Starzenie się komórek mezotelialnych

Transkrypt

1 Starzenie się komórek mezotelialnych STRESZCZENIE Mezotelium to specyficzna grupa komórek posiadających cechy zarówno komórek mezenchymalnych, jak i nabłonkowych. Jedną z najbardziej unikatowych właściwości tej grupy komórek jest niska aktywność proliferacyjna oraz niewielka liczba możliwych do osiągnięcia podziałów. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie aktualnego stanu wiedzy na temat przyczyn przedwczesnego starzenia się komórek mezotelialnych pochodzenia otrzewnowego i zaprezentowanie molekularnych zjawisk zaangażowanych w ten proces. Szczególna uwaga poświęcona została roli telomerów, aktywności efektorów starzenia na poziomie cyklu komórkowego, działaniu stresu oksydacyjnego oraz transformującego czynnika wzrostu-β1. Omówiony został także związek między procesem starzenia się komórek mezotelialnych a starzeniem się organizmu jako całości, jak również udział komórek starych w rozwoju wewnątrzotrzewnowych przerzutów komórek nowotworowych. WPROWADZENIE BIOLOGIA KOMÓREK MEZOTELIALNYCH JAMY OTRZEWNEJ Mezotelium to pojedyncza warstwa komórek o klasycznej morfologii kostki brukowej i średnicy około 25 µm, której zadaniem jest wyściełanie trzewnych i ściennych powierzchni jamy otrzewnej, opłucnej i osierdzia. W obrębie jamy otrzewnej komórki mezotelialne (HPMCs, ang. human peritoneal mesothelial cells) stanowią najliczniejszą populację komórek prawidłowych, dzięki czemu przypada im w udziale pełnienie nadrzędnej funkcji w regulacji przebiegu zjawisk fizjologicznych i procesów chorobowych rozwijających się w tej jamie ciała [1,2]. Pierwotnie, komórki mezotelialne postrzegane były jako struktura odpowiedzialna przede wszystkim za wyściełanie i ochronę jam ciała. Funkcje te komórki mezotelialne wypełniają dzięki zdolności do wydzielania dużych ilości proteoglikanów i fosfolipidów, które dzięki obniżaniu napięcia powierzchniowego zapewniają gładkie i bezurazowe przesuwanie się względem siebie narządów wewnętrznych. Postęp w rozwoju metod obrazowania, jak również technik immunoenzymatycznych przyczynił się do zidentyfikowania kolejnych funkcji HPMCs. Stwierdzono m.in., że komórki te chronią otrzewną przed powstawaniem zrostów oraz procesami włóknienia, co wynika z ich konstytutywnej zdolności do wydzielania mediatorów fibrynolizy, w tym tkankowego i urokinazowego aktywatora plazminogenu (t-pa i u-pa). Ponadto, mezotelium otrzewnowe posiada zdolność wydzielania licznych mediatorów reakcji zapalnej, w tym cytokin (IL-1, IL-6, IL-15) i chemokin (IL-8, MCP-1, RANTES, GRO-1, SDF-1), przez co pełni kluczową rolę w nadzorowaniu przebiegu otrzewnowej odpowiedzi zapalnej. Ważną funkcją HPMCs jest także ich udział w procesach syntezy i przebudowy elementów macierzy pozakomórkowej, która możliwa jest dzięki wydzielaniu takich czynników jak: transformujący czynnik wzrostu-β1 (TGF-b1), metaloproteazy MMP-2, MMP-3 oraz inhibitory metaloproteaz TIMP- 1 i TIMP-2. Komórki te pobudzają także waskularyzację otrzewnej, która to cecha wynika w głównej mierze z ich zdolności do wydzielania czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) [3,4]. Justyna Mikuła-Pietrasik Krzysztof Książek * Pracownia Gerontologii, Katedra i Zakład Patofizjologii, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, ul. Rokietnicka 8, Poznań; tel.: (61) , faks: (61) , krzysztof. ksiazek@ump.edu.pl * Pracownia Gerontologii, Katedra i Zakład Patofizjologii, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu, Poznań Artykuł otrzymano 11 marca 2014 r. Artykuł zaakceptowano 27 marca 2014 r. Słowa kluczowe: komórki mezotelialne, otrzewna, przerzuty nowotworowe, starzenie komórkowe, stres oksydacyjny Wykaz skrótów: 8-OH-dG 8-hydroksy-2 - -deoksyguanozyna; γ-h2a.x ufosforylowany wariant histonu H2A.X; EGF epidermalny czynnik wzrostu; GSH zredukowany glutation; HPMC komórki ludzkiego mezotelium otrzewnowego; KGF czynnik wzrostu keratynocytów; MAPK kinaza białkowa aktywowana miogenami; PBN N-tert-butylo-alfa-fenylonitron; PDGF płytkopochodny czynnik wzrostu; RFT reaktywne formy tlenu; SA-β-Gal β-galaktozydaza związana ze starzeniem; SASP fenotyp sekrecyjny związany ze starzeniem; SOD dysmutaza ponadtlenkowa; t-bhp hydronadtlenek- -tert-butylu; t-pa tkankowy aktywator plazminogenu; TGF-b1 transformujący czynnik wzrostu-β1; TSP-1 trombospondyna-1; u-pa urokinazowy aktywator plazminogenu; VEGF czynnik wzrostu śródbłonka naczyń Podziękowania: Badania prowadzone przez Autorów niniejszej pracy są finansowane ze środków przyznanych na naukę przez Narodowe Centrum Nauki (# 2011/03/B/ NZ3/01214). Należy wspomnieć, że HPMCs są populacją komórek o unikatowej właściwości łączenia cech komórek mezenchymalnych