za badania nad molekularnymi podstawami eukariotycznej transkrypcji

Transkrypt

1 Nagroda Nobla w dziedzinie chemii za rok 2006 za badania nad molekularnymi podstawami eukariotycznej transkrypcji Roger D. Kornberg USA Stanford University Stanford, CA ur. 1947

2 Artur Kornberg Roger Kornberg Nobel z medycyny Nobel z chemii ½ nagrody wraz z Severo Ochoa za odkrycie mechanizmów biologicznej syntezy kwasu rybonukleinowego i deoksyrybonukleinowego USA, Stanford University, Stanford, CA ur. 1918

3 Artur Kornberg Roger Kornberg Nobel z medycyny Nobel z chemii ½ nagrody wraz z Severo Ochoa za odkrycie mechanizmów biologicznej syntezy kwasu rybonukleinowego i deoksyrybonukleinowego USA, Stanford University, Stanford, CA ur. 1918

4 przed R. Kornbergiem było wiadomo, że u Eukariota: są trzy pol RNA (Roeder i Rutter 1969, Kedinger i in. 1970) 1970-te są one złożone z wielu podjednostek, a po oczyszczeniu nie wykazują selektywnej zdolności transkrybowania oczyszczonego DNA nie ma odpowiednika bakteryjnej podjednostki σ z hodowlanych ludzkich linii komórkowych można otrzymać bezkomórkowy ekstrakt, który wraz z oczyszczona pol II RNA inicjuje transkrypcję z wirusowego promotora (Weil i in. 1979) biochemiczne frakcjonowanie takiego ekstraktu ujawniło istnienie wielu czynnków transkrypcyjnych dla pol II RNA (Matsui et al., 1980) czynniki te są ogólne (TFIIB, D, E, F i H), nad ich charakterystyką pracowało wiele laboratoriów promotor genu jest bardziej złożony niż u Prokariota, zawiera specyficzne dla genu elementy enhancerowe, sekwencje DNA, które wiążą białka aktywatorowe danego genu, które z kolei kontrolują jego transkrypcję (Johnson i McKnight, 1989)

5 wkład R. Kornberga wkroczył do badań nad transkrypcją jako postdoc w Medical Research Council w Cambridge, U.K., gdzie pracował z Francis em Crick iem i Aaronem Klug iem; w tym czasie badania rentgenowskie wykazały, że chromatyna składa się z powtarzalnych jednostek, zaś trawienie nukleazą daje produkty będące wielokrotnością pewnej wielkości (Hewish i Burgoyne 1973) Kornberg i Thomas (1974) odkryli, że histony H3 i H4 tworzą w roztworze tetamer (H3) 2 (H4) 2 Kornberg (1974) zaproponował, że jednostką chromatyny jest oktamer histonów i 200 pz DNA

6 wkład R. Kornberga Po powrocie do Stanford, kontynuował badania nad transkrypcyjną regulacją u Eukariota wykorzystując drożdże piekarnicze jako organizm modelowy opracował (10 lat badań!) drożdżowy system transkrypcji in vitro (Lue i Kornberg 1987, Sayre i in. 1992). Wkrótce okazało się, że rekonstytuowany system składający się z oczyszczonych pol II RNA, TFIIB, E, F, H i TBP (TATA-binding protein) jedynie podtrzymuje podstawowy poziom transkrypcji natomiast nie reaguje na dodanie genowo specyficznych białek aktywatorowych. Doprowadziło to do odkrycia i oczyszczenia Mediatora, kompleksu ponad 20 różnych białek (Kelleher i in. 1990, Flanagan i in. 1991, Kim i in. 1994), którego rolą u wszystkich Eukariota (od drożdży po człowieka) jest przeniesienie pozytywnych i negatywnych sygnałów od wiążących DNA genowo specyficznych czynników transkrypcyjnych na pol II RNA i ogólne czynniki transkrypcji.

7 Wraz z odkryciem Mediatora ustalono, że istotnymi składnikami eukariotycznej regulacji genów i transkrypcji są: OGÓLNE CZYNNIKI TRANSKRYPCYJNE (5-6 TFII, >26 peptydów) MEDIATOR (20 polipeptydów, 1 MDa) POL II RNA (10-12 podjedn., 500 kda) U bakterii transkrypcyjne represory i aktywatory bezpośrednio kontaktują się z pol RNA i wpływają na jej zdolność wiązania się do promotora. U Eukariota Mediator i chromatyna dodają nowe bardziej skomplikowane poziomy regulacji pomiędzy genowo specyficznymi czynnikami transkrypcyjnymi a polimerazą RNA, ale cała ta wiedza pozwala jedynie na schematyczny obraz białek skupionych wokół promotora.

8 Krystalograficzną strukturę kompleksów TBP + fragment DNA zawierający TATA i TFIIB+TBP+DNA ustalili Kim JL i in. 1993, Kim Y i in. 1993, Chasman i in. 1993, Nikolov i in Dostarczyło to nieco informacji o rozpoznawaniu promotora, struktura reszty aparatu transkrypcyjnego pozostawała nieznana. wkład R. Kornberga Kornberg wcześnie uswiadomil sobie, że platformą, wokół której buduje się cala maszyneria trankrypcyjna, musi być polimeraza RNA, lecz duży rozmiar drożdżowej pol II RNA (12 podjedn., 0, ) i niestabilnośc oczyszczonych kompleksów utrudniały badania strukturalne. Rozwiązanie przyszło wraz z opracowaniem metody 2-wymiarowych kryształów białkowych na powierzchni lipidowej (Uzgiris i Kornberg 1983) i połączeniem jej z mikroskopią elektronową i krystalografią rentgenowską w oparciu o wcześniej ustalony drożdżowy system in vitro transkrypcji.

