linii jajnika chomika chińskiego, CHO, poddanych działaniu C-1311 od 24 do 120 godzin w stężeniu odpowiadającemu dawce IC 80. Po zakończonej inkubacji dodawałam do komórek CM-H 2DCFDA oraz Hoechst 33342 (w celu obserwacji jąder komórkowych) i analizowałam zmiany we fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. a. Linia CHO-WT Rysunek 30 Generacja reaktywnych form tlenu w komórkach CHO-WT poddanych działaniu pochodnej imidazoakrydonu C-1311 (0,09 µm) przez podane czasy. Dana seria zdjęć pochodzi z tego samego pola preparatu oglądanego pod mikroskopem przy powiększeniu 400x. (A) widok komórek w świetle widzialnym, (B) widok w świetle UV jąder komórkowych wybarwionych Hoechst 33342 (2 µg/ml), (C) widok w świetle niebieskim komórek wybarwionych CM-H2DCFDA (10 µm). Kontrola negatywna komórki nietraktowane związkiem, kontrola pozytywna - komórki traktowane 200 µm H2O2. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. W komórkach CHO typu dzikiego niezależnie od czasu inkubacji ze związkiem C-1311 w niewielkim stopniu dochodziło do hydrolizy CM-H 2DCFDA do fluoryzującej pochodnej (Rysunek 30). 72- i 120-godzinna ekspozycja komórek na związek prowadziła do pojawienia się pojedynczych komórek zabarwionych na zielono, jednak proces ten przebiegał ze słabą intensywnością. Jedynie w komórkach CHO-WT traktowanych H 2O 2 (kontrola pozytywna) 100%

Wyniki 108 komórek wykazywała zieloną fluorescencję. W komórkach CHO-WT traktowanych pochodną imidazoakrydonu w niewielkim stopniu dochodziło do tworzenia się reaktywnych form tlenu. b. Linia CHO-HR Komórki linii CHO-HR z nadekspresją ludzkiej reduktazy cytochromu P450 traktowane związkiem C-1311 już od 24 godzin inkubacji barwiły się na kolor zielony, zatem dochodziło w nich do hydrolizy CM-H 2DCFDA do fluoresceiny pod wpływem reaktywnych form tlenu (Rysunek 31). Wraz ze wzrostem czasu inkubacji komórek wykazujących zieloną fluorescencję przybywało. Warto zwrócić uwagę, że zielona fluorescencja generowana przez komórki CHO- HR z kontroli pozytywnej była znacznie intensywniejsza niż miało to miejsce w przypadku komórek linii CHO-WT. Podsumowując, w komórkach linii CHO-HR o nadekspresji reduktazy cytochromu P450 proces tworzenia się reaktywnych form tlenu przebiegał z dużą intensywnością. Może to być jedna z przyczyn obserwowanej różnicy w cytotoksyczności i odpowiedzi komórkowej między komórkami linii dzikiej, CHO-WT, a omawianej, CHO-HR. Rysunek 31 Generacja reaktywnych form tlenu w komórkach CHO-HR poddanych działaniu pochodnej imidazoakrydonu C-1311 (0,03 µm) przez podane czasy. Dana seria zdjęć pochodzi z tego samego pola preparatu oglądanego pod mikroskopem przy powiększeniu 400x. (A) widok komórek w świetle widzialnym, (B) widok w świetle UV jąder komórkowych wybarwionych Hoechst 33342 (2 µg/ml), (C) widok w świetle niebieskim komórek wybarwionych CM-H2DCFDA (10 µm). Kontrola negatywna komórki nietraktowane związkiem, kontrola pozytywna - komórki traktowane 200 µm H2O2. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. c. Linia CHO-HR-3A4 W komórkach linii CHO-HR-3A4 o podwójnej nadekspresji reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4 traktowanych pochodną C-1311 również pojawiała się zielona fluorescencja pochodząca od zhydrolizowanej formy barwnika CM-H 2DCFDA (Rysunek 32). Pojedyncze zielone komórki pojawiały już od 24 godzin inkubacji. Po 72-godzinnej ekspozycji

Wyniki 109 na związek fluoryzowały jedynie te komórki, które znajdowały się w późnym stadium apoptozy, zaś po 120 godzinach inkubacji niemalże wszystkie komórki były zabarwione na zielono. Warto jednak zwrócić uwagę, że po tym czasie większość komórek CHO-HR-3A4 wykazywała zmiany jądra charakterystyczne właśnie dla śmierci apoptotycznej. W komórkach CHO-HR-3A4 na skutek działania pochodnej imidazoakrydonu C-1311 tworzyły się reaktywne formy tlenu. Zjawisko to zachodziło przede wszystkim w komórkach o morfologii jądra charakterystycznej dla śmierci apoptotycznej. Porównując powyższe zdjęcia (Rysunek 32) z tymi wykonanymi dla komórek linii CHO-HR o podwyższonym poziomie jedynie reduktazy cytochromu P450 (Rysunek 31) nasuwa się wniosek, że w komórkach CHO-HR tworzenie się ROS dotyczyło szerszej populacji komórek o zmianach morfologii jądra typowej nie tylko dla apoptozy, ale również dla katastrofy mitotycznej bądź niezmienionych. Rysunek 32 Generacja reaktywnych form tlenu w komórkach CHO-HR-3A4 poddanych działaniu pochodnej imidazoakrydonu C-1311 (0,06 µm) przez podane czasy. Dana seria zdjęć pochodzi z tego samego pola preparatu oglądanego pod mikroskopem przy powiększeniu 400x. (A) widok komórek w świetle widzialnym, (B) widok w świetle UV jąder komórkowych wybarwionych Hoechst 33342 (2 µg/ml), (C) widok w świetle niebieskim komórek wybarwionych CM-H2DCFDA (10 µm). Kontrola negatywna komórki nietraktowane związkiem, kontrola pozytywna - komórki traktowane 200 µm H2O2. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Podsumowując, obecność w komórkach jajnika chomika chińskiego, CHO ludzkiej reduktazy cytochromu P450 prowadziła do generacji reaktywnych form tlenu w warunkach ekspozycji komórek na imidazoakrydon C-1311, przy czym wydaje się, że obecność izoenzymu CYP3A4 w niewielkim stopniu niwelowała ten efekt.

Wyniki 110 5.2 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom i aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach CHO Badanie odpowiedzi komórkowej indukowanej przez pochodną imidazoakrydonu C-1311 w komórkach CHO pozwoliły bliżej poznać biologiczny mechanizm działania związku. Pokazałam, że poziom ekspresji enzymów metabolizujących ma wpływ na rodzaj odpowiedzi komórkowej indukowanej przez badany związek, choć wpływ ten nie wynika z bezpośredniej zmiany stężenia aktywnych metabolitów. Enzymy, które są odpowiedzialne za aktywacyjną transformację związku nie są jak dotąd poznane. Wiadomo jednak, że pochodna C-1311 wpływa na aktywność białek biorących udział w metabolizmie leków. Potwierdziły to badania in vitro przeprowadzone w naszej Katedrze na rekombinantowych izoenzymach cytochromu P450, które pokazały, że związek powodował inhibicję izoenzymów CYP1A2 i CYP3A4 [Potęga i wsp., 2011]. Stąd kolejnym moim krokiem zmierzającym w kierunku lepszego poznania mechanizmu działania C-1311 było sprawdzenie, czy wpływa on na poziom i aktywność jednego z izoenzymów cytochromu P450, jakim jest CYP3A4 w modelowym układzie komórkowym CHO. 5.2.1 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom białka CYP3A4 Wpływ pochodnej imidazoakrydonu C-1311 na wewnątrzkomórkowy poziom białka CYP3A4 cytochromu P450 zbadałam metodą Western blot. Na początku określiłam, w której z badanych linii komórkowych CHO poziom białka jest na wystarczającym poziomie do przeprowadzenia analizy. W tym celu z komórek każdej linii: CHO-WT, CHO-HR i CHO-HR-3A4 nietraktowanych związkiem wyizolowałam frakcję białkową. Wykonałam to dwoma metodami. Pierwsza metoda służy do wyizolowania frakcji białkowej zawartej jedynie w mikrosomach, co pozwala badać ekspresję białek, których zawartość w komórce jest niewielka. Druga zaś metoda, zaproponowana przez dr Friedberga [Ding i wsp., 1997] pozwala otrzymać białka z całej zawartości komórki, ze szczególnym uwzględnieniem tych, znajdujących się w błonach mikrosomalnych. a. Sprawdzenie poziomu białka CYP3A4 w komórkach CHO nietraktowanych związkiem w zależności od zastosowanej metody izolacji frakcji mikrosomalnej Wyniki przeprowadzonej analizy poziomu białka CYP3A4 w komórkach trzech linii jajnika chomika chińskiego pokazały, że jedynie w komórkach CHO-HR-3A4 z nadekspresją ludzkiej reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4 obserwowana była ekspresja badanego białka na wysokim poziomie (Rysunek 33). Obie zastosowane do izolacji białka metody dały zbliżony wynik, a zatem przy kolejnych analizach poziomu izoenzymu CYP3A4 mogłam

Wyniki 111 zastosować izolację z całych komórek, dzięki czemu omija się czasochłonny etap ultrawirowania. W przypadku pozostałych badanych linii nie obserwowałam na błonie prążka odpowiadającego białku CYP3A4 bez względu na zastosowaną metodę. W komórkach tych albo nie dochodzi do ekspresji izoenzymu CYP3A4, albo poziom tego białka jest zbyt niski do wykrycia. Należy zwrócić uwagę, że zawartość β-aktyny we frakcji mikrosomalnej i z całych komórek była różna. Dużo więcej kontrolnego białka było w lizatach z całych komórek. Rysunek 33 Analiza Western blotting poziomu CYP3A4. Numer prążka odpowiada następującym frakcjom białkowym wyizolowanych z podanej linii komórkowej: 1 HepG2, frakcja mikrosomalna; 2 CHO-WT frakcja mikrosomalna; 3 CHO-WT, całe komórki; 4 CHO-HR, frakcja mikrosomalna; 5 CHO-HR, całe komórki; 6 CHO- HR-3A4, frakcja mikrosomalna; 7 CHO-HR-3A4, całe komórki; 8 kontrola pozytywna, rekombinantowy izoenzym CYP3A4. b. Wpływ pochodnej C-1311 na poziom białka CYP3A4 w komórkach CHO-HR-3A4 w zależności od czasu inkubacji Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom izoenzymu CYP3A4 w zależności od czasu inkubacji przeprowadziłam jedynie dla komórek CHO-HR-3A4 (Rysunek 34). Czasy ekspozycji komórek CHO-HR-3A4 na pochodną C-1311 (stężenie IC 80) wynosiły: 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, i 120 godzin. Rysunek 34 Zależny od czasu wpływ pochodnej C-1311 na poziom izoenzymu CYP3A4 w komórkach CHO-HR-3A4 traktowanych związkiem (0,06 μm) przez podane czasy. K oznacza próbkę kontrolną, czyli komórki nietraktowane pochodną. Wynik jest reprezentatywny dla czterech wykonanych doświadczeń. W komórkach CHO-HR-3A4 traktowanych C-1311 nie dochodziło do zmiany w poziomie ekspresji izoenzymu CYP3A4 wraz ze wzrostem czasu inkubacji ze związkiem (Rysunek 34). Widoczne na błonie prążki dla każdego czasu ekspozycji były takiej samej szerokości (przy uwzględnieniu poziomu ekspresji białka kontrolnego, β-aktyny). Zatem badany związek nie wpływał na wewnątrzkomórkowy poziom białka cytochromu P450 CYP3A4 bez względu na czas ekspozycji komórek na C-1311.

Wyniki 112 5.2.2 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach CHO przy zastosowaniu techniki HPLC Aktywność izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 mierzyłam badając stopień przemiany testosteronu w komórkach trzech linii CHO przy zastosowaniu techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych, RP-HPLC. Testosteron jest standardowym substratem dla enzymu CYP3A4. Metabolizm testosteronu przeprowadzany przez ten izoenzym prowadzi do powstanie 6-hydroksylowej pochodnej testosteronu. Analiza tej przemiany jest wskaźnikiem aktywności izoenzymu CYP3A4. a. Wpływ pochodnej C-1311 na aktywność białka CYP3A4 w komórkach CHO-HR-3A4 w zależności od czasu inkubacji Podobnie jak w przypadku badania poziomu białka CYP3A4, w pierwszym etapie analizy sprawdziłam przemianę testosteronu w komórkach trzech linii jajnika chomika chińskiego CHO nietraktowanych pochodną C-1311. Uzyskane wyniki przemiany testosteronu w komórkach CHO wykazały, że produkt przemiany testosteronu 6-hydroksytestosteron widoczny był jedynie w przypadku komórek linii CHO-HR-3A4, czyli wykazujących koekspresję ludzkiej reduktazy cytochromu P450 i izoenzymu CYP3A4 (Rysunek 35). Wynik ten koreluje z badaniem poziomu białka w komórkach CHO, który wykazał, że jedynie w komórkach CHO-HR-3A4 dochodziło do ekspresji tego białka. Absorbancja [AU] 0,19 0,14 0,09 0,04-0,01 CHO-HR-3A4 CHO-HR CHO-WT 20 25 30 35 40 Czas retencji [min] Rysunek 35 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu testosteronu (stężenie 50 µm) w komórkach trzech linii CHO przy długości fali 254 nm. Strzałka wskazuje na metabolit testosteronu, 6-β-hydroksytestosteron, typowy dla obecności w komórkach izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450. Przedstawione chromatogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. W dalszej części określiłam wpływ na aktywność CYP3A4 pochodnej imidazoakrydonu C-1311 w komórkach CHO-HR-3A4 traktowanych pochodną C-1311 w dwóch różnych stężeniach: dawce IC 80 (0,06 µm) i 50xIC 50 (1,0 µm) w zależności od czasu inkubacji. Badanie aktywności izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w komórkach transfekowanej linii jajnika chomika chińskiego, CHO-HR-3A4 wykazało, że wraz ze wzrostem czasu inkubacji komórek z pochodną C-1311 aktywność białka spadała względem próby kontrolnej, nietraktowanej związkiem (Rysunek 36). Spadek ten był obserwowany począwszy od 48 godzin inkubacji ze związkiem. W komórkach CHO-HR-3A4 traktowanych C-1311 w stężeniu

Wyniki 113 odpowiadającemu dawce IC 80 obniżenie aktywności następowało systematycznie i powoli. Po 120 godzinach jego aktywność wynosiła względem kontroli około 35%. W komórkach poddanych ekspozycji 1 µm C-1311 aktywność CYP3A4 po 48 godzinach spadła do wartości 40% i w kolejnych dniach obniżyła się do niecałych 20%. Podsumowując, pochodna imidazoakrydonu C-1311 powodowała obniżenie aktywności izoenzymu CYP3A4 w komórkach CHO-HR-3A4 zależnie od czasu inkubacji. Aktywność CYP3A4 względem kontroli [%] 120 100 80 60 40 20 0 *** *** *** *** *** *** 0.06 μm 1.00 μm *** *** C 24 48 72 96 120 Czas inkubacji [godz.] Rysunek 36 Zależny od czasu wpływ pochodnej C-1311 na aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach CHO-HR-3A4 traktowanych związkiem o stężeniu 0,06 μm lub 1,00 μm przez podane czasy. K oznacza próbkę kontrolną, czyli komórki nietraktowane związkiem. Wynik jest średnią z trzech niezależnych doświadczeń. *** statystycznie istotna różnica względem kontroli, P < 0,0001. b. Wpływ pochodnej C-1311 na aktywność białka CYP3A4 w komórkach CHO-HR-3A4 w zależności od stężenia związku Wpływ stężenia pochodnej imidazoakrydonu C-1311 na aktywność białka CYP3A4 w komórkach linii CHO-HR-3A4 traktowanych związkiem przez 24 godziny wykonałam dla następującego zakresu stężeń: 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 25 i 50 μm. Aktywność izoenzymu CYP3A4 oszacowałam na podstawie przemiany testosteronu do formy 6-hydroksylowej, gdzie jako 100% uznałam wartość biotransformacji uzyskaną dla komórek kontrolnych, nietraktowanych związkiem (Rysunek 37). Aktywność CYP3A4 względem kontroli [%] 120 100 80 60 40 20 0 *** *** 24 godz. *** *** K 0,01 0,1 1 5 10 25 50 Stężenie C-1311 [μm] Rysunek 37 Zależny od stężenia pochodnej C-1311 wpływ związku na aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach CHO-HR-3A4 traktowanych związkiem (24 godziny) o podanych stężeniach. K oznacza próbkę kontrolną, czyli komórki nietraktowane związkiem. Wynik jest średnią z trzech wykonanych doświadczeń. *** statystycznie istotna różnica względem kontroli, P < 0,0001. Badanie aktywności izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w komórkach CHO-HR-3A4 traktowanych różnymi stężeniami pochodnej C-1311 wykazało, że wraz ze wzrostem stężenia związku aktywność enzymu systematycznie malała. Spadek ten był obserwowany począwszy od dawki 5 μm (72% względem kontroli). W komórkach traktowanych najwyższą dawką pochodnej C-1311 aktywność CYP3A4 wynosiła jedynie 22%. Zatem wzrost stężenia C-1311 również potęguje inhibicyjne właściwości badanego imidazoakrydonu.

Wyniki 114 5.3 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom i aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach HepG2 Dotychczas przedstawione badania zostały wykonane na ssaczym modelu komórkowym komórkach jajnika chomika chińskiego, CHO. Jest to dobry system komórkowy do badań wstępnych. Jednakże przy założeniu, że badania mają służyć pogłębieniu wiedzy na temat czynników warunkujących skuteczność terapii nowotworów rozwijających się w organizmie człowieka, analogiczne doświadczenia powinny być wykonane w komórkach ludzkich. Dlatego też poziom i aktywność izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 zbadałam również w ludzkich komórkach nowotworu wątroby o normalnej i podwyższonej ekspresji wspomnianego białka. Wybrałam ten model komórkowy ze względu na obecność endogennego izoenzymu CYP3A4, chociaż o niskiej jego zawartości. Zastosowałam też linię HepG2 o podwyższonej ekspresji CYP3A4. Linię tę opracował D. Feierman [Feierman i wsp., 2002] i jej nazwa to Hep3A4. Poniżej przedstawiłam wyniki badań nad wpływem związku C-1311 na poziom i aktywność izoenzymu CYP3A4 w zależności od czasu inkubacji i stężenia pochodnej w komórkach HepG2 i Hep3A4. 5.3.1 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na poziom białka CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4 a. Wpływ związku C-1311 na poziom izoenzymu CYP3A4 w zależności od czasu inkubacji Rysunek 38 Zależny od czasu wpływ pochodnej C-1311 na poziom izoenzymu CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4 traktowanych związkiem (IC50 1,5 μm) przez podane czasy. K oznacza próbkę kontrolną, czyli komórki nietraktowane pochodną. Wynik jest reprezentatywny dla trzech wykonanych doświadczeń.

Wyniki 115 W komórkach linii HepG2 i Hep3A4 pod wpływem działania związku C-1311 nie dochodziło do zmiany poziomu białka CYP3A4 zależnie od czasu inkubacji (Rysunek 38). Zatem pochodna imidazoakrydonu nie oddziałuje na wewnątrzkomórkowy poziom tego enzymu. Wynik jest analogiczny jak ten, uzyskany dla komórek CHO-HR-3A4 (Rysunek 34). b. Wpływ związku C-1311 na poziom izoenzymu CYP3A4 w zależności od jego stężenia Wpływ pochodnej imidazoakrydonu C-1311 na wewnątrzkomórkowy poziom białka CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4 określiłam także w zależności od stężenia związku (Rysunek 39). HepG2 CYP3A4 β-aktyna Hep3A4 CYP3A4 β-aktyna K 1 5 10 25 50 100 Stężenie związku C-1311 [µm] Rysunek 39 Zależny od stężenia wpływ pochodnej C-1311 na poziom izoenzymu CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4 traktowanych związkiem o różnych stężeniu przez 24 godziny. K oznacza próbkę kontrolną, czyli komórki nietraktowane związkiem. Wynik jest reprezentatywny dla dwóch wykonanych doświadczeń. Wyniki analizy wpływu różnego stężenia pochodnej imidazoakrydonu C-1311 na poziom białka CYP3A4 w ludzkich komórkach nowotworu wątroby, HepG2 i Hep3A4 wykazały, że związek nie zmienia poziomu białka, nawet przy wysokich dawkach pochodnej. Podsumowując, bez względu na czas inkubacji i stężenie pochodnej imidazoakrydonu C-1311 związek nie wpływał na wewnątrzkomórkowy poziom izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w komórkach HepG2 o normalnej i podwyższonej ekspresji enzymu CYP3A4. 5.3.2 Badanie wpływu pochodnej C-1311 na aktywność białka CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4 Aktywność izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w komórkach HepG2 i Hep3A4 mierzyłam analogiczną metodą jak dla komórek CHO-HR-3A4 badając stopień przemiany testosteronu z zastosowaniem analizy RP-HPLC. Wpływ pochodnej C-1311 na aktywność białka CYP3A4 przeprowadziłam w zależności od czasu inkubacji oraz stężenia związku.

Wyniki 116 a. Wpływ związku C-1311 na aktywność izoenzymu CYP3A4 w zależności od czasu inkubacji Wyniki badania HPLC aktywności białka CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4 w zależności od czasu inkubacji z pochodną C-1311 o stężeniu 1,5 µm (dawka IC 50) przedstawia Rysunek 40. Aktywność CYP3A4 względem kontroli [%] 160 140 120 100 80 60 40 20 0 * * * ** * ** *** *** HepG2 Hep3A4 *** *** *** *** *** *** K 3 6 12 24 48 72 96 120 144 Czas inkubacji [godz.] Rysunek 40 Zależny od czasu inkubacji wpływ pochodnej C-1311 na aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4 traktowanych związkiem (1,5 μm) przez podane czasy. K oznacza próbkę kontrolną, czyli komórki nietraktowane związkiem. Wynik jest średnią z 3 wykonanych doświadczeń. * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001 statystycznie istotne różnice między daną próbą a kontrolą. Badanie aktywności izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w ludzkich komórkach nowotworowych wątroby o normalnym i podwyższonym poziomie izoenzymu CYP3A4 wykazała nieznaczne różnice w aktywności enzymatycznej białka pomiędzy dwoma badanymi liniami komórkowych poddanych działaniu pochodnej C-1311. W komórkach linii dzikiej, HepG2 podczas pierwszych godzin ekspozycji komórek na badany związek dochodziło do wzrostu aktywności izoenzymu CYP3A4 (6 i 12 godzin inkubacji) do poziomu około 130% (różnice statystycznie istotne). W tym samym czasie w komórkach rekombinantowych Hep3A4 stopień przemiany testosteronu był na podobnym poziomie jak w komórkach nietraktowanych związkiem. Po dłuższych czasach inkubacji w obu badanych liniach komórkowych dochodziło do inhibicji aktywności enzymatycznej białka CYP3A4, jednakże spadek ten następował szybciej w komórkach Hep3A4. Po 24 godzinach inkubacji aktywność CYP3A4 w komórkach Hep3A4 wynosiła 71%. Analogiczny stopień przemiany testosteronu w komórkach HepG2 obserwowany był po 48 godzinach. W kolejnych dobach ekspozycji komórek na działanie pochodnej C-1311 związek powodował dalszą inhibicję enzymu, a proces ten zachodził w podobnym stopniu w komórkach obu linii. Dopiero dla dłuższych czasach inkubacji, jak 120 i 144 godziny zahamowanie aktywności enzymatycznej było nieco silniejsze w komórkach Hep3A4 i wynosiło 89%. Podsumowując, w komórkach HepG2 o niezmienionym poziomie izoenzymu CYP3A4 dochodziło do przejściowej indukcji aktywności badanego białka w pierwszych godzinach ekspozycji na związek. Po dłuższych czasach inkubacji w komórkach obu linii komórkowych, HepG2 i Hep3A4 następowała inhibicja enzymatyczna białka CYP3A4, która nasilała się wraz ze wzrostem czasu traktowania komórek chemoterapeutykiem.

Wyniki 117 b. Wpływ związku C-1311 na aktywność izoenzymu CYP3A4 w zależności od jego stężenia Wpływ pochodnej imidazoakrydonu C-1311 na aktywność enzymatyczną izoenzymu CYP3A4 w ludzkich komórkach nowotworowych wątroby oznaczyłam także w zależności od stężenia C-1311. Dawki pochodnej, jakim poddałam komórki HepG2 o normalnym i podwyższonym poziomie CYP3A4, były podobne jak przy oznaczaniu wpływu związku na poziom białka, czyli: 1, 5, 10, 25, 50 i 100 µm. Komórki traktowałam C-1311 przez 24 godziny, a następnie określiłam stopień przemiany testosteronu do pochodnej 6-hydroksylowej w oparciu o analizę RP-HPLC. W ludzkich komórkach nowotworu wątroby HepG2 o normalnym i podwyższonym poziomie izoenzymu CYP3A4 rosnące stężenie pochodnej C-1311 powodowało spadek aktywności białka CYP3A4 (Rysunek 41). Istotna zmiana w aktywności białka obserwowana była przy traktowaniu komórek związkiem o stężeniu 25 µm dla komórek linii HepG2 oraz już przy 1 µm dla Hep3A4. 100 µm stężenie C-1311 powodowało inhibicję CYP3A4 aż w 78% i 94% odpowiednio dla komórek linii o normalnej i podwyższonej ekspresji badanego białka. Zatem pochodna C-1311 indukowała zmiany w stopniu przemiany testosteronu dużo silniej i szybciej dla komórek Hep3A4. Aktywność CYP3A4 względem kontroli [%] 120 100 80 60 40 20 0 * ** *** * *** ** *** HepG2 Hep3A4 ** *** K 1 5 10 25 50 100 Stężenie C-1311 [μm] Rysunek 41 Zależny od stężenia pochodnej C-1311 wpływ związku na aktywność izoenzymu CYP3A4 w komórkach HepG2 i Hep3A4 traktowanych związkiem (24 godziny) o podanych stężeniach. K oznacza próbkę kontrolną, czyli komórki nietraktowane związkiem. Wynik jest reprezentatywny dla trzech niezależnych doświadczeń. * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001 statystycznie istotne różnice między daną próbą a kontrolą. Podsumowując, związek C-1311 powodował inhibicję enzymu CYP3A4 w ludzkich komórkach nowotworu wątroby HepG2 i Hep3A4 w zależności od wzrastającego stężenia pochodnej imidazoakrydonu. Ponownie, jest to wynik analogiczny, jak ten uzyskany w komórkach linii CHO-HR-3A4. Zatem bez względu na zastosowany model komórkowy wykazałam, że pochodna C-1311 nie zmieniała wewnątrzkomórkowego poziomu izoenzymu CYP3A4, ale prowadziła do inhibicji jego aktywności katalitycznej w miarę wzrostu czasu ekspozycji komórek na związek i jego stężenie.

Wyniki 118 5.4 Badanie metabolizmu i odpowiedzi biologicznej w komórkach KB-3 traktowanych pochodnymi C-1305 oraz C-1311 Najnowsze badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że pochodne triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 ulegają metabolicznej transformacji pod wpływem monooksygenazy flawinowej, FMO głównie typu 1 i 3 [Fedejko-Kap i wsp., 2011; Potęga i wsp., 2011], jak również są substratem dla UDP-glukuronylotransferaz, UGT. Forma UGT, która w największym stopniu odpowiada za biotransformację badanych związków, to izoenzym UGT1A10 [Fedejko-Kap i wsp., 2012]. W związku z dużym zainteresowaniem naukowców rolą w metabolizmie i funkcjonowaniu komórki enzymów z rodziny UGT, kolejnym celem badawczym mojej rozprawy doktorskiej było określenie roli izoenzymu UGT1A10 w szlakach metabolicznych pochodnych C-1305 i C-1311 oraz jego wpływu na aktywację bądź detoksykację badanych związków i wynikającą z tego odpowiedzią biologiczną traktowanych związkami komórek nowotworowych. UDP-glukuronylotransferazy należą do enzymów II fazy metabolizmu leków. Odpowiadają za detoksykacyjny metabolizm związków. Enzymy UGT przyłączają do grup funkcyjnych związków cząsteczkę kwasu glukuronowego, przez co związek staje się bardziej polarny i może być łatwiej usunięty z wnętrza komórki, a także organizmu. Glukuronidy zwykle nie wykazują aktywności cytotoksycznej, jaką przypisuje się związkom wyjściowym. Istnieją jednak sytuacje, kiedy glukuronidacja prowadzi do zwiększenia toksyczności danego związku. Tak jest w przypadku morfiny i niektórych estrogenów [Fedejko i Mazerska, 2011]. Najłatwiejszym sposobem określenia cytoksyczności metabolitu jest bezpośrednia inkubacja komórek z tą pochodną. W przypadku formy glukuronowej leku takiego badania nie można wykonać, gdyż polarne związki, do jakich należą glukuronidy, nie są w stanie przejść przez błonę komórkową i dotrzeć do wnętrza komórki. Zatem jedyną skuteczną metodą w badaniach aktywności cytotoksycznej takich związków jest wewnątrzkomórkowe osiągnięcie podwyższonej ekspresji enzymu, który za dany szlak metaboliczny odpowiada. W literaturze brak jest danych na temat istniejącego modelu ludzkich komórek nowotworowych wykazujących niską bądź wysoką ekspresję izoenzymu UGT1A10. Stworzenie linii komórkowych o stałej nadekspresji wybranych enzymów metabolizujących jest zadaniem trudnym i czasochłonnym, stąd dostęp do rekombinantowych linii komórkowych jest ograniczony. Aby móc badać rolę UGT1A10 w metabolizmie pochodnych C-1305 i C-1311 wykorzystałam technikę przejściowej transfekcji komórek z zastosowaniem elektroporacji, dzięki której do wnętrza komórek mogłam wprowadzić plazmidy kodujące wybrane enzymy i w ten sposób uzyskać ich podwyższoną ekspresję.

Wyniki 119 Transfekcji poddałam ludzkie komórki nowotworu szyjki macicy, KB-3. Komórki te są subklonem popularnej linii komórkowej, HeLa. Komórki linii KB-3 w porównaniu do linii wyjściowej charakteryzują się większa opornością na często stosowane w chemioterapii leki przeciwnowotworowe, zwłaszcza winkrystynę, stąd linia ta jest przydatna w badaniach odpowiedzi komórkowej i nie tylko. Co istotne, komórki KB-3 łatwo ulegają transfekcji, a naturalny, wewnątrzkomórkowy poziom enzymów metabolizujących jest bardzo niski. Omawiane komórki poddałam transfekcji plazmidami kodującymi UDP-glukuronylotransferazę UGT1A10, jak również izoenzym CYP3A4 cytochromu P450. Warunki elektroporacji i wydajność transfekcji określiłam wprowadzając do komórek plazmid kodujący białko GFP (ang. green fluorescent protein), dzięki czemu w łatwy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej mogłam sprawdzić, czy wprowadzany plazmid ulega ekspresji (zielona barwa komórek), a przyjęte warunki elektroporacji są korzystne dla komórki. Poziom ekspresji porównywałam z tym uzyskanym dla komórek kontrolnych poddanych transfekcji pustym wektorem, plazmidem pcdna3.1 niekodującym żadnego białka oraz plazmidem niosącym gen ugt2b4 (dla komórek o nadekspresji UGT1A10) lub cpr (dla komórek o nadekspresji CYP3A4), które nie biorą udziału w biotransformacji pochodnych C-1305 i C-1311. Zastosowanie powyższych kontroli miało na celu wykluczenie wpływu samej elektroporacji i transfekcji na odpowiedź biologiczną badanych komórek KB-3. Poniżej przedstawiłam wyniki badania odpowiedzi biologicznej i metabolizmu w komórkach KB-3 typu dzikiego i przejściowo transfekowanych, a następnie traktowanych pochodnymi C-1305 i C-1311. 5.4.1 Transfekcja komórek KB-3 określenie ekspresji białka GFP Rysunek 42 Zdjęcia komórek KB-3 poddanych transfekcji białkiem GFP (ang. green fluorescent protein) wykonane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w zakresie światła niebieskiego (lewe zdjęcie) i mikroskopu świetlnego (prawe zdjęcie) po wskazanym czasie od elektroporacji. Powiększenie 400x. Transfekcji poddano jednorazowo 6 mln komórek wprowadzając 5 µg plazmidu/400 µl zawiesiny komórkowej. Warunki elektroporacji: 160V, długość impulsu 20 ms. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla trzech wykonanych doświadczeń. Na powyższych zdjęciach (Rysunek 42) wyraźnie widać, że w większości komórek KB-3 poddanych transfekcji plazmidem kodującym gfp dochodziło do ekspresji białka zielonej

Wyniki 120 fluorescencji. Wydajność transfekcji w pierwszej dobie po transfekcji wynosiła około 70 80%. Po 96 godzinach od elektroporacji, czyli po maksymalnym czasie, dla którego wykonywałam doświadczenia na komórkach KB-3 w dalszej części badań, liczba komórek o zielonej fluorescencji białka GFP utrzymywała się na podobnym poziomie, choć intensywność zielonej fluorescencji nieco zmalała. Podsumowując, opracowane warunki elektroporacji pozwoliły na osiągnięcie wydajnej, jak również łagodnej dla komórek transfekcji. 5.4.2 Transfekcja komórek KB-3 określenie poziomu mrna kodującego białka UGT1A10 i UGT2B4 Sprawdzenie ekspresji białka GFP jest szybkim i prostym sposobem określenia, czy dane komórki ulegają transfekcji i w jakim stopniu może w nich dochodzić do ekspresji dodatkowo wprowadzanego białka. Jest to jednak metoda, która nie daje jasnej odpowiedzi, czy każde wprowadzane białko będzie ulegało ekspresji. Stąd wydajność transfekcji komórek KB-3 sprawdziłam również określając poziom mrna badanego białka UGT1A10 i zastosowanego względem niego białka kontrolnego, UGT2B4, które, w przeciwieństwie do izoformy 1A10, nie bierze udziału w metabolizmie związków C-1305 i C-1311. Poziom mrna białek UGT1A10 i UGT2B4 określiłam w komórkach KB-3 poddanych transfekcji plazmidami kodującymi wspomniane enzymy 24 godziny po elektroporacji. Wyizolowane mrna zostało przepisane na cdna za pomocą odwrotnej transkryptazy, a następnie stosując odpowiednio zaprojektowane startery został określony poziom cdna genów ugt1a10 i ugt2b4 metodą łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym, Real- Time PCR. Wzrost poziomu ekspresji białek UGT1A10 i UGT2B4 obliczyłam stosując metodę porównawczą 2 -ΔΔCt [Livak i Schmittgen, 2000] względem genu referencyjnego GADPH. Tabela 18 Względny wzrost poziomu mrna kodującego białka UGT1A10 i UGT2B4 w komórkach KB-3 poddanych transfekcji wspomnianymi enzymami względem komórek KB-3 typu dzikiego poddanych jedynie procesowi elektroporacji 24 godziny po transfekcji. Gen Względny wzrost poziomu mrna ugt1a10 920 ± 474 ugt2b4 1024 ± 297 Tabela przedstawia wartości ± odchylenie standardowe. Komórki KB-3 (12 mln) poddano transfekcji plazmidami (5 μg DNA/400 μl zawiesiny komórkowej) kodującymi geny białek UGT1A10 i UGT2B4 za pomocą elektroporacji (warunki: 160 V, impuls 20 ms). Uzyskany wynik pochodzi z dwóch niezależnych doświadczeń, w których poziom ekspresji poszczególnych genów mierzony był dwukrotnie. W komórkach KB-3 poddanych transfekcji plazmidami kodującymi enzymy UGT1A10 i UGT2B4 dochodziło do znaczącego wzrostu poziomu mrna tychże białek (Tabela 18). Ilość

Wyniki 121 mrna kodującego UGT1A10 była 920 razy większa, zaś UGT2B4 około 1020 razy większa niż w komórkach KB-3 typu dzikiego. Nawet jeśli całe mrna nie ulegało przepisaniu na łańcuch aminokwasów, można się spodziewać, że w transfekowanych komórkach KB-3 poziom białek UGT1A10 i UGT2B4 był bardzo wysoki. Duże wartości odchyleń są spowodowane faktem, iż każda z transfekcji nie zachodziła z identyczną wydajnością, jednak wystarczającą do uzyskania wysokiej nadekspresji badanych białek UGT. 5.4.3 Metabolizm pochodnych C-1305 i C-1311 w komórkach KB-3 Kolejnym etapem badań prowadzonych na komórkach linii KB-3 było określenie metabolizmu pochodnych triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 w komórkach nowotworowych szyjki macicy o normalnym i podwyższonym poziomie enzymu UGT1A10 i CYP3A4. Biotransformację związków zbadałam również w komórkach kontrolnych, o nadekspresji izoenzymu UGT2B4 lub reduktazy cytochromu P450 (CPR) oraz poddanych transfekcji wektorem pustym w celu sprawdzenia wpływu procesu elektroporacji i transfekcji na zdolność przemian metabolicznych komórek KB-3. Komórki traktowałam badanymi związkami w stężeniu 30 μm i inkubowałam z C-1305 lub C-1311 od 24 do 72 godzin. Analizie z zastosowaniem techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej, HPLC poddawałam przygotowywane z komórek metanolowe ekstrakty oraz pożywkę hodowlaną pozostałą po inkubacji komórek z chemoterapeutykami. Otrzymane ekstrakty metanolowe zbadałam również techniką spektrometrii mas, ESI-MS w celu określenia struktury metabolitów badanych pochodnych C-1305 i C-1311. a. Przemiany metaboliczne pochodnej triazoloakrydonu C-1305 w komórkach KB-3 Chromatogramy uzyskane z analizy HPLC metanolowych lizatów komórek KB-3 typu dzikiego, z nadekspresją UGT1A10 oraz UGT2B4 przedstawiłam na Rysunku 43. Wyników analizy biotransformacji C-1305 w komórkach transfekowanych plazmidami kodującymi enzymy CYP3A4, CPR (które nie biorą udziału w metabolizmie omawianych pochodnych) i wektorem pustym pcdna3.1 nie zamieszczałam ze względu na brak różnic względem komórek KB-3 WT. Badanie przemian metabolicznych pochodnej triazoloakrydonu C-1305 w komórkach KB-3 wykazało, że w komórkach typu dzikiego oraz komórkach kontrolnych KB-3 UGT2B4 obserwowany był zasadniczo związek wyjściowy w okolicy 18 minuty czasu retencji. Widoczny nierozdzielony pik tuż za substratem mógł należeć do sprotonowanej formy związku C-1305. Czas jego retencji może również sugerować, że był to N-tlenek C-1305 [Fedejko-Kap i wsp., 2011]. Chromatogramy z analizy przemian metabolicznych zachodzących w komórkach KB-3 z przejściową nadekspresją izoenzymu UGT1A10 pokazały, że we wnętrzu komórek

Wyniki 122 i w pożywce hodowlanej znajdowały się trzy związki. Pierwszy widoczny na chromatogramie w okolicy 14 minuty czasu retencji to prawdopodobnie glukuronid pochodnej C-1305, drugi w okolicy 18 minuty to związek wyjściowy, zaś trzeci to obecny również w dzikich komórkach nieidentyfikowany związek. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji stężenie glukuronidu wzrastało, zarówno w lizatach komórkowych, jak i w pożywce. Poziom konwersji związku C-1305 do formy z kwasem glukuronowym po 72 godzinach ekspozycji na związek wynosił około 4,5% we wnętrzu komórek, zaś w pożywce około 57% (Tabela 19). A Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g B Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] Czas retencji [min] D KB-3 UGT1A10 72 g 15 KB-3 UGT1A10 72 48 g 15 KB-3 UGT1A10 48 24 g 12,5 C KB-3 UGT1A10 WT 24 g 24 g 12,5 KB-3 WT 24 g 25 G S 72 g 10 G 10 S 48 g 20 7,5 24 g 15 7,5 5 10 5 5 2,5 2,5 0 0 10 15 20 25 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 10 15 20 Czas retencji [min] 25 Rysunek 43 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1305 Czas w retencji komórkach [min] linii: KB-3 WT typu dzikiego (A), KB-3 UGT2B4 (B) oraz UGT1A10 w: lizatach komórkowych (C) i pożywce (D) przy długości fali 420 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1305, G glukuronid pochodnej triazoloakrydonu. Przedstawione chromatogramy są reprezentatywne dla trzech wykonanych doświadczeń. Absorpcja [mau] Tabela 19 Stopień przemiany triazoloakrydonu C-1305 o stężeniu 30 µm do pochodnej glukuronowej zachodzącej w komórkach KB-3 przejściowo transfekowanych izoenzymem UGT1A10. Absorpcja [mau] Absorpcja [mau] Czas inkubacji [godz.] Lizaty komórkowe Stopień przemiany związku Pożywka hodowlana 24 2,51 ± 0,03 40,07 ± 10,44 48 3,13 ± 0,35 47,17 ± 07,55 72 4,27 ± 0,60 56,05 ± 12,72 Metabolizm związku został sprawdzony po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji komórek z C-1305. Ilość powstającego glukuronidu C-1305 została określona w lizacie komórkowym i pożywce hodowlanej. Wartości przedstawione w tabeli to średnia ± odchylenie standardowe oznaczone na podstawie 3 niezależnych doświadczeń.

Wyniki 123 b. Przemiany metaboliczne pochodnej imidazoakrydonu C-1311 w komórkach KB-3 Przemiany metaboliczne C-1311 śledziłam w komórkach KB-3 typu dzikiego, z nadekspresją UGT1A10, UGT2B4, CYP3A4, CPR i poddanych transfekcji wektorem pustym. A Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g B Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] Czas retencji [min] C Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 G S 72 g 48 g 24 g D Absorpcja [mau] 15 12,5 10 7,5 5 2,5 G S KB-3 UGT1A10 72 g KB-3 UGT1A10 48 g KB-3 UGT1A10 24 g KB-3 WT 24 g 0 10 15 20 25 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] Czas retencji [min] Rysunek 44 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1311 w komórkach linii: KB-3 WT typu dzikiego (A), KB-3 UGT2B4 (B) oraz UGT1A10 w: lizatach komórkowych (C) i pożywce (D) przy długości fali 420 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1311, G glukuronid pochodnej imidazoakrydonu. Przedstawione chromatogramy są reprezentatywne dla trzech wykonanych doświadczeń. Tabela 20 Stopień przemiany imidazoakrydonu C-1311 o stężeniu 30 µm do pochodnej glukuronowej zachodzącej w komórkach KB-3 przejściowo transfekowanych izoenzymem UGT1A10. Czas inkubacji [godz.] Lizaty komórkowe Stopień przemiany związku Pożywka hodowlana 24 0,52 ± 0,21 27,26 ± 11,02 48 1,36 ± 0,48 34,64 ± 07,45 72 2,25 ± 0,57 43,58 ± 09,90 Metabolizm związku został sprawdzony po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji komórek z C-1311. Ilość powstającego glukuronidu C-1311 została określona w lizacie komórkowym i pożywce hodowlanej. Wartości przedstawione w tabeli to średnia ± odchylenie standardowe oznaczone na podstawie 3 niezależnych doświadczeń. Analiza przemian metabolicznych (Rysunek 44) pochodnej C-1311 w komórkach KB-3 WT oraz kontrolnych, KB-3 UGT2B4 wykazała, że w lizatach komórkowych obecny był głownie

Wyniki 124 związek wyjściowy widoczny w okolicach 15,5 minuty czasu retencji oraz metabolity o bardzo niskim stężeniu jeden przed substratem i kilka za. Podobny wynik uzyskałam dla komórek KB-3 o przejściowej nadekspresji CYP3A4 i CPR (dane nie przedstawione). Zatem badana pochodna akrydonu ulegała niewielkim przemianom metabolicznym w tych komórkach. Z kolei w komórkach KB-3 UGT1A10 podwyższony poziom izoenzymu UGT1A10 dodatkowo skutkował tworzeniem się glukuronidu pochodnej C-1311 widocznego na chromatogramach około 12,5 minuty czasu retencji w analizie lizatów komórkowych i pożywki hodowlanej. Podobnie jak dla związku C-1305, wraz ze wzrostem czasu inkubacji ilość glukuronidu C-1311 rosła i po 72 godzinach wynosiła ona: w lizatach komórkowych około 2,5%, zaś w pożywce około 45% (Tabela 20). c. Określenie struktury metabolitów związków C-1305 i C-1311 otrzymanych w analizie metabolizmu zachodzącego w komórkach KB-3 UGT1A10 W celu weryfikacji, czy obserwowany w komórkach KB-3 o przejściowej nadekspresji izoenzymu UGT1A10 metabolit jest formą glukuronową związków C-1305 i C-1311, otrzymane lizaty komórkowe zostały poddane analizie spektrometrii mas. Jon masowy (Rysunek 45) otrzymany z analizy próbki biotransformacji związku C-1305 w komórkach KB-3 UGT1A10 o m/z 514,1 (S+176+1) wskazał, że metabolit ten powstawał poprzez sprzężenie związku C-1305 (M=337 g/mol) z resztą kwasu glukuronowego (M=176=194-18), prawdopodobnie na atomie tlenu grupy hydroksylowej, jak to pokazały wcześniejsze badania przeprowadzone w naszym zespole. Również jon masowy otrzymany z analizy metabolitu C-1311 wskazywał, że była to pochodna glukuronowa: S+176+1, gdzie S=M C-1311=350. C-1305 C-1311 Intensywność [%] Intensity [%] 100 80 60 40 20 0 100 200 300 400 500 600 700 800 m/z 514.1 515.1 516.9 Intensywność [%] Intensity [%] 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Rysunek 45 Widma masowe metabolitów związków C-1305 i C-1311 uzyskane z analizy spektrometrii mas lizatów komórkowych z komórek KB-3 o przejściowej ekspresji UGT1A10. 100 80 60 40 20 m/z 527.2 528.1 529.2 Widma masowe potwierdziły zatem, że obserwowane na chromatogramach metabolity związków C-1305 i C-1311, były ich glukuronidami.

Wyniki 125 5.4.4 Określenie dawki efektywnej pochodnych C-1305 i C-1311 wobec ludzkich komórek raka szyjki macicy, KB-3 Pierwszym etapem badania wpływu testowanych związków na odpowiedź komórkową było wyznaczenie jego biologicznie efektywnej dawki. Wartość stężenia, jaką określiłam z zależności ilości żywych komórek od logarytmu stężenia związku to IC 50. Jest to dawka związku, przy którym dochodzi do zahamowania proliferacji komórek w 50% w stosunku do komórek nietraktowanych związkiem. Efektywne stężenia pochodnych C-1305 i C-1311 wyznaczałam metodą MTT. Doświadczenie przeprowadziłam dla komórek linii dzikiej, KB-3 WT oraz poddanych przejściowej transfekcji plazmidami kodującymi enzymy: UGT1A10, UGT2B4, CYP3A4 i CPR oraz wektorem pustym, pcdna3.1. Doświadczenie wykonałam dla obu badanych związków minimum trzykrotnie. Poniżej zamieściłam wykresy zależności ilości żywych komórek od stężenia związku, a w tabelach obliczone wartości IC 50 dla każdej z linii. a. Komórki typu dzikiego, KB-3 WT Stężenia pochodnych C-1305 i C-1311 powodujące zahamowanie wzrostu komórek KB-3 w 50% wynosiły odpowiednio 0,260 µm oraz 0,112 µm (Tabela 21). Tabela 21 Wartość IC50 obliczona dla komórek KB-3 typu dzikiego traktowanych związkami C-1305 lub C-1311. Stężenie C-1305 C-1311 IC 50 [µm] 0,263 ± 0,016 0,106 ± 0,015 Wartości przedstawione w tabeli to średnia ± odchylenie standardowe wyznaczone na podstawie trzech niezależnych doświadczeń. Proliferacja komórki KB-3 była zatem silnie hamowana przez działanie pochodnych triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311. Dla porównania, komórki raka szyjki macicy były mniej wrażliwe na działanie badanych związków niż komórki linii CHO (doświadczenie wykonane inną metodą, Tabela 6, Rysunek 3), ale dużo bardziej wrażliwe niż komórki nowotworu wątroby, HepG2 (ta sama metoda, rozdział 5.3.1). Do kolejnych doświadczeń przeprowadzonych na komórkach linii KB-3 wybrałam stężenia odpowiadające wartości 30 x IC 50., w przybliżeniu odpowiadające dawce IC 90. W następnych doświadczeniach stosowałam dawki związków C-1305 i C-1311 o stężeniach odpowiednio 8 µm i 3 µm. b. Komórki KB-3 z nadekspresją CYP3A4 Krzywe zahamowania wzrostu wyznaczone dla komórek o przejściowej nadekspresji izoenzymu CYP3A4 (KB-3 CYP3A4) i kontrolnych, transfekowanych plazmidem z reduktazą

Wyniki 126 cytochromu P450 (KB-3 CPR) w porównaniu do komórek KB-3 typu dzikiego (KB-3 WT) przedstawiłam na Rysunku 46. Wyniki pokazały, że nadekspresja izoenzymu CYP3A4 i reduktazy cytochromu P450 (CPR) nie wpłynęła na zmianę wrażliwości ludzkich komórek nowotworu szyjki macicy, KB-3 na oba badane związki pochodną C-1305 i C-1311. Obliczone wartości IC 50 dla danego związku wobec poszczególnych typów komórek były bardzo zbliżone (Tabela 22). Liczba komórek vs kontrola [%] 100 80 60 40 20 KB-3 WT KB-3 CPR KB-3 CYP3A4 0-2 -1 0 1 Liczba komórek vs kontrola [%] 100 KB-3 WT 80 60 40 20 KB-3 CPR KB-3 CYP3A4 0-2 -1 0 1 Log(stezenie C-1305) [M] Log(stezenie C-1311) [M] Rysunek 46 Zależny od dawki wpływ pochodnych C-1305 oraz C-1311 na proliferację komórek KB-3 typu dzikiego (KB-3 WT) oraz z nadekspresją CYP3A4 i CPR wyrażony jako procent żywych komórek traktowanych testowanymi związkami w stosunku do komórek kontrolnych nietraktowanych związkiem. Wykresy zostały wykonane w programie Graph Pad Prism na podstawie trzech niezależnych doświadczeń. Tabela 22 Wartość IC50 obliczona dla komórek linii KB-3 typu dzikiego oraz z nadekspresją izoenzymu CYP3A4 i reduktazy cytochromu P450 traktowanych pochodnymi C-1305 lub C-1311. Linia komórkowa Stężenie IC 50 [µm] C-1305 C-1311 KB-3 WT 0,263 ± 0,016 0,106 ± 0,015 KB-3 CYP3A4 0,259 ± 0,007 0,101 ± 0,006 KB-3 CPR 0,291 ± 0,008 0,107 ± 0,004 Wartości przedstawione w tabeli to średnia ± odchylenie standardowe wyznaczone na podstawie 3 niezależnych doświadczeń. Różnice między obliczonymi wartościami IC50 dla danego typu komórek w obrębie jednego związku są statystycznie nieistotne. c. Komórki KB-3 z nadekspresją UGT1A10 Wrażliwość na pochodne C-1305 i C-1311 komórek KB-3, w których za pomocą przejściowej transfekcji została osiągnięta nadekspresja izoenzymu UGT1A10, różniła się od wrażliwości komórek KB-3 typu dzikiego (Rysunek 47, Tabela 23). Cytotoksyczność C-1305 wobec komórek linii KB-3 UGT1A10 była zdecydowanie niższa niż dla komórek KB-3 WT IC 50 wynosiło odpowiednio 0,180 µm i 0,263 µm. Zatem wyższy poziom izoenzymu UGT1A10 podwyższył cytotoksyczne działanie pochodnej triazoloakrydonu C-1305.

Wyniki 127 Przeciwny efekt do powyższego obserwowany był dla pochodnej imidazoakrydonu C-1311. Komórki z nadekspresją izoenzymu UGT1A10 były mniej wrażliwe na ekspozycję badanym związkiem niż komórki typu dzikiego. Wartości IC 50 dla komórek KB-3 UGT1A10 i KB-3 WT wynosiły odpowiednio 0,131 µm i 0,106 µm (różnica statystycznie istotna). Liczba komórek vs kontrola [%] 100 80 60 40 20 KB-3 WT KB-3 UGT1A10 KB-3 UGT2B4 KB-3 EV 0-2 -1 0 1 Liczba komórek vs kontrola [%] 100 KB-3 WT 80 60 40 20 KB-3 UGT1A10 KB-3 UGT2B4 KB-3 EV 0-2 -1 0 1 Log(stezenie C-1305) [M] Log(stezenieC-1311) [M] Rysunek 47 Zależny od dawki wpływ pochodnych C-1305 oraz C-1311 na proliferację komórek KB-3 typu dzikiego (KB-3 WT), z nadekspresją UGT1A10 i UGT2B4 oraz transfekowanych wektorem pustym (KB-3 EV) wyrażony jako procent żywych komórek traktowanych testowanymi związkami w stosunku do komórek kontrolnych nietraktowanych związkiem. Wynik jest reprezentatywny dla ośmiu doświadczeń przypadku związku C-1305 i pięciu dla C-1311. Wykresy zostały wykonane w programie Graph Pad Prism. Tabela 23 Wartość IC50 obliczona dla komórek linii KB-3 typu dzikiego (KB-3 WT) oraz z nadekspresją izoenzymu UGT1A10 i UGT2B4 oraz transfekowanych wektorem pustym (KB-3 EV) traktowanych pochodnymi C-1305 lub C-1311. Linia komórkowa Stężenie IC 50 [µm] C-1305 C-1311 KB-3 WT 0,263 ± 0,016 0,106 ± 0,014 KB-3 UGT1A10 0,180 ± 0,014 a** b** c** 0,131 ± 0,008 a* c* KB-3 UGT2B4 0,260 ± 0,020 0,113 ± 0,018 KB-3 EV 0,261 ± 0,028 0,102 ± 0,008 Wartości IC50 przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie minimum pięciu niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t-studenta. a statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii KB-3 WT; b statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii KB-3 UGT2B4, c statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek KB-3 EV, gdzie * P < 0,05, ** P < 0,001. Co ważne, transfekcja komórek KB-3 genem innego enzymu UDP-glukuronylotransferazy, UGT2B4, który nie bierze udziału w metabolizmie obu związków, nie wpłynęła na odpowiedź komórek KB-3 inkubowanych z C-1305 i C-1311. Pozostała ona na tym samym poziomie, co komórek typu dzikiego. Podobnie, wprowadzenie do komórek pustego wektora niekodującego żadnego białka nie zmieniło cytotoksyczności związków.

Wyniki 128 5.4.5 Analiza dystrybucji komórek KB-3 w cyklu życiowym Badanie dystrybucji komórek w cyklu życiowym pozwala na wstępne określenie biochemicznego mechanizmu działania związków cytotoksycznych. Daje również możliwość wstępnego określenia stopnia degradacji DNA (frakcja sub-g 1) przez stosowany związek. Doświadczenie przeprowadziłam dla dwóch typów ludzkich komórek nowotworowych szyjki macicy, KB-3 traktowanych pochodnymi C-1305 i C-1311 w stężeniu 30 x IC 50. Analizie poddałam komórki typu dzikiego (KB-3 WT) oraz o podwyższonej ekspresji izoenzymu UGT1A10 (KB-3 UGT1A10), wobec których obserwowałam różnice w cytotoksyczności. Czasy inkubacji komórek ze związkami to: 24, 48 i 72 godziny. a. Komórki KB-3 typu dzikiego, KB-3 WT Rysunek 48 Histogramy obrazujące zmiany w dystrybucji komórek KB-3 WT w cyklu życiowym, inkubowanych z pochodnymi C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm) przez podaną liczbę godzin. Oś X intensywność fluorescencji jodku propidyny określającego zawartość DNA w komórce. Oś Y ilość komórek. Przedstawione histogramy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Uzyskane na podstawie przeprowadzonych doświadczeń wyniki pokazały, że obie pochodne, C-1305 i C-1311 oddziaływały na progresję cyklu życiowego komórek linii KB-3 typu dzikiego w nieco odmienny sposób (Rysunek 48). Związek C-1305 powodował przejściową akumulację komórek w fazie S (po 24 godzinach inkubacji), a następnie blok cyklu w fazie G 2/M. Wzrostowi populacji komórek o 4n DNA towarzyszył spadek frakcji komórek będących w fazie G 1 oraz S cyklu życiowego. Po 72 godzinach inkubacji komórek będących w fazie G 2/M było nieco ponad 50% (Tabela 24). Jednocześnie, wraz ze wzrostem czasu inkubacji rosła frakcja komórek sub-g 1, której wielkość po 72 godzinach wynosiła prawie 20%. Z kolei związek C-1311 indukował słabszą akumulację komórek w fazie G 2/M, których liczba utrzymywała się na podobnym poziomie dla wszystkich czasów inkubacji i wynosiła około 30%. Pochodna imidazoakrydonu, w przeciwieństwie do triazoloakrydonu, powodowała blok cyklu komórkowego

Wyniki 129 w fazie S. Frakcja komórek, w której zachodziła synteza DNA, stanowiła 50% całej populacji komórek KB-3 po 24 i 48 godzinnej ekspozycji na związek. Wraz ze wzrostem czasu ekspozycji przybywało komórek ze zdegradowanym DNA (frakcji sub-g 1), której wielkość po 72 godzinach wynosiła 17%. Tabela 24 Procentowa zawartość komórek KB-3 WT w danej fazie cyklu życiowego po określonym czasie inkubacji z pochodną C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm). Sub-G 1 ± G 1 ± S ± G 2/M ± Poli ± Kontrola 3,41 2,40 49,62 1,70 14,41 2,13 19,15 7,06 5,12 1,87 C-1305 24 g 6,41 1,37 20,07 0,52 36,59 7,67 30,07 3,63 6,87 3,18 C-1305 48 g 13,22 0,42 10,70 2,28 11,95 3,13 44,97 11,11 9,18 3,46 C-1305 72 g 18,72 0,57 6,44 1,22 10,32 4,13 50,70 5,36 13,82 4,24 C-1311 24 g 4,16 0,27 8,96 0,44 49,59 8,41 26,89 2,31 10,40 10,01 C-1311 48 g 9,09 2,34 2,56 1,43 48,90 0,98 31,40 8,71 8,06 3,96 C-1311 72 g 16,89 0,98 4,93 0,97 37,96 2,79 30,96 5,35 9,26 2,07 Wartości przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie dwóch niezależnych eksperymentów. Poli oznacza populację komórek poliploidalnych. b. Komórki KB-3 z nadekspresją UGT1A10 Rysunek 49 Histogramy obrazujące zmiany w dystrybucji komórek KB-3 UGT1A10 w cyklu życiowym, inkubowanych z pochodnymi C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm) przez podaną liczbę godzin. Oś X intensywność fluorescencji jodku propidyny określającego zawartość DNA w komórce. Oś Y ilość komórek. Przedstawione histogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Analiza dystrybucji komórek linii KB-3 o podwyższonej ekspresji enzymu UGT1A10 wykazała, że obie pochodne C-1305 i C-1311 oddziaływały na progresję cyklu życiowego komórek w nieco odmienny sposób (Rysunek 49), podobnie jak miało to miejsce w przypadku