i nabłonkowych. Oznacza to w praktyce, iż komórki mezotelium pochodzą, podobnie jak fibroblasty, z mezodermy, jednakże ich morfologia, właściwości wydzielnicze i pełnione funkcje zbliżają je do komórek pochodzenia nabłonkowego. Potwierdzeniem tego dualizmu jest m.in. fakt, iż komórki mezotelialne cechuje produkcja filamentów pośrednich typowych dla mezodermy (wimentyny) oraz komórek nabłonkowych (cytokeratyny). Warto jednak zauważyć, że zdolności proliferacyjne HPMCs plasują je zdecydowanie bliżej komórek nabłonkowych niż fibroblastów. Stwierdzono, że nawet w zoptymalizowanych warunkach HPMCs wykazują bardzo ograniczone, aby nie powiedzieć niewielkie, możliwości podziałowe, czego Postępy Biochemii 60 (2)

2 przejawem jest utrzymywanie proliferacji w fazie wykładniczej przez maksymalnie 2 3 pasaże. Ponadto, obserwuje się szybko postępującą utratę homogenności hodowli, czemu towarzyszy wzrost odsetka powiększonych i zdeformowanych komórek starych [5-7]. Niewielka jest także aktywność podziałowa mezotelium in vivo, przejawiająca się indeksem mitotycznym na poziomie 0,16 0,5%. Szczegółowe informacje na temat funkcji i właściwości biologicznych komórek mezotelialnych Czytelnik odnajdzie we wcześniejszych pracach przeglądowych poświęconych tym komórkom [2-4]. REPLIKACYJNE STARZENIE SIĘ KOMÓREK MEZOTELIUM OTRZEWNOWEGO Komórki mezotelium otrzewnowego pozyskiwane są do badań eksperymentalnych z różnych źródeł. Najczęściej jest nim fragment sieci większej (łac. omentum maius), izolowany od pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym, np. z powodu zrostów otrzewnej. Po usunięciu z organizmu, fragment tkanki poddawany jest trawieniu enzymatycznemu, którego celem jest uwolnienie z masy tkankowej komórek mezotelialnych i, ewentualnie, fibroblastów [1,8,9]. Jak wspomniano wcześniej, młode hodowle HPMC charakteryzują się niewielkimi zdolnościami podziałowymi, które można jednak nieco zwiększyć poprzez wzbogacenie pożywki hodowlanej w czynniki wzrostu takie jak EGF, PDGF lub KGF [10]. Co ważne, egzogenne czynniki wzrostu wspomagają proliferację tylko w przypadku dodania ich do hodowli z wczesnych pasaży. W przypadku suplementacji starszych hodowli, właściwości podziałowe komórek pomimo obecności dodatkowych mitogenów pozostają bez zmian. W warunkach optymalnych, obejmujących: ustaloną pożywką hodowlaną (M199), stężenie surowicy (10%), suplementy, gęstość posiewu komórek oraz interwały czasowe między pasażami, HPMCs są w stanie podzielić się maksymalnie 12 razy [7,11]. Istotne jest jednak to, że pomimo tak wczesnego wyczerpania potencjału podziałowego, stare komórki mezotelialne wykazują wszystkie klasyczne cechy fenotypowe, opisywane wcześniej np. w fibroblastach, tj. Rycina 1. Reprezentatywne zdjęcie hodowli starych komórek mezotelium otrzewnowego. Niebieskie zabarwienie komórek świadczy o podwyższonej aktywności β-galaktozydazy związanej ze starzeniem. Powiększenie x100. zwiększenie rozmiarów (hipertrofia), spłaszczenie, wakuolaryzację i wielojądrzastość. Ponadto, komórki stare są nadal aktywne metabolicznie oraz oporne na docierające do nich sygnały proapoptotyczne [7]. Wśród pozostałych cech starego mezotelium otrzewnowego wyróżnić można syntezę β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-Gal) [7], wzrost zawartości lipofuscyny [12] oraz liczne uszkodzenia DNA, szczególnie w postaci pęknięć obu nici DNA, rozpoznawanych na podstawie obecności ufosforylowanego wariantu histonu H2A.X (γ-h2a.x) [13] (Ryc. 1). W odniesieniu do zmian, zachodzących na poziomie cyklu komórkowego, na uwagę zasługuje zatrzymanie aktywności podziałowej komórek na etapie fazy G1 cyklu komórkowego. Zjawisku temu towarzyszy obniżenie syntezy antygenu proliferacyjnego Ki67 oraz wzrost syntezy p16 INK4A, inhibitora kinaz zależnych od cyklin [7]. Co ciekawe, w starych komórkach mezotelialnych obserwuje się także podwyższoną syntezę innego inhibitora podziałów komórkowych, białka p21 Kip1 [14], co może świadczyć o jednoczesnej aktywacji dwóch różnych szlaków starzenia. Wzrost syntezy białka p16 INK4 jest bowiem utożsamiany z tzw. przedwczesnym, niezależnym od telomerów procesem starzenia, który inicjowany jest w komórkach w wyniku niesprzyjających warunków środowiska zewnętrznego, określanych mianem szoku hodowlanego [15]. Z kolei białko p21 Kip1 jest uważane jako mediator klasycznego mechanizmu starzenia zależnego od telomerów, w którym główną rolę sprawczą odgrywają uszkodzenia telomerowego DNA [16]. Badania długości telomerów w młodych i starych HPMC wykazały, że w wyniku kolejnych podziałów mitotycznych nie dochodzi do skrócenia tych struktur, co może wskazywać, iż główny mechanizm starzenia się mezotelium bazuje na uszkodzeniach