BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE REGENERACYJNEJ

POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 39 2012 NR 4 (637 652) BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE REGENERACYJNEJ AMNIOTIC MEMBRANE: STRUCTURE, FUNCTIONS AND USE IN REGENERATIVE MEDICINE Zofia GRZYWOCZ 1, Arkadiusz GAWRYLUK 2, Bartłomiej NOSZCZYK 3 1 Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego w Warszawie 2 Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie w Warszawie 3 Klinika Chirurgii Plastycznej CMKP Streszczenie: Błona owodniowa znajduje się po wewnętrznej stronie łożyska. Składa się ona z trzech warstw: nabłonka, błony podstawnej i beznaczyniowej warstwy komórek mezenchymalnych. Populacje komórek nabłonkowych oraz mezenchymalnych błony owodniowej wykazują ekspresję markerów komórek macierzystych: Oct4, Nanog, TRA1-60 i TRA1-81 oraz nestyny i Musashi-1 markerów komórek macierzystych układu nerwowego. Komórki te mają właściwości przejściowe między plurii multipotencją. Standardowym postępowaniem w celu określenia pluripotencji izolowanych komórek jest ich hodowla w środowisku sprzyjającym różnicowaniu w kierunku tkanek wywodzących się ze wszystkich listków zarodkowych. Dla komórek mezenchymalnych zalecane przez Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy kierunki różnicowania w tkanki kostną, chrzęstną i tłuszczową. Dzięki hodowli komórek nabłonkowych owodni w odpowiednich środowiskach mogą one różnicować w kierunku: komórek nerwowych, hepatocytów, komórek β trzustki oraz kardiomiocytów. Obserwowano też różnicowanie komórek mezenchymalnych owodni w kierunku komórek neuronalnych, śródbłonkowych i kardiomiocytów. Badania z zastosowaniem modeli zwierzęcych, pokazały potencjalną zdolność tych komórek do udziału w regeneracji uszkodzonych narządów. W ciąży błona owodniowa wydziela czynniki, pełniące różnorodne funkcje m.in. czynniki o działaniu odnawiającym nabłonek, czynniki które mają właściwości antyangiogenne i przeciwnowotworowe oraz czynniki immunomodulujące i przeciwzapalne. Błona owodniowa ma także właściwości antywirusowe i bakteriostatyczne. Cechy te powodują, że zarówno błona owodniowa jak i obydwie populacje izolowanych z niej komórek są intensywnie badane z myślą o wykorzystaniu ich w przeszczepach i regeneracji narządów. Słowa kluczowe: łożysko, owodnia, AM, AEC, AMSCs

638 Z. GRZYWOCZ, A. GAWRYLUK, B. NOSZCZYK Summary: Amniotic membrane (AM) is a translucent biological structure. It consists of three main histological layers: the epithelial layer, the basement membrane and the avascular, mesenchymal tissue. Amniotic epidermal cells (AEC) and amniotic mezenchymal stromal cells (AMSC), express stem cells markers : Oct4, Nanog, TRA1-60 and TRA1-81. They express nestin and Musashi-1 as well which are markers of stem cells of nervous system. Cells of amniotic membrane have pluri- and multipotent properties. According to Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy pluripotency of cells define typical experiments of differentiation into cartiliage, chondrocyte and adipose tissue. AEC when cultured in specified media differentiated to: neurons, hepatocytes, β pancreatic cells, kardiomiocytes. AMSC were differentiated to: neurons, epithelium, and kardiomiocytes. Animal model experiments confirmed the ability of grafted amnion cells to participate in regeneration of injured organs. During pregnancy AM secretes many peptides which play different role in organism. These are factors that can stimulate epithelialization, and have anty-angiogenic and anty-tumor effects. AM release immunomodulating and anty-inflammatory factors too. Besides amnion membrane secrets peptides with anty-bacterial and anty-viral properties. All these properties prompt researchers to use isolated cells and whole amniotic membranes for transplantation in regenerative medicine. Key words: placenta, amnion, AM, AEC, AMSCs Wykaz stosowanych skrótów: ABCG (ang. ABC transporter ATP-binding cassette sub-family G); ANP (ang. Atrial Natriuretic Peptide); AEC (ang. Amniotic Epithelial Cell); ALCAM (ang. Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule); AM (ang. Amnion Membrane); AMSCs (ang. Amniotic Mezenchymal Stromal Cells); bfgf (ang. Basic Fibroblast Growth Factor); BrdU (ang. 5-bromo-2 -deoxyuridine); CA-1 (ang. Carbonic Anhydrase 1); CA125 (ang. Carbohydrate Antigen 125); CCL2/MPC-1 (ang. Chemokine Ligand 2); CCL5/RANTES (ang. Chemokine Ligand 5); CNP-azy (ang. 2,3 -cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase); ctnt (ang. Troponin T type 2); Cx26 (ang. Gap junction beta 2 protein); CXCL9/MIG (ang. Chemokine Ligand 10); CXCL10/IP-10 (ang. Chemokine Ligand 10); EGF (ang. Epidermal Growth Factor); Gap-43 (ang. growth associated protein 43); HGF (ang. Hepatocyte Growth Factor); HGFR (ang. Hepatocyte Growth Factor Receptor); HNF-3γ (ang. Hepatocyte Nuclear Factor); ipsc (ang. induced Pluripotent Stem cells); KGF (ang. Krertinocyte Growth Factor); KGFR (ang. Krertinocyte Growth Factor Receptor); Kv4.3 (ang. potassium voltage-gated channel, Shal-related subfamily, member 3); MIF (ang. Macrophage Migration Inhibitory Factor); MRP (ang. Multidrug Resistance Protein); NF-M (ang. Neurofilament M subunit); NSE (ang. Neuronal Enolase); Oct 4 (ang. octamer-binding transcription factor 4); PAX-6 (ang. paired box gene 6); PEDF (ang. Pigment Epithelium-Derived Factor); PDGF (ang. Platelet-Derived Growth Factor); PDX-1 (ang. Pancreatic and Duodenal homeobox 1); SCID (ang. Severe Combined Immunodeficiency); SDF (ang. Stromal Cell-Derived Factor); sicam-1 (ang. soluble Intercellular Adhesion Molecule 1); SLPI (ang. Secretory Leukocyte Peptidase Inhibitor); SSEA 4 (ang. Stage Specyfic Embryonic Antigen 4); TFF (ang. Trefoil Factor Family peptide); TGF (ang. Transforming Growth Factor); TIMP (ang. Tissue Inhibitor of Metalloprotease); TNF (ang. Tumor Necrosis Factors); TRA (ang. Tumor Rejection Antigen); VEGF (ang. Vascular Endothelial Growth Factor)

BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE.. 639 BUDOWA I FUNKCJE BŁONY OWODNIOWEJ Dokładny opis budowy i funkcji łożyska można znaleźć w podręcznikach embriologii [2, 3, 13]. W niniejszej publikacji więc zagadnienie rozwoju łożyska zostanie pominięte. Rycina 1 obrazuje rozwój łożyska i błony owodni u człowieka. Błona owodni (AM) w dojrzałym łożysku jest cienką warstwą znajdującą się po wewnętrznej stronie łożyska otaczającą embrion/płód. AM otacza jamę owodniową wypełnioną płynem owodniowym, nie ma naczyń limfatycznych, unerwienia ani mięśni [19]. Na początku ciąży przeżycie komórek owodni możliwe jest dzięki kontaktowi tej błony z płynem kosmówkowym z zewnętrznej strony oraz płynem owodniowym od wewnątrz, dodatkowo za wymianę gazową i dostarczanie składników odżywczych odpowiadają znajdujące się na powierzchni tej błony naczynia krwionośne. Wymienione procesy zachodzą m.in. na drodze dyfuzji [2, 19]. Grubość błony owodniowej waha się od 0,02 do 0,5 mm. Błona ta składa się z trzech warstw: nabłonka, błony podstawnej i beznaczyniowej warstwy komórek mezenchymalnych. Pojedyncza warstwa komórek nabłonkowych kontaktuje się z płynem owodniowym i jest przytwierdzona do błony podstawnej. W skład błony podstawnej wchodzi kolagen typu I, II, i V. Błona podstawna zbudowana jest w dużej mierze z proteoglikanów bogatych w siarczany heparanu, co stanowi przepuszczalną barierę dla makrocząsteczek. Najgłębszą warstwę owodni tworzą mezenchymalne fibroblastopodobne komórki otoczone substancją międzykomórkową. Duża zawartość kolagenu w tej warstwie powoduje, że niektórzy autorzy wyróżniają zewnętrzną warstwę mezenchymalną tzw. zona spongioza. Strefa ta przypomina budową histologiczną gąbkę, ze względu na dużą zawartość proteoglikanów i glikoprotein, a obecna tam sieć niewłóknistego kolagenu typu III nadaje jej wytrzymałość i graniczy bezpośrednio z warstwą kosmówki. Pozwala to łatwo oddzielić mechanicznie owodnie od kosmówki [31]. Błona owodniowa w trakcie ciąży funkcjonuje jako bariera, przez którą odbywa się transport wody i substancji rozpuszczalnych oraz czynników bioaktywnych, takich jak cytokiny np. IL4 czy czynniki wzrostu. Główną jednak funkcją błony owodniowej jest ochrona płodu i zapewnienie przyjaznego środowiska, dostarczającego wolnej przestrzeni do swobodnego wzrostu. Jest to możliwe dzięki jej specjalnej budowie, w skład której wchodzą kolageny typu I, II i III oraz elastyna [19]. Ponadto, w trakcie porodu nabłonek błony owodniowej ma zdolność do produkcji prostaglandyn, zwłaszcza prostaglandyny E2 oraz enzymów odpowiedzialnych za syntezę prostaglandyn np. fosfolipaz i syntetaz prostaglandyn, co umożliwia rozpoczęcie i podtrzymanie skurczów macicy. W trakcie ciąży komórki AEC odpowiadają za stałe podtrzymywanie odpowiedniego stężenia jonów wodorowych (ph) płynu owodniowego na poziomie 7.10, dzięki obecności w tych komórkach izoenzymów anhydraz węglowych CA-1 i CA-2 [19, 31].

640 Z. GRZYWOCZ, A. GAWRYLUK, B. NOSZCZYK RYCINA 1. Rozwój łożyska i błony owodni u człowieka (Jura 1983, zmienione). A blastocysta wszczepia się częściowo do zrębu śluzówki macicy. Trofoblast różnicuje się do cyto- i syncytiotrofoblastu. W węźle zarodkowym wyróżniają się komórki epi- i hipoblastu. Pomiędzy epiblastem a cytotrofoblastem pojawia się szczelina zawiązek jamy owodni. B jama owodni od strony trofoblastu jest wyścielona amnioblastami. Do jamy blastocysty wnikają komórki mezodermy pozazarodkowej tworząc błonę Hausera. Powstaje pierwotny pęcherzyk żółtkowy. W syncytiotrofoblaście tworzą się zatoki. C w mezodermie pozazarodkowej powstają szczeliny pozazarodkowej jamy ciała, rozdzielające mezodermę na płat ścienny i płat trzewny. Trofoblast z pozazarodkową mezodermą ścienną tworzą kosmówkę. Błona Hausera jest wyścielona od strony światła pierwotnego pęcherzyka żółtkowego komórkami pozazarodkowej endodermy. Zatoki syncytiotrofoblastu wypełniają się krwią pochodzącą z naczyń krwionośnych śluzówki macicy. D na skutek rozrostu jaja płodowego i powiększenia się pozazarodkowej jamy ciała, zarodek z owodnią i pęcherzykiem żółtkowym łączy się za pomocą szypuły brzusznej z kosmówką. Syncytiotrofoblast przekształca się w kosmki pierwotne, które są opłukiwane przez krew wynaczynioną z naczyń krwionośnych śluzówki macicy. ab amnioblasty, bh błona Hausera, ct cytotrofoblast, eb epiblast, en endoderma, hb hipoblast, jc pozazarodkowa jama ciała, jow jama owodni, jpżp jama pierwotnego pęcherzyka żółtkowego, jpżw jama wtórnego pęcherzyka żółtkowego, k kosmówka, mś mezoderma ścienna, mt mezoderma trzewna, noś naczynia krwionośne śluzówki, nś nabłonek śluzówki macicy, ow owodnia, pżw pęcherzyk żółtkowy wtórny, szb szypuła brzuszna, st syncytiotrofoblast, śm śluzówka macicy, zt zatoki syncytiotrofoblastu (Jura 1983, zmienione)

BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE.. 641 FIGURE 1. Development of placenta and amnion membrane in humans (Jura 1983 changed). ab amnioblasts, bh Heuser s membrane, ct cytotrophoblast, eb epiblast, en endoderm, hb hipoblast, jc extraembryonic coelom, jow amniotic cavity, jpżp primitive yolk sack cavity, jpżw secondary yolk sack cavity, k chorion, mś somatopleuric mesoderm, mt splanochronopleuric mesoderm, nś mucosa s epithelium, ow amnion, pżw secondary yolk sack, szb peduncle, st syncytiotrophoblast, śm materna mucosa, zt syncytiotrophoblast sinus FENOTYP KOMÓREK OWODNI W błonie owodniowej można wyróżnić dwie populacje komórek: nabłonkowe komórki owodni (ang. Amnion Epithelial Cells, AEC) oraz mezenchymalne komórki owodni (ang. Amnion Mesenchymal Stromal Cells, AMSC). Typowe markery komórek każdej z tych populacji przedstawia tabela 1. Komórki nabłonkowe owodni mają na swojej powierzchni mikrokosmki, które prawdopodobnie odpowiadają za aktywne wydzielanie oraz transport na zewnątrz i do wnętrza komórki. Komórki te mają duże jądro z wielkim homogennym jąderkiem oraz liczne pęcherzyki pinocytarne w cytoplazmie. Ekspresja markerów endodermalnych tj. glikoproteiny CA125, receptora dla oksytocyny oraz desminy, wskazuje na ich pluripotencjalny charakter. Zawierają także receptor dla erytropoetyny oraz samą erytropoetynę [19, 31]. AEC mogą być łatwo izolowane za pomocą trawienia enzymatycznego. Subpopulacje AEC zawierają markery obecne na embrionalnych komórkach macierzystych np. SSEA3 i SSEA4 ma około 15-50% oraz TRA1-60 i TRA1-80 ma 5-10%. Taki rozkład ekspresji markerów sugeruje, że komórki nabłonkowe owodni znajdują się w różnym stadium zróżnicowania. Po 10 miesiącach księżycowych ciąży większość komórek ma już stopień zróżnicowania dojrzałych komórek nabłonkowych i jedynie 5-10% komórek zachowuje właściwości komórek macierzystych [21]. Wg Izumi i wsp. owodnie w drugim trymestrze zawierają 30-40% komórek macierzystych o ekspresji TRA 1-60 i TRA1-81, podczas gdy owodnie tuż przed porodem tylko 5% [12]. W komórkach nabłonkowych odkryto mrna dla markerów lekooporności i białek z nimi związanych tj. ABCG2 (CD338) oraz MRP1, ABCC1, 2, 5. Wyniki badań in vitro sugerują, że zadaniem tych komórek jest ochrona owodni przed ksenobiotykami, a nie ochrona embrionu. Wniosek ten jest uzasadniany rozmieszczeniem transporterów ABC. Antygeny te są rozmieszczone wzdłuż komórek owodni, zarówno w warstwie powierzchniowej jak i bazalnej komórek. Sugeruje to, że usuwają one toksyny z wnętrza komórek, a nie mają wpływu na usuwanie toksyn z płynu owodniowego [1].

642 Z. GRZYWOCZ, A. GAWRYLUK, B. NOSZCZYK TABELA 1. Obecność markerów w populacji komórek nabłonkowych (AEC) i mezenchymalnych (AMSC) błony owodniowej (+ obecność markera, brak markera, NT nie badano) TABLE 1. Presence of cells antygens on Amniotic Epithelial Cells (EAC) and Amniotic Mezenchyma Stroma Cells (AMSC) (+ marker present, marker absent, NT not tested) MARKER AEC AMSC REFERENCJE CD105 + + [5, 21,24] CD106 - + [5, 24] CD90 + + [5, 6, 21, 24] CD73 + + [6, 21, 24] CD44 + + [5, 6, 21, 24] CD29 + + [5, 6, 19, 21, 24] HLA ABC + + [5, 24] CD13 + + [5, 21, 24] CD10 + + [21] CD166 + + [21, 24] CD49d - + [24] CD49e + + [24] HLA DR - - [5, 21, 24] CD49c NT + [24] CD54 + + [5, 21] CD14 - - [24] CD34 - - [5, 21, 24 ] CD45 - - [21, 24 ] CD31 - - [21, 24] CD133 - - [21, 24] CD3 - - [24] HLA G + + [9, 19, 31] EMBRIONALNE MARKERY KOMÓREK MACIERZYSTYCH Oct-4 + + [6, 21, 24, 31] SSEA3 + NT [24] SSEA4 + + [6, 24] TRA 1-60 + + [21, 24] TRA 1-81 + + [21, 24] SOX 2 + NT [21, 24] NANOG + NT [21, 24] SSEA1 - NT [24] INNE CD324 + + [24] CD140b + + [24] CD349 - - [24]

BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE.. 643 Mezenchymalne komórki owodni mają fenotyp pośredni między komórkami nabłonkowymi i mezenchymalnymi. Cechami nabłonkowymi tych komórek są: powierzchniowe mikrokosmki typu niejelitowego, obecność w cytoplazmie lamininy oraz połączenia międzykomórkowe. Do cech typowo mezenchymalnych należą: bogato rozwinięta rer (szorstka siateczka wewnątrzplazmatyczna) z układem charakterystycznym dla komórek mezenchymalnych oraz krople tłuszczu. Cechy te wydają się potwierdzać pluripotencję tych komórek [25]. Ponadto Kobayashi i wsp. [15] opisali istnienie subpopulacji komórek mezenchymalnych owodniowych zwanej SP (ang. Side Population). Populacja SP stanowi około 0.1 do 0.2% izolowanych komórek i charakteryzuje się intensywnym transportem barwników fluorescencyjnych poza komórkę, co jest uważane za jedną z cech komórek macierzystych. Populacja SP ma wysoką ekspresją markerów: CD13, CD29, CD44, CD46, CD49b, CD49c, CD49e, CD59, CD140a (PDGFRa) i CD166 (ALCAM), a niską ekspresją CD49d i CD51. Zarówno populacje komórek nabłonkowych jak i mezenchymalnych z błony owodniowej mają ekspresję markerów układu nerwowego: Musashi-1, a także nestyny [19]. CZYNNIKI WYDZIELANE PRZEZ OWODNIĘ W trakcie ciąży błona owodniowa wydziela czynniki pełniące różnorodne funkcje. Ponieważ komórki nabłonkowe owodni sąsiadują z płynem owodniowym, można przypuszczać, że niektóre substancje znajdujące się w płynie owodniowym są częściowo produkowane przez błonę owodniową, a częściowo przez rozwijający się płód. W płynie owodniowym pobranym od matek w środkowym trymestrze odkryto SDF-1α. Autorzy pracy [32] sugerują, że stężenie tego czynnika w płynie owodniowym podczas ciąży może być skorelowane z wcześniactwem, niższą masą urodzeniową i niższą wartością w skali Apgar. Z drugiej strony nie znaleziono SDF-1 w nadsączach z hodowli komórek owodni [11]. Tak różne obserwacje mogą wynikać z różnic środowiska in vivo i in vitro. Inne obserwacje świadczą o obecności w płynie owodniowym IL-6 i IL-8 [19]. Interleukiny IL-6 i IL-8 są zaliczane do cytokin zapalnych, więc jeżeli płyn owodniowy był pobierany w stanie stresu jakim jest poród ich poziom może rosnąć. Na powierzchni błony owodniowej znajduje się szereg czynników, które mają właściwości antyangiogenne są to: endostatyna i trombospondyna-1, tkankowy inhibitor metaloproteinazy (TIMP-1, 2, 3, 4), antagonista dla receptora IL-1 oraz IL-10 i PEDF. W trakcie przeszczepów błony owodniowej w miejsce uszkodzonej rogówki m.in. obecność tych czynników zapobiega tworzeniu naczyń krwionośnych na powierzchni odnawiającej się rogówki [18, 30]. Błona owodnio-

644 Z. GRZYWOCZ, A. GAWRYLUK, B. NOSZCZYK wa, zarówno w hodowli jak i po przeszczepie do rogówki, wydziela TFF3 (ang. Trefoil Factor Family peptide 3) i TFF2 (ang. Trefoil Factor Family peptide2). Bi - ałka te mają właściwości wspomagające regenerację rogówki, zapobiegając apoptozie komórek rogówki oraz wspomagając jej reepitelializację [28]. W płynie owodniowym ludzkim wykryto również obecność neurotransmiterów i czynników neurotroficznych. Do substancji tych należą: acetylocholina, katecholamina, transporter dopaminy i receptor dopaminy. Czynniki te są produkowane i wydzielane przez komórki AEC, zarówno człowieka jak i małp naczelnych. Również w badaniach nadsączy z hodowli tych komórek wykryto wymienione wyżej czynniki. Prawdopodobnie uczestniczą one w trakcie wczesnego kształtowanie się układu nerwowego zarodka [27]. Payne i wsp. udowodnili, że komórki nabłonkowe owodni w hodowli oraz po przeszczepieniu do ran oparzeniowych, wydzielają PDGF, VEGF, angiogeninę, TGF-β2 oraz tkankowy inhibitor mataloproteazy 1 i 2 (TIMP1 i TIMP2) [26]. Badania wspólnych hodowli ludzkich AEC z nerwowymi komórkami siatkówki oka oraz transplantacja tych komórek do małp z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, sugerują możliwość produkcji czynników z rodziny EGF. Autorzy proponują istnienie nie odkrytej dotąd izoformy EGF produkowanej przez nabłonkowe komórki owodni człowieka [33]. Z obserwacji in vitro wynika, że komórki mezenchymalne owodni wydzielają: IL-6, CCL2/MPC-1 oraz niewielką ilość CXCL8/IL-8. Komórki te nie produkują: TNF, CXCL10/IP-10, CXCL9/MIG, CCL5/RANTES [18]. Komórki mezenchymalne z błony owodniowej obok MIF (GIF, DER6), IL-8, Serpiny E1 (PAI-1), GROα (CXCL1) oraz IL-6, wydzielają również: sicam-1 (CD54), MCP-1 (CCL2) [11]. Czynnikami o działaniu odnawiającym nabłonek, a wykrywanymi w hodowlach zarówno przez AEC i AMSC są: TGF-α, EGF, KGF, HGF, bfgf, KGFR i HGFR. Komórki owodni w hodowli produkują także substancje o działaniu przeciwzapalnym: antagonistę receptora IL-2, IL-10 oraz endostatynę, które hamują podziały komórek nabłonkowych, angiogenezę i wzrost nowotworów. Błona owodniowa ma także właściwości anty-wirusowe i bakteriostatyczne. Stymulowane komórki owodni wydzielają: β3-defensynę, SLPI i elafinę [19]. MOŻLIWOŚCI PRAKTYCZNEGO WYKORZYSTANIA OWODNI Zarówno cała błona owodniowa jak i populacje izolowanych z niej komórek są intensywnie badane z myślą o ich wykorzystaniu w przeszczepach i regeneracji narządów. Komórki te mają właściwości przejściowe między pluri- i multipotencjalnymi komórkami [22]. Komórki pluripotencjalne mają zdolność do różnicowania się w tkanki wywodzące się z trzech listków zarodkowych: endodermy, mezoder-

BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE.. 645 my i ektodermy. Uważa się jednak, że komórki plutipotencjalne błony owodniowej nie są w stanie zróżnicować się w kosmówkę. Komórki wyizolowane z owodni, po przeszczepieniu nie tworzą potworniaków (teratomy), co dodatkowo sprzyja ich wykorzystaniu w medycynie regeneracyjnej [22, 31]. Standardowym postępowaniem w celu określenia pluripotencji izolowanych komórek jest ich hodowla w warunkach stymulujących różnicowanie w kierunku tkanek wywodzących się ze wszystkich listków zarodkowych. Dla komórek mezenchymalnych zalecane przez Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy tkanki to: tkanka kostna, chrzęstna oraz tłuszczowa [7]. Obecnie na rynku są już dostępne komercyjnie gotowe zestawy pożywek z cytokinami i czynnikami wzrostu niezbędnymi do różnicowania, w związku z czym autorzy niniejszej pracy postanowili pominąć ten kierunek badań. Poniżej opisane zostaną inne, niekomercyjne badania. IZOLOWANE KOMÓRKI NABŁONKOWE BŁONY OWODNI AEC in vitro w zależności od określonych warunków różnicują się w komórki przypominające komórki: neuronalne, wątrobowe, komórki trzustki oraz serca. Komórki neuronalne AEC hodowane w warunkach sprzyjających różnicowaniu się w komórki neuronalne (np. w pożywce z dodatkiem witaminy A oraz FGF) wykazywały ekspresję specyficznej dla neuronów enolazy, neurofilamentów-m, białka związanego z mikrotubulami, zasadowego białka mieliny oraz nestynę i dekarboksylazy kwasu glutaminowego [21]. Białka te są uważane za markery komórek glejowych i nerwowych. W innym badaniu hodowane komórki wykazywały ekspresję genów oligodendrocytów, białka proteolipidu oraz CNP-azy [21]. W warunkach hodowli różnicującej komórki nabłonkowe owodni mają ekspresję: acetylocholiny, katecholaminy, dopaminy, activiny i nogginu [19].Prawidłowo zamrożone AEC zachowują swój potencjał do różnicowania nawet do 30 lat po odmrożeniu. Izolowane w 1974 roku komórki po odmrożeniu przyjmowały morfologię neuronalną i miały ekspresję: β-iii-tubuliny, Gap-43, NF-M, TAU i synaptofizyny [21]. Przeszczepy tych komórek do modelu zwierzęcego choroby Parkinsona zaowocowały wydzielaniem: ketacholaminy i czynnika wzrostu nerwów, neurotrofiny-3 oraz mózgowego czynnika wzrostu [19, 21]. Ponadto, przeszczepione komórki miały zdolność do wydzielania dopaminy. Badania na szczurzych nabłonkowych komórkach owodni wykazały zdolność tych komórek do różnicowania się w komórki przypominające neurony, zarówno w hodowli jak i po podaniu ich do mózgu szczura [29]. Podobne wyniki uzyskano dla modelu szczurzego udaru mózgu. Podanie do mózgu komórek nabłonkowych

646 Z. GRZYWOCZ, A. GAWRYLUK, B. NOSZCZYK owodni spowodowało migrację tych komórek do obszaru uszkodzenia i poprawiło funkcje behawioralne zwierząt. Istnieją także doniesienia poprawy pamięci u myszy z chorobą Alzheimera, którym podano nabłonkowe komórki owodni [21]. Komórki wątroby i przewodu żółciowego In vitro nabłonkowe komórki z owodni stymulowane w kierunku hepatocytów mają ekspresję: albuminy, α1-antytrypsyny, cytokeratyny 18, syntetazy glutaminu, karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej, cytochromów: P450, 2D6 oraz 3A4, a także HNF-3γ. Badania immunohistochemiczne prowadzonych hodowli potwierdziły obecność albuminy i glikogenu w komórkach. Podobne wyniki uzyskano dla badań in vivo. Komórki haec były wszczepiane do myszy z upośledzoną odpornością, co sprzyjało przyjęciu się ksenoprzeszczepu. U myszy z takim przeszczepem wykryto ludzką α1-antytrypsynę w krążeniu. Autorzy uznali ten wynik za dowód na wszczepienie się i prawidłowe funkcjonowanie podanych komórek jako komórek o charakterze hepatocytów [21]. Także zwierzętom z marskością wątroby wywołaną lekami podano ludzkie AEC i zaobserwowano brak zwłóknienia w wątrobie. Rezultat ten może sugerować efekt immunosupresyjny i przeciwzapalny podanych komórek. Z drugiej jednak strony autorzy pracy wykryli u biorców ludzką albuminę, co sugerowałoby wszczepienie się i różnicowanie komórek. Prawdopodobnie więc zaobserwowane wyniki mogą być związane z obydwoma zjawiskami. Także badania na szczurzej owodni potwierdziły zdolność komórek nabłonkowych owodni do wszczepiania się w wątrobę i pozostawania tam przez 30 dni. Przeszczepy do jamy otrzewnej myszy haec uprzednio poddanych różnicowaniu w kierunku hepatocytów, ujawniły zarówno przeżycie tych komórek jak i produkcję albuminy [19].W mysim modelu zastoju żółci wywołanym chemicznie podawano AEC. W wątrobie obserwowano obecność struktur podobnych do przewodu żółciowego, zbudowanych z komórek mysich z ekspresją CK7 markera cholangiocytów. Wyniki te sugerują właściwości stymulujące budowę kanałów żółciowych z komórek AEC, a nie ich bezpośrednie wbudowywanie w tworzoną strukturę [21]. Komórki trzustki Obserwowano, że nabłonkowe komórki owodni mogą się także różnicować w kierunku komórek β trzustki. Komórki te mają podwyższoną ekspresję genów: pdx-1, pax-6, nkx2.2, insuliny i glukagonu [21]. Także po przeszczepianiu takich komórek do myszy z cukrzycą zaobserwowano normalizację poziomu glukozy w surowicy krwi do kilku miesięcy po transplantacji [19]. Badania te zostały potwierdzone przez wykrycie obecności c-peptydu zależnego od glukozy w krwi [10, 21].

BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE.. 647 Komórki serca Zdolność serca do autoregeneracji jest bardzo powolna, dlatego też szuka się innych źródeł komórek mających zdolność do naprawy uszkodzonego narządu. Jednym z nich może być owodnia [21]. Komórki owodni w hodowli mają ekspresję specyficznych dla kardiomiocytów czynników transkrypcyjnych tj. GATA4, oraz markerów takich jak: lekki łańcuch miozyny (MLC 2a, MLC-2v, ctni), ctnt, specyficzna dla serca α-podjednostka L-typu kanału wapniowego (α1c) i kanału potasowego Kv4.3 oraz Nkx2.5 czy przedsionkowego peptydu natriuretycznego (ANP) [19]. Ponadto, haec hodowane na warstwie mysich embrionalnych kardiomiocytów różnicują się w kierunku komórek serca, wykazując obecność α-aktininy oraz zdolność do spontanicznych skurczów. Wykazano, że ekspresja α-aktininy w różnicujących się z AEC kardiomiocytach jest charakterystyczna dla niedojrzałych komórek serca. In vivo badania przeprowadzone na komórkach ze szczurzej owodni wszczepionych do szczura znacznie poprawiały funkcjonowanie serca. Efekt ten był prawdopodobnie związany z właściwościami parakrynnymi lub immunomodulującymi wszczepionych komórek, ponieważ tylko kilka AEC zróżnicowało się do kardiomiocytów [21]. Inne komórki Przeprowadzano również eksperymenty dotyczące regeneracji płuc z zastosowaniem AEC. Do myszy SCID z uszkodzeniem płuc wywołanym bleomycyną wstrzykiwano ludzkie komórki nabłonkowe z owodni. Komórki te hamowały stan zapalny i włóknienie uszkodzonych płuc [21].Co ciekawe nabłonkowe komórki owodni mają również na swojej powierzchni Cx26 oraz pompę jodowo potasową. AEC mogą więc służyć jako narzędzie do leczenia patologii ucha wewnętrznego. Badania na modelu zwierzęcym potwierdziły na tych komórkach obecność markerów fibrocytów ślimaka kostnego po 3 tygodniach od transplantacji [19, 31]. IZOLOWANE KOMÓRKI MEZENCHYMALNE Z BŁONY OWODNI Z błony owodni (ang. Amniotic Membran, AM), za pomocą trawienia enzymatycznego, można także izolować mezenchymalne komórki. Wykazano, że komórki te mają właściwości pluri- i multipotencjalne [6, 22, 24]. Mezenchymalne komórki owodni (AMSC) hodowane w odpowiednich warunkach mają zdolność do różnicowania się w komórki: neuronalne, serca i międzyneuronalne.

648 Z. GRZYWOCZ, A. GAWRYLUK, B. NOSZCZYK Komórki neuronalne AMSCs hodowane w odpowiednich warunkach wykazywały morfologię i ekspresję markerów charakterystycznych dla komórek neuronalnych. Komórki te także wydzielały dopaminę [4]. U szczurów z ogniskowym niedotlenieniem mózgu, po przeszczepieniu stymulowanych hamscs, obserwowano poprawę behawioralną. Komórki AMSC wyznakowane BrdU znaleziono w mózgach wzdłuż miejsca niedotlenienia i w pobliżu miejsca podania. Komórki te nie tylko dzieliły się in vivo ale także miały na swojej powierzchni marker specyficzną enolazę neuronów (NSE). Nie zaobserwowano glejaków ani infiltracji limfocytów do miejsca uszkodzenia [17]. Komórki ips Pierwsze ludzkie indukowane komórki pluripotencjalne ips (ang. induced Pluripotent Stem cells) uzyskano z komórek somatycznych fibroblastów [30]. Jednak od pewnego czasu w literaturze trwa dyskusja czy komórki te rzeczywiście przeprogramowano czy też od początku w hodowli znajdowały się komórki o charakterze komórek embrionalnych [14, 34, 35]. Pomimo tych niejasności, metoda uzyskania ips jest obecnie szeroko stosowana dla komórek z różnych tkanek. Komórki mezenchymalne z owodni stanowią mieszaną, heterogenną populację [14, 34, 35] nadającą się do przeprogramowania w indukowane komórki pluripotencjalne. Kalifornijski zespół badawczy pod przewodnictwem Yang a wprowadził do hamscs wektor zawierający czynniki: Oct4, Sox2, Klf2 oraz c-myc tworząc linię komórek zwaną MiPSCs. Komórki te z sukcesem przeszczepiono myszom, jak również zróżnicowano in vitro w kierunku kardiomiocytów [8]. Inne komórki Przeprowadzano także próby różnicowania meznchymalnych komórek owodni do komórek endotelialnych. Pomimo, że komórki te przyjmowały w hodowli postać komórek śródbłonka, a w Matrigel-u (mieszanina białek o konsystencji żelu uzyskiwana z hodowli linii komórkowej mysich mięsaków) tworzyły struktury przypominające sieć naczyń krwionośnych, dokładna ich analiza wykazała, że nie są to dojrzałe komórki śródbłonka. Ekspresja genów proangiogennych była obniżona, a czynnika von Willebranta nie znaleziono. Podwyższeniu uległa natomiast ekspresja czynników antyangiogennych [16]. Zaobserwowane wyniki mogą być spowodowane znanym dla komórek mezenchymalnych zjawiskiem mimikry. Komórki te, hodowane w odpowiednich mediach, przyjmują morfologię pożądanych komórek, bez zmiany swoich właściwości epigenetycznych i fizjologicznych.

BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE.. 649 BŁONY OWODNIOWE Badania z zastosowaniem całych błon owodniowych przeprowadzane są zarówno na zwierzętach jak i w badaniach klinicznych. Błona owodniowa nałożona na fragment serca szczurzego z zawałem, poprawiała funkcjonowanie serca, a efekt ten był związany z właściwościami wydzielniczymi tej błony [19]. Główne zastosowania kliniczne błon owodniowych mają miejsce w okulistyce, oparzeniach skóry, a także w chirurgii głowy, szyi, krtani, brzucha oraz układu rozrodczego. W okulistyce W okulistyce pierwszy opisany przypadek zastosowania błony owodniowej w uszkodzeniu spojówki i zrośnięciu powiek sięga roku 1940. Obecnie w okulistyce błony owodniowe mają zastosowanie w chirurgii skrzydlika, usunięciu nowotworu spojówki, zrośnięciu powiek, formowaniu dna oka, rekonstrukcji oczodołu, oparzeniach chemicznych, nie gojących się wrzodów istoty właściwej, całkowitego lub częściowego braku komórek macierzystych rąbkowych oraz bolesnego zwyrodnienia pęcherzykowego rogówki. Błony owodniowe są również używane w okulistyce jako rusztowania ułatwiające regenerację oraz ze względu na swoje właściwości promujące reepitelializację obniżające stan zapalny i włóknienie, oraz zapobiegające powstawaniu naczyń krwionośnych na powierzchni oka [19, 28]. W dermatologii W leczeniu chorób skóry wykorzystuje się takie właściwości błony owodniowej jak: właściwości antyadhezyjne, bakteriostatyczne, ochronne w przypadku ran, redukujące ból oraz inicjujące epitelializację. Właściwości te zostały potwierdzone w badaniu prospektywnym u chorych z owrzodzeniem żylnym nóg, w którym obserwowani pacjenci odczuli zmniejszenie bólu. Zaobserwowano także zmniejszenie włóknienia i powstawanie nabłonka w miejscu ran [19, 20]. W ginekologii W ginekologii błony owodniowe mogą mieć zastosowanie jako pomoc w leczeniu zespołu Ashermana. Choroba ta objawia się powstawaniem zrostów i zwłóknień w endometrium. Zwłóknienia te leczy się histeroskopowo jednakże dodatkowo zastosowanie błon owodniowych polepsza regenerację endometrium [19].

650 Z. GRZYWOCZ, A. GAWRYLUK, B. NOSZCZYK PODSUMOWANIE Kliniczne zastosowanie błony owodniowej w okulistyce, do leczenia ran, w tym ran oparzeniowych i chirurgii stanowi tylko niewielki procent potencjału jaki ma zastosowanie komórek owodni oraz błon owodniowych. Ze względu na pluri- i multipotencjalne własności komórek owodniowych, oraz fakt nie tworzenia potworniaków po ich wszczepieniu, komórki te mogą mieć w przyszłości szerokie zastosowanie w transplantologii i medycynie regeneracyjnej. Właściwości immunomodulujące, przeciwzapalne i zapobiegające włóknieniu mają znaczenie dla chirurgii i transplantologii. Właściwości sekrecyjne owodni bakteriostatyczne oraz antywirusowe mogą także mieć znaczenie w farmacji. Udane próby z mrożeniem i przechowywaniem oraz tworzeniem linii komórkowych ips mogą w przyszłości pozwolić na wykorzystanie tych komórek w biotechnologii. Jednak w większości klinik popłód (łożysko wraz z błonami płodowymi) stanowi zbędny materiał, który w standardowych procedurach ulega utylizacji. Jest to więc ciągle niedoceniane i słabo wykorzystywane źródło uniwersalnych, jak się wydaje, komórek i struktur. PODZIĘKOWANIA Praca została wykonana w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka 2007-2013 pn. Innowacyjne metody wykorzystania komórek macierzystych w medycynie (POIG.01.01.02-00-109/09) LITERATURA [1] Aye IL, Paxton JW, Evseenko DA, Keelan JA. Expression, localization and activity of ATP binding cassette (ABC) family of drug transporters in human amnion membranes. Placenta. 2007; 28: 868-877. [2] Bartel H, Embr iol ogia, Wydawnict wo Lekar skie PZWL, War szawa 2010. [3] Bielańska-Osuchowska Z. Embriologia, Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa 2010. [4] Chang YJ, Hwang SM, Tseng CP, Cheng FC, Huang SH, Hsu LF, Hsu LW, Tsai MS. Isolation of mesenchymal stem cells with neurogenic potential from the mesoderm of the amniotic membrane. Cells Tissues Organs. 2010; 192: 93-105. [5] Cheglakov IB, Rytenkov AN, Yarygin KN. Vital dye dil and fluorescent magnetic microparticles do not affect the phenotype of mesenchymal stem cells from human amnion and their differentiation capacity. Bull Exp Biol Med. 2008; 145: 504-510. [6] Díaz-Prado S, Muiños-López E, Hermida-Gómez T, Rendal-Vázquez ME, Fuentes-Boquete I, de Toro FJ, Blanco FJ. Multilineage differentiation potential of cells isolated from the human amniotic membrane. J Cell Biochem. 2010; 111: 846-857. [7] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8: 315-317.