Wyniki 130 komórek KB-3 WT. Tym razem związek C-1305 nie powodował bloku cyklu życiowego komórek w fazie G 2/M, a jedynie nieznaczną akumulację. Frakcja ta wzrosła do około 32% po 72 godzinach inkubacji (Tabela 25). W miarę wzrostu czasu traktowania komórek KB-3 UGT1A10 pochodną C-1305 malały populacje komórek będących w fazie G 1 oraz S cyklu życiowego. Jednocześnie, wraz ze wzrostem czasu inkubacji silnie rosła frakcja komórek sub-g 1, której wielkość po 72 godzinach wynosiła około 37%. Populacja ta była zatem zdecydowanie większa niż dla komórek KB-3 WT. Tabela 25 Procentowa zawartość komórek KB-3 UGT1A10 w danej fazie cyklu życiowego po określonym czasie inkubacji z pochodną C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm). Sub-G 1 ± G 1 ± S ± G 2/M ± Poli ± Kontrola 6,27 2,19 44,98 3,42 7,69 0,57 21,74 3,05 21,02 3,49 C-1305 24 g 14,67 1,46 26,79 2,58 14,87 4,14 26,88 2,49 16,27 2,20 C-1305 48 g 23,09 4,75 19,54 1,02 13,25 1,45 32,48 4,62 11,32 0,21 C-1305 72 g 37,16 3,19 12,11 0,39 8,97 1,52 31,54 5,24 11,19 1,45 C-1311 24 g 12,77 0,73 26,68 3,15 21,72 0,80 22,03 1,51 16,65 2,51 C-1311 48 g 18,81 1,04 18,56 3,82 21,61 1,29 29,23 2,06 15,49 2,95 C-1311 72 g 22,44 3,94 7,13 2,97 23,51 6,44 42,79 4,21 10,13 1,55 Wartości przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie trzech niezależnych eksperymentów. Poli oznacza populację komórek poliploidalnych. Związek C-1311, w przeciwieństwie do wyżej opisanego C-1305, indukował akumulację komórek KB-3 o nadekspresji UGT1A10 w fazie G 2/M. Populacja komórek o 4n rosła wraz ze wzrostem czasu inkubacji i po 72 godzinach wynosiła prawie 43%. Pochodna imidazoakrydonu w komórkach KB-3 UGT1A10 nie powodowała bloku cyklu komórkowego w fazie S, jak miało to miejsce w przypadku komórek typu dzikiego, KB-3 WT. Frakcja komórek, w której zachodziła synteza DNA utrzymywała się przez wszystkie czasy inkubacji na podobnym poziomie około 20%. Wraz ze wzrostem czasu ekspozycji przybywało komórek ze zdegradowanym DNA (frakcja sub-g 1), których liczba po 72 godzinach równała się 23% i w przeciwieństwie do wyników uzyskanych dla pochodnej C-1305, nie różniła się znacznie od wartości wyznaczonych dla komórek KB-3 WT. c. Zestawienie W celu bardziej przejrzystego uwidocznienia różnic w dystrybucji komórek w fazach: sub-g 1, S i G 2/M cyklu komórkowego pomiędzy komórkami KB-3 typu dzikiego i KB-3 UGT1A10

Wyniki 131 poddanych ekspozycji na związki C-1305 lub C-1311 zamieściłam poniżej wykresy porównawcze (Rysunek 50). C-1305 Liczba komórek [%] 60 50 40 30 20 10 Sub-G1 S G2/M KB-3 WT Liczba komórek [%] 60 50 40 30 20 10 Sub-G1 S G2/M * KB-3 UGT1A10 * * * ** 0 K 24 48 72 Czas inkubacji [godz.] 0 K 24 48 72 Czas inkubacji [godz.] C-1311 Liczba komórek [%] 60 50 40 30 20 10 Sub-G1 S G2/M KB-3 WT Liczba komórek [%] 60 50 40 30 20 10 Sub-G1 S G2/M * KB-3 UGT1A10 * * * ** 0 K 24 48 72 Czas inkubacji [godz.] 0 K 24 48 72 Czas inkubacji [godz.] Rysunek 50 Procentowy rozkład komórek KB-3 WT i KB-3 UGT1A10 w fazach cyklu komórkowego: sub-g1, S i G2/M inkubowanych z pochodną C-1305 lub C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości 30xIC50. Wykresy zostały wyznaczone na podstawie minimum dwóch niezależnych doświadczeń. * P < 0,05, ** P < 0,001 statystycznie istotne różnice między KB-3 WT a KB-3 UGT1A10. Na podstawie zamieszczonych powyżej wykresów i obliczeń statystycznych wynika, że istotne statystycznie różnice w dystrybucji w cyklu życiowym komórek KB-3 WT i KB-3 UGT1A10 traktowanych pochodną C-1305 występowały przede wszystkim dla frakcji sub-g 1. Największa różnica w ilości komórek w tejże fazie obserwowana była dla komórek KB-3 traktowanych związkiem C-1305 przez 72 godziny. Zatem w komórkach o nadekspresji enzymu UGT1A10 dochodziło do degradacji DNA w znacząco wyższym stopniu w porównaniu do komórek linii dzikiej. Zmiana w wielkości populacji komórek w danej fazie cyklu życiowego pomiędzy liniami KB-3 WT i KB-3 UGT1A10 występowała również dla fazy S cyklu komórkowego, czyli syntezy DNA. Różnice obserwowane były dla komórek kontrolnych i inkubowanych przez 24 godziny. Związek C-1311 również wpływał odmiennie na wielkość populacji komórek KB-3 WT i KB-3 UGT1A10 w fazie S. Tutaj różnice były wysokie i obserwowane dla komórek kontrolnych i traktowanych C-1311 przez 24 i 48 godzin. Niewielka zmiana w wielkości populacji komórek w fazie sub-g 1 pomiędzy linii dziką i z nadekspresją enzymu UGT1A10 zachodziła po 24

Wyniki 132 godzinach inkubacji komórek ze związkiem C-1311. Zatem pochodną imidazoakrydonu indukowała degradację DNA w stopniu nieznacznie różnym w dwóch badanych liniach KB-3, w przeciwieństwie do związku C-1305. 5.4.6 Badanie poziomu białek zaangażowanych w cykl komórkowy i indukcję apoptozy w komórkach KB-3 metodą Western blot Analiza dystrybucji komórek w cyklu życiowym komórek KB-3 wykazała, że obie pochodne akrydyny, C-1305 i C-1311 indukują blok cyklu w fazie G 2/M. Należałoby zatem rozstrzygnąć, czy obserwowana wysoka populacja komórek o 4n chromosomach znajduje się w fazie G 2 cyklu życiowego, czy w trakcie mitozy. Dłuższy czas ekspozycji komórek KB-3 na oba badane związki prowadził do degradacji DNA, o czym świadczyła wzrastająca liczba komórek we frakcji sub-g 1. Z reguły w tejże frakcji znajdują się komórki, w których dochodzi do indukcji apoptozy. Tę hipotezę również należałoby zweryfikować. W związku z powyższym, w celu bliższego poznania mechanizmu odpowiedzi biologicznej indukowanej przez pochodne C-1305 i C-1311 w dzikich komórkach nowotworowych ludzkiego raka szyjki macicy KB-3 przeprowadziłam szereg analiz metodą Western blot. Pozwoliły mi one określić wpływ związków na poziom białek zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego i indukcję apoptozy. Białkiem typowym dla fazy G 2 jest cyklina B1 jej wysoka ekspresja obserwowana jest od fazy S, a zanika w mitozie [Innocente i wsp., 1999]. W trakcie mitozy charakterystycznym zjawiskiem jest fosforylacja histonu 3 na serynie 10 (P-H3) [Prigent i Dimitrov, 2003] oraz obecność specyficznej dla dużej rodziny fosfoprotein sekwencji ufosforylowanych aminokwasów (motyw fosfo-ser/thr-pro), określanej jako tzw. fosfoepitop MPM-2 i rozpoznawanej przez przeciwciało MPM-2 (ang. mitotic phosphoprotein monoclonal-2) [Davis i wsp., 1983]. W apoptozie, jak już wielokrotnie wspominałam, ważną rolę odgrywa białko kaspaza-3, które przy indukcji tego procesu ulega aktywacji. W przeprowadzonym doświadczeniu zbadałam poziom trzech form tego białka: aktywną kaspazę-3, pociętą kaspazę-3 oraz prokaspazę-3. Sprawdziłam również, czy dochodziło do cięcia białka PARP przez kaspazy. Badania techniką Western blot przeprowadziłam na komórkach linii KB-3 typu dzikiego traktowanych pochodnymi C-1305 lub C-1311 w stężeniach 30 x IC 50. Czasy inkubacji komórek ze związkami wynosiły: 24, 48 i 72 godziny. Kontrolę równomiernego załadowania studzienek stanowiło białko GADPH. Analiza Western blot (Rysunek 51) pokazała, że poziom cykliny B1 znacząco wzrastał w komórkach KB-3 traktowanych związkami C-1305 i C-1311 w stosunku do poziomu obserwowanego w komórkach nietraktowanych chemoterapeutykiem. Czas inkubacji komórek z pochodnymi nie wpływał na ilość cykliny B1. Można jedynie zauważyć, że było jej nieco mniej

Wyniki 133 w komórkach poddanych działaniu związków przez 24 godziny. Analiza poziomu białek zaangażowanych w proces mitozy, takich jak fosforylowany histon 3 oraz fosforylowane białka rozpoznawane przez specyficzne przeciwciało MPM-2 wykazała, że w komórkach KB-3 inkubowanych ze związkami C-1305 i C-1311 białka te nie były wykrywane. W przypadku kontroli pozytywnej komórek poddanych działaniu czynnika powodującego blok cyklu życiowego w mitozie (winblastyna), białka te były wyraźnie widoczne. Rysunek 51 Poziom białek: GAPDH, cykliny B1, fosforylowanego histonu H3 (P-H3), fosforylowanych białek MPM- 2, aktywnej kaspazy-3, pociętej kaspaza-3, pro-kaspazy-3 i pociętego PARP w komórkach KB-3 traktowanych pochodnymi C-1305 (8 μm) i C-1311 (3 μm) przez podane czasy. K oznacza komórki KB-3 nietraktowane związkiem, + - oznacza kontrolę pozytywną, komórki KB-3 traktowane winblastyną. Po lewej stronie został podany ciężar molekularny białek. Wynik jest reprezentatywny dla 2 niezależnych doświadczeń. Badanie poziomu białek biorących udział w apoptozie pokazało, że w komórkach KB-3 traktowanych pochodnymi C-1305 i C-1311 dochodziło do aktywacji kaspazy-3. Poziom tego białka wzrastał wraz ze wzrostem czasu inkubacji z obydwoma związkami. Efekt był wyraźniej widoczny dla pochodnej C-1311. Również badanie cięcia kaspazy-3 wykazało, że im dłuższy czas ekspozycji komórek KB-3 na związki, tym więcej pojawiało się obu form pociętej

Wyniki 134 kaspazy-3 (fragmentu o masie 17 i 19 kda). Wraz ze wzrostem czasu inkubacji komórek z pochodnymi C-1305 i C-1311 ubywało prokaspazy-3. Dodatkowo sprawdziłam, czy w komórkach KB-3 pod wpływem działania badanych związków dochodziło do cięcia białka PARP, substratu kaspazy-3. Proces ten także zachodził na kliszy wyraźnie widoczne było, jak wraz ze wzrostem czasu inkubacji malał poziom natywnego białka, w miejsce którego pojawiała się zdegradowana forma, fragment o masie 85 kda. Wszystkie studzienki zostały upakowane równomiernie, co pokazał Western blot białka GAPDH prążki były podobnej intensywności. Podsumowując, pochodne C-1305 i C-1311 w komórkach KB-3 indukowały blok cyklu życiowego jedynie w fazie G 2, a nie w mitozie. Pod wpływem działania związków dochodziło do aktywacji procesu apoptozy zależnej od kaspazy-3, która była obserwowana w nieco większym stopniu dla pochodnej imidazoakrydonu C-1311. 5.4.7 Obserwacje mikroskopowe morfologii jąder komórek KB-3 W dotychczas przeprowadzonych doświadczenia na komórkach KB-3 wykazałam, że ekspozycja komórek na pochodne C-1305 i C-1311 prowadziła do zatrzymania komórek w fazie S lub G 2 cyklu komórkowego. Przedłużone działanie obu związków skutkowało pojawieniem się frakcji komórek o zdegradowanym DNA i indukcją apoptozy. W celu ustalenia, jak duża populacja komórek ulega śmierci apoptotycznej dokonałam obserwacji morfologicznej jąder komórek KB-3 traktowanych C-1305 i C-1311. Doświadczenie przeprowadziłam dla komórek typu dzikiego, KB-3 WT i przejściowo transfekowanych izoenzymem UGT1A10, KB-3 UGT1A10, co pozwoliło mi sprawdzić, czy podwyższony poziom wspomnianego enzymu prowadzi do zwiększenia cytotoksycznego działania C-1305 i obniżenia C-1311, a tym samym do zmiany odpowiedzi komórkowej. Eksperyment wykonałam w takich samych warunkach, jak analizę dystrybucji komórek KB-3 w cyklu życiowym: czas inkubacji 24 72 godziny, stężenie związków: 30 x IC 50. a. Komórki typu dzikiego KB-3 WT Obserwacje mikroskopowe komórek KB-3 typu dzikiego wykazały, że obie badane pochodne, C-1305 i C-1311 indukowały zmiany w morfologii jąder typowe dla apoptozy (Rysunek 52). Począwszy od 24 godzin ekspozycji komórek na związek C-1305 widoczne były jądra o skondensowanej chromatynie i pofragmentowanych do charakterystycznych ciałek apoptotycznych. Populacja komórek o takiej morfologii po 72 godzinach inkubacji z triazoaloakrydonem wynosiła 18,5% (Rysunek 53). Wynik ten koreluje z tym uzyskanym z analizy dystrybucji komórek w cyklu życiowym, gdzie wykazałam, że po tym samym czasie frakcja sub-g 1, w której znajdują się komórki apoptotyczne, wynosiła 19% (Tabela 24). Po

Wyniki 135 dłuższym czasie ekspozycji na C-1305 zaobserwować można było również komórki, w których doszło do nieprawidłowego przebiegu mitozy widoczne były jądra ze skondensowanymi, porozrzucanymi chromosomami lub mikrojądra charakterystyczne dla katastrofy mitotycznej (około 5,5% komórek po 72 godz.). C-1305 Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny C-1311 Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny Rysunek 52 Morfologia jąder komórek linii KB-3 WT (typu dzikiego) traktowanych pochodną C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm), wybarwionych DAPI i oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w świetle UV przy powiększeniu 400x. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Strzałki wskazują zmiany charakterystyczne dla apoptozy, groty dla nieprawidłowej mitozy. Związek C-1311, w przeciwieństwie do C-1305, w komórkach KB-3 WT indukował zmiany w morfologii jąder komórkowych typowe jedynie dla apoptozy (Rysunek 52). Efekt ten był również dużo silniejszy niż w przypadku oddziaływania C-1305. Populacja komórek apoptotycznych pojawiała się po 24 godzinach ekspozycji na pochodną C-1311 i jej wielkość rosła wraz z czasem inkubacji, osiągając wartość 30% po 72 godzinach (Rysunek 53). Warto zwrócić uwagę, że większość jąder komórek apoptotycznych to tzw. jądra pyknotyczne, czyli obkurczone jądra o skondensowanej chromatynie. To może tłumaczyć wyniki wcześniejszych badań, w których wykazałam, że frakcja sub-g 1 (w której zwykle znajdują się komórki apoptotyczne już po podziale na ciałka apoptotyczne) po 72 godzinach inkubacji komórek KB-3 WT z C-1311 wyniosła jedynie 17% (Tabela 24). Z kolei badanie Western blot poziomu aktywnej

Wyniki 136 kaspazy-3, fragmentów pociętej kaspazy-3, prokaspazy-3 i cięcia białka PARP wykazało, że to w komórkach KB-3 WT traktowanych C-1311 dochodziło do indukcji apoptozy dużo silniej niż w komórkach poddanych działaniu C-1305. Liczba komórek [%] 40 30 20 10 0 Apoptoza Nieprawidłowa mitoza K 24 48 72 24 48 72 C-1305 C-1311 Czas inubacji [godz.] Rysunek 53 Liczba komórek KB-3 WT inkubowanych z pochodną C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm) przez określone czasy o charakterystycznych dla danego procesu zmianach jądra komórkowego. Wykres uwzględnia komórki o jądrach ze zmianami charakterystycznymi dla apoptozy i nieprawidłowej mitozy. Obliczenia zostały wykonane na podstawie zdjęć wykonanych przy powiększeniu 200x. Jednorazowo zliczanych było minimum 500 komórek. Wynik jest średnią z dwóch niezależnych doświadczeń poddanych analizie po 2 razy. Podsumowując, pochodna triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 indukowały w komórkach KB-3 WT śmierć komórkową na drodze apoptozy, przy czym efekt ten zachodził silniej w komórkach traktowanych związkiem C-1311. b. Komórki KB-3 z nadekspresją UGT1A10 Obserwacje mikroskopowe morfologii jąder komórek KB-3 UGT1A10 traktowanych pochodnymi C-1305 lub C-1311 wykazały, że oba związki indukowały w tychże komórkach przede wszystkim apoptozę (Rysunek 54). Pochodna triazoloakrydonu C-1305 w komórkach KB-3 UGT1A10 prowadziła do kondensacji chromatyny i tworzenia ciałek apoptotycznych począwszy od 24 godzin inkubacji. Wraz ze wzrostem czasu ekspozycji komórek o takiej morfologii znacząco przybywało, a ich liczba po 72 godzinach osiągnęła wartość około 32% (Rysunek 55). Także populacja komórek o zmianach świadczących o nieprawidłowym przebiegu rosła wraz z czasem ekspozycji i wyniosła 11% po 72 godzinach. C-1305 Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny

Liczba komórek [%] Wyniki 137 C-1311 Kontrola Rysunek 54 Morfologia jąder komórek linii KB-3 UGT1A10 traktowanych pochodną C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm), wybarwionych DAPI i oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w świetle UV przy powiększeniu 400x. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Strzałki wskazują zmiany charakterystyczne dla apoptozy, groty dla nieprawidłowej mitozy. Związek C-1311 w komórkach KB-3 UGT1A10, podobnie jak w komórkach KB-3 WT, powodował jedynie zmiany świadczące o indukcji apoptozy. Komórki apoptotyczne pojawiały się po 24 godzinach ekspozycji na C-1311, a ich liczba powoli rosła w miarę wydłużania się czasu inkubacji. Po 72 godzinach traktowania związkiem populacja ta wynosiła 21,5%. Wynik ten jest zbliżony do tego uzyskanego z wpływu związku na przebieg cyklu życiowego. Tam frakcja sub-g 1, charakterystyczna dla komórek o pofragmentowanym DNA, wynosiła nieco ponad 22%. (Tabela 25). 40 30 20 10 0 Apoptoza Nieprawidłowa mitoza K 24 48 72 24 48 72 C-1305 C-1311 Czas inubacji [godz.] Rysunek 55 Liczba komórek KB-3 UGT1A10 inkubowanych z pochodną C- 1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm) przez podane czasy o charakterystycznych dla danego procesu zmianach jądra komórkowego. Wykres uwzględnia komórki o jądrach ze zmianami charakterystycznymi dla apoptozy i nieprawidłowej mitozy. Obliczenia zostały wykonane na podstawie zdjęć wykonanych przy powiększeniu 200x. Jednorazowo zliczanych było minimum 500 komórek. Wynik jest średnią z dwóch niezależnych doświadczeń poddanych analizie po dwa razy. Podsumowując, obie badane pochodne akrydyny w komórkach KB-3 UGT1A10 indukowały przede wszystkim zmiany charakterystyczne dla apoptozy. Związek C-1305 dodatkowo powodował dezintegrację chromosomów i katastrofę mitotyczną. Co istotne, przejściowa nadekspresja izoenzymu UGT1A10 w komórkach KB-3 spowodowała znaczący wzrost proapoptotycznych właściwości C-1305 oraz ich obniżenie w przypadku związku C-1311 (po dłuższym czasie inkubacji), co dobrze obrazuje Rysunek 56.

Wyniki 138 50 KB-3 WT Liczba komórek [%] 40 30 20 10 0 KB-3 UGT1A10 ** ** * * ** * K 24 48 72 24 48 72 C-1305 C-1311 Czas inubacji [godz.] Rysunek 56 Liczba komórek KB-3 WT i KB-3 UGT1A10 poddanych działaniu C-1305 (8 µm) lub C-1311 (3 µm) przez podane czasy o zmianach morfologii jądra charakterystycznych dla śmierci apoptotycznej. Wykres został wyznaczony na podstawie minimum dwóch niezależnych doświadczeń. * P < 0,05, ** P < 0,001 statystycznie istotne różnice między komórkami KB-3 WT a KB-3 UGT1A10. 5.4.8 Identyfikacja żywych/martwych komórek KB-3 traktowanych związkami Analiza cyklu życiowego oraz obserwacje morfologiczne jąder komórek KB-3 traktowanych związkami C-1305 lub C-1311 wykazały, że w warunkach podwyższonej ekspresji izoenzymu UGT1A10 śmierć apoptotyczna była indukowana w większym stopniu dla pochodnej C-1305, zaś znacząco ograniczona dla C-1311. W celu dokładnego określenia ogólnej liczby komórek KB-3 martwych po ekspozycji na badane pochodne, przeprowadziłam kolejne doświadczenie, barwienie przyżyciowe. Po zakończonej inkubacji ze związkami C-1305 i C-1311 (warunki identyczne jak przy wcześniejszych analizach) komórki KB-3 typu dzikiego i o przejściowej nadekspresji izoenzymu UGT1A10 jednocześnie barwiłam dioctanem fluoresceiny (FDA) i jodkiem propidyny (PI), a następnie oglądałam pod mikroskopem fluorescencyjnym i liczyłam komórki żywe i martwe. Uzyskane zdjęcia oraz liczbę komórek martwych przedstawiłam poniżej. a. Komórki KB-3 typu dzikiego Komórki KB-3 WT (typu dzikiego) w miarę wzrostu czasu inkubacji z pochodną C-1305 lub C-1311 traciły ciągłość błony komórkowej, a zatem umierały. Po najdłuższym czasie ekspozycji komórek na związki liczba tych martwych wynosiła: dla C-1305 około 11,5%, zaś C-1311 prawie 16% (Rysunek 57).

Wyniki 139 Rysunek 57 Zdjęcia komórek linii KB-3 WT traktowanych pochodną C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm), wybarwionych dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 200x. Przedstawione obrazy są reprezentatywne dla dwóch wykonanych doświadczeń. Cyfra w dolnym prawym rogu oznacza procentową wielkość populacji komórek martwych i jest średnią z czterech zliczeń pochodzących z dwóch niezależnych eksperymentów, każde minimum po 500 komórek. b. Komórki KB-3 z nadekspresją UGT1A10 Inkubacja komórek KB-3 UGT1A10 wykazujących przejściową nadekspresję izoenzymu UGT1A10 ze związkami C-1305 i C-1311 również powodowała śmierć komórek. Im dłuższy był czas ekspozycji na badane pochodne, tym większa była liczba komórek martwych. Po 72 godzinach traktowania komórek KB-3 UGT1A10 związkami akrydonu liczba komórek zabarwionych na czerwono wynosiła: około 24% dla pochodnej C-1305 i 15% dla C-1311 (Rysunek 58). Należy zwrócić uwagę, że śmierć komórkowa była indukowana dużo silniej w komórkach KB-3 UGT1A10 niż KB-3 WT traktowanych pochodną C-1305 (Rysunek 59). Zatem obecność izoenzymu UGT1A10 spowodowała większą wrażliwość komórek KB-3 na badany związek. W przypadku C-1311 taki efekt nie był obserwowany. Obie populacje komórek, KB-3 WT i KB-3 UGT1A10 reagowały na ekspozycję na pochodną imidazoakrydonu C-1311 w podobny sposób.

Wyniki 140 Rysunek 58 Zdjęcia komórek linii KB-3 UGT1A10 traktowanych pochodną C-1305 (8 μm) lub C-1311 (3 μm), wybarwionych dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 200x. Przedstawione obrazy są reprezentatywne dla dwóch wykonanych doświadczeń. Cyfra w dolnym prawym rogu oznacza procentową wielkość populacji komórek martwych i jest średnią z czterech zliczeń pochodzących z dwóch niezależnych eksperymentów, każde minimum po 50 0 komórek. 50 KB-3 WT Liczba komórek [%] 40 30 20 10 0 KB-3 UGT1A10 ** *** K 24 48 72 24 48 72 C-1305 C-1311 Czas inubacji [godz.] Rysunek 59 Liczba komórek martwych linii KB-3 WT oraz KB-3 UGT1A10 poddanych działaniu C-1305 (8 µm) lub C-1311 (3 µm) przez podane czasy. Wykres został wyznaczony na podstawie minimum dwóch niezależnych doświadczeń. ** P < 0,001, *** P < 0,0001 statystycznie istotne różnice między komórkami KB-3 UGT1A10 a KB-3 WT.

Wyniki 141 5.5 Badanie metabolizmu i cytotoksyczności w komórkach wybranych ludzkich linii nowotworowych o przejściowej nadekspresji CYP3A4 i UGT1A10 traktowanych pochodnymi C-1305 oraz C-1311 Badania przeprowadzone na modelu komórek jajnika chomika chińskiego CHO wykazały, że w warunkach podwyższonej ekspresji izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 cytotoksyczne i proapoptotyczne działanie pochodnej imidazoakrydonu C-1311 istotnie się zwiększało. Indukcja śmierci komórkowej na drodze apoptozy lub katastrofy mitotycznej zachodziła dużo szybciej i z większą intensywnością w komórkach CHO-HR-3A4 (z koekspresją CYP3A4 i reduktazy cytochromu P450) niż w komórkach CHO-WT i CHO-HR. Za powyższy efekt nie był odpowiedzialny zmieniony profil metaboliczny pochodnej C-1311, gdyż, jak wykazano wcześniej, izoenzym CYP3A4 nie bierze bezpośredniego udziału w biotransformacji pochodnej [Potęga i wsp., 2011]. Z kolei zaproponowałam, że za różnice w obserwowanej odpowiedzi komórkowej na działanie związku między komórkami CHO-WT (typu dzikiego) pozbawionych reduktazy cytochromu P450 a CHO-HR wykazujących wysoką ekspresję reduktazy odpowiadała zwiększona generacja ROS wynikająca właśnie z obecności reduktazy. Kolejna część badań wykonanych na komórkach KB-3 pokazała, że przejściowa nadekspresja izoenzymu UDP-glukuronylotransferazy UGT1A10 istotnie zmieniała właściwości cytotoksyczne pochodnej triazoloakrydonu C-1305 oraz imidazoakrydonu C-1311, przy czym wpływ obecności enzymu na mechanizm działania obu związków był odmienny. Tworzenie się glukuronidu C-1305 z udziałem UGT1A10 znacząco podwyższało cytotoksyczność pochodnej oraz zwiększało zdolność do indukcji apoptozy w komórkach KB-3. Z kolei przemiana pochodnej C-1311 do formy z kwasem glukuronowym istotnie zmniejszała wrażliwość komórek na związek, a śmierć apoptotyczna indukowana była w mniejszej populacji komórek KB-3 UGT1A10 w porównaniu do KB-3 WT (typu dzikiego). W związku z interesującymi wynikami otrzymanymi w badaniach opisanych powyżej, w dalszym etapie pracy sprawdziłam, czy w komórkach innych ludzkich linii nowotworowych obserwowane są analogiczne efekty zwiększenie proapoptotycznych właściwości związku C-1311 przy nadekspresji izoenzymu CYP3A4 oraz związku C-1305 przy nadekspresji izoenzymu UGT1A10, a obniżenie cytotoksyczności pochodnej C-1311 przy podwyższonym poziomie UGT1A10. Do badań wybrałam komórki dwóch linii raka piersi: MCF-7 (komórki estrogenozależne) i MDA-MB-231 (komórki nieestrogenozależne) oraz dwóch linii raka płuc: H460 (wielkokomórkowy rak) i A549 (niedrobnokomórkowy rak). Komórki raka piersi wybrałam ze względu na fakt, że pochodna imidazoakrydonu C-1311 podczas badań klinicznych była podawana pacjentkom z nowotworem piersi [Capizzi i wsp., 2008]. Dodatkowo, wykazano, że w komórkach raka piersi, zwłaszcza hormonozależnych,

Wyniki 142 poziom ekspresji izoenzymu CYP3A4 jest podwyższony [Kapucuoglu i wsp., 2003]. Co więcej, białko CYP3A4 wskazano jako jeden z możliwych markerów przeżywalności pacjentów z nowotworem piersi [Murray i wsp., 2010]. W metabolizmie estrogenów ważną rolę odgrywają enzymy z rodziny UGT [Guillemette i wsp., 2004], co również było powodem, dla którego komórki raka piersi zostały wybrane do kolejnych doświadczeń. Pochodna imidazoakrydonu C-1311 w badaniach przedklinicznych przeprowadzonych przez NCI wykazywała wysoką cytotoksyczność również względem komórek raka płuc [NSC 645809, www.dtp.nci.nih.gov/docs/cance/cancer_data.html), stąd linie komórkowe wywodzące się z tego nowotworu zostały dobrane jako drugi model badawczy. Komórki płuc są bezpośrednio narażone na oddziaływanie ksenobiotyków występujących w powietrzu, stąd poziom enzymów metabolizujących jest ważny dla prawidłowego funkcjonowania całego organu [Castell i wsp., 2005]. Postuluje się również, że ekspresja niektórych enzymów z rodziny cytochromu P450 jest podwyższona w nowotworach płuc. Bezpośrednią zależność pokazano między innymi dla izoenzymu CYP2J2, który, podobnie jak CYP3A4, zaangażowany jest w metabolizm kwasów epoksyeikozatrienowych [Jiang i wsp., 2005]. W związku z powyższym zasadne było przeprowadzenie badań związków C-1305 i C-1311 w komórkach linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 o różnej ekspresji izoenzymu CYP3A4 lub UGT1A10 uzyskanej poprzez przejściową transfekcję. Zdolność komórek linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 do ulegania wydajnej transfekcji sprawdzałam wprowadzając do wnętrza komórek plazmid kodujący gen białka GFP i analizując poziom zielonej fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Poziom nadekspresji izoenzymu CYP3A4 sprawdzałam badając aktywność katalityczną enzymu wobec standardowego substratu izoenzymu CYP3A4, testosteronu, który z udziałem tego enzymu jest przekształcany do pochodnej 6-β-hydroksylowej. W przypadku komórek transfekowanych izoenzymem UGT1A10 o aktywności katalitycznej białka świadczyła ilość powstającego glukuronidu związków C-1305 i C-1311. 5.5.1 Transfekcja komórek linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 analiza ekspresji białka GFP Badanie fluorescencji białka GFP wykazało, że jego ekspresja zachodziła wydajnie w komórkach wszystkich badanych linii: MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 (Rysunek 60). Na zamieszczonych poniżej zdjęciach widać, że w większości komórek wspomnianych linii obserwowana była zielona fluorescencja białka. 24 godziny po transfekcji około 50-60% komórek MCF-7, 40-50% komórek MDA-MB-231, 60-70% komórek H460 i 40-50% A549 świeciła na zielono. Po 96 godzinach od elektroporacji, czyli po maksymalnym czasie, dla

Wyniki 143 którego wykonywałam kolejne doświadczenia, liczba komórek o zielonej fluorescencji białka GFP utrzymywała się na podobnym poziomie dla wszystkich linii, choć intensywność zielonej fluorescencji w przypadku komórek MDA-MB-231 wyraźnie zmalała. Co ważne, zastosowane do transfekcji warunki elektroporacji nie były dla komórek szkodliwe przynajmniej 90% spośród nich przeżywała i była w dobrej kondycji. Zwiększenie parametrów elektroporacji prowadziło do śmierci większej populacji komórek. Rysunek 60 Zdjęcia komórek linii: MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 poddanych transfekcji białkiem GFP (ang. green fluorescent protein) wykonane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w zakresie światła niebieskiego (lewe zdjęcie) i mikroskopu świetlnego (prawe zdjęcie) po wskazanym czasie od elektroporacji. Powiększenie 400x. Transfekcji poddano jednorazowo 12 mln komórek wprowadzając 10 µg plazmidu/400 µl zawiesiny komórkowej. Warunki elektroporacji dla każdej z linii zostały przedstawione w Tabeli 4, Rozdział 4.3.11. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla trzech wykonanych doświadczeń.

Wyniki 144 5.5.2 Transfekcja komórek MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 określenie aktywności katalitycznej izoenzymu CYP3A4 Badanie ekspresji białka GFP w komórkach linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 pozwoliło dobrać optymalne parametry elektroporacji i transfekcji. Najistotniejszym jest jednak, by w następstwie transfekcji powstawało funkcjonalne białko o wysokiej aktywności enzymatycznej. Kolejnym krokiem było zatem określenie zdolności katalitycznych izoenzymów CYP3A4 i UGT1A10 po transfekcji komórek genami wspomnianych białek. Aktywność CYP3A4 badałam określając stopień konwersji testosteronu do pochodnej 6-β-hydroksylowej. 20 MCF-7 CYP3A4 20 MDA-MB-231 CYP3A4 Absorpcja [mau] 15 10 5 MCF-7 WT Absorpcja [mau] 15 10 5 MDA-MB-231 WT 0 20 22 24 26 28 Czas retencji [min] 0 20 22 24 26 28 Czas retencji [min] 20 H460 CYP3A4 20 A549 CYP3A4 Absorpcja [mau] 15 10 5 H460 WT Absorpcja [mau] 15 10 5 A549 WT 0 20 22 24 26 28 Czas retencji [min] 0 20 22 24 26 28 Czas retencji [min] Rysunek 61 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu testosteronu (stężenie 50 µm) w komórkach linii MCF-7, MBA-MB-231, H460 i A549 przy długości fali 254 nm. Strzałka wskazuje na metabolit testosteronu, 6-β-hydroksytestosteron, charakterystyczny dla obecności w komórkach izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450. Przedstawione chromatogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Rysunek 61 przedstawia chromatogramy uzyskane z analizy tej przemiany testosteronu zachodzącej w komórkach MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 typu dzikiego oraz o przejściowej nadekspresji izoenzymu CYP3A4. Substrat, czyli testosteron występował na chromatogramie przy czasie retencji około 26,5 minuty, zaś jego metabolit w okolicy 22 minuty. Badanie wykazało, że konwersja standardowego substratu izoenzymu CYP3A4 zachodziła w komórkach trzech linii: MCF-7, H460 i A549, natomiast w komórkach linii MDA-MB-231 nie był obserwowany pik pochodzący od 6-β-hydroksytestosteronu. Przemiana testosteronu (stężenie 50 µm) po jego 24 godzinnej inkubacji z komórkami MCF-7, H460 i A549 wykazującymi przejściową

Wyniki 145 nadekspresję izoenzymu CYP3A4 zachodziła z wydajnością około 0,8-1%. Dla porównania, w komórkach CHO-HR-3A4 o stabilnej i wysokiej nadekspresji badanego białka konwersja ta była rzędu 14,40±4,62% (Rysunek 35, Rozdział 5.2.2.a), zaś w komórkach Hep3A4, również o stabilnej nadekspresji CYP3A4 już tylko 3,80±1,44%. Zatem można uznać, że podwyższony poziom białka CYP3A4 osiągnięty poprzez zastosowanie przejściowej transfekcji w komórkach linii MCF-7, H460 i A549 był zadowalający. 5.5.3 Przemiany metaboliczne pochodnych C-1305 i C-1311 w komórkach linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 Kolejnym etapem badań było określenie metabolizmu pochodnych triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 w komórkach nowotworowych: MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 typu dzikiego oraz poddanych przejściowej transfekcji izoenzymami CYP3A4 i UGT1A10. Biotransformację związków sprawdziłam również w komórkach, do których wprowadziłam wektor pusty, niekodujący żadnego białka. Komórki traktowałam pochodnymi C-1305 i C-1311 w stężeniu 30 μm i inkubowałam od 24 do 72 godzin. Analizie z zastosowaniem techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej, HPLC, poddawałam przygotowywane z komórek metanolowe ekstrakty oraz pożywkę hodowlaną pozostałą po inkubacji komórek ze związkami. a. Przemiany metaboliczne C-1305 i C-1311 w komórkach MCF-7 Badanie przemian metabolicznych pochodnej triazoloakrydonu C-1305 w lizatach komórek linii MCF-7 wykazało, że w komórkach typu dzikiego (MCF-7 WT), komórkach z wektorem pustym (MCF-7 EV) oraz z przejściową nadekspresją CYP3A4 (MCF-7 CYP3A4) obserwowany był przede wszystkim związek wyjściowy przy czasie retencji 19 minut (Rysunek 62). Widoczny nierozdzielony pik tuż za substratem prawdopodobnie pochodził od metabolitu powstającego z udziałem enzymu FMO, czyli formy N-tlenkowej związku C-1305 [Fedejko-Kap i wsp., 2011]. Analiza zawartości pożywki pohodowlanej wskazała, że oprócz substratu znajdowały się w niej dwa inne związki, w okolicy 20,5 oraz 21 minuty, których nie identyfikowałam. Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu związku C-1305 w komórkach MCF-7 UGT1A10, zarówno w próbce wyizolowanej z komórek oraz pobranej z pożywki wskazały na obecność nowego piku w okolicy 14 minuty czasu retencji, nieobserwowanego wcześniej w innych, wyżej opisanych komórkach. Porównując wyniki otrzymane z badania metabolizmu związku C-1305 w komórkach KB-3 UGT1A10 (Rysunek 43, Rozdział 5.4.3.a, [Pawłowska i wsp, 2013]) oraz wcześniej wykonanych w naszym laboratorium [Fedejko-Kap i wsp., 2013] można

Wyniki 146 C-1305 A Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g B Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] C Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g D Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g E Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 25 20 15 10 5 G Czas retencji [min] S 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g F Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 50 40 30 20 10 Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g Rysunek 62 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1305 (stężenie 30 µm) w komórkach linii: MCF-7 WT typu dzikiego: w lizatach komórkowych (A) i w pożywce (B), lizatach komórek MCF-7 CYP3A4 (C), MCF-7 EV (transfekowanych wektorem pustym) (D) oraz MCF-7 UGT1A10 w: lizatach komórkowych (E) i pożywce (F) przy długości fali 420 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1305, G glukuronid pochodnej triazoloakrydonu. Chromatogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. stwierdzić, że pik ten należał to glukuronidu związku C-1305. Transfekcja komórek MCF-7 plazmidem kodującym ugt1a10 przebiegła zatem pomyślnie i w komórkach powstało aktywne białko. Glukuronid C-1305 pojawiał się już po 24 godzinnej inkubacji komórek MCF-7 UGT1A10 ze związkiem i wraz ze wzrostem czasu ekspozycji do 72 godzin stężenie metabolitu wzrastało zarówno w komórkach, jak i pożywce do około 2,5% w stosunku do związku C-1305 w komórkach oraz do około 33,5% w pożywce (Tabela 27). Analiza biotransformacji pochodnej imidazoakrydonu C-1311 wewnątrz komórek MCF-7 typu dzikiego, z wektorem pustym i z przejściową nadekspresją CYP3A4 pokazała, że w komórkach tych obecny był przede wszystkim związek wyjściowy (czas retencji 16 minuta,

Wyniki 147 C-1311 A B Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] C Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g D Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g E Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 25 20 15 10 5 G Czas retencji [min] S 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g F Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 50 40 30 20 10 Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g Rysunek 63 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1311 (stężenie 30 µm) w komórkach linii: MCF-7 WT typu dzikiego: w lizatach komórkowych (A) i w pożywce (B), lizatach komórek MCF-7 CYP3A4 (C), MCF-7 EV (transfekowanych wektorem pustym) (D) oraz MCF-7 UGT1A10 w: lizatach komórkowych (E) i pożywce (F) przy długości fali 420 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1311, G glukuronid pochodnej imidazoakrydonu. Chromatogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. chromatogramach widoczne były również dodatkowe niewielkie piki dwa tuż przed substratem i trzy zaraz za nim. Ich struktura jest nieznana. Należy jednak zaznaczyć, że konwersja C-1311 do wspomnianych 5 metabolitów zachodziła dla wszystkich badanych czasów inkubacji i linii komórkowych z wydajnością około 0,2%. Analiza chromatograficzna pożywki hodowlanej pobranej po inkubacji komórek z imidazoakrydonem wskazała na obecność jednego metabolitu w bardzo niskim stężeniu. Badanie metabolizmu imidazoakrydonu w komórkach MCF-7 UGT1A10 pokazało, że przy podwyższonej ekspresji izoenzymu UGT1A10 powstawał z jego udziałem glukuronid

Wyniki 148 C-1311 widoczny na chromatogramie w okolicy 12 minuty. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji ilość pochodnej glukuronowej związku wzrastała i po 72 godzinach wynosiła: w lizatach komórkowych około 0,2% (zdecydowanie mniej niż dla związku C-1305), a w pożywce prawie 30%. (Tabela 26). W sumie konwersja C-1311 do glukuronidu zachodziła z porównywalną wydajnością jak dla C-1305. Tabela 26 Stopień przemiany triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 o stężeniu 30 µm do pochodnej glukuronowej zachodzący w komórkach MCF-7 o przejściowej nadekspresji izoenzymu UGT1A10. Czas inkubacji [godz.] Stopień przemiany związku Lizaty komórkowe Pożywka hodowlana C-1305 C-1311 C-1305 C-1311 24 1,02 ± 0,34 0,073 ± 0,034 8,54 ± 3,88 8,11 ± 1,43 48 1,69 ± 0,60 0,12 ± 0,05 18,08 ± 3,64 13,97 ± 3,12 72 2,54 ± 1,07 0,21 ± 0,01 33,50 ± 8,11 29,80 ± 6,97 Metabolizm związku został sprawdzony po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji komórek z C-1305 i C-1311. Ilość powstającego glukuronidu została określona w lizacie komórkowym i pożywce hodowlanej. Przedstawione wartości to średnia ± odchylenie standardowe oznaczone na podstawie trzech niezależnych doświadczeń. b. Przemiany metaboliczne C-1305 i C-1311 w komórkach MDA-MB-231 Absorpcja [mau] C-1305 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 S 72 g 48 g 24 g Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 C-1311 25 20 15 10 5 Czas retencji [min] S 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 50 40 30 20 10 Czas retencji [min] S 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g Rysunek 64 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1305 i C-1311 (stężenie 30 µm) w komórkach MDA-MB-231 WT (typu dzikiego): w lizatach komórkowych (lewy panel) i w pożywce (prawy panel) przy długości fali 420 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1305 lub C-1311. Chromatogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń.

Wyniki 149 Badanie aktywności izoenzymu CYP3A4 w komórkach MDA-MB-231 poddanych przejściowej transfekcji plazmidem kodującym wspomniany enzym wykazało, że w komórkach tych nie powstawał aktywny enzym. Analogiczny wynik uzyskałam przy próbie osiągnięcia nadekspresji izoenzymu UGT1A10 badanie metabolizmu w komórkach MDA-MB-231 UGT1A10 wskazało na brak formy glukuronowej związków C-1305 i C-1311 (doświadczenie wykonane trzykrotnie). Na Rysunku 64 przedstawiłam zatem tylko chromatogramy uzyskane dla komórek MDA-MB-231 typu dzikiego. Analiza chromatograficzna metabolizmu pochodnej C-1305 zachodzącego w komórkach MDA-MB-23 wykazała, że w metanolowych lizatach wyizolowanych z komórek i w pożywce obserwowany był związek wyjściowy oraz w niskim stężeniu obserwowany wcześniej nie identyfikowany metabolit o czasie retencji wyższym niż substrat. Natomiast niskie stężenie metabolitu C-1311 o czasie retencji nieco niższym niż substrat obserwowano jedynie w lizatach komórkowych, zaś w pożywce znajdował się tylko związek wyjściowy. c. Przemiany metaboliczne C-1305 i C-1311 w komórkach H460 Analiza biotransformacji pochodnej C-1305 w komórkach H460 WT, H460 CYP3A4 i H460 EV wykazała, że podobnie jak w przypadku komórek linii MCF-7, w lizatach komórkowych obecny był związek wyjściowy oraz jeden metabolit (Rysunek 65). Pożywka hodowlana zawierała substrat oraz dwa metabolity, w tym jeden o tym samym czasie retencji co w komórkach. Z kolei w komórkach H460 UGT1A10, zarówno w próbce uzyskanej z lizatów komórkowych, jak i w pożywce hodowlanej obecny był glukuronid związku C-1305. Stężenie glukuronidu wewnątrz komórek przez wszystkie badane czasy inkubacji było podobne i wynosiło około 2% (Tabela 28). Zdecydowanie wyższe stężenie pochodnej glukuronowej związku C-1305 obserwowane było w pożywce hodowlanej po 24 godzinach od dodania związku już 45% C-1305 ulegało koniugacji z kwasem glukuronowym, a po 72 godzinach prawie 74%. Związek C-1311 w komórkach H460 WT, H460 CYP3A4 i H460 EV w niewielkim stopniu ulegał przemianom metabolicznym (Rysunek 65). Na uzyskanych chromatogramach widoczny był przede wszystkim związek wyjściowy (16 minuta czasu retencji) oraz kilka metabolitów w okolicach substratu o łącznej zawartości zaledwie 0,05%. W pożywce hodowlanej obecny był jedynie sam związek C-1311. W komórkach H460 UGT1A10 o przejściowej nadekspresji izoenzymu UGT1A10 dochodziło do sprzężenia C-1311 z kwasem glukuronowym. Proces ten zachodził z wysoką wydajnością (Tabela 27). Większość glukuronidu była usuwana do pożywki. W samych komórkach przez wszystkie badane czasy inkubacji pozostawało ok. 1% glukuronidu, zaś w pożywce po 72 godzinach 60% związku było w formie glukuronowej. Zatem sprzężenie C-1311 z kwasem glukuronowym zachodziło z nieco mniejszą wydajnością niż dla C-1305.

Wyniki 150 Warto zaznaczyć, że proces ten zachodził dla obu związków dużo efektywniej niż w komórkach MCF-7 UGT1A10 (Tabela 26). Tabela 27 Stopień przemiany triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 o stężeniu 30 µm do pochodnej glukuronowej zachodzący w komórkach H460 o przejściowej nadekspresji izoenzymu UGT1A10. Czas inkubacji [godz.] Stopień przemiany związku Lizaty komórkowe Pożywka hodowlana C-1305 C-1311 C-1305 C-1311 24 1,97 ± 0,60 0,93 ± 0,43 45,50 ± 9,68 44,00 ± 10,53 48 2,12 ± 1,10 0,98 ± 0,44 62,94 ± 14,78 48,65 ± 13,34 72 2,04 ± 0,43 0,90 ± 0,42 73,70 ± 7,70 59,51 ± 16,25 Metabolizm związku został sprawdzony po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji komórek z C-1305 i C-1311. Ilość powstającego glukuronidu C-1305 i C-1311 została określona w lizacie komórkowym i pożywce hodowlanej. Wartości przedstawione w tabeli to średnia ± odchylenie standardowe oznaczone na podstawie 3 niezależnych doświadczeń. C-1305 A B Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 0 10 15 20 25 C Czas retencji [min] D Czas retencji [min] Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min]

Wyniki 151 E Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 G S 72 g 48 g 24 g F Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 G S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] C-1311 A Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g B Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] C Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g D Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g E Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 25 20 15 10 5 G S Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g F Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 50 40 30 20 10 G Czas retencji [min] S 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g Rysunek 65 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1305 lub C-1311 (stężenie 30 µm) w komórkach linii: H460 WT typu dzikiego: w lizatach komórkowych (A) i w pożywce (B), lizatach komórek H460 CYP3A4 (C), H460 EV (transfekowanych wektorem pustym) (D) oraz H460 UGT1A10 w: lizatach komórkowych (E) i pożywce (F) przy długości fali 420 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1305 lub C-1311, G glukuronid pochodnej C-1305 lub C-1311. Chromatogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń.

Wyniki 152 d. Przemiany metaboliczne C-1305 i C-1311 w komórkach A549 Na chromatogramach (Rysunek 66) z analizy HPLC metanolowych lizatów komórek A549, a zwłaszcza pozostałej pożywki pohodowlanej oprócz substratu widoczne były glukuronidy związków odpowiednio w okolicy 14 i 12 minuty czasu retencji. Wykazałam zatem, że komórki A549 posiadają endogenne enzymy UGT. Stopień sprzężenia C-1305 z kwasem glukuronowym po 72 godzinach wynosił 26%, zaś dla C-1311 14% (Tabela 28). W samych komórkach zawartość glukuronidu była niewielka od 0,045 do 0,13% dla C-1305 oraz od 0,025 do 0,045% dla C-1311 (piki niewidoczne na chromatogramach przy zastosowanej skali). Pochodna triazoloakrydonu w komórkach A549 ulegała dodatkowym przekształceniom do produktu o niskim stężeniu i nieco wyższym od substratu czasie retencji, który obecny był zarówno w komórkach, jak i pożywce. Pochodna imidazoakrydonu w komórkach A549 metabolizowana była do kilku produktów o niskim stężeniu o stopniu przemiany około 2%. W pożywce po inkubacji obecny był jedynie substrat i glukuronid. C-1305 Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 G S 72 g 48 g 24 g Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 G S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] C-1311 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 G S 72 g 48 g 24 g 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] Rysunek 66 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1305 i C-1311 (stężenie 30 µm) w komórkach A549 WT (typu dzikiego): w lizatach komórkowych (lewy panel) i w pożywce (prawy panel) przy długości fali 420 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1305 lub C-1311. G glukuronid pochodnej C-1305 lub C-1311. Chromatogramy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Metabolizm pochodnych C-1305 i C-1311 w komórkach A549 CYP3A4 i A549 EV zachodził identycznie jak w komórkach A549 WT (dane nie przedstawione). W związku z tym, że wykazałam, iż komórki A549 posiadają endogenne izoenzymy UGT, nie przeprowadzałam transfekcji komórek plazmidem kodującym ten enzym.

Wyniki 153 Tabela 28 Stopień przemiany triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 o stężeniu 30 µm do pochodnej glukuronowej zachodzący w komórkach A549 WT. Czas inkubacji [godz.] Stopień przemiany związku Lizaty komórkowe Pożywka hodowlana C-1305 C-1311 C-1305 C-1311 24 0,045 ± 0,007 0,025 ± 0,007 16,54 ± 3,33 9,71 ± 1,63 48 0,073 ± 0,015 0,030 ± 0,001 22,55 ± 6,50 13,41 ± 0,68 72 0,130 ± 0,014 0,045 ± 0,007 25,89 ± 1,17 14,09 ± 1,32 Metabolizm związku został sprawdzony po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji komórek z C-1305 i C-1311. Ilość powstającego glukuronidu C-1305 i C-1311 została określona w lizacie komórkowym i pożywce hodowlanej. Wartości przedstawione w tabeli to średnia ± odchylenie standardowe oznaczone na podstawie 2 niezależnych doświadczeń. 5.5.4 Cytotoksyczność pochodnych C-1305 i C-1311 wobec komórek linii: MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 Wobec określonej powyżej zróżnicowanej zdolności badanych komórek do transformacji pochodnych triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 ostatnim etapem tej części badań było wyznaczenie cytotoksyczności pochodnych C-1305 i C-1311 wobec komórek linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 typu dzikiego, o przejściowej nadekspresji CYP3A4 i UGT1A10 oraz poddanych transfekcji wektorem pustym. W Tabeli 29 zamieściłam wartości IC 50 uzyskane z zależności wzrostu komórek do stężenia związku, co pozwoliło na poznanie roli metabolizmu w cytotoksyczności tych związków. Badanie cytotoksyczności pochodnych C-1305 i C-1311 wobec komórek linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 wykazało, że komórki te były wrażliwe na działanie obu związków. Obliczone wartości IC 50 dla pochodnej C-1305 wobec wszystkich badanych linii komórkowych były mniejsze niż 2 µm, zaś dla C-1311 mniejsze niż 1 µm. Zatem pochodna imidazoakrydonu powodowała zatrzymanie proliferacji komórek w większym stopniu niż triazoloakrydon. Komórki linii H460 (wielkokomórkowy rak płuc) były najwrażliwsze na działanie związków, a komórki MCF-7 (estrogenozależne komórki raka piersi) najmniej. Transfekcja komórek MCF-7, H460 i A549 wektorem pustym nie zmieniła cytotoksyczności pochodnych, a zatem poddanie komórek procesowi elektroporacji i wprowadzenie do ich wnętrza plazmidu nie powodowało zmian we wrażliwości na chemoterapeutyki.

Wyniki 154 Tabela 29 Wartość IC50 wyznaczone (metodą MTT) dla komórek linii MCF-7, MDA-MB-231, H460 i A549 typu dzikiego (WT), o przejściowej nadekspresji izoenzymu CYP3A4 i UGT1A10 oraz transfekowanych wektorem pustym (EV) traktowanych pochodnymi C-1305 lub C-1311. Linia komórkowa Stężenie IC 50 [µm] C-1305 C-1311 MCF-7 WT 1,64 ± 0,48 0,74 ± 0,23 MCF-7 EV 1,63 ± 0,23 0,78 ± 0,12 MCF-7 CYP3A4 0,74 ± 0,23 a* b** 0,45 ± 0,10 a* b* MCF-7 UGT1A10 0,71 ± 0,27 a* b* 0,71 ± 0,09 MDA-MB-231 WT 1,377 ± 0,098 0,465 ± 0,048 H460 WT 1,092 ± 0,089 0,332 ± 0,049 H460 EV 1,071 ± 0,418 0,308 ± 0,071 H460 CYP3A4 1,117 ± 0,234 0,178 ± 0,033 a* b* H460 UGT1A10 0,820 ± 0,226 a* 0,427 ± 0,040 a* b* A549 WT 1,371 ± 0,088 0,822 ± 0,112 A549 EV 1,283 ± 0,058 0,957 ± 0,142 A549 CYP3A4 1,296 ± 0,080 0,717 ± 0,046 Wartości IC50 przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie minimum trzech niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t-studenta. a statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii WT; b statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii EV, gdzie * P < 0,05. Komórki MCF-7 i H460 o przejściowej nadekspresji izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 charakteryzowały się inną wrażliwością na działanie związków niż komórki typu dzikiego, WT i kontrolne z wektorem pustym, EV. Podwyższony poziom CYP3A4 w komórkach MCF-7 CYP3A4 spowodował obniżenie dawki IC 50 obu pochodnych: z 1,64 µm do 0,71 µm dla C-1305 oraz z 0,74 µm do 0,45 µm dla C-1311. W komórkach H460 CYP3A4 taki efekt był obserwowany tylko dla jednego związku C-1311. Wobec tychże komórek dawka IC 50 pochodnej C-1311 wynosiła 0,178 µm, zaś w komórkach H460 WT 0,332 µm. Warto zaznaczyć, że podwyższenie cytotoksyczności związku C-1311 w komórkach o nadekspresji CYP3A4 było obserwowane również w przypadku komórek A549, jednak różnica wyznaczonych dawek IC 50 wobec komórek A549 WT (0,822 µm) i A549 CYP3A4 (0,717 µm) była statystycznie nieistotna. Podsumowując, podwyższony poziom izoenzymu CYP3A4 spowodował zwiększenie cytotoksycznych właściwości pochodnej imidazoakrydonu C-1311 w komórkach MCF-7 i H460 oraz triazoloakrydonu C-1305, ale tylko w komórkach MCF-7.

Wyniki 155 Przejściowy podwyższony poziom izoenzymu UGT1A10 został osiągnięty jedynie w komórkach MCF-7 i H460, które nie wykazują ekspresji tego białka. Komórki A549 posiadają endogenny enzym, stąd wprowadzanie dodatkowych kopii jego genów było bezpodstawne. Tworzenie glukuronidu pochodnej C-1305 w komórkach MCF-7 UGT1A10 istotnie zwiększało cytotoksyczność związku dawka IC 50 zmalała z 1,64 µm do 0,71 µm. Zmiana cytotoksyczności nie zachodziła dla związku C-1311. Zwiększenie wrażliwości komórek o wysokim poziomie enzymu UGT1A10 na działanie związku C-1305 obserwowane było również w komórkach H460. Tutaj dawka IC 50 zmalała z 1,092 µm wobec komórek H460 WT do 0,82 µm wobec H460 UGT1A10. Co ciekawe, sprzęganie z kwasem glukuronowym pochodnej C-1311 prowadziło do istotnego obniżenia właściwości cytotoksycznych związku wobec komórek H460. Tutaj dawka IC 50 wzrosła z 0,333 µm do 0,427 µm. Podsumowując, glukuronid pochodnej C-1305 był bardziej cytotoksyczny od związku wyjściowego wobec komórek MCF-7 i H460, zaś glukuronid C-1311 mniej, choć efekt ten obserwowany był jedynie w komórkach H460.

Wyniki 156 5.6 Badanie metabolizmu i odpowiedzi biologicznej w komórkach MCF-7 o stabilnej nadekspresji CYP3A4 i UGT1A10 traktowanych pochodnymi C-1305 oraz C-1311 W związku z tym, że wyniki otrzymane poprzednio przy zastosowaniu linii komórkowych o przejściowej nadekspresji izoenzymów CYP3A4 i UGT1A10 wskazały na zmianę aktywności cytotoksycznej pochodnych akrydonu C-1305 i C-1311 oraz powstawanie glukuronidów związków w warunkach podwyższonej ekspresji UGT1A10 zwłaszcza w komórkach MCF-7 i H460, opracowałam model komórkowy o stabilnej nadekspresji wspomnianych białek. Komórki, które wybrałam jako system ekspresyjny to ludzkie komórki raka piersi, MCF-7. Zostały one wybrane ze względu na wyniki badań klinicznych, podczas których pochodna imidazoakrydonu była podawana właśnie pacjentkom z nowotworem piersi [Capizzi i wsp., 2008]. Dodatkową przesłanką były wyniki, które wykazały, że w funkcjonowaniu komórek raka piersi dużą rolę może odgrywać izoenzym CYP3A4 cytochromu P450 oraz enzymy z rodziny UGT [Mitra i wsp., 2011; Guillemette i wsp., 2004]. 5.6.1 Otrzymanie komórek MCF-7 o stabilnej nadekspresji izoenzymów CYP3A4 i UGT1A10 Dokładna procedura otrzymania stabilnych linii komórkowych została przedstawiona w rozdziale 4.3.12. Po elektroporacji i wprowadzeniu do komórek MCF-7 kolejno odpowiednich plazmidów: (i) pcdna3/cyp3a4/c-myc/his dla osiągnięcia nadekspresji CYP3A4, (ii) pcdna3.39/ugt1a10 i pcdna3.1 obu jednocześnie (w stosunku 9:1) dla uzyskania wysokiego poziomu UGT1A10 oraz (iii) wektora pustego pcdna3.1 dla otrzymania linii kontrolnej, komórki pozostawiałam na 48 godzin w warunkach standardowej hodowli w celu ich przyklejenia się do podłoża oraz powrotu do prawidłowego funkcjonowania i proliferacji po elektroporacji. Po tym czasie dodawałam do komórek genetycynę G418 (500 µg/ml) w celu selekcji komórek z plazmidem prawidłowo zintegrowanym z genomem komórki. Każdy z zastosowanych plazmidów (oprócz pcdna3.39/ugt1a10) zawierał odcinek kodujący białko oporności na neomycynę (genetycynę G418), dzięki czemu taką selekcję można było przeprowadzić. Po dwutygodniowej inkubacji komórek MCF-7 z czynnikiem selekcyjnym, wymieniałam pożywkę na świeżą, bez dodatku G418 i czekałam kolejne dwa tygodnie do uzyskania pojedynczych kolonii komórkowych, które następnie przenosiłam do osobnych pojemników hodowlanych i namnażałam. Każdy z otrzymanych klonów poddawałam analizie w celu weryfikacji, czy wprowadzony plazmid ulegał ekspresji i powstawał funkcjonalny katalitycznie izoenzym CYP3A4 lub UGT1A10. Klon, który charakteryzował się najwyższą ekspresją i aktywnością

Wyniki 157 wspomnianych białek został namnożony i zamrożony. Otrzymane w ten sposób komórki były gotowe do dalszych badań. Nazwy, jakie zostały im przypisane to: MCF-7-CYP3A4, MCF-7-UGT1A10 oraz linia kontrolna, MCF-7-EV. a. Analiza ekspresji cyp3a4 i ugt1a10 metodą Real-Time PCR W pierwszej kolejności sprawdziłam poziom ekspresji genów cyp3a4 i ugt1a10 w komórkach modelu MCF-7: komórkach kontrolnych MCF-7-EV oraz rekombinantowych MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10. Analizę przeprowadziłam metodą łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym, Real-Time PCR. Tabela 30 Względny wzrost poziomu mrna kodującego białka: CYP3A4 w komórkach MCF-7-CYP3A4 i UGT1A10 w komórkach MCF-7-UGT1A10 względem komórek kontrolnych, MCF-7-EV. Gen Względny wzrost poziomu mrna cyp3a4 2,89 ± 0,11 ugt1a10 12,19 ± 1,13 Tabela przedstawia wartości ± odchylenie standardowe. Uzyskany wynik pochodzi z dwóch niezależnych doświadczeń, w których poziom ekspresji poszczególnych genów mierzony był dwukrotnie. W komórkach MCF-7-CYP3A4 poddanych stabilnej transfekcji izoenzymem CYP3A4 cytochromu P450 wzrost ekspresji białka względem komórek kontrolnych MCF-7-EV był prawie 3-krotny (Tabela 30). Nie jest to wysoki wzrost, ale wystarczający do obserwacji różnic w odpowiedzi biologicznej indukowanej przez związki C-1305 i C-1311. Najistotniejsze jest by aktywność izoenzymu CYP3A4 była odpowiednio wysoka, co zostało określone w kolejnych eksperymentach. Względny wzrost poziomu ekspresji genu ugt1a10 między komórkami MCF-7-EV a MCF-7-UGT1A10 wynosił nieco ponad 12 razy. Był to duży wzrost, gwarantujący wysoką aktywność białka. Podsumowując, wprowadzenie do komórek MCF-7 dodatkowych kopii genów kodujących izoenzymy CYP3A4 i UGT1A10 było skuteczne, dzięki czemu została osiągnięta stabilna nadekspresja obu białek. b. Poziom białka i aktywność katalityczna izoenzymu CYP3A4 Wyżej opisane doświadczenie wykazało, że gen cyp3a4 ulegał ekspresji i powstawało odpowiednie mrna. W następnym etapie sprawdziłam zatem, czy mrna zostało przepisane na łańcuch aminokwasów analizując poziom białka CYP3A4 metodą Western blot i czy białko to było aktywne katalitycznie. W celu określenia aktywności izoenzymu CYP3A4 zbadałam jego zdolność do metabolizowania standardowego substratu, testosteronu do pochodnej 6-β-hydroksytestosteronu za pomocą techniki HPLC.

Wyniki 158 A B 20 MCF-7-CYP3A4 Absorpcja [mau] 15 10 5 MCF-7-EV 0 20 22 24 26 28 Czas retencji [min] Rysunek 67 Poziom białka CYP3A4 i jego aktywność katalityczna w komórkach MCF-7-EV i MCF-7-CYP3A4. (A) Poziom białka CYP3A4 został określony metodą Western blot. Przestawiony wynik jest reprezentatywny dla dwóch niezależnych doświadczeń. (B) Chromatogramy uzyskane z analizy metodą RP-HPLC metabolizmu testosteronu (stężenie 50 µm, czas 24 godziny) w komórkach MCF-7-EV i MCF-7-CYP3A4 przy długości fali 254 nm. Strzałka wskazuje na metabolit testosteronu, 6-β-hydroksytestosteron, charakterystyczny dla obecności w komórkach izoenzymu CYP3A4. Przedstawione chromatogramy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Analiza Western blot poziomu białka CYP3A4 w komórkach modelu MCF-7 pokazała, że widoczny na kliszy prążek odpowiadający komórkom o nadekspresji izoenzymu CYP3A4 był intensywniejszy niż ten uzyskany dla komórek kontrolnych. Tak więc w komórkach linii MCF-7-CYP3A4 nastąpił wzrost ilości enzymu w stosunku do tego obserwowanego w komórkach kontrolnych, MCF-7-EV (Rysunek 67 A). Z kolei badanie przemiany standardowego substratu izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450, testosteronu do pochodnej 6-β-hydroksylowej wykazało, że w komórkach MCF-7-CYP3A4 powstawało więcej wspomnianego metabolitu niż w komórkach MCF-7-EV (Rysunek 67 B). Konwersja testosteronu w komórkach z nadekspresją białka wynosiła około 1,5%, zaś w komórkach kontrolnych zaledwie 0,2%. Podsumowując, w komórkach MCF-7-CYP3A4 poziom i aktywność katalityczna izoenzymu CYP3A4 były wyższe w stosunku do komórek wyjściowych, choć wzrost ten nie był tak wysoki, jak w komórkach Hep3A4, czy CHO-HR-3A4. 5.6.2 Przemiany metaboliczne pochodnych C-1305 i C-1311 w komórkach MCF- 7 W dalszej części badań dotyczących modelu komórek MCF-7 określiłam ich zdolność do metabolizowania pochodnych C-1305 i C-1311. Tym samym mogłam określić, czy osiągnięta stabilna nadekspresja izoenzymu UGT1A10 była równoznaczna z powstaniem aktywnego katalitycznie białka. Na Rysunku 68 zamieściłam chromatogramy uzyskane z analizy HPLC metanolowych lizatów wyizolowanych z komórek MCF-7-EV i MCF-7-UGT1A10 inkubowanych ze związkami C-1305 i C-1311 od 24 do 72 godzin oraz pozostałej po inkubacji pożywki hodowlanej. Nie zamieszczałam przemian metabolicznych w komórkach MCF-7-CYP3A4 ze względu na brak różnic względem komórek kontrolnych, MCF-7-EV.

Wyniki 159 C-1305 A Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g B Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 S 72 g 48 g 24 g C Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 25 20 15 10 5 C-1311 G Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 S Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g D Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 50 40 30 20 10 G Czas retencji [min] 0 10 15 20 25 S Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g A Absorpcja [mau] 25 20 15 10 5 S 72 g 48 g 24 g B Absorpcja [mau] 50 40 30 20 10 S 72 g 48 g 24 g C Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 25 20 15 10 5 G Czas retencji [min] S 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g D Absorpcja [mau] 0 10 15 20 25 50 40 30 20 10 Czas retencji [min] S 0 10 15 20 25 Czas retencji [min] 72 g 48 g 24 g Rysunek 68 Chromatogramy uzyskane z analizy metabolizmu pochodnej C-1305 i C-1311 (stężenie 30 µm) w komórkach: MCF-7-EV w: lizatach komórkowych (A) i pożywce (B) oraz MCF-7-UGT1A10 w: lizatach komórkowych (C) i pożywce (D) przy długości fali 420 nm. S oznacza substrat, czyli związek wyjściowy C-1305 lub C-1311, G glukuronid danego związku. Chromatogramy są reprezentatywne dla czterech niezależnych doświadczeń.

Wyniki 160 Chromatogramy pochodzące z analizy metabolizmu pochodnej C-1305 w komórkach MCF-7-EV wyglądały bardzo podobnie jak te dla komórek MCF-7 WT. Tuż za związkiem wyjściowym (czas retencji około 19 min.), zarówno na chromatogramie otrzymanym z badania lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, widoczny był dodatkowy pik, który mógł pochodzić od pochodnej N-tlenkowej (Rysunek 68 A, B). Pochodna imidazoakrydonu C-1311 ulegała niewielkim przemianom metabolicznym w komórkach MCF-7-EV. Związek wyjściowy widoczny był na chromatogramie około 16 minuty czasu retencji (Rysunek 68 A, B). W jego okolicy można było zauważyć dwa metabolity jeden tuż przed, a drugi za substratem. Analiza pożywki hodowlanej pozostałej po inkubacji komórek MCF-7-EV z C-1311 wskazała na obecność tylko substratu. Tabela 31 Stopień przemiany triazoloakrydonu C-1305 i imidazoakrydonu C-1311 o stężeniu 30 µm do pochodnej glukuronowej zachodzący w komórkach MCF-7-UGT1A10. Czas inkubacji [godz.] Stopień przemiany związku Lizaty komórkowe Pożywka hodowlana C-1305 C-1311 C-1305 C-1311 24 0,090 ± 0,029 0,058 ± 0,015 13,18 ± 2,51 6,49 ± 0,79 48 0,165 ± 0,037 0,103 ± 0,025 29,38 ± 4,16 18,48 ± 2,54 72 0,395 ± 0,110 0,243 ± 0,091 47,29 ± 5,38 32,65 ± 0,68 Metabolizm związku został sprawdzony po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji komórek z C-1305 i C-1311. Ilość powstającego glukuronidu została określona w lizacie komórkowym i pożywce hodowlanej. Przedstawione wartości to średnia ± odchylenie standardowe oznaczone na podstawie czterech niezależnych doświadczeń. Analiza przemian metabolicznych pochodnych C-1305 i C-1311 w komórkach MCF-7-UGT1A10 pokazała, że w wyniku osiągniętej stabilnej nadekspresji izoenzymu UGT1A10, oba związki ulegały sprzężeniu z kwasem glukuronowym. Na otrzymanych chromatogramach (Rysunek 68 C, D) glukuronid pochodnej C-1305 widoczny był w okolicy 14 minuty, zaś C-1311 12 minuty. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji rosło stężenie powstającego glukuronidu, zarówno w samych komórkach, jak i w pożywce hodowlanej. Należy jednak zwrócić uwagę, że stężenie pochodnych glukuronowych związków C-1305 i C-1311 pozostawało bardzo niskie wewnątrz komórek. Po 72 godzinach od dodania związku wewnątrz komórek było około 0,4% glukuronidu C-1305 (Tabela 31) oraz 0,24% glukuronidu C-1311. Większość powstającego koniugatu pochodnej C-1305 i C-1311 z kwasem glukuronowym ulegała usunięciu poza komórkę. Po 72 godzinach inkubacji 47% i 32,5% odpowiednio związku C-1305 i C-1311 była w formie glukuronidu. Podsumowując, osiągnięta nadekspresja UGT1A10 w komórkach MCF-7 była wysoka. Związek C-1305 w komórkach MCF-7-UGT1A10 ulegał koniugacji z kwasem glukuronowym silniej niż w komórkach MCF-7 o przejściowo podwyższonym poziomie enzymu.

Wyniki 161 5.6.3 Cytotoksyczność C-1305 i C-1311 wobec komórek MCF-7 Dotychczas wykonane przeze mnie badania na różnych liniach komórkowych pokazały, że zmiana w ekspresji izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 oraz izoenzymu UGT1A10 UDP-glukuronylotransferazy wpływała na wrażliwość komórek wobec stosowanych pochodnych C-1305 i C-1311. Stąd kolejnym ważnym etapem badań na modelu komórek MCF-7 o stabilnej nadekspresji wyżej wymienionych enzymów było określenie cytotoksyczności obu związków. Badanie cytotoksyczności C-1305 i C-1311 wykonałam dwoma sposobami: metodą liczenia komórek w liczniku Coulter Counter (podobnie jak w badaniach na komórkach CHO) oraz z zastosowaniem barwnika MTT (jak w eksperymentach dla pozostałych linii komórkowych). Krzywe zahamowania wzrostu komórek wyznaczyłam po 72 godzinnej inkubacji ze związkiem. a. Metoda liczenia komórek w liczniku Coulter Counter Tabela 32 Wartości aktywności cytotoksycznej C-1305 i C-1311 (IC50, IC80 i IC90) wobec komórek trzech linii nowotworu piersi: MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10 wyznaczone po 72-godzinnej inkubacji z danym związkiem metodą liczenia komórek. Stężenie MCF-7-EV MCF-7-CYP3A4 MCF-7-UGT1A10 Związek C-1305 IC 50 [μm] 1,53 ± 0,33 0,96 ± 0,10* 1,49 ± 0,32 IC 80 [μm] 4,87 ± 0,86 4,71 ± 0,84 5,48 ± 0,77 IC 90 [μm] 14,68 ± 0,13 15,38 ± 3,12 15,76 ± 3,86 Związek C-1311 IC 50 [μm] 0,36 ± 0,08 0,23 ± 0,01* 0,33 ± 0,04 IC 80 [μm] 1,04 ± 0,12 0,70 ± 0,02* 1,00 ± 0,06 IC 90 [μm] 11,86 ± 1,02 11,36 ± 3,12 10,30 ± 3,13 Wartości IC50, IC80 i IC80 przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie minimum trzech niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t-studenta. * P < 0,05, statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii MCF-7-EV Badanie cytotoksyczności metodą liczenia komórek wykazało, że zahamowanie wzrostu 50% komórek w stosunku do kontroli następowało przy stężeniu związku wynoszącym około 1,5 µm, 80% przy około 5 µm, a 90% przy 15 µm (Tabela 32). Jedynie IC 50 obliczone wobec komórek MCF-7-CYP3A4 było niższe od tego wobec komórek MCF-7-EV i wynosiło niecałe 1 µm (różnica statystycznie istotna). Zatem wszystkie linie modelu MCF-7, poza jednym wyjątkiem, charakteryzowały się zbliżoną wrażliwością na stosowany związek dla wyznaczanej dawki efektywnej. Pochodna C-1311 silniej oddziaływała na komórki modelu MCF-7 niż związek C-1305. Dawka IC 50 wynosiła nieco ponad 0,3 µm, IC 80 1 µm, a IC 90 około 11 µm.

Wyniki 162 Nadekspresja izoenzymu CYP3A4 również w przypadku działania związku C-1311 spowodowała zwiększenie jego cytotoksyczności. Podsumowując, komórki modelu MCF-7 były bardziej wrażliwe na działanie pochodnej imidazoakrydonu C-1311 niż triazloakrydonu C-1305. Podwyższony poziom izoenzymu CYP3A4 powodował zwiększenie cytotoksyczności obu związków, ale jedynie w zakresie niższych stężeń. Nadekspresja UGT1A10 nie wpływała na efekt działania pochodnych. b. Metoda z zastosowaniem barwnika MTT Tabela 33 Wartości aktywności cytotoksycznej C-1305 i C-1311 (IC50, IC80 i IC90) wobec komórek trzech linii nowotworu piersi: MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10 wyznaczone po 72-godzinnej inkubacji z danym związkiem metoda z zastosowaniem barwnika MTT. Stężenie MCF-7-EV MCF-7-CYP3A4 MCF-7-UGT1A10 Związek C-1305 IC 50 [μm] 1,87 ± 0,05 1,55 ± 0,23* 1,57 ± 0,08* IC 80 [μm] 9,19 ± 1,45 6,28 ± 0,73* 6,37 ± 0,73* IC 90 [μm] 20,83 ± 1,99 10,13 ± 1,21* 12,50 ± 1,65* Związek C-1311 IC 50 [μm] 1,83 ± 0,12 0,78 ± 0,01* 2,46 ± 0,22* IC 80 [μm] 16,23 ± 2,67 11,83 ± 0,02* 27,05 ± 3,61* IC 90 [μm] 40,07 ± 6,60 27,70 ± 3,79 63,38 ± 3,13* Wartości IC50, IC80 i IC80 przedstawiono w postaci średnich ± odchylenie standardowe na podstawie minimum trzech niezależnych eksperymentów. Analizę statystyczną pomiędzy danymi wartościami przeprowadzono testem t-studenta. * P < 0,05 statystycznie istotna różnica w stosunku do komórek linii MCF-7-EV Pochodna triazoloakrydonu C-1305 w teście z MTT oddziaływała słabiej na komórki linii MCF-7-EV niż w metodzie liczenia komórek. Wyznaczone dawki wynosiły: IC 50 1,9 µm, IC 80 niecałe 10 µm, a IC 90 20 µm (Tabela 33). Co więcej, wrażliwość na działanie C-1305 komórek pozostałych dwóch linii, MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10 była do siebie bardzo zbliżona, ale istotnie wyższa od tej wyznaczonej dla MCF-7-EV. Zatem metoda określania cytotoksyczności z zastosowaniem barwnika MTT uwidoczniła różnice we wrażliwości komórek modelu MCF-7 na działanie pochodnej triazoloakrydonu C-1305. Stężenia efektywne IC 50, IC 80 i IC 90 obliczone dla pochodnej imidazoakrydonu C-1311 wobec komórek MCF-7-EV wynosiły odpowiednio 1,8 µm, 16 µm i 40 µm (Tabela 34). Wyniki zdecydowanie różniły się od tych wyznaczonych metodą liczenia komórek (Tabela 33). Stabilna nadekspresja izoenzymu CYP3A4 podwyższyła wrażliwość komórek MCF-7 na działanie pochodnej C-1311. Natomiast komórki linii MCF-7-UGT1A10 reagowały na traktowanie

Wyniki 163 pochodną imidazoakrydonu w sposób odmienny. Dawki efektywne C-1311 wobec tych komórek były dużo wyższe niż dla komórek MCF-7-EV. Podsumowując, pochodna C-1311 przy podwyższonej ekspresji izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 silniej hamowała proliferację komórek modelu MCF-7, zaś przy nadekspresji izoenzymu UGT1A10 właściwości cytotoksyczne pochodnej były słabsze. Co więcej, pokazałam, że wrażliwość na działanie związku C-1311 komórek MCF-7 typu dzikiego i rekombinantowych z dodatkowym odcinkiem DNA niekodującym żadnego białka była odmienna. Opracowanie linii kontrolnej, poddanej transfekcji pustym wektorem i innym procesom mającym na celu uzyskanie klonu o stałej obecności dodatkowej sekwencji DNA było zatem istotne dla wiarygodności i rzetelności przedstawianych wyników. 5.6.4 Analiza dystrybucji w cyklu życiowym komórek MCF-7 Badanie cytotoksyczności związków C-1305 i C-1311 wykazało, że przy podwyższonym poziomie enzymów CYP3A4 i UGT1A10 zmieniały się właściwości antyproliferacyjne badanych pochodnych wobec komórek MCF-7. Nasuwa się zatem pytanie, czy odpowiedź biologiczna tychże komórek również ulegnie zmianie. W pierwszej kolejności zbadałam wpływ związków C-1305 i C-1311 na dystrybucję komórek w cyklu życiowym. Badanie wykonałam na komórkach trzech linii: MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10 traktowanych związkami od 24 do 120 godzin w stężeniu odpowiadającemu dawce IC 80: 5 µm dla C-1305 i 1 µm dla C-1311. a. Działanie pochodnej triazoloakrydonu C-1305 Badanie dystrybucji w cyku życiowym komórek MCF-7 traktowanych pochodną triazoloakrydonu C-1305 wykazało, że związek nie indukował wyraźnych zmian w rozkładzie komórek w poszczególnych fazach cyklu (Rysunek 69 i 70). W miarę wzrostu czasu inkubacji wielkość danej frakcji (G 1, S, G 2/M) komórek linii MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10 pozostawała na podobnym poziomie. Również liczba komórek poliploidalnych nie ulegała zmianie w trackie ich ekspozycji na chemoterapeutyk. Począwszy od 72 godzin inkubacji można było zaobserwować niewielki wzrost liczby komórek o pofragmentowanym DNA, tzw. frakcji sub- G 1, która po 120 godzinach wynosiła dla każdej z trzech linii modelu MCF-7 około 4-5%.

Wyniki 164 Rysunek 69 Histogramy obrazujące zmiany w dystrybucji komórek linii MCF-7 w cyklu życiowym, inkubowanych z pochodną C-1305 (5 μm) przez podaną liczbę godzin. Oś X intensywność fluorescencji jodku propidyny określającego zawartość DNA w komórce. Oś Y ilość komórek. Przedstawione histogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Rysunek 70 Procentowy rozkład komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego dla trzech linii MCF-7 inkubowanych z pochodną C-1305 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80. Wykres uwzględnia procentową zawartość komórek w fazach: G1, S i G2/M oraz frakcję komórek sub-g1 i poliploidalnych (Poli).

Wyniki 165 b. Działanie pochodnej imidazoakrydonu C-1311 Rysunek 71 Histogramy obrazujące zmiany w dystrybucji komórek modelu MCF-7 w cyklu życiowym, inkubowanych z pochodną C-1311 (1 μm) przez podaną liczbę godzin. Oś X intensywność fluorescencji jodku propidyny określającego zawartość DNA w komórce. Oś Y ilość komórek. Przedstawione histogramy są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń. Pochodna C-1311 w miarę wzrostu czasu inkubacji indukowała zmiany w przebiegu cyklu życiowego komórek MCF-7 (Rysunek 71). Począwszy od 24 godzin ekspozycji wyraźnie spadała populacja komórek będących w fazie G 1 cyklu życiowego. Jednocześnie wzrastała liczba komórek o 4N DNA, znajdujących się w fazie G 2 lub w trakcie mitozy. We wszystkich liniach MCF-7 dochodziło zatem do zahamowania przebiegu cyklu życiowego w punkcie G 2/M po 48 i 72 godzinnej ekspozycji na C-1311 około 60-65% komórek posiadało 4n DNA (Rysunek 72). Od 96 godzin inkubacji populacja ta zaczęła maleć, co przełożyło się na pojawienie się komórek o zdegradowanym materiale genetycznym, czyli frakcji sub-g 1. Po 120 godzinach liczba komórek o zawartości DNA mniejszej niż 2n wynosiła 22,2%, 26,9% i 20,2% odpowiednio dla komórek linii MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10 (Rysunek 73). Przedstawione

Wyniki 166 wartości dla typów komórek EV i CYP3A4 oraz EV i UGT1A10 różniły się od siebie statycznie istotnie (odpowiednio P = 0,001 i P = 0,04). Liczba komórek poliploidalnych przez wszystkie czasy inkubacji pozostawała na podobnym poziomie dla wszystkich trzech badanych linii, zaś populacja komórek, w których zachodziła synteza DNA, nieznacznie malała począwszy od 24 godzin ekspozycji. Podsumowując, pochodna imidazoakrydonu C-1311 w komórkach MCF-7 powodowała blok cyklu życiowego w fazie G 2/M. Wzrost czasu ekspozycji komórek na związek prowadził do degradacji materiału genetycznego, przy czym nadekspresja izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 potęgowała ten efekt, a podwyższony poziom UGT1A10 obniżył. Glukuronid pochodnej C-1311 posiadał zatem nieco słabsze właściwości degradujące DNA niż związek wyjściowy. Rysunek 72 Procentowy rozkład komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego dla trzech linii MCF-7 inkubowanych z pochodną C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80. Wykres uwzględnia procentową zawartość komórek w fazach: G1, S i G2/M oraz frakcję komórek sub-g1 i poliploidalnych (Poli). Rysunek 73 Wielkość frakcji sub-g1, czyli komórek o zdegradowanym materiale genetycznym MCF-7 poddanych działaniu C-1311 (1 µm) przez podane czasy. Wykres został wyznaczony na podstawie trzech niezależnych doświadczeń. * P < 0,05 statystycznie istotne różnice między komórkami linii MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10 w stosunku do komórek MCF-7-EV 5.6.5 Identyfikacja żywych/martwych komórek MCF-7 traktowanych związkami Analiza dystrybucji komórek w cyklu życiowym wykazała, że ekspozycja komórek MCF- 7 na pochodne C-1305 i C-1311 prowadziła do degradacji DNA. We frakcji sub-g 1 zwykle znajdują się komórki, w których na skutek uszkodzenia DNA doszło do indukcji śmierci komórkowej, najczęściej na drodze apoptozy, ale również nekrozy. Stąd kolejnym etapem badań na modelu komórek MCF-7 było określenie dokładnej liczby komórek, w których pod wpływem

Wyniki 167 działania związków indukowana była śmierć komórkowa. W tym celu przeprowadziłam barwienie przyżyciowe komórek MCF-7, barwiąc je dioctanem fluoresceiny (FDA) i jodkiem propidyny (PI). Badaniu poddałam komórki wszystkich trzech linii MCF-7 traktowanych związkami C-1305 i C-1311 od 24 do 120 godzin w stężeniu IC 80. Wyniki odczytałam za pomocą cytometru przepływowego. a. Działanie pochodnej triazoloakrydonu C-1305 Komórki MCF-7 traktowane pochodną C-1305 w niewielkim stopniu ulegały śmierci komórkowej. Po 120 godzinach inkubacji zaledwie 5,0% komórek linii MCF-7-EV, 6,3% MCF-7-CYP3A4 oraz 5,0% MCF-7-UGT1A10 miała przerwaną błonę komórkową i barwiła się jodkiem propidyny (Rysunek 74). Nadekspresją wybranego enzymu metabolizującego nie miała wpływu na liczbę komórek martwych pojawiających się na skutek działania związku C-1305. Rysunek 74 Liczba komórek martwych wśród populacji komórek MCF-7 poddanych działaniu C-1305 (5 µm) przez podane czasy. Wykres został wyznaczony na podstawie dwóch niezależnych doświadczeń analizowanych dwukrotnie. b. Działanie pochodnej imidazoakrydonu C-1311 Analiza cytometryczna wielkości populacji komórek żywych i martwych MCF-7 inkubowanych z pochodną C-1311 wykazała, że przez pierwsze 4 doby ekspozycji związek prowadził do śmierci niewielkiej liczby komórek (od 6 do 8,5%, Rysunek 75). Dopiero po 120 godzinach ekspozycji wyraźnie wzrosła populacja komórek wybarwionych jodkiem propidyny. Wynosiła ona: dla komórek linii MCF-7-EV 25%, MCF-7-CYP3A4 35,5% oraz MCF-7-UGT1A10 24,5%. Komórki o nadekspresji izoenzymu CYP3A4 cytochromu P450 w największym stopniu ulegały śmierci na skutek działania C-1311, a zatem obecność tego białka istotnie wpływała na odpowiedź biologiczną komórek MCF-7 traktowanych tą pochodną. Rysunek 75 Liczba komórek martwych wśród populacji komórek MCF-7 poddanych działaniu C-1311 (1 µm) przez podane czasy. Wykres został wyznaczony na podstawie dwóch niezależnych doświadczeń analizowanych dwukrotnie. * P < 0,05 statystycznie istotna różnica między komórkami linii MCF-7-CYP3A4 w stosunku do komórek MCF-7-EV

Wyniki 168 5.6.6 Obserwacje mikroskopowe jąder komórek MCF-7 Dotychczasowe badania pokazały, że pochodna C-1305 indukowała zmiany w cyklu życiowym i śmierć komórek MCF-7 w niewielkim zakresie. Z kolei związek C-1311 wywierał silniejszy wpływ na komórki nowotworowe piersi wraz ze wzrostem czasu inkubacji dochodziło do systematycznej degradacji materiału genetycznego. W celu poznania drogi śmierci komórek (apoptoza bądź nekroza) wykonałam kilka doświadczeń. Jako pierwszą przeprowadziłam obserwację jąder komórek MCF-7 traktowanych związkami C-1305 i C-1311 w dawce IC 80 od 24 do 120 godzin. Po zakończonej inkubacji komórki barwiłam DAPI i oglądałam pod mikroskopem fluorescencyjnym w świetle UV. a. Działanie pochodnej triazoloakrydonu C-1305 Pochodna C-1305 powodowała niewielkie zmiany w morfologii jąder komórek modelu MCF-7 (Rysunek 76). Począwszy od 72 godzin inkubacji można było zaobserwować pojedyncze komórki o nieprawidłowej budowie jądra. Cześć z nich charakteryzowała się skondensowaną i pofragmentowaną chromatyną, co mogło wskazywać na indukcję apoptozy. Widać było kilka komórek wielojądrzastych typowych dla katastrofy mitotycznej. Obecne były także komórki, których chromosomy charakteryzowały się zaburzoną strukturą i nieregularnym ułożeniem, co świadczyło o nieprawidłowym przebiegu mitozy. Liczba komórek o zmienionej morfologii jądra wzrastała z każdą kolejną dobą ekspozycji i po 120 godzinach osiągnęła wartość: 5,7±1,6% dla komórek MCF-7-EV, 6,3±1,2% dla MCF-7-CYP3A4 i 7,6±0,8% dla MCF-7-UGT1A10. Przedstawione wartości nie różniły się statystycznie istotnie (P > 0,05). MCF-7-EV

Wyniki 169 MCF-7-CYP3A4 MCF-7-UGT1A10 24 godziny 48 godzin 72 godziny 96 godzin 120 godzin Rysunek 76 Morfologia jąder komórek MCF-7 traktowanych pochodną triazoloazoakrydonu C-1305 (5 μm), wybarwionych DAPI i oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w świetle UV przy powiększeniu 400x. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Gruba strzałka wskazuje zmiany sugerujące apoptozę, cienka strzałka katastrofę mitotyczną, grot nieprawidłową mitozę. Zatem nadekspresja izoenzymu CYP3A4 i UGT1A10 nie wpływała na indukcję zmian w morfologii jądra w komórkach nowotworu piersi, MCF-7 traktowanych związkiem C-1305. b. Działanie pochodnej imidazoakrydonu C-1311 Obserwacje mikroskopowe morfologii jąder komórek MCF-7 wykazały, że związek C-1311 indukował znaczące zmiany w budowie i strukturze jąder po dłuższych czasach inkubacji. Do zmian tych należały: kondensacja i fragmentacja chromatyny, co mogło świadczyć o indukcji apoptozy, tworzenie się tzw. mikrojąder będących efektem katastrofy mitotycznej, zaburzenia w strukturze jądra o trudnym do zakwalifikowania pochodzeniu oraz figury mitotyczne o nieregularnych i uszkodzonych chromosomach (Rysunek 77). Dwie ostatnie zmiany świadczyły o nieprawidłowym przebiegu procesu mitozy, której efektem końcowym mogła być nekroza. Liczba komórek o takiej morfologii systematycznie rosła w miarę wzrostu czasu inkubacji. Po 120 godzinach znacząco wzrosła również populacja komórek o morfologii sugerującej indukcję apoptozy. Ilość komórek o zmianach typowych dla katastrofy mitotycznej

Wyniki 170 dla trzech badanych linii utrzymywała się na podobnym, bardzo niskim poziomie w granicach 2-4% po dłuższych czasach inkubacji (Rysunek 78). MCF-7-EV Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny 96 godzin 120 godzin MCF-7-CYP3A4 Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny 96 godzin 120 godzin

Wyniki 171 MCF-7-UGT1A10 Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny 96 godzin 120 godzin Rysunek 77 Morfologia jąder komórek MCF-7 traktowanych pochodną imidazoakrydonu C-1311 (1 μm), wybarwionych DAPI i oglądanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w świetle UV przy powiększeniu 400x. Przedstawione zdjęcia są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Gruba strzałka wskazuje zmiany sugerujące apoptozę, cienka strzałka katastrofę mitotyczną, grot nieprawidłową mitozę. Należy zaznaczyć, że przedstawiony opis i obliczenia (Rysunek 78) mogą być obarczone błędem. Niejednokrotnie trudno było odróżnić komórkę apoptotyczną od tej, w której doszło do nieprawidłowej mitozy mowa tu o strukturach: (i) podobnych do ciałek apoptotycznych lub pofragmentowanego jądra, ale o słabszej kondensacji chromatyny lub (ii) jądrach silnie skondensowanych przypominających jądro pyknotyczne, które nie muszą wskazywać na początek apoptozy. Opisane zmiany morfologiczne mogą wskazywać na przebieg nekrozy, dla której również obserwowano pyknozę i karioreksję [Elmore, 2007]. To, czy w komórkach MCF- 7 traktowanych pochodną C-1311 doszło do indukcji apoptozy czy nekrozy będą mogły rozstrzygnąć eksperymenty przedstawione w dalszej części pracy. Rysunek 77 Procentowy rozkład komórek o zmianach w morfologii jądra charakterystycznych dla: katastrofy mitotycznej, apoptozy i nieprawidłowego przebiegu mitozy dla trzech linii komórek MCF-7 inkubowanych z pochodną C-1311 w stężeniu odpowiadającemu wartości IC80.

Wyniki 172 Na tym etapie należy zatem analizować sumaryczny udział komórek, których zmiany sugerowały indukcję apoptozy i zaburzony przebieg mitozy wśród komórek MCF-7 traktowanych C-1311 (Rysunek 79). Najwyższy przyrost tychże frakcji przez pierwsze 3 doby ekspozycji następował dla komórek MCF-7-UGT1A10. Po 72 godzinnej inkubacji populacja komórek apoptotycznych i mitotycznych była wyraźnie wyższa, zarówno dla linii MCF-7-UGT1A10, jak i MCF-7-CYP3A4. Z kolei po 96 godzinach komórki z nadekspresją izoenzymu CYP3A4 uległy największej degradacji. Po 120 godzinach inkubacji komórek o zmienionym jądrze było łącznie: 50% wśród MCF-7-EV, 60% wśród MCF-7-CYP3A4 oraz 46% wśród MCF-7-UGT1A10. Rysunek 79 Liczba komórek modelu MCF-7 poddanych działaniu C-1311 (1 µm) przez podane czasy o nieprawidłowej morfologii jądra (zmiany sugerujące apoptozę i nekrozę). Wykres został wyznaczony na podstawie dwóch niezależnych doświadczeń. * P < 0,05 statystycznie istotne różnice w wielkości populacji komórek linii MCF-7-CYP3A4 i MCF- 7-UGT1A10 w stosunku do komórek MCF-7- EV. Podsumowując, nadekspresja izoenzymu CYP3A4 potęgowała zmiany w morfologii jąder komórek MCF-7 w następstwie działania związku C-1311 po dłuższych czasach ekspozycji. Nieprawidłowy przebieg mitozy obserwowany był w większym stopniu także w warunkach podwyższonej ekspresji izoenzymu UGT1A10, ale tylko dla pośrednich czasów. 5.6.7 Zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek MCF-7 Wobec powyższych wyników w niniejszym etapie pracy określiłam, czy w komórkach MCF-7 po ekspozycji na związki dochodzi do indukcji apoptozy bądź nekrozy. W tym calu zbadałam zmiany w asymetrii i przepuszczalności błony cytoplazmatycznej barwiąc komórki białkiem aneksyną-v (A) skoniugowaną z fluoresceiną, jak również jodkiem propidyny (PI). Analizę cytometryczną z zastosowaniem przedstawionych barwników wykonałam dla komórek traktowanych związkami w stężeniu IC 80 od 24 do 120 godzin. a. Działanie pochodnej triazoloakrydonu C-1305 Analiza cytometryczna asymetrii i przepuszczalności błony cytoplazmatycznej komórek trzech rekombinantowych linii MCF-7 wykazała, że pod wpływem działania związku C-1305 nie dochodziło do translokacji fosfatydyloseryny do zewnętrznej warstwy błony brak komórek wybarwionych aneksyną-v-fitc (Rysunek 80). Zatem w komórkach MCF-7 pod wpływem działania C-1305 nie była uruchamiana śmierć na drodze apoptozy. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji rosła populacja komórek wybarwionych jodkiem propidyny (A-/PI+), co wskazuje jako

Wyniki 173 efekt działania pochodnej triazoazoloakrydonu nekrozę. Frakcja ta po 120 godzinach wynosiła dla linii MCF-7-EV 5,0%, MCF-7-CYP3A4 7,3% i MCF-7-UGT1A10 6,6% (Rysunek 81). Przedstawione wartości są bardzo zbliżone do tych uzyskanych z barwienia przyżyciowego. Rysunek 80 Cytogramy obrazujące zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek MCF-7: kontrolnych i traktowanych pochodną C-1305 (5 μm) przez podane czasy. Oś X fluorescencja pochodząca od fluoresceiny skoniugowanej z aneksyną-v. Oś Y fluorescencja pochodząca od jodku propidyny. Pole A komórki niezmienione (A, PI ), pole B komórki wczesnoapoptotyczne (A+, PI ), pole C komórki późnoapoptotyczne, wtórnie nekrotyczne (A+, PI+), pole D komórki nekrotyczne (A, PI+). Przedstawione cytogramy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń analizowanych trzykrotnie.

Wyniki 174 Rysunek 81 Wielkość populacji komórek nekrotycznych wybarwionych jodkiem propidyny (A-/PI+) wśród komórek linii MCF-7-EV, MCF-7-CYP3A4 i MCF-7-UGT1A10 traktowanych pochodną C-1305 (5 μm) przez podane czasy. * P < 0,05 statystycznie istotne różnice w wielkości populacji komórek linii MCF-7- CYP3A4 w stosunku do komórek MCF-7-EV. b. Działanie pochodnej imidazoakrydonu C-1311 Rysunek 82 Cytogramy obrazujące zmiany w budowie błony cytoplazmatycznej komórek MCF-7: kontrolnych i traktowanych pochodną C-1311 (1 μm) przez podane czasy. Oś X fluorescencja pochodząca od fluoresceiny skoniugowanej z aneksyną V. Oś Y fluorescencja pochodząca od jodku propidyny. Pole A komórki niezmienione (A, PI ), pole B komórki wczesnoapoptotyczne (A+, PI ), pole C komórki późnoapoptotyczne, wtórnie nekrotyczne (A+, PI+), pole D komórki nekrotyczne (A, PI+). Przedstawione cytogramy są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń analizowanych trzykrotnie.