nietelomerowych obszarów DNA i związany jest właśnie z aktywacją białka p16 INK4 [17]. Inną przesłanką, świadczącą o dominującej roli tego właśnie mechanizmu starzenia była obserwacja, iż zdecydowana większość uszkodzeń DNA związanych ze starzeniem (γ-h2a.x) jest zlokalizowana w pozatelomerowych fragmentach genomu [17]. ZESPÓŁ NAGŁEGO STARZENIA KOMÓREK MEZOTELIALNYCH Zespołem nagłego starzenia (ang. sudden senescence syndrome) określa się zjawisko występowania w obrębie hodowli komórkowych z wczesnego pasażu, komórek wykazujących morfologiczne i czynnościowe oznaki starzenia [18,19]. Istnieje wiele przesłanek wskazujących na to, że HPMC są grupą komórek, w przypadku których zjawisko to może odgrywać zasadniczą rolę w kontekście wczesnego wyczerpywania ich zdolności podziałowych. Badania hodowli HPMC pochodzących z wczesnych pasaży (1 3) wykazały, że wśród dominującej populacji komórek o typowej morfologii kostki brukowej, będących w wykładniczej fazie wzrostu, występuje liczna frakcja komórek hipertroficznych i wielojądrzastych, morfologicznie niemal identycznych z komórkami starymi (Ryc. 2). Dokładne badania wykazały, że nawet do 50% populacji teoretycznie młodych komórek mezotelialnych wykazuje określone cechy komórek starych, w tym obecność licznych ognisk histonu γ-h2a.x, syntezę SA-β-Gal oraz wysoki poziom białka p16 INK4A. Co więcej, jak wykazały badania długości telomerów metodą 188

3 Rycina 2. Pierwotna hodowla komórek mezotelium otrzewnowego, pochodzących z pierwszego pasażu. Uwagę zwraca liczna frakcja komórek hipertroficznych, odpowiadających morfologicznie komórkom starym. Powiększenie x100. ilościowego PCR, średnia długość tych odcinków w populacjach młodych komórek mezotelialnych wynosi przeciętnie 3500 par zasad [17], co jest wartością niewspółmiernie niską w porównaniu z większością typów prawidłowych komórek somatycznych [20]. Badania z wykorzystaniem hodowli młodych HPMC z domieszką komórek starych wykazały, że obecność starych komórek mezotelialnych w hodowlach z wczesnych pasaży przekłada się na możliwości proliferacyjne hodowli jako całości [11]. Stwierdzono m.in., że im większa była domieszka komórek starych, tym mniejszą liczbę podziałów osiągała hodowla przed wejściem w fazę starzenia. Istotny efekt uzyskano w tych eksperymentach już wówczas, gdy domieszka komórek starych wynosiła zaledwie 5%. Z kolei, w doświadczeniach z wykorzystaniem próbek pożywki kondycjonowanej, wygenerowanej przez badane hodowle mieszane dowiedziono, że czynniki rozpuszczalne, wydzielone do środowiska mogą wywierać działanie pro-starzeniowe dopiero wówczas, gdy w hodowli jest przynajmniej 20% komórek starych. Obserwacje te sugerują, że w przypadku HPMC, zespół nagłego starzenia się jest w głównej mierze determinowany fizyczną obecnością komórek starych [11]. Stwierdzenie to nie oznacza jednak, że czynniki wydzielane do środowiska przez stare komórki HPMC mają marginalne znaczenie dla procesu starzenia się tej grupy komórek. Otóż zauważono, że komórki mezotelialne o fenotypowych cechach starzenia, są w stanie indukować podobne zmiany w sąsiadujących z nimi komórkach młodych, na zasadzie autokrynnej (mezotelium) i parakrynnej (fibroblasty otrzewnowe) [21]. STARZENIE SIĘ KOMÓREK MEZOTELIALNYCH A STRES OKSYDACYJNY Według współczesnej wiedzy na temat czynników wyzwalających kaskadę zjawisk, prowadzących do starzenia się komórek somatycznych, jednym z najważniejszych czynników inicjujących ten proces jest stres oksydacyjny [22,23]. Badania przeprowadzone na modelu replikacyjnego starzenia się HPMC wykazały, że procesowi temu towarzyszy stres oksydacyjny, czego dowodem jest wzrost uwalniania reaktywnych form tlenu (RFT) oraz gromadzenie oksydacyjnych uszkodzeń DNA (8-hydroksy-2 -deoksyguanozyny; 8-OH-dG), a także lipidów (lipofuscyny) [14,17]. Ponadto, komórki stare charakteryzują się osłabioną wydajnością mechanizmów antyoksydacyjnych, w tym obniżonym poziomem zredukowanego glutationu (GSH) oraz obniżoną aktywnością dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [14,24]. Istotnym elementem tych zmian jest także zauważalny spadek wartości potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej, będącego wykładnikiem zdolności komórek do generowania ATP [17]. Komórki mezotelialne są też bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny pochodzenia środowiskowego. Dowiodła tego seria doświadczeń, w których komórki poddawano działaniu pułapki spinowej, N-tert-butylo-alfa-fenylonitronu (PBN), jako formy protekcji przed działaniem egzogennej hiperoksji. Badania te pokazały, że zapewnienie komórkom wczesnej ochrony przed działaniem RFT, poprzez wprowadzenie PBN do środowiska już na etapie izolacji tkanki z jamy