Otrzymywanie kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger metodą hodowli wgłębnej w podłożach z glicerolem

Transkrypt

1 Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu Wydział Inżynieryjno Ekonomