STRESZCZENIE mgr Paweł Czubak

Transkrypt

1 STRESZCZENIE mgr Paweł Czubak Komórki macierzyste są słabo zróżnicowane, zdolne do samoodnowy i różnicowania w inne typy komórek. Cechuje je zdolność do nielimitowanego podziału. Występują w niewielkiej liczbie w większości tkanek i organów. Wykazują one różną zdolność różnicowania się, w związku z czym wyróżniamy komórki totipotencjalne, pluripotencjalne, multipotencjalne i unipotencjalne. Najwyższa zdolność różnicowania przejawiają embrionalne komórki macierzyste (ang. embryonic stem cells, ESCs), lecz ich wykorzystanie związane jest z problemami natury etycznej, w przeciwieństwie do użycia komórek pochodzących z dojrzałych tkanek i narządów, np. mezenchymalnych komórek macierzystych (ang. mesenchymal stem cells, MSCs). MSCs wywodzą się z embrionalnej mezodermy. Naturalnie zasiedlają różne tkanki, m.in. szpik kostny, tkankę tłuszczową, okostną, błonę maziową, mięśnie, skórę właściwą, krew czy istotę gąbczastą kości. Powszechność ich występowania sprawia, że są stosunkowo łatwe do pozyskania. W warunkach in vitro MSCs charakteryzują się wrzecionowatym kształtem, wzrostem w monowarstwie oraz adhezją do plastiku. In vivo charakteryzują się długim czasem przeżycia. Wśród MSCs najlepiej poznane są komórki pochodzące ze szpiku kostnego, choć wiadomo, że różne MSCs mają podobne cechy niezależnie od pochodzenia. Mezenchymalne komórki macierzyste wykazują zdolność różnicowania się w komórki innych listków zarodkowych niż ten, z którego się wywodzą. Przykładem jest różnicowanie ich (linia komórek mezodermalnych) w komórki β trzustkowe (linia komórek endodermalnych). Tradycyjny przeszczep komórek trzustkowych to obecnie najlepszy sposób leczenia cukrzycy. Problemem pozostaje jednak zbyt mała liczba dawców przeszczepów. Ze względu na niską immunogenność mezenchymalne komórki macierzyste mogą być wykorzystane w przeszczepach allogenicznych. W taki sposób mogą być stosowane np. w leczeniu cukrzycy, poprzez ich uprzednie zróżnicowanie, w warunkach in vitro, w komórki produkujące insulinę, a następnie wszczepienie pacjentowi.

2 Różne grupy badaczy prowadziły badania nad różnicowaniem komórek macierzystych w komórki produkujące insulinę. Wykazano, że mogą być one różnicowane w sposób pośredni i bezpośredni. Różnicowanie pośrednie polega na zastosowaniu induktorów chemicznych i czynników wzrostu, wpływających na ekspresję określonych genów. Do najczęściej wykorzystywanych tego typu czynników należą: EGF, bfgf, aktywina A, betacellulina oraz wysokie stężenie glukozy w podłożu. Różnicowanie bezpośrednie polega na transferze określonych genów, np. z wykorzystaniem wektorów wirusowych. Takie geny wbudowują się w genom gospodarza, po czym następuje różnicowanie komórek. W przypadku różnicowania MSCs w komórki IPCs, ważną rolę odgrywa to, z jakiego miejsca w organizmie pochodzą, np. MSCs szpiku kostnego łatwiej ulegają różnicowaniu niż komórki pozyskane z tkanki tłuszczowej czy krwi pępowinowej. Pierwsze próby różnicowania komórek macierzystych zostały przeprowadzone przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych. D Amour i wsp., wykorzystując substancje chemiczne i czynniki wzrostu, osiągnęli stopień zróżnicowania komórek na poziomie około 7,3%. Podobnie Takeuchi i wsp., różnicując hescs uzyskali około 9,2% komórek IPCs. Jeden z pierwszych protokołów różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego przedstawili Xie i wsp. Wykorzystując pośrednią metodę różnicowania uzyskali oni komórki, które wytwarzały 8,4 ± 2,9 ng insuliny na 10 6 komórek. Sun i wsp. w podobny sposób uzyskali 68 ± 14% różnicujących się komórek, które wydzielały cząsteczki insuliny o aktywności 46,5 ± 3,6 µiu/ml. Tang i wsp. udowodnili, że czynnikiem stymulującym produkcję insuliny jest wysokie stężenie glukozy w podłożu hodowlanym, z kolei Tsai i wsp. przeprowadzili doświadczenie, w którym wykazali, że wysokie stężenie glukozy może być jedynym induktorem różnicowania. Jak dotąd nie udało się jednak opracować protokołu różnicowania, który z odpowiednią wydajnością pozwalałby otrzymywać komórki produkujące insulinę. Należy pamiętać o tym, że użycie niezróżnicowanych komórek macierzystych do przeszczepu może stanowić zagrożenie dla pacjenta. Celem pracy było pośrednie przekształcenie MSCs szpiku kostnego linii Bone Marrow Stromal Cells w komórki produkujące insulinę. Różnicowanie

