Przebudowa struktur chromatynowych przez kompleksy wielobiałkowe. The rearrangement of chromatin structures by multiprotein complexes

Transkrypt

1 Przebudowa struktur chromatynowych przez kompleksy wielobiałkowe The rearrangement of chromatin structures by multiprotein complexes TOMASZ T. CALIKOWSKI Spis treści: I. Wstęp II. Maszyny komórkowe zaangażowane w przebudowę struktur chromatynowych III. Kompleksy białkowe związane z utrzymywaniem tkankowo specyficznego wzoru ekspresji genów IV. Uwagi końcowe Contents: I. Introduction II. Cellular machines responsible for remodeling of chromatin structures III. Protein complexes involved in the maintenace of tissue specific pattern of gene expression IV. Concluding remarks Wykaz stosowanych skrótów: ACF ATP-zależny czynnik składania i przebudowy chromatyny (ang. A T P dependent chromatin assembly and rem odeling factor), BSH mutacja krzaczasty wzrost A rabidopsis thaliana (ang. bushy growth), NURF czynnik przebudowy nukleosomów (ang. nucleosome rem odeling factor), CHRAC kompleks warunkujący dostępność do chromatyny (ang. chromatin accessibility complex), FIE mutacja bielmo niezależne od zapłodnienia (ang. Fertilization Independent Endosperm), F IS mutacja nasienie niezależne od zapłodnienia (ang. Fertilization Independent Seed), Pc-G - białka z grupy Polycom b, PEV efekt zmiany barwy w zależności od położenia genu (ang. position effect variegation), RSC kompleks remodelowania chromatyny (ang. remodels the structure o f chromatin), SWI gen zmiany typu płciowego drożdży (ang. switch), SNF gen związany z fermentacją sacharozy u drożdży (ang. sucrose non-ferm enting), trx-g białka z grupy trithorax. I. Wstęp Jedną z zasadniczych cech organizm ów eukariotycznych jest obecność jądra, czyli przedziału komórkowego zawierającego m ateriał genetyczny. Powoduje to, że wszelkie procesy molekularne związane z DNA takie jak replikacja, rekom binacja i transkrypcja zachodzą w wydzielonej przestrzeni wew nątrzkom órkowej. Rów nież i inne etapy Dr, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Pracownia Biologii Molekularnej Roślin, ul. Pawińskiego 5a, Warszawa, tomekc@ibb.waw.pl ekspresji genów nie związane z DNA, jak następująca równocześnie z transkrypcją lub po niej obróbka RNA, zachodzą wewnątrz jądra kom órkow e go. Na terenie jądra DNA podlega wieloetapowemu, hierarchicznem u procesowi kondensacji, dzięki któremu jego długość, zbliżająca się u wyższych eukariontów po całkowitym rozprostow aniu do kilku m e trów, ulega pozornemu skróceniu o ok razy [1, 2]. Kondensacja genomowego DNA stwarza potencjalny problem zapewnienia dostępu czynników białkowych do sekwencji genowych i regulatorowych zawartych w DNA. Wymaga to szybkiej i efektywnej przebudowy struktur DNA zwiniętego wewnątrz jądra i pozostającego w ścisłym kontakcie z białkami kondensującymi. Do wytworzenia tychże struktur nukleoproteinowych (noszących nazwę chromatyny) dochodzi w pierwszym rzędzie poprzez oddziaływania DNA z silnie zasadowymi białkami histonami [3, 4]. W wyniku tych oddziaływań tworzy się podstaw owa jednostka strukturalna chrom atyny nukleosom [5, 6]. Cząstki nukleosomowe zawierające DNA i histony widoczne są pod m ikroskopem elektronowym jako koraliki (ang. beads-ona-string) o średnicy 10 nm, ulokowane na nici DNA [7]. Pojedynczy koralik odpowiada cząstce rdzeniowej nukleosomu. Zawiera ona DNA o długości ok. 146 par zasad owinięty niemal dwukrotnie wokół rdzenia białkowego, w skład którego wchodzą po dwie dwóch cząsteczki każdego z histonów: H2A, POSTĘPY BIOCHEMII 47(2),

2 H2B, H3 i H4. Piąty histon, noszący nazwę łącznikowego lub H I, wiąże się do nukleosomu od zewnątrz i ułatwia organizowanie się nukleosomów w strukturę wyższego rzędu, włókno 30 nm. Histony ulegają modyfikacjom potranslacyjnym, jak acetylacja i fosforylacja, co ma znaczenie dla kontroli transkrypcji i regulacji cyklu kom órkow ego, a także dla organizacji ogólnej i lokalnej struktury chrom atyny [4]. Generalnie, chromatyna kompetentna transkrypcyjnie, czyli tzw. euchromatyna ma strukturę rozluźnioną, która w obrazie spod mikroskopu elektronowego widoczna jest jako miejsca jasne. Jej przeciwieństwem jest ciemna i gęsta elektronowo struktura nieaktyw nej transkrypcyjnie heterochrom atyny. Rola chromatyny w procesach z udziałem DNA (transkrypcja, replikacja, rekom binacja) nie ogranicza się do funkcji biernego rusztowania. Do zajścia tych procesów konieczna jest dynam iczna przebudowa elementów struktur chromatynowych. Kluczowe znaczenie m ają tu specyficzne czynniki m odyfikujące chromatynę, zdolne do jej aktywacji lub represji [8]. W większości procesów biochemicznych z udziałem chromatyny pośredniczą duże kompleksy zawierające liczne białka. Ich zasadniczą funkcją jest reorganizacja nukleosomów poprzez zmianę kontaktów DNA z histonam i [9]. II. Maszyny komórkowe zaangażowane w przebudowę struktur chromatynowych W ielopodjednostkowe kom pleksy białkowe przebudowujące chromatynę zostały do tej pory poznane u muchówek, drożdży i człow ieka [9-11]. U Drosophila poznano trzy takie kompleksy: czynnik przebudowy nukleosomów (NURF, ang. nucleosome rem odeling fa cto r) [12], kom pleks w a runkujący dostępność do chromatyny (CHRAC, ang. chromatin accessibility complex) [13] i ATP-zależny czynnik składania i przebudowy chromatyny (ACF, ang. ATP dependent chromatin assem bly and remodeling factor) [14]. Z kolei u drożdży poznano kompleks SW I/SNF (zob. opis poniżej) [15], jak i spokrewniony z nim kompleks remodelowania chromatyny RSC (ang. remodels the structure o f chromatin) [16]. Wszystkie one zdolne są do przebudowy struktur chromatynowych, lecz sposób ich działania jest różny w warunkach in vitro, co sugeruje, że także in vivo pełnią one odmienne role w procesie składania chromatyny i regulacji transkrypcji. Badania regulacji transkrypcji u drożdży pozw o liły na odkrycie genów związanych z niezdolnością do zmiany typu płciowego lub z niem ożnością fermentacji sacharozy. Pierw sze z nich nazwano SWI (od ang. switch o f mating type), drugie zaś SNF (od ang. sucrose non-fermenting) [17], Produkt jednego z genów pierwszej grupy, SWI2, okazał się identyczny z produktem genu z grupy drugiej i nosi odtąd nazwę SWI2/SNF2. Polipeptyd ten posiada siedem konserwowanych m otyw ów białkow ych charakterystycznych dla dużej grupy białek wiążących trifosforany nukleotydów. Do tej grupy należą również helikazy DNA i RNA. W wyniku dalszych prac okazało się, że białko SWI2/SNF2 współdziała z innymi partnerami (SWI1/ADR6, SWI3, SNF5 i SNF6) tworząc z nimi kompleks białkowy o masie ok. 2 megadaltonów, niezbędny do właściwej kontroli transkrypcyjnej [18, 11]. Supresorami mutacji swi i s n f są między innymi mutacje w genach biosyntezy histonów, co wskazuje, że białka SWI i SNF przeciw działają represji nukleosomowej [19]. Stwierdzono ponadto, że brak białka SW I2/SNF2 lub SWI5 powoduje obniżenie transkrypcji genu SUC2, oraz zmiany w okolicy promotora tego genu. Oba efekty można odwrócić przez obniżenie poziomu histonów H2A i H2B [20] Istnieje również doniesienie wskazujące na obecność kompleksu SWI/SNF w bliskim otoczeniu holoenzymu polim erazy II RNA [21] (jednak zob. [16]). Kom pleks hom ologiczny do SWI/SNF w yizolowano również z komórek ludzkich [22], zaś u Drosophila odkryto pokrewny mu kompleks brahma (brm), zawierający homolog białka SWI2/SNF2 białko BRM [23]. Kom pleks brahma zawiera co najmniej siedem podjednostek, w tym ATPazę. Białko to związane jest z regulacją genów homeotycznych, pełniących niezw ykle ważne funkcje podczas różnicowania komórek i rozwoju. Podobne białka, BRG-1 i BRM, występują także u ssaków, łącząc się ze specyficznymi czynnikami BAF, takimi jak IN I, BAF170 i BAF155 [22, 23]. W łączenie ich do kompleksu wraz z BRG1 w znaczny sposób podnosi jego aktywność, szczególnie tę zw iązaną ze zm ianą topologii DNA. Niedawno przeprow adzono dośw iadczenie, w którym wytworzono linię transgenicznych myszy, całkowicie pozbawionych genu i białka BRM [24]. Stwierdzono, że homozygotyczne myszy B R M '' rozwijały się normalnie, chociaż były cięższe o 15% od zwierząt kontrolnych z tego samego miotu. Ponadto, pochodzące z nich fibroblasty wykazywały niezdolność do zatrzymania się na granicy faz GO/G 1 cyklu komórkowego. Wyniki te świadczą o udziale białka BRM w proliferacji komórek. Wskazuje na to również zdolność tworzenia przez białko BRG1 kom pleksu z produktem genu supresora now otw orowego, retinoblastom a (RB) [25]. Oba białka znajdujące się w kom pleksie w spółdziałają przy ham o waniu cyklu kom órkowego. Białko brahma wchodzi 130 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

3 ponadto w skład multimerycznych kompleksów trithorax, odkrytych po raz pierwszy u Drosophila melanogaster (zobacz rozdział 3). Homologi drożdżowych składników kompleksu SWI/SNF wykryto również u roślin [26]. Białko BSH zarabidopsis thaliana ma masę 27 kda i wykazuje wysoką homologię do odpowiednika produktu drożdżowego genu SWI5, jak i do jego homologa z Caenorhabditis elegans i człowieka (INI1 lub hsnf5) (patrz dalej). Co ciekawe, znaczne obniżenie fizjologicznego poziomu białka BSH nie zmniejsza żywotności roślin, lecz wywołuje charakterystyczne zmiany fenotypowe, objawiające się krzaczastym pokrojem i niezdolnością do wydaw ania nasion. N a tomiast u Drosophila całkowity brak homologa genu SWI5 jest letalny [27]. Innym przedstawicielem rodziny kompleksów SWI/SNF jest ludzki kompleks hswi/snf. Zawiera on około 10 podjednostek, w tym hsn F5/IN Il, który jest bona fid e represorem nowotworowym, często nieobecnym w bardzo złośliw ych dziecięcych now o tworach siatkówki [28]. Funkcje biochemiczne składników hsw I/SNF są podobne do jego drożdżowego odpowiednika [10]. Istotną różnicę stanowią jednak ich wymagania względem czynników niezbędnych do aktywacji ATPazy: podczas gdy kompleksy zawierające białko ISWI (patrz str. 132) ulegają pobudzeniu wyłącznie przez nukleosomy, do stymulacji białka hsw I2 zdolne są zarówno nukleosomy, jak i wolny DNA. Do rodziny kompleksów SWI/SNF należy także drożdżowy kompleks remodelujący chromatynę RSC [16]. RCS ma masę bliską 1 MDa i zawiera 15 podjednostek, w tym ATPazę STH1, niezbędną do funkcjonowania całego kompleksu i homologiczną do białka SWI/SNF2. Homologię do składników kompleksu SWI/SNF wykazują jeszcze dwa inne polipeptydy kompleksu: RSC6 i RSC8. Kompleks RSC jest zdolny, podobnie jak SWI/SNF, do wywołania zależnych od ATP zmian oddziaływań histonów z DNA w zrekonstytuowanych mononukleosomach. Tym co różni kompleks RSC od SWI/SNF jest wpływ, jaki na wzrost kom órek drożdżow ych w y wierają mutacje w składnikach kompleksu. Podczas gdy geny składników SWI/SNF nie są konieczne do wzrostu S. cerevisiae, geny trzech składników RCS (RSC6, STH1 i RSC8) są niezbędne do wzrostu drożdży [29]. Co więcej, w przeciwieństwie do SWI/SNF RSC wykazuje zdolność do przenoszenia oktameru histonowego z rdzeniowej cząsteczki nukleosomowej na nagi DNA [30]. Nowo uformowany kompleks oktam eru z DNA wykazuje wszystkie cechy nukleosomu i powstaje z udziałem ATP. Kolejną rodziną czynników przebudowujących chrom atynę jest grupa kom pleksów M i-2/chd, znana również jako rodzina CHD. Jak dotąd, zaliczono do niej dwa kompleksy: Mi-2 (wyizolowany z Xenop u s) i NuRD (wyizolowany z kom órek ludzkich). Zawierają one od 6 do 7 podjednostek, w tym niezbędną do funkcjonowania ATPazę Mi-2/CHD [9]. Białka CHD zawierają oprócz motywu helikazy dwa motywy strukturalne noszące miano chromodomeny, odpowiedzialne za oddziaływania z innymi białkami, oraz motyw PHD (homeodomeny roślinnej) lub inny motyw odpowiedzialny za wiązanie DNA [23]. Chrom odomeny w ystępują w wielu białkach zw iązanych z chromatyną (w tym w białku heterochromatynowym 1 (HP1) Drosophila i w białkach z grupy Polycomb (patrz rozdział 3 tego artykułu). Interesującą obserwacją było ustalenie, że kompleks NuRD posiada dwie podjednostki (HDAC1 i HDAC2) o aktywności deacetylazy histonowej [31, 32]. Kompleks ten wchodzi ponadto w bezpośrednie lub pośrednie oddziaływania z m etylowanym DNA [9]. Z zarodków D rosophila wyizolowano trzy kom pleksy rem odelujące chrom atynę i wykazujące również aktywność ATPazy: NURF, CHRAC i ACF. N a leżą one, wraz z drożdżowymi kompleksami typu ISW I i ISW2 do rodziny kompleksów ISWI, gdyż wszystkie zawierają ATPazę ISWI (ang. imitation SWI2), homologiczną do białka SWI2 [14, 12, 33]. Homologia ta ogranicza się jednak tylko do motywu helikazy, gdyż białko ISWI nie posiada motywu noszącego nazwę brom odom eny obecnego w karboksylowym końcu SWI2/SNF2 [34], Domena ta służy do zapewnienia oddziaływań pomiędzy białkami. Bromodomena obecna w białku SWI2 wiąże się selektywnie do aminowych ogonów histonów H3 i H4 [35]. Sugeruje się jednak, że białko ISWI może także kontaktować się z ogonami histonów H2A i H2B [23]. Jego aktywność ATPazowa stanowi napęd większej maszynerii białkowej. Wykazano jednak, że ludzkie homologii SWI2/SNF2 (zawierające ISWI), BRG1 lub hbrm ułatwiają dostęp do DNA zorganizowanego w nukleosom, w sposób zależny od ATP i porównywalny z tym uzyskiwanym za pom ocą całych kom pleksów [36]. NURF zawiera 4 podjednostki i jest zdolny do rozbijania struktury nukleosomu podczas aktywacji transkrypcyjnej. Pierwszego przykładu takiej aktywacji dostarczył model w iązania się in vitro czynnika GAGA do układu nukleosom ów w obrębie których znajduje się promotor genu szoku cieplnego hsp70 u Drosophila [37]. Kom pleks NURF wykazuje POSTĘPY BIOCHEMII 47(2),

4 wysoką specyficzność wobec DNA zorganizow anego w strukturę nukleosomową, przy czym ważna rolę w rozpoznawaniu nukłeosomu przez NURF pełnią aminowe ogony histonów [38]. Stwierdzono rów nież, że rozpoznawanie ogonów histonów przez NURF nie jest związane z ich acetylacją. NURF nie posiada jednak zdolności do pozycjonowania nukleosomów. Taką aktywność posiada natomiast inny kom pleks z rodziny ISWI: ACF. Zawie- Ważna rola w organizacji struktur chromatynowych przypada kompleksowi CF1RAC. Zawiera on siedem podjednostek i wykazuje nie tylko aktywność ATPazy, jak pozostałe kompleksy przebudowujące Drosophila, lecz także topoizomerazy DNA II [39, 13, 40] W jego skład, oprócz ATPazy ISW I, topoizomerazy II i polipeptydu o masie 175 kda, wchodzą dwa małe białka o masie 14 kda i 16 kda, noszące odpowiednio nazwy MARY i JOEY [40]. W ykazują Nagi DNA Nut: k o i our/ odło arie, h c 2 nie r omiie sacaane prawidłowo Nukleosomy roania sączone prawidłowo Zwią.aanie aktywatora (ACT) twuraymiajsce nadwrażliwe na DNAzę I Odkładanie nukleosomów Ekstrakt z zarodków Drosophila. + history i Nap 1 f ACF CHRAC' Ryc. 1. Model składania chromatyny i zaburzania struktury nukłeosomu przez kompleks SWI/SNF, kompleks dostępności do chromatyny CHRAC, czynnik remodelowania nukleosomów NURF i zależny od ATP czynnik remodelowania i składania chromatyny ACF. Do złożenia chromatyny na matrycy DNA zawierającej miejsca wiązania dla aktywatora transkrypcyjnego (ACT, trzy ciemne, niewielkie prostokąty) może dojść w warunkach in vitro w dwu etapach: w pierwszym oktamer histonowy jest odkładany bez udziału ATP, zaś w drugim nukleosomy ulegają porządkowaniu. Czynniki niezdolne do przeprowadzenia danej reakcji zostały przekreślone [ Na podstawie 11]. ra on cztery podjednostki, w tym ATPazę ISWI. Oprócz pozycjonowania nukleosomów zdolny jest do pośredniczenia w ich składaniu, a także w przebudowie chrom atyny [14]. Do złożenia w pełni funkcjonalnej chromatyny ACF potrzebuje wyłącznie ATP, DNA, histonów oraz histonowego białka opiekuńczego N apl, chociaż do pozycjonowania już złożonych nukleosom ów N apl nie jest potrzebny. Wydaje się, że proces odkładania nukleosomów w funkcjonalne struktury chromatynowe zachodzi w dwu etapach: w pierwszym z nich działająhistonowe białka opiekuńcze niezależne od ATP, zaś w drugim kompleksy pozycjonujące zawierające ATPazę [ 11], one uderzające podobieństw o do domen zwoju histonowego, przypominając czynniki transkrypcyjne ssaków NF-YB i NF-YC, a także odpowiednio histony H2B i H2A. Co ciekawe, obie podjednostki CHRAC podlegają ścisłej regulacji podczas rozwoju Drosophila ich ekspresja jest najwyższa we wczesnym rozwoju zarodkowym, zaś gwałtownie obniża się w stadium poczwarki i formy dorosłej owada. Regulacja tego typu może świadczyć o roli, jaką kom pleks CHRAC pełni w kontroli podziałów kom órkowych, np. w bezpośrednim ułatwianiu replikacji DNA chromosomów, lub - poprzez zmiany w yższego rzędu struktur chromatynowych w kondensacji i dekondensacji chrom atyny związanej z tworzeniem 132 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

5 a następnie zanikiem chrom osom ów m etafazowych [41]. CHRAC nie jest zdolny do przebudowy struktury mononukleosomów (na wzór NURF i SWI/SNF), lecz jest w stanie przekształcać nieuporządkowane ich układy w pozycjonowane szeregi o minimalnej energii potencjalnej [14]. Zdolność do przebudowy struktur nukleosomowych, jak i zdolność do porządkowania układu nukleosomów charakteryzuje także niedawno poznany ludzki kompleks rem odelujący RSF [42, 43]. Kom pleks ten ma bardzo prostą budowę i składa się z zaledwie dwu podjednostek: polipeptydu o masie 135 kda wykazującego 75% homologii do białka ISWI Drosophila oraz z polipeptydu o masie 325 kda o nieznanej dotychczas funkcji. Listę aktyw ności poznanych dotąd kompleksów przebudowujących chromatynę przedstawia rycina 1. Podsumowanie wiadomości o poznanych dotąd zależnych od ATP kom pleksach przebudow ujących chrom atynę zaw iera Tabela 1. Nazwa: Swp82 Swp73 Swp61 /Snf12 BAF60 Rsc6 Bap60 Swp59 Snf6 /Arp7 BAF53 Rsc11/Arp7 Bap55 /Arp9 BAF53 Rsc12/Arp9 Bap53 Swp29 Snf11 /Tafii30 Rodzina kompleksów ISWI Pochodzenie: Bibliografia: Masa molekularna (kda): Aktywność: BAF57 [i-aktyna ßaktyna/Bap47 Rsc1 Rsc3,-5,-7,-9,-10 Rsc13,-15 Bap111 Bap47 NURF CHRAC ACF ISWI Drosophila Drosophila Drosophila drożdże [12] [13] [14] [15] Fosfataza Topoizomeraza nieorganiczna III. Kompleksy białkowe związane z utrzymaniem tkankowo specyficznego wzoru ekspresji genów Jedną z zasadniczych kwestii w regulacji rozwoju eukariontów jest utrzym anie tkankow ego wzoru ekspresji genów, który ustala się na wczesnych etapach Tabela 1 Wielobiałkowe kompleksy zależne od ATP, zdolne do przebudowy struktur chromatynowych (na podstawie [65] ATPaza: Pozostałe jednostki homologiczne: ISWI ISWI ISW1/ISW2 Nurf55 p215 Nurf38 Topoizomeraza II p175 p20 (MARY) p 18 (JOEY) ISWI Acf1 p74 p105 p110 p140 Rodzina kompleksów Mi-2 Rodzina kompleksów SWI2/SNF2 Kompleks: SWI/SNF SWI/SNF RSC Brahma Pochodzenie: drożdże człowiek drożdże Drosophila Bibliografia: [15,18,68] [10,22] [16] [23] Wielkość kompleksu (MDa) Funkcja: Przeciwdziałanie represji nukleo- somowej Represja nowotworowa Regulacja cyklu komórkowego Transfer okta- merów nukleo somowych Różnicowanie i rozwój poprzez wpływ na topologie DNA (regulacja genów homeotycznych) Silne wiązanie się do nukleosomów i do DNA, dysrupcja nukleosomów Nazwa: NURD/NuRD Mi-2 Pochodzenie: człowiek Xenopus Bibliografia: [66] [67] Masa molekularna (MDa); 0,7 0,6 Funkcja: Deacetylacja histonów i przebudowa zmetylowanych regionów chromatyny (mobilizacja nukleosomów) ATPaza: Mi-2ß/CHD4, Mi-2a/CHD3 Mi-2 Pozostałe jednostki homolgiczne: HDAC1 Rpd3 HDAC2 Rpd3 RbAp48 (NURD56) RbAb48/46 RbAp46 (NURD56) RbAp48/46 MTA1/2 (NURD70) MTAI-like MBD3 MBD3 p66 Sin3 ATPaza: Swi2/Snf2 hbrg1/hbrm Sth1/Nsp1 Brm Pozostałe jednostki homologiczne: Swi1 P270/BAF250 Swi5 hsnf5/inl1/baf47 Sfh1 Snr1 Swi3 BAF170, BAF155 Bap155/Moira Rsc8/Swh3 różnicowania komórek. Po rozpoczęciu procesu róż nicowania, kom órki realizują ustalony plan rozw ojo POSTĘPY BIOCHEMII 47(2),

6 wy, zapisany w genach za pom ocą struktur chromatynowych. Mechanizmy potrzebne do utrzymania ustalonego wzoru ekspresji genów nazwane pam ięcią komórkową, poznano najlepiej u Drosophila [44, 45]. Wykryto je również u innych eukariontów, w tym u roślin [46]. U Drosophila tożsamość segmentów ciała zależy od utrzymania ograniczonych przestrzennie wzorów ekspresji genów hom eotycznych. Geny te zebrane są puszczalny mechanizm działania kompleksów trx-g i Pc-G w chromatynie przedstawia rycina 2. Do białek z grupy Poly comb zaliczają się m. in. polycomb (Pc), polycom blike (Pci), Extra sex combs (Esc) i Enhancer o f zeste (E(z)). Utrata któregokolwiek z genów kodujących te białka nie zmienia wzoru ekspresji genów homeotycznych, lecz powoduje spadek ich represji na dalszych etapach embriogenezy, prowadząc do m utacji hom eotycznych. Pc-Gm (b) Pc-Gm PRE TATA (c) PRE TATA Y Lokalna deacetylacja histonów ^ hlperacetylowane, aktywne miejsce wiązania Ryc. 2. Przypuszczalny mechanizm (a, b) represji przez Pc-G i (c, d) aktywacji przez trx-g. Geny docelowe (takie jak geny homeotyczne Hox) mogą ulegać represji (a) lub aktywacji (b) wskutek działania wczesnych czynników specyficznych pod względem sekwencji DNA, takich jak Hunchback (Hb) i Fus hi tarazu (ftz). Prowadzi to do związania albo deacetylazy histonowej dmi2 (HDAC) i kompleksów białkowych Pc-G lub w przypadku aktywnych promotorów do związania holoenzymu polimerazy RNAII (POL II holo) i związanych z nim kompleksów remodelujących chromatynę GAGA/NURF. (b) Zmiana struktury chromatyny w wyniku lokalnej deacetylacji histonów, w połączeniu z działaniem wczesnych białek Pc-G, umożliwia wiązanie kolejnych białek z grupy Pc, co prowadzi do podtrzymania represji, (c) Z drugiej strony, kompleks polimerazy RNA II oraz białka remodelujące chromatynę uczestniczą w powstawaniu zmian w strukturze chromatyny, w czym wspomagająje również specyficzne sekwencyjnie białka trx-g (takie jak trx i GAGA), a być może także acetylazy histonowe (HAT), co prowadzi do powstania (d) hiperacetylowanego, aktywnego, miejsca wiązania [47], na chrom osomach w dwa regiony: Antennapedia i bithorax [44]. Zaburzenia w ekspresji któregokolwiek z genów tych kompleksów genowych prowadzi do charakterystycznych mutacji rozwojowych (mutacje homeotyczne). W procesie podtrzymywania pamięci komórkowej uczestniczą białka z dwóch grup trithorax (trx-g) i Polycomb (Pc-G), tworzące ogromne kom pleksy białkowe o masie 2-5 MDa [47]. Pierw sze z nich pełnią w chrom atynie funkcje aktyw atorów transkrypcji, drugie zaś represorów. Przy- Nieduże białko Pc (390 aminokwasów, 44 kda) w swoim końcu aminowym zawiera konserwowany motyw chromodomeny (37 aminokwasów), obecny również w drożdżowym białku SWI6, oraz w białku HP1 Drosophila związanym z heterochromatyną i kodowanym przez gen Su(var)205 [48]. To ostatnie białko związane jest z tak zwanym efektem zmiany barwy w zależności od położenia (PEV, ang.position effect variegation), podczas którego wyciszeniu ulegają geny przem ieszczone w pobliże struktur hetero- 134 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

7 chromatynowych. W przeciw ieństw ie do PEV R e presja wywierana przez kompleksy białek Pc-G nie musi być jednak zw iązana z heterochrom atynizacją. Doświadczenia przeprow adzone w ostatnich latach wskazują, że u Drosophila i u myszy istnieją dwa funkcjonalne kompleksy białek tej grupy. Pierwszy, potrzebny jest na wstępnym etapie procesu represji chromatynowej, zawiera m. in. białka Extra sex combs i Enhancer o f zeste. Drugi kompleks, zawierający m. in. białka Poly comb, Posterior sex combs (Psc) i Polyhomeotic (Ph) [47], niezbędnyjest do podtrzym aniu zainicjowanej już represji konkretnych genów. Przypuszcza się, że w oddziaływaniu z DNA jednego z białek z grupy Polycomb, (Esc), uczestniczy kom pleks M i-2, w którego skład wchodzi również deacetylaza histonow a [49]. M yszy pozbawione genów Pc-G, lub wyrażające nadmierną dawkę białka bmi-1 (hom ologa białka psc z D rosophila), w ykazują charakterystyczne defekty rozwojowe, jak zaburzenia szkieletu osiowego oraz zmieniony wzór proliferacji i żywotności komórek krwiotwórczych [50]. Podobne efekty w yw iera utrata kontroli nad ekspresją genów homeotycznych u człowieka, co objawia się wrodzonymi defektami rozwoju szkieletu (wielopalczastość) i białaczkami [51]. Poza wpływem na geny homeotyczne, białka z grupy Polycomb wiążą się także do innych miejsc na chromosomach. U myszy jednym z nich jest locus INK4a, kodujący inhibitory cyklu komórkowego p 16 i p l9 A rf [52]. Nadekspresja białka bmi-1 powoduje zmniejszenie produkcji tych inhibitorów. Zarówno p 16, jak i p 19A rf są regulatorami szlaków supresji nowotworowej białek Retinoblastoma (RB) i p53, które stanow ią kom órkow y m echanizm odliczający podziały komórkowe i chroniący komórki przed unieśm iertelnieniem [53]. Być może kom pleksy Pc-G są częścią kom órkow ego zegara odliczającego podziały kom órek. Z najbardziej w yrazistym efektem działania genów z grupy Polycomb mamy do czynienia u myszy pozbawionych genu M33, homologa genu Polycomb z Drosophila. U zwierząt homozygotycznych pod względem delecji dochodzi do zmiany płci z męskiej na żeńską [54], Może to świadczyć o wpływie represji Pc-G na szlak determinacji płci SRY. Ostatnio białka z grupy Polycom b odkryto rów nież u roślin [46], U roślin wyższych, jak Arabidopsis, geny te mają wpływ na rozwój zarodka i bielma. M utacje w genach FIE (ang. Fertilization Independent Endosperm; bielm o niezależne od zapłodnienia; [55]) lub FIS (ang. Fertilization Independent Seed, nasienie niezależne od zapłodnienia; [56]) pobudzają wytwarzanie bielma, powstawanie otoczki nasiennej, wydłużanie nasienia, a nawet częściowy rozwój zarodka bez wcześniejszego zapłodnienia. Takie efekty przypominają apomiksję, będącą formą rozrodu nie powiązanego z zapłodnieniem. Gen FIE wykazuje 40% homologii do genu extra sex combs (esc) z grupy Polycomb Drosophila i genu Embryonic ectoderm development (Eed) ssaków [57]. Gen FIS2 koduje białko zaw ierające motyw palca cynkowego i sygnał lokalizacji w jądrze komórkowym, co sugeruje, że może być zaangażowane w kontrolę transkrypcyjną [58]. Innym genem Arabidopsis z grupy Polycomb jest MEDEA [59]. Mutacje w tym genie, przeciwnie niż w przypadku genów FIS i FIE, stym ulują rozrost zarodka kosztem bielma, a następnie obum ieranie zarodka w wyniku letalnych zaburzeń w jego rozwoju [60]. MEDEA zawiera domenę SET wykazującą 55% homologii do innego białka z grupy Polycomb enhancer o f zeste (E(z)) D rosophila [61]. W szystkie m utacje w roślinnych genach Polycomb w yw ierają działanie jedynie w ów czas, gdy m utację dostarcza haploidalna linia m a teczna i dotyczą wyłącznie komórek generatywnych. W roślinnych mutantach fie i medea nie dochodzi do zaburzeń wzrostu wegetatywnego. Do tej pory w roślinach zidentyfikowano około 10 genów z grupy Polycomb. Należy do nich także gen CURLY LEAF, niezbędny do regulacji genów hom eotycznych zaangażowanych w proces kwitnienia [61]. Jest wysoce prawdopodobne, że działanie roślinnych białek z grupy Polycomb związane jest z wygaszaniem ekspresji genów w podobny sposób, jak ma to miejsce u Drosophila to jest poprzez tworzenie represywnych transkrypcyjnie struktur chromatynowych. Być może mogą one również uczestniczyć w kontroli równowagi między genami rodzicielskimi, biorąc udział w procesie piętnowania genetycznego [60]. Podczas gdy białka z grupy Polycomb pełnią w chromatynie funkcje represorów transkrypcyjnych, rola aktywatorów przypada białkom z grupy trithorax [62, 47]. U Drosophila, do białek tych należą m. in. polipeptydy kodowane przez gen trithorax: trxl, o masie cząsteczkowej 368 kda i trxll, o masie 404 kda. Oba białka zawierają centralny obszar bogaty w cysteiny, przypom inający dom enę palców cynkowych. Dom e ny te odnaleziono także w ludzkim białku ALEI (MLL, HRX), zdolnym do tworzenia przeszło 30 różnych fuzji z innymi polipeptydam i kom órkow y mi, i związanym z licznymi białaczkami [47]. Białko trx wykryto w ponad 16 miejscach na politenicznych chromosomach Drosophila, do których wiążą się również białka z grupy Polycomb. W iązanie się POSTĘPY BIOCHEMII 47(2),

8 białek trx do chromosomów jest uzależnione od obecności innych składników kompleksu trx, oraz białek Pc-G. Jeżeli w chromatynie zabraknie białka Enhancer o f zeste, od swoich miejsc wiązania na chromosomach odłączają się białka trithorax i Posterior sex combs (należące do Pc-G) [63]. Co ciekawe, zarówno w niektórych białkach z grupy trithorax (np. trx), jak i Polycomb (Pel, E(z)) występują identyczne motywy białkowe, takie jak palce PHD, albo domena SET [62]. Sugeruje to, że te przeciwstawnie działające białka mogą wykorzystywać podobne m e chanizmy molekularne, lub wiązać się do podobnych miejsc na chromosomach. Do białek trx-g należy również brahma, zaw ierające bromodomenę i zależną od DNA ATPazę i helikazę (patrz rozdział 2 tego artykułu). Białko to jest homołogiem drożdżowych polipeptydów SWI2/ SNF2 i ssaczych białek b rg l/b rm l. Bromodomena została wykryta również w białku z grupy trx lin-49 Caenorhabditis elegans, które jest zaangażowane (wspólnie z innym białkiem z tej grupy, lin-59) w regulację normalnego rozwoju męskich przydatków płciowych i odbytu, a także w utrzymywanie właściwej budowy pokładełka (struktury niezbędnej do składania jaj) [64]. IV. Uwagi końcowe Utrzymanie prawidłowej struktury chromatyny, a także procesy umożliwiające jej dynamiczne zmiany m ają podstawowe znacznie dla rozw oju i różnicow a nia organizmów. Poznanie procesów molekularnego podłoża zmian zachodzących w chromatynie będzie miało kluczowe znaczenie dla zrozumienia przyczyn nowotworzenia i zaburzeń rozwojowych. Badania mechanizmów regulacyjnych działających na poziomie struktur chromatynowych rozwijają się ostatnio niezwykle burzliwie, przynosząc wiele zaskakujących i ważnych odkryć. Podziękowania Bardzo dziękuję Panu Profesorow i Andrzejow i Jerzmanowskiemu za cenne uwagi i sugestie w trakcie przygotowywania niniejszej pracy, a także za jej wnikliwą ocenę. Piśm iennictwo Artykuł otrzymano 6 lutego 2001 r. Zaakceptowano do druku 30 kwietnia 2001 r. 1. Spencer V A i Davie J R (1999) Gene 240: Pikaard C S (1998) Plant Celi 10: v a n Holde K E (1989) Chromatin, Nowy Jork, Springer 4. Ramakrishnan V (1997) Annu Rev Biophys Biomol Struct 26: Kornberg R D (1974) Science 184: OlinsAL.OlinsDE (1974) Science 183: Oudet P, Gross-Bellard M, Chambon P (1975) Cell 92: Dreyfuss G, Struhl K (1999) Curr Opin Cell Biol, 11: Tyler J K, i Kadonaga J T (1999) Cell 99: Pazin M.J i Kadonaga J T (1997) Cell 88: C a i r n s B R (1998) Trends Biochem Sci 23: Tsukiyama T, Wu C (1995) Cell 83: Varga-Weisz P, Blank T A, Becker P B (1995) EMBO J 14: o T, Bulger M, Pazin M J, Kobayashi R, Kadonaga J T (1997) Cell 90: Cairns B R, Kim Y J., Sayre M H, Laurent B C, Kornberg R D (1994) Proc Natl Acad Sci USA91: Cairns B R, Lorch Y, Li Y, Zhang M, Lacomis L, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Du J, Laurent B, Kornberg R D (1996) Cell 87: B r e e d en L, Nasmyth K (1987) Cell 48: Peterson C L, Herskowitz I (1992) Cell 68: Winston F, Carlson M (1992) Trends Genet 8: Hirschhorn J N, Brown S A, Clark-Adams C D, Winston F (1992) Genes Dev 6: Wilson C J, Chao D M, Imbalzano A N, Schnitzler G R, Kingston R E, Young R A (1996) Cell 84: W angw,côtéj,xuey,zhous,khavaripa,biggar S R, Muchardt C, Kalpana G, Goff S P, Yaniv M, Workman J L (1996) EMBO J 15: Travers A (1999) Cell 96: Reyes J C, Barra J, Murchardt C, Camus A, Babinet C, Yaniv M (1998) EMBO J 17: Dunaief J L, Strober B E, Guha S, Khavan P A, Alin K, Luban J, Begemann M, Crabtree GR, GoffS P (1998) Cell 79: Brzeski J, Podstolski W, Olczak K, Jerzmanowski A (1999) Nucleic Acid Res 27: Dingwall A K, Beek S J, McCallum C M, Tamkun J W, Kalpana G V, Goff S P, Scott M P (1994) Mol Biol Cell 6: Versteege I, Sévenet N, Lange J, Rous se - au-merck M F, Ambros P, Handgretinger R, A u - rias A,Delattre O (1998) Nature 394: Laurent B C, Yang X, Carlson M (1992) Mol Cell Biol 12: Lorch Y, Zhang M, Kornberg RD (1999) Cell. 96: LXue Y, Wong J, Moreno G T, Young M K, Côté J, Wang W (1998)Mol Cell 2: Lemon B D, Freedman L P (1999) Curr Opin Gen Dev 9: Eisen JA, Sweder K S, Hanawalt P C (1995Nucleic Acid Res 23: Jeanmougin F, Wurtz J-M, le Douarin B, Chambon P, Losson R (1997) Trends Biochem Sci 22: rnaghi P, Ballario P, Lena A M, Gonzalez A, Filetici P (1999) J Mol Biol 287: Phelan M I, Sif S, Narlikar G J,Kingston R E (1999) Mol Cell 3, Tsukiyama T, Becker P i Wu C (1994) Nature 367: Georgel P, Tskukiyama T, Wu C (1998) EMBO J, 16: Varga-Weisz P, Wilm M, Bonté E, Dumas K, Mann M, Becker PB (1997) Nature 388: Corona D FV, Budde A, Deuring R, Ferrari S, Varga-Weisz P, Wilm M, Tamkun J, Becker PB (2000) EMBO J 19: POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

9 41. Alexiadis V, Varga-Weisz D, Bonte E, Becker P B, Gruss C (1998) EMBO JY1\ LeRoy G, Orphanides G, Lane W S, Reinberg D (1998) Science 282: Kornberg R D, Lorch Y (1999) Curr Opin Gen Dev 9: Kennison J A (1995) Annu Rev Genet 29: Hagstrom K, Schedl P (1997) Curr Opin Gen Dev 7: Preuss D (1999) Plant Cell 11: v a n Lohuizen M (1999) Curr Opin Gen Dev 9: Eissenberg J C, Morris GD, Reuter G, Hartnett T (1992) Genetics, 131: Kehle J, Beuchle D, Treuheit S, Christen B, Kennison J A, Bienz M, Müller J (1998) Science 282: Gould A (1997) Curr Opin Gent Dev 7: Look A (1997) Science 278: Jacobs J J, Kieboom K, Marino S, DePinho R A, van Lohuizen M (1999) Nature 397: Sharpless N E, DePinho R A (1999) Cur Opin Gen Dev 9: Katoh-Fukui Y, Tsuchiya R, Shiroshi T, Nakahara Y, Hashimoto N, Noguchi K, Higashinakagawa T (1998) Nature 393: Ohad J, Margossian L, Hsu Y-C, Williams C, Repetti P, Fischer R L (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: Chaudhury AM, Ming., Miller C, Craig S, Dennis E S, Peacock W J (1997) Proc Natl Aca Sei USA 94: Ohad N, Yadegari R, Margossian L, Hannon M, Michaeli D, Harada J J, Goldberg R B, Fischer R L (1999) Plant Cell 11: L u o M, Bilodeau P, Koltunow A, Dennis E S, Peacock W J, Chaudhury A M (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96: G r o s s n i k 1a u s U, V i e 11 e - C a 1z ad a J-P, Hoeppner M A, Gagliano W B (1998) Science 280: Scott R J, Vinkenoog R, Spielman M, Dickinson H G (1998) Trends Plant Sei 3: Goodrich J, Puangsomlee P, Martin M, Long D, Meyerowitz E M, Coupland G ( 1998)AAz/wre386: Orlando V, Paro R (1995) Curr Opin Gen Dev 5: Rastelli L, Chan C S, Pirotta V (1993) EMBO J 12: Chamberlin H M, Thomas J H (2000) Development 127: Vignali M, Hassan A H, Neely KE, Workman J L (2000) Mol Cell Biol 20: Xue, Y, Wong G, Moreno M K, Young J, Côté J, Wang W (1998) Mol Cell 2: Wade P A, Jones P L, Vermaak D I Wolffe A (1998) Curr Biol 8: POSTĘPY BIOCHEMII 47(2),