BŁONA OWODNIOWA: BUDOWA, FUNKCJE I ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE.. 651 [8] Ge X, Wang IN, Toma I, Sebastiano V, Liu J, Butte MJ, Reijo Pera RA, Yang PC. Human Amniot ic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 2012 Jun 11. [Epub ahead of print] [9] Han YM, Romero R, Kim JS, Tarca AL, Kim SK, Draghici S, Kusanovic JP, Gotsch F, Mittal P, Hassan SS, Kim CJ. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heteroogeneity of the human amnion. Biol Reprod. 2008; 79: 954-961. [10] Hou Y, Huang Q, Liu T, Guo L: Human amnion epithelial cells can be induced to differentiate into functional insulin-producing cells. Acta Biochim Biophys Sin 2008; 40: 830-839. [11] Hwang JH, Shim SS, Seok OS, Lee HY, Woo SK, Kim BH, Song HR, Lee JK, Park YK. Comparison of cytokine expression in mesenchymal stem cells from human placenta, cord blood, and bone marrow. J Korean Med Sci. 2009; 24: 547-554. [12] Izumi M, Pazin BJ, Minervini CF, Gerlach J, Ross MA, Stolz DB, Turner ME, Thompson RL, Miki T. Quantitative comparison of stem cell marker-positive cells in fetal and term human amnion. J Reprod Immunol 2009; 81:39-43. [13] Jura Cz, Krzanowska H, Rzehak K, Podstawy Embriologii, wydawnictwo PWN, 1983. [14] Kitada M, Wakao S, Dezawa M. Muse cells and induced pluripotent stem cell: implication of the elite model. Cell Mol Life Sci. 2012 Apr 24. [Epub ahead of print] [15] Kobayashi M, Yakuwa T, Sasaki K, Sato K, Kikuchi A, Kamo I, Yokoyama Y, Sakuragawa N. Multilineage potential of side population cells from human amnion mesenchymal layer. Cell Transplant. 2008; 17: 291-301. [16] König J, Huppertz B, Desoye G, Parolini O, Fröhlich JD, Weiss G, Dohr G, Sedlmayr P, Lang I. Amnion-derived mesenchymal stromal cells show angiogenic properties but resist differentiation into mature endothelial cells. Stem Cells Dev. 2012; 20; 21: 1309-1320. [17] Li F, Miao ZN, Xu YY, Zheng SY, Qin MD, Gu YZ, Zhang XG. Transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells in the treatment of focal cerebral ischemia. Mol Med Report. 2012; 6: 625-630. [18] Magatti M, De Munari S, Vertua E, Nassauto C, Albertini A, Wengler GS, Parolini O. Amniotic mesenchymal tissue cells inhibit dendritic cell differentiation of peripheral blood and amnion resident monocytes. Cell Transplant. 2009; 18: 899-914. [19] Mamede AC, Carvalho MJ, Abrantes AM, Laranjo M, Maia CJ, Botelho MF. Amniotic membrane: from structure and functions to clinical applications. Cell Tissue Res. 2012 May 18. [Epub ahead of print] [20] Mermet I, Pottier N, Sainthillier J, Malugani C, Cairey-Remonnay S, Maddens S, Riethmuller D, Tiberghien P, Humbert P, Aubin F. Use of amniotic membrane transplantation in the treatment of venous leg ulcers. Wound Repair Regen 2007; 15: 459-464. [21] Miki T, Amnion-derived stem cells: in quest of clinical applications. Stem Cell Res Ther. 2011; 2: 25. [22] Pappa KI, Anagnou NP. Novel sources of fetal stem cells: where do they fit on the developmental conotinuum? Regen Med. 2009; 4: 423-433. [23] Paracchini V, Carbone A, Colombo F, Castellani S, Mazzucchelli S, Gioia SD, Degiorgio D, Seia M, Porretti L, Colombo C, Conese M. Amniotic mesenchymal stem cells: a new source for hepatocyte-like cells and induction of CFTR expression by coculture with cystic fibrosis airway epithelial cells. J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 575471. [24] Parolini O, Alviano F, Bagnara GP, Bilic G, Bühring HJ, Evangelista M, Hennerbichler S, Liu B, Magatti M, Mao N, Miki T, Marongiu F, Nakajima H, Nikaido T, Portmann-Lanz CB, Sankar V, Soncini M, Stadler G, Surbek D, Takahashi TA, Redl H, Sakuragawa N, Wolbank S, Zeisberger S, Zisch A, Strom SC. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 2008; 26: 300-311. [25] Pasquinelli G, Tazzari P, Ricci F, Vaselli C, Buzzi M, Conte R, Orrico C, Foroni L, Stella A, Alviano F, Bagnara GP, Lucarelli E. Ultrastructural characteristics of human mesenchymal stromal (stem) cells derived from bone marrow and term placenta. Ultrastruct Pathol. 2007; 31: 23-31.

652 Z. GRZYWOCZ, A. GAWRYLUK, B. NOSZCZYK [26] Payne WG, Wachtel TL, Smith CA, Uberti MG, Ko F, Robson MC. Effect of amnion-derived cellular cytokine solution on healing of experimental partial-thickness burns. World J Surg. 2010; 34: 1663-1668. [27] Sakuragawa N, Elwan MA, Uchida S, Fujii T, Kawashima K. Non-neuronal neurotransmitters and neurotrophic factors in amniotic epithelial cells: expression and function in humans and monkey. Jpn J Pharmacol. 2001; 85: 20-23. [28] Schulze U, Hampel U, Sel S, Goecke TW, Thäle V, Garreis F, Paulsen F. Fresh and cryopreserved amniotic membrane secrete the trefoil factor family peptide 3 that is well known to promote wound healing. Histochem Cell Biol. 2012 Apr 3. [Epub ahead of print] [29] Shinya M, Komuro H, Saihara R, Urita Y, Kaneko M, Liu Y. Neural differentiation potential of rat amniotic epithelial cells. Fetal Pediatr Pathol. 2010; 29: 133-143. [30] Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2007; 12: 3081-3089. [31] Toda A, Okabe M, Yoshida T, Nikaido T. The potential of amniotic membrane/amnion-derived cells for regeneration of various tissues. J Pharmacol Sci 2007; 105: 215-228. [32] Tseng JJ, Chen YF, Hsieh YT, Chou MM. Elevated amniotic fluid stromal cell-derived factor-1alpha (SDF-1alpha) concentration in mid-gestation as a predictor of adverse birth outcomes. J Chin Med Assoc. 2009; 72: 638-642. [33] Venkatachalam S, Palaniappan T, Jayapal PK, Neelamegan S, Rajan SS, Muthiah VP. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 2009; 33: 81-89. [34] Wakao S, Kitada M, Dezawa M. The elite and stochastic model for ips cell generation: Multilineagedifferentiating stress enduring (Muse) cells are readily reprogrammable into ips cells. Cytometry A. 2012 Jun 12. [Epub ahead of print] [35] Wakao S, Kitada M, Kuroda Y, Shigemoto T, Matsuse D, Akashi H, Tanimura Y, Tsuchiyama K, Kikuchi T, Goda M, Nakahata T, Fujiyoshi Y, Dezawa M. Multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells are a primary source of induced pluripotent stem cells in human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108: 9875-9880. Otrzymano: 15.09.2012 Przyjęto: 06.12.2012 Zofia Grzywocz Zakład Cytologii Klinicznej Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego ul. Marymoncka 99/103, 01-813 Warszawa tel.: (22) 569 37 87 fax: (22) 569 38 39 e-mail: sofiabiol@poczta.onet.pl Redaktor prowadzący Maciej Zabel