3 przeprowadzono na podstawie protokołu zaproponowanego przez Sun i wsp., ze zmianami, które dotyczyły głównie stężeń czynników wzrostu. Kontrolę dla zróżnicowanych komórek stanowiły komórki MSCs szpiku kostnego nie poddane procesowi różnicowania. Dodatkowo, stosując różne stężenia czynników wzrostu, określono stężenie optymalne dla różnicowania BM-MSCs w IPCs. Starano się także odpowiedzieć na pytanie, czy komórki IPCs uzyskane w taki sposób są zdolne do wydzielania cząsteczek insuliny. W tym celu, korzystając z testu immunoenzymatycznego ELISA, zbadano stężenie peptydu C w podłożu po hodowli. Otrzymane wyniki ewidentnie wskazują na to, że komórki BM-MSCs różnicowały się w IPCs. Komórki przed różnicowaniem miały wydłużony, wrzecionowaty kształt. Po różnicowaniu większość hodowli tworzyła struktury podobne do wysp trzustkowych. Barwienie ich Ditizonem pozwoliło uwidocznić cząsteczki insuliny wewnątrz komórek IPCs. Inne dane mówią o tym, jaki wpływ na różnicowanie komórek miało stężenie czynników wzrostu. Najmniej komórek ulegało zróżnicowaniu przy stężeniu wynoszącym 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bfgf, 10 ng/ml aktywiny A oraz 10 ng/ml betacelluliny (średnio 3,65%), najwięcej zaś przy stężeniu czynników wzrostu wynoszącym 60 ng/ml EGF, 60 ng/ml bfgf, 30 ng/ml aktywiny A oraz 30 ng/ml betacelluliny (średnio 31,42%). W dwóch przypadkach udało się uzyskać ponad 50% różnicujących się komórek. Dalsze zwiększanie stężenia czynników wzrostu spowodowało spadek ilości komórek różnicujących się w IPCs: przy stężeniu czynników wzrostu wynoszącym 100 ng/ml EGF, 100 ng/ml bfgf, 50 ng/ml aktywiny A oraz 50 ng/ml betacelluliny średnio 13% komórek ulegało różnicowaniu. Świadczy to o istotnym wpływie stężenia tych czynników na odsetek powstających IPCs. Wykorzystując technikę qrt-pcr udało się określić poziom ekspresji mrna dla insuliny, w zależności od zastosowanego stężenia czynników wzrostu. Poziom ekspresji obliczono według 1/ C t. Z otrzymanych danych wynika, że ekspresja mrna dla insuliny w różnicowanych komórkach nie jest zależna od zastosowanego stężenia czynników wzrostu. Istotne jest także to, że w porównaniu do próby kontrolnej, poziom ekspresji w komórkach IPCs był średnio od około 3 do około 4 razy wyższy.

4 W przeprowadzonym badaniu oceniano także stężenie peptydu C w podłożu po hodowli i różnicowaniu komórek macierzystych. Otrzymane dane pokazują, że stężenie peptydu C w podłożu było bardzo niskie. W zaledwie jednym przypadku wynik był wyższy niż dla kontroli, jaką były komórki niepoddane procesowi różnicowania. Stężenie użytych czynników wzrostu nie wpływało w sposób istotny na stężenie peptydu C wydzielanego przez komórki IPCs. Zróżnicowane komórki praktycznie nie wydzielały tej cząsteczki do podłoża hodowlanego. Na podstawie wyników badania wysunięto następujące wnioski: 1) Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego linii Bone Marrow Stromal Cells są zdolne do różnicowania się w komórki produkujące insulinę. 2) Wysokie stężenie glukozy oraz użycie czynników wzrostu: rekombinowanego ludzkiego EGF, rekombinowanego ludzkiego bfgf, ludzkiej betacelluliny, rekombinowanej ludzkiej aktywiny A indukują przekształcenie komórek BM-MSCs w komórki produkujące insulinę. 3) Stężenie czynników wzrostu użytych w hodowli ma znaczący wpływ na liczbę powstających komórek IPCs. Optymalne stężenie czynników wzrostu to 60 ng/ml EGF, 60 ng/ml bfgf, 30 ng/ml aktywiny A oraz 30 ng/ml betacelluliny. 4) Pośrednie różnicowanie komórek BM-MSCs w IPCs jest związane z powstaniem pseudo-wysp trzustkowych w postaci sferycznych struktur. Ich ilość oraz budowa zależy od użytego w hodowli stężenia czynników wzrostu. 5) Poziom ekspresji mrna dla insuliny w różnicowanych komórkach MSCs nie zależy od zastosowanych stężeń czynników wzrostu. 6) Wytwarzane przez IPCs cząsteczki insuliny nie są wydzielane na zewnątrz komórki. Zmiany stężeń czynników wzrostu nie wpływają na ten proces.

5 Podsumowując, wyniki badań przedstawionych w niniejszej pracy dowodzą, że komórki macierzyste szpiku kostnego są zdolne do różnicowania w komórki IPCs. Co więcej, wykazano że nawet tak niewielkie zmiany w trakcie różnicowania, jak zwiększanie stężenia wybranych związków, może prowadzić do znacznej poprawy wydajności różnicowania. Dużym plusem MSCs, wykorzystywanych do leczenia osób chorych jest to, że komórki te nadają się idealnie do przeszczepów autologicznych, dzięki czemu możemy uniknąć wielu komplikacji. Niektóre badania uwidaczniają, że do stymulacji różnicowania niezbędne jest jedynie wysokie stężenie glukozy w podłożu hodowlanym. Według innych badań potrzebne są inne liczne stymulatory różnicowania. W badaniach nad różnicowaniem komórek macierzystych w IPCs uwidocznione zostały także różnice między różnicowaniem komórek pochodzących od diabetyków i od osób zdrowych. Wciąż jest jednak wiele zagadek, których rozwikłanie może zbliżyć nas do sytuacji, w której osoba chora na cukrzyce będzie otrzymywała przeszczep z własnych zróżnicowanych komórek macierzystych, który będzie w pełni zastępował normalną pracę trzustki w zakresie wytwarzania insuliny i reakcji na zmiany stężenia glukozy we krwi.

6 ABSTRACT Stem cells are poorly-differentiated, capable of self-renewal and differentiation into other cell types. They are characterized by the ability of unlimited cell division and they are present in a small number in almost all tissues and organs. Stem cells exhibit varyied ability of differentiation, and therefore totipotent, pluripotent, multipotent and unipotent stem cells can be distinguished. Embryonic stem cells (ESCs) have the highest potential of differentiation, but their use is associated with the ethical problems, in a contrast to the cells derived from adult tissues and organs, for example mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs derive from embryonic mesoderm. They colonize different tissues, including bone marrow, adipose tissue, periosteum, synovium, muscle, dermis, blood or cancellous bone. Their widespread occurrence makes them relatively easy to obtain. In vitro MSCs are spindle-shaped, grow in the monolayer and are plasticadherent cells. In vivo they are characterized by the potential for long-term survival. Among other MSCs, bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) are the best known, although all MSCs have similar characteristics regardless of their origin. Mesenchymal stem cells have the ability to differentiate into germ layers other than those they originated from. The example is the differentiation of mesenchymal stem cells (mesodermal cell line) into pancreatic β cells (endodermal cell line). Traditional pancreatic cell transplantation is currently considered to be the best method for the treatment of diabetes. The remaining problem is a small number of donors. Due to the low immunogenicity of the mesenchymal stem cells, they can be used in allogeneic transplants, for example, in the treatment of diabetes MSCs can be in vitro differentiated into the insulin-producing cells (IPCs), and then implanted into the patient. Various researchers investigated the differentiation of stem cells into insulinproducing cells. It has been shown that stem cells can be differentiated in a direct or indirect way. Indirect differentiation involves the use of chemical inducers and growth factors, which affect the expression of specific genes. The most commonly used factors are EGF, bfgf, activin A, betacellulin and high glucose concentration. Direct differentiation involves transfer of specific genes with the use of, for example, viral vectors. Such genes build into the host genome, and then the cell differentiate. The