brzusznej pacjenta, a następnie pozostawienie go na każdym etapie hodowli (włączając w to płukanie komórek i ich trypsynizację) przekłada się na wzrost możliwej do osiągnięcia przez komórki liczby podziałów nawet o 60%. Wprowadzenie pułapki spinowej na późniejszym etapie hodowli nie wpływało istotnie na potencjał podziałowy komórek, sugerując, że kluczowe dla replikacyjnej długości życia komórek mezotelium otrzewnowego są zdarzenia oksydacyjne, których komórki te doświadczają już na najwcześniejszych etapach swego bytowania in vitro [11]. Odrębną kwestią, związaną z tempem starzenia się komórek somatycznych, a zarazem integralną częścią stresu oksydacyjnego, jest status ich endogennej ochrony antyoksydacyjnej. Jak wykazano na przykładzie fibroblastów, komórki tego samego typu, lecz pochodzące z innych lokalizacji anatomicznych, mogą znacząco różnić się między sobą liczbą możliwych do osiągnięcia podziałów, a czynnikiem determinującym te różnice jest poziom aktywności pozakomórkowej izoformy dysmutazy ponadtlenkowej (EC-SOD) [25]. Aby sprawdzić, czy niewielkie możliwości podziałowe i wczesne starzenie się HPMC mogą być wynikiem zróżnicowanego poziomu stresu oksydacyjnego w tych komórkach, dokonano analizy porównawczej szeregu parametrów związanych z proliferacją i starzeniem się dwóch typów komórek mezotelialnych otrzewnej, tj. HPMC pochodzących z sieci większej oraz komórek LP-9, pozyskanych z płynu puchlinowego 26-letniej kobiety, cierpiącej na raka jajnika [26]. Wybór tej drugiej populacji komórek był podyktowany ich ponadprzeciętnymi możliwościami proliferacyjnymi, porównywalnymi do fibroblastów [27]. Przeprowadzone badania wykazały, że choć cechy fenotypowe starych HPMC i LP-9 są niemal identyczne, to jednak dynamika ich pojawiania się jest zgoła odmienna. Frakcja komórek wykazujących produkcję i obecność ognisk γ-h2a.x w hodowlach HPMC osiągały swój maksymalny poziom dużo szybciej niż w komórkach LP-9. Co więcej, w przeciwieństwie do HPMC, frakcja komórek p16 INK4A -dodatnich w hodowlach LP-9 była nieliczna, a jej przyrost w trakcie starzenia się bardzo nieznaczny, co może sugerować, że białko to odgrywa marginalną rolę w starzeniu się tych ko- Postępy Biochemii 60 (2)

4 mórek. Ciekawą prawidłowość zaobserwowano natomiast w odniesieniu do zmian poziomu uszkodzeń DNA mierzonych ilością 8-OH-dG w komórkach. Stwierdzono, że choć w komórkach pochodzących z sieci większej poziom tej pochodnej DNA wzrastał dużo szybciej niż w komórkach LP-9, to jednak w hodowlach starych okazał się on istotnie niższy. Można przypuszczać, że taka sytuacja jest wynikiem większej wrażliwości HPMC na stres oksydacyjny, przez co komórki te, aby się zestarzeć, potrzebują mniejszej liczby uszkodzeń niż komórki bardziej oporne na stres oksydacyjny. Istnienie różnic w potencjale antyoksydacyjnym między HPMC i LP-9 potwierdziła ocena aktywności SOD oraz stężenia GSH, które w przypadku komórek LP-9 były zdecydowanie wyższe. Także zdolność odpowiedzi na egzogenny stres oksydacyjny w komórkach LP-9 okazała się silniejsza niż w HPMC, wskazując na to, że niedostateczna ochrona antyoksydacyjna może być rzeczywiście jedną z przyczyn przedwczesnego starzenia się tych ostatnich [14]. TGF-β1 JAKO MEDIATOR STARZENIA SIĘ KOMÓREK MEZOTELIALNYCH Transformujący czynnik wzrostu-β1 (TGF-β1) jest cytokiną o plejotropowych właściwościach biologicznych, które przejawiają się udziałem w takich procesach jak: proliferacja, różnicowanie, reakcja zapalna, angiogeneza, przebudowa macierzy pozakomórkowej i wiele innych [28]. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie TGF-β1 jako mediatorem starzenia komórek [29,30]. Pomiary stężenia tej cytokiny w środowisku hodowlanym wykazały, że proces starzenia się komórek mezotelialnych jest związany z kilkukrotnym wzrostem poziomu sekrecji tego czynnika [31,32]. Co więcej, im większe było stężenie TGF-β1 w pożywce hodowlanej, tym słabsze były zdolności proliferacyjne komórek rosnących w obecności tego czynnika [11]. Badania z wykorzystaniem egzogennej rekombinowanej formy TGF-β1 dowiodły ponadto, że związek ten może być po części odpowiedzialny za rozwój niektórych fenotypowych oznak starzenia, w tym zahamowanie aktywności podziałowej, wzrost poziomu białka całkowitego w komórkach (wykładnik hipertrofii) oraz wzrost syntezy SA-β-Gal [31]. Interesującą kwestią w kontekście autokrynnego działania TGF-β1 jest jego aktywność biologiczna. Jak wykazały badania z wykorzystaniem pożywek kondycjonowanych, w których rosły stare komórki, neutralizacja zawartego w nich TGF-β1 przyczynia się do poprawy aktywności podziałowej komórek oraz zaniku wybranych oznak starzenia [11,31]. Obserwacja ta sugeruje, że cytokina ta, wydzielana