9 wkład R. Kornberga Przełomowy był rok W dwu artykułach opublikowanych w Science Kornberg i in. opisali przy rozdzielczości 2.8 Å strukturę 10-podjednostkowej drożdżowej polimerazy RNA oraz kompleksu elongacyjnego składającego się z polimerazy, matrycowego DNA i transkryptu (Cramer i in. 2001, Gnatt i in. 2001). pol II RNA złapana in flagranti

10 struktura ssaczych pol II RNA jest podobna Science (2001) 292: W strukturze polimerazy dwie największe podjednostki leżą po obu stronach szczeliny wiążącej kwasy nukleinowe otoczone bardziej zewnętrznie leżącymi mniejszymi podjednostkami. Szczelina jest mostkowana przez α-helisę największej podjednostki i przechodzi przez miejsce aktywne tworzenia wiązań fosfodiestrowych i elongacji łańcucha RNA.

11 struktura ssaczych pol II RNA jest podobna Science (2001) 292: W strukturze polimerazy dwie największe podjednostki leżą po obu stronach szczeliny wiążącej kwasy nukleinowe otoczone bardziej zewnętrznie leżącymi mniejszymi podjednostkami. Szczelina jest mostkowana przez α-helisę największej podjednostki i przechodzi przez miejsce aktywne tworzenia wiązań fosfodiestrowych i elongacji łańcucha RNA.

12 Science (2001) 292: struktura transkrybującego kompleksu pol II RNA: mostkująca α-helisa, jon metalu w centrum aktywnym, DNA, RNA

13 te i późniejsze prace Gnatt i in. 2001, Bushnell i in translokacja hybrydowej helisy DNA/RNA (polrna?) podczas transkrypcji wynik oscylacji mostkującej α- helisy pomiędzy formą prostą i zgiętą Boeger i in FEBS Lett 579:

14 te i późniejsze prace Gnatt i in. 2001, Bushnell i in translokacja hybrydowej helisy DNA/RNA (polrna?) podczas transkrypcji wynik oscylacji mostkującej α- helisy pomiędzy formą prostą i zgiętą Boeger i in FEBS Lett 579:

15 rozdzielenie nici (Westover i in. 2004a)-struktura stanu po translokacji pokazuje, że pętla lid polimerazy oddziela łańcuch RNA od matrycowego DNA powodując całkowite rozdzielenie obu nici w pozycjach -9 i -10 (ostatni nukleotyd dodany do RNA ma pozycję -1); pętla lid wraz z dwoma innymi pętlami białkowymi zapobiega reasocjacji nici RNA i DNA selekcja nukleotydów (Gnatt i in. 2001, Westover i in. 2004b) - NTP dyfunduje do centrum aktywnego przez lejkowaty otwór w strukturze pol RNA w 2-stopniowym procesie początkowo nukleotyd jest wiązany w odwróconej pozycji poniżej m-sca aktywnego, potem następuje rotacja do m-sca aktywnego, gdzie jest selektywnie wiązany do matrycowego DNA dopasowanie powoduje wytworzenie wiązania fosfodiestrowego katalizowanego przez jon Mg, brak dopasowania destabilizuje hybrydową helisę i jej wiązanie przez białko, co powoduje negatywną selekcję

16 rozpoznawania promotora, inicjacja poronna, opuszczanie promotora- w pewnych w-kach TFIIB i TBP tworzą minimalny kompleks inicjacyjny z pol RNA i DNA (Bushnell et al., 2004).TBP zagina DNA w rejonie TATA, co dopasowuje DNA do konturów polimerazy i kieruje niżej leżące sekwencje do centrum aktywnego wyznaczając odległość TATA od inicjatora na ok. 25 nt. Pętla tworzona przez N-koniec TFIIB rozciąga się do centrum aktywnego, gdzie współzawodniczy z nowo powstałym hybrydowym DNA/RNA. Zwycięstwo pętli powoduje odłączenie nici RNA - inicjację poronną (niezdolność wielu transkryptów do osiągnięcia drugości >10 nt). Zwycięstwo RNA powoduje odsunięcie pętli wraz z całym TFIIB i promotorowym DNA polimeraza opuszcza promotor i rozpoczyna elongację.

17 SCIENCE 303 (2004): 983-8

18 model kompleksu inicjacyjnego transkrypcji (Bushnell i in. 2004). 5 ogólnych czynników transkrypcyjnych wiąże się bezpośrednio do 2-niciowego DNA promotora, podczas gdy pol RNA może związać się do DNA tylko po rozpleceniu helisy. Rozplecenie umożliwia zgięcie DNA pod kątem 90, a to umożliwia nici matrycowej wejście do szczeliny centrum aktywnego pol RNA. Na obrazach z ME Mediator rogalikowato otacza pol II RNA (Asturias i in. 1999). Funkcjonalna częśc głowowa Mediatora składa się z 7 podjedn. O łącznej masie 223 kda (Takagi et al., 2006). Oddziaływanie pomiędzy tą częscią Mediatora i pol RNA wymaga obecności TFIIF.

19 R. Kornberg jest autorem ponad 200 prac naukowych publikowanych od 1965 r. opisana przez niego i współ. struktura kompleksu pol II RNA jest jak dotąd największą i najbardziej skomplikowaną poznaną nierepetytywną strukturą białkową

20 Hildie Calero, Postdog Hometown: Da Pound Nickname: What dog? Education: Ph.D. Favorite color: Mostly shades of grey Favorite music: Snoop Dog Favorite movie: 101 Dalmations Favorite food: Cats Favorite beverage: Toilet water Can be heard saying: Not much Lab duties: Holding down Guillermo's Chair