7 source of stem cells plays an important role in the case of the MSCs differentiation into IPCs. For example, the BM-MSCs can be differentiated more easily than the cells derived from adipose tissue or umbilical cord blood. The first attempts to differentiate stem cells into IPCs were carried out with the use of embryonic stem cells. D'Amour et al. differentiated ESCs using chemicals and growth factors, and obtained about 7.3% of IPCs. Similarly Takeuchi et al., after differentiation of hescs gained about 9.2% of IPCs. One of the first bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation protocol was introduced by Xie et al. Using the indirect method of differentiation they obtained cells that produced 8.4 ± 2.9 ng of insulin per 10 6 cells. Sun et al., using a similar protocol of differentiation obtained 68 ± 14% of differentiated cells. These IPCs secreted insulin whose activity was 46.5 ± 3.6 µiu/ml. Tang et al., demonstrated that the high glucose level is the factor which stimulates insulin production, while Tsai et al., conducted an experiment in which they showed that the high glucose concentration may be the only differentiation inducer. So far, there is no highly efficient differentiation protocol, which could instruct us how to obtain a large number of insulin producing cells. It is crucial because the use of undifferentiated stem cells for transplantation may pose a risk to the patient. The aim of the study was to differentiate BM-MSCs of the Bone Marrow Stromal Cells line into insulin-producing cells, with the use of chemicals and growth factors. Differentiation was based on the protocol proposed by Sun et al. Some changes, mainly related to the concentration of growth factors, were introduced. As a control we used undifferentiated bone marrow MSCs. In addition, the optimal concentration for the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into insulin producing cells was determined with the use of various concentrations of growth factors. We also attempted to answer the question whether the IPCs obtained in this way are able to secrete insulin molecules. For this purpose, the concentration of C- peptide in the culture medium was measured with the use of the enzyme-linked immunosorbent asay (ELISA). The results clearly indicate that the MSCs differentiated into IPCs. Before the differentiation, the cells were elongated, spindle-shaped. After the differentiation, most of the cells growing in a cell culture formed structures similar to pancreatic islets. The dithizone staining helped to reveal the insulin molecule within the IPCs.

8 Other data indicate that the use of various growth factors concentration resulted in different IPCs numbers. At the concentration of 20 ng/ml of EGF, 20 ng/m of bfgf, 10 ng/ml of activin A and 10 ng/ml of betacellulin, the smallest number of MSCs differentiated into IPCs (an average of about 3.65%). On the other hand, the highest number of MSCs differentiated into IPCs (an average of about 3.65%) at the concentration of 60 ng/ml of EGF, 60 ng/ml of bfgf, 30 ng/ml of activin A and 30 ng/ml of betacellulin. In these two cases, we achieved over 50% of differentiated cells. Further increase of growth factors concentration caused a decrease in the number of differentiated IPCs: at the concentration of growth factors of 100 ng/ml of EGF, 100 ng/m of bfgf, 50 ng/ml of activin A and 50 ng/ml of betacellulin only an average of about 13% of the cells underwent differentiation. This demonstrates the significant influence of the concentration of these factors on the percentage of generated IPCs. Using qrt-pcr technique, we determined the level of insulin mrna expression and its dependence on the concentration of growth factors. The expression level was calculated according to 1/ΔCt. Looking at the data we can see that the concentration of growth factors did not influence the insulin mrna expression level. It is also important that, in comparison with the control, the mrna expression level was about 3 to 4 times higher. In this research we also examined the C-peptide levels in the medium after the cultivation and differentiation of stem cells. The collected data demonstrate that C- peptide levels in the medium was very low. In only one case, the result was higher than in the control, involving the undifferenciated cells. The used concentration of growth factors had no significant effect on the concentration of C-peptide secreted by the IPCs. The following conclusions were put forward, basing on the results of the research: 1) Bone marrow mesenchymal stem cells of the Bone Marrow Stromal line are capable of differentiating into insulin producing cells. 2) High glucose concentration and the use of growth factors: recombinant human EGF, recombinant human bfgf, human betacellulin and recombinant human activin A induce BM-MSCs differentiation into IPCs.

9 3) The concentration of growth factors used in the cell culture has a significant impact on the number of generated IPCs. The optimal concentration of growth factors is 60 ng/ml of EGF, 60 ng/ml of bfgf, 30 ng/ml of activin A and 30 ng/ml of betacellulin. 4) Indirect differentiation of BM-MSCs into IPCs is associated with the generation of pancreatic pseudo-islet in the form of spherical structures. Their number and quantity is dependent upon the growth factors concentration used in the culture. 5) The level of the insulin mrna expression in differentiated MSCs does not depend on the concentration of growth factors used. 6) Insulin molecules produced by the IPCs are not secreted outside the cell. Changes in the concentrations of growth factors do not affect this process. To sum up, the results presented in this paper show that the bone marrow mesenchymal stem cells are capable of differentiating into insulin producing cells. Moreover, it was shown that during the differentiation even small changes, for example increasing the concentration of growth factors, can lead to the significant improvements in the efficiency of the differentiation. MSCs are ideal for autologoustransplantation, so we can avoid many complications by using them. Some studies underline that the high glucose concentration in the culture medium is the only one necessary factor during the differentiation of stem cells into IPCs. According to other studies, numerous other differentiation stimulants are needed. There are still many problems to be solved and unraveling them may bring us closer to a situation when a person suffering from diabetes will receive his or her own differentiated stem cells as a transplant. Further research are needed to obtain IPCs which will fully replace the normal pancreatic insulin secretory function.