zwyczajowo w formie nieaktywnej, ulega aktywacji pod wpływem działania określonych bodźców, prawdopodobnie także związanych ze starzeniem HPMC. Badanie tego wątku zaowocowało odkryciem, iż przyczyną aktywacji wydzielonego TGF-β1 jest działanie trombospondyny-1 (TSP-1), której sekrecja przez stare komórki mezotelialne jest także podwyższona [21]. Jak wykazały badania, nasilona produkcja TGF-β1 w trakcie starzenia się HPMC jest związana ze stresem oksydacyjnym. Udokumentowano to w badaniach wykorzystujących silny egzogenny utleniacz, hydronadtlenek-tert-butylu (t-bhp), którego działanie spowodowało wzrost wydzielania TGF-β1. Jednocześnie, protekcja komórek za pomocą PBN zapobiegła indukcji TGF-β1 pod wpływem stresu oksydacyjnego [32]. Jako ważny, wewnątrzkomórkowy przekaźnik zależnej od RFT produkcji TGF-β1, rozpoznano kinazę p38 MAPK [32]. Nie tylko jednak stres oksydacyjny jest czynnikiem regulującym skalę produkcji TGF-β1 przez komórki mezotelialne. Jak wykazały doświadczenia na hodowlach tkankowych założonych od pacjentów w różnym wieku, wielkość sekrecji TGF-β1 rośnie wraz z wiekiem dawcy komórek. Co więcej, im wyższa była produkcja TGF-β1 przez komórki z wczesnych pasaży tym niższa była maksymalna liczba podziałów osiąganych przez komórki danej hodowli [33]. STARZENIE HPMCs IN VITRO A STARZENIE DAWCY TKANKI IN VIVO Dyskusja nad znaczeniem replikacyjnego starzenia się komórek, obserwowanego w warunkach hodowlanych w procesie kalendarzowego starzenia się organizmu in vivo sięga lat sześćdziesiątych ubiegłego wieku [34]. Oceny tej kwestii podjęto się także w odniesieniu do starzenia się HPMCs. Wykazano, że istnieje silna odwrotna zależność między wiekiem dawcy tkanki a replikacyjną długością życia wyizolowanych z niej komórek mezotelialnych. Potencjalnej przyczyny tej zależności można doszukiwać się w poziomie produkcji TGF-b1, który będąc czynnikiem antyproliferacyjnym wpływał na wydłużenie trwania pojedynczego cyklu mitotycznego [33]. Odrębnym czynnikiem rzutującym na współzależność tempa starzenia replikacyjnego i kalendarzowego wieku dawcy okazał się być stopień zgromadzonych oksydacyjnych uszkodzeń DNA. Ilościowa ocena zawartości 8-OH- -dg dowiodła, że poziom tej pochodnej DNA rośnie wraz z wiekiem dawcy komórek. Prawdopodobną przyczyną gromadzenia 8-OH-dG towarzyszącego starzeniu się jest osłabiona reakcja komórek na RFT. Potwierdzeniem tej tezy była obserwacja, że komórki pochodzące od osób starszych poddawane działaniu t-bhp cechowały się znamiennie większą indukcją uszkodzeń DNA w porównaniu z komórkami osób młodszych. Jednocześnie, komórki te charakteryzowały się niższymi zdolnościami naprawy powstałych uszkodzeń, po usunięciu oksydanta ze środowiska hodowlanego. Specyficzny przebieg miała także krzywa aktywności SOD po stymulacji t-bhp. W komórkach osób starszych, podwyższona aktywność SOD utrzymywała się krócej w porównaniu z komórkami młodszych dawców [35]. Ostatecznym dowodem na udział replikacyjnego starzenia HPMC w procesie starzenia się organizmu jako całości in vivo było wykazanie obecności w obrębie jamy otrzewnej komórek syntetyzujących SA-β-Gal. Dzięki tej obserwacji, jama otrzewnej dołączyła do grupy tkanek reprezentowanej m.in. przez skórę [36], prostatę [37] i naczynia krwionośne [38], w których obecność komórek starych wykazano już wcześniej. ROLA STARZENIA KOMÓREK MEZOTELIUM OTRZEWNOWEGO W PROGRESJI NOWOTWORÓW Jama otrzewnej jest głównym miejscem przerzutów różnego typu nowotworów, szczególnie raka jajnika, trzustki 190

5 i okrężnicy. Przykładowo, w odniesieniu do nowotworów jajnika, kolonizacja otrzewnej dotyczy około 70% chorych w fazie III i IV [39]. W trakcie inwazji jamy otrzewnej, komórki nowotworowe ulegają zrzuceniu (zostają oddzielone od powierzchni jajnika) z powierzchni jajnika, po czym zawieszone w płynie otrzewnowym sedymentują na powierzchni otrzewnej, wchodząc w bezpośredni kontakt z komórkami mezotelialnymi [40,41]. Uważa się, że bezpośrednie oddziaływania między HPMC a komórkami nowotworowymi stanowią istotny czynnik w rozwoju wewnątrzotrzewnowych przerzutów. Zdania są jednak podzielone, co do roli warstwy mezotelialnej w tym procesie. Według części badaczy, komórki te stanowią barierę, której penetracja umożliwia komórkom nowotworowym wejście w obręb podścieliska i interakcję z fibroblastami otrzewnej, pobudzającymi kolejne etapy inwazyjności. Teoria ta opiera się na stwierdzeniu, że komórki mezotelialne nie występują pod otrzewnową masą guza w zaawansowanym stadium choroby [42], czego przyczyny upatruje się w aktywności miozyny generowanej przez komórki nowotworowe [41]. Według innych autorów komórki mezotelialne odgrywają aktywną rolę w pobudzaniu inwazyjności komórek nowotworowych. Teza ta bazuje na stwierdzeniu, iż na powierzchni obu typów komórek znajduje się szereg aktywnych cząstek i receptorów, których skoordynowane współdziałanie przyczynia się do pobudzenia adhezji, proliferacji i migracji komórek nowotworowych. Mając na uwadze fakt, że stare komórki mezotelialne mogą gromadzić się w jamie otrzewnej in vivo, podjęto próbę określenia, czy proces starzenia się HPMC może wpływać na nasilenie rozwoju przerzutów nowotworowych w jamie otrzewnej. Ten wątek badań był pochodną wcześniejszych obserwacji starych fibroblastów, które wspierały progresję komórek raka piersi in vitro i in vivo [43]. Wykazano między innymi, że stare HPMC cechują się zwiększoną produkcją białka macierzy pozakomórkowej, fibronektyny, co jest bezpośrednią przyczyną intensyfikacji jej oddziaływań z integrynami α5β1 znajdującymi się na powierzchni komórek raka jajnika (linii A2780, OVCAR-3, SKOV-3) i związanego z tym wzrostu wydajności adhezji komórek nowotworowych do starych HPMC [32]. Proadhezyjne działanie starych komórek mezotelialnych opisano także w odniesieniu do komórek raka trzustki (PSN-1) i okrężnicy (SW-480), a przyczyną zwiększonej adhezji tej grupy nowotworów był wzrost syntezy cząstek adhezyjnych ICAM-1 na powierzchni starych HPMC oraz wzrost skuteczności wiązania adhezyn ICAM-1 z ich receptorem CD43 [44]. Uważa się, że główną przyczyną pobudzającego działania komórek starych w kontekście nasilenia stopnia inwazyjności komórek nowotworowych, jest rozwinięcie się w tych pierwszych tzw. fenotypu sekrecyjnego związanego ze starzeniem (SASP, ang. senescence-associated secretory phenotype). Istotą SASP jest wydzielanie przez komórki stare do środowiska szeregu czynników w tym cytokin, chemokin i czynników wzrostu, które mając zdolność m.in. pobudzania angiogenezy i przebudowy macierzy pozakomórkowej są w stanie promować określone aspekty inwazyjności komórek nowotworowych. Stwierdzono, że SASP jest także cechą starych HPMC, czego dowodem jest wzrost konstytutywnej produkcji takich czynników, jak inhibitor aktywatora Rycina 3. Wynik bioluminescencyjnej oceny rozwoju guzów jajnika w otrzewnej mysich ksenograftów, wytworzonych poprzez dootrzewnowe wszczepienie mieszaniny komórek raka jajnika ze starymi komórkami mezotelium otrzewnowego. Zdjęcia przedstawiają sygnały luminescencyjne emitowane przez guzy rozwinięte w jamie otrzewnej po 7 dniach od wszczepienia komórek. plazminogenu-1 (PAI-1), u-pa, metaloproteaza-3 (MMP-3), TGF-β1, interleukina-6 (IL-6), chemokiny CXCL1/GRO-1 i CXCL8/IL-8, VEGF, rozpuszczalna forma międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 (sicam-1) oraz trombospondyna-1 (TSP-1) [21]. Daje się zauważyć, że wśród czynników wydzielanych w zwiększonych stężeniach przez stare HPMC, ważną rolę ogrywają mediatory angiogenezy. W badaniach poświęconych temu zagadnieniu stwierdzono, że pożywki kondycjonowane starych komórek mezotelialnych mają zdolność pobudzania proliferacji komórek śródbłonka naczyniowego [45], co ma szczególne znaczenie w kontekście rozwoju przerzutów nowotworowych do otrzewnej, które, jak wykazały badania na modelu zwierzęcym, lokalizują się głównie w rejonach o wysokiej gęstości naczyń krwionośnych [46]. Obecnie prowadzone są przez nas badania, mające na celu określenie, czy pobudzenie różnych wykładników progresji komórek nowotworowych przez stare HPMC przekłada się także na wzrost dynamiki rozwoju guzów w otrzewnej in vivo. W tym celu, do jamy otrzewnej myszy z upośledzonym układem odpornościowym wszczepiane są specjalnie dobrane mieszaniny komórek nowotworowych z młodymi lub starymi komórkami mezotelialnymi, a tempo rozwoju guzów monitorowane jest za pomocą metody bioluminescencyjnej (Ryc. 3). Wyniki tych doświadczeń zostaną wkrótce opublikowane w prasie specjalistycznej. PODSUMOWANIE Komórki mezotelium otrzewnowego, choć nie cieszą się tak dużym zainteresowaniem w badaniach procesu starzenia jak fibroblasty czy komórki nabłonkowe, stanowią cenne źródło wiedzy na temat mechanizmów tego zjawiska, jak również jego roli w patogenezie chorób związanych z wiekiem. Najważniejszymi czynnikami sprzyjającymi badaniom z wykorzystaniem komórek mezotelialnych są ich: łatwa dostępność podczas zabiegów chirurgicznych, prostota Postępy Biochemii 60 (2)

6 izolacji z materiału tkankowego, małe wymagania względem środowiska hodowlanego oraz relatywnie krótki czas niezbędny do uzyskania populacji komórek starych. Niebagatelne znaczenie dla uznania mezotelium otrzewnowego za wartościowy model starzenia ma opisany w niniejszej pracy fakt gromadzenia się starych komórek mezotelialnych w tkankach in vivo. PIŚMIENNICTWO 1. Yung S, Li FK, Chan TM (2006) Peritoneal mesothelial cell culture and biology. Perit Dial Int 26: Yung S, Chan TM (2007) Mesothelial cells. Perit Dial Int 27 Suppl 2: S110-S Mutsaers SE (2002) Mesothelial cells: their structure, function and role in serosal repair. Respirology 7: Mutsaers SE (2004) The mesothelial cell. Int J Biochem Cell Biol 36: Chung-Welch N, Patton WF, Shepro D, Cambria RP (1997) Two-stage isolation procedure for obtaining homogenous populations of microvascular endothelial and mesothelial cells from human omentum. Microvasc Res 54: Pronk A, Leguit P, Hoynck van Papendrecht AA, Hagelen E, van Vroonhoven TJ, Verbrugh HA (1993) A cobblestone cell isolated from the human omentum: the mesothelial cell; isolation, identification, and growth characteristics. In Vitro Cell Dev Biol 29A: Książek K, Piwocka K, Brzezińska A, Sikora E, Zabel M, Bręborowicz A, Jorres A, Witowski J (2006) Early loss of proliferative potential of human peritoneal mesothelial cells in culture: the role of p16ink4a- -mediated premature senescence. J Appl Physiol 100: Stylianou E, Jenner LA, Davies M, Coles GA, Williams JD (1990) Isolation, culture and characterization of human peritoneal mesothelial cells. Kidney Int 37: van Bronswijk H, Verbrugh HA, Bos HJ, Heezius EC, Oe PL, van der MJ, Verhoef J (1989) Cytotoxic effects of commercial continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD) fluids and of bacterial exoproducts on human mesothelial cells in vitro. Perit Dial Int 9: Leard LE, Broaddus VC (2004) Mesothelial cell proliferation and apoptosis. Respirology 9: Książek K, Mikula-Pietrasik J, Jorres A, Witowski J (2008) Oxidative stress-mediated early senescence contributes to the short replicative life span of human peritoneal mesothelial cells. Free Radic Biol Med 45: Książek K, Passos JF, Olijslagers S, von Zglinicki T (2008) Mitochondrial dysfunction is a possible cause of accelerated senescence of mesothelial cells exposed to high glucose. Biochem Biophys Res Commun 366: Ksiazek K, Passos JF, Olijslagers S, Saretzki G, Martin-Ruiz C, von Zglinicki T (2007) Premature senescence of mesothelial cells is associated with non-telomeric DNA damage. Biochem Biophys Res Commun 362: Książek K, Mikula-Pietrasik J, Olijslagers S, Jorres A, von Zglinicki T, Witowski J (2009) Vulnerability to oxidative stress and different patterns of senescence in human peritoneal mesothelial cell strains. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 296: R374-R Sherr CJ, DePinho RA (2000) Cellular senescence: mitotic clock or culture shock? Cell 102: Herbig U, Sedivy JM (2006) Regulation of growth arrest in senescence: telomere damage is not the end of the story. Mech Ageing Dev 127: Książek K, Passos JF, Olijslagers S, Saretzki G, Martin-Ruiz C, von Zglinicki T (2007) Premature senescence of mesothelial cells is associated with non-telomeric DNA damage. Biochem Biophys Res Commun 362: Rubelj I, Vondracek Z (1999) Stochastic mechanism of cellular aging - abrupt telomere shortening as a model for stochastic nature of cellular aging. J Theor Biol 197: Cristofalo VJ, Sharf BB (1973) Cellular senescence and DNA synthesis. Thymidine incorporation as a measure of population age in human diploid cells. Exp Cell Res 76: Campisi J (1997) The biology of replicative senescence. Eur J Cancer 33: Mikula-Pietrasik J, Sosinska P, Janus J, Rubis B, Brewinska-Olchowik M, Piwocka K, Ksiazek K (2013) Bystander senescence in human peritoneal mesothelium and fibroblasts is related to thrombospondin- -1-dependent activation of transforming growth factor-beta1. Int J Biochem Cell Biol 45: von Zglinicki T, Saretzki G, Docke W, Lotze C (1995) Mild hyperoxia shortens telomeres and inhibits proliferation of fibroblasts: a model for senescence? Exp Cell Res 220: von Zglinicki T (2002) Oxidative stress shortens telomeres. Trends Biochem Sci 27: Książek K, Breborowicz A, Jorres A, Witowski J (2007) Oxidative stress contributes to accelerated development of the senescent phenotype in human peritoneal mesothelial cells exposed to high glucose. Free Radic Biol Med 42: Serra V, von Zglinicki T, Lorenz M, Saretzki G (2003) Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. J Biol Chem 278: Wu YJ, Parker LM, Binder NE, Beckett MA, Sinard JH, Griffiths CT, Rheinwald JG (1982) The mesothelial keratins: a new family of cytoskeletal proteins identified in cultured mesothelial cells and nonkeratinizing epithelia. Cell 31: Thomas E, al-baker E, Dropcova S, Denyer S, Ostad N, Lloyd A, Kill IR, Faragher RG (1997) Different kinetics of senescence in human fibroblasts and peritoneal mesothelial cells. Exp Cell Res 236: Blobe GC, Schiemann WP, Lodish HF (2000) Role of transforming growth factor beta in human disease. N Engl J Med 342: Debacq-Chainiaux F, Borlon C, Pascal T, Royer V, Eliaers F, Ninane N, Carrard G, Friguet B, de LF, Boffe S, Remacle J, Toussaint O (2005) Repeated exposure of human skin fibroblasts to UVB at subcytotoxic level triggers premature senescence through the TGF-beta1 signaling pathway. J Cell Sci 118: Kim KH, Park GT, Lim YB, Rue SW, Jung JC, Sonn JK, Bae YS, Park JW, Lee YS (2004) Expression of connective tissue growth factor, a biomarker in senescence of human diploid fibroblasts, is up-regulated by a transforming growth factor-beta-mediated signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun 318: Książek K, Korybalska K, Jorres A, Witowski J (2007) Accelerated senescence of human peritoneal mesothelial cells exposed to high glucose: the role of TGF-beta1. Lab Invest 87: Książek K, Mikula-Pietrasik J, Korybalska K, Dworacki G, Jorres A, Witowski J (2009) Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am J Pathol 174: Książek K, Winckiewicz M, Staniszewski R, Breborowicz A, Witowski J (2007) Correlation between the donor age and the proliferative lifespan of human peritoneal mesothelial cells in vitro: is TGF-beta1 a link? Exp Gerontol 42: HAYFLICK L (1965) The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res 37: Książek K, Piątek K, Witowski J (2008) Impaired response to oxidative stress in senescent cells may lead to accumulation of DNA damage in mesothelial cells from aged donors. Biochem Biophys Res Commun 373: Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Roskelley C, Medrano EE, Linskens M, Rubelj I, Pereira-Smith O, Campisi J (1995) A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 92: Choi J, Shendrik I, Peacocke M, Peehl D, Buttyan R, Ikeguchi EF, Katz AE, Benson MC (2000) Expression of senescence-associated beta-galactosidase in enlarged prostates from men with benign prostatic hyperplasia. Urology 56:

7 38. Vasile E, Tomita Y, Brown LF, Kocher O, Dvorak HF (2001) Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB J 15: Amadori D, Sansoni E, Amadori A (1997) Ovarian cancer: natural history and metastatic pattern. Front Biosci 2: g Gardner MJ, Jones LM, Catterall JB, Turner GA (1995) Expression of cell adhesion molecules on ovarian tumour cell lines and mesothelial cells, in relation to ovarian cancer metastasis. Cancer Lett 91: Iwanicki MP, Davidowitz RA, Ng MR, Besser A, Muranen T, Merritt M, Danuser G, Ince TA, Brugge JS (2011) Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov 1: Witz CA, Monotoya-Rodriguez IA, Schenken RS (1999) Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil Steril 71: Krtolica A, Parrinello S, Lockett S, Desprez PY, Campisi J (2001) Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc Natl Acad Sci USA 98: Ksiazek K, Mikula-Pietrasik J, Catar R, Dworacki G, Winckiewicz M, Frydrychowicz M, Dragun D, Staniszewski R, Jorres A, Witowski J (2010) Oxidative stress-dependent increase in ICAM-1 expression promotes adhesion of colorectal and pancreatic cancers to the senescent peritoneal mesothelium. Int J Cancer 127: Książek K., Jorres A, Witowski J (2008) Senescence induces a proangiogenic switch in human peritoneal mesothelial cells. Rejuvenation Res 11: Gerber SA, Rybalko VY, Bigelow CE, Lugade AA, Foster TH, Frelinger JG, Lord EM (2006) Preferential attachment of peritoneal tumor metastases to omental immune aggregates and possible role of a unique vascular microenvironment in metastatic survival and growth. Am J Pathol 169: Senescence of mesothelial cells Justyna Mikuła-Pietrasik, Krzysztof Książek * Laboratory for Gerontology, Department of Pathophysiology, Poznań University of Medical Sciences, 8 Rokietnicka St., Poznań, Poland * krzysztof.ksiazek@ump.edu.pl Key words: cancer metastasis; cellular senescence; mesothelial cells; oxidative stress; peritoneum ABSTRACT The mesothelium is a specific group of cells having characteristics of both mesenchymal and epithelial cells. One of the most unique properties of these cells is a low proliferative capacity and a small number of achievable division. The purpose of this paper was to present the current state of knowledge on the causes of premature senescence of peritoneal mesothelial cells and to discuss the molecular events involved in this process. Particular attention was paid to the role of telomeres, the activity of senescence effectors at the level of the cell cycle, and the action of oxidative stress and transforming growth factor β1. Moreover, the relationship between senescence of mesothelial cells and the aging of the organism as a whole, as well as the participation of senescent cells in the development of the intraperitoneal cancer metastasis was addressed. Postępy Biochemii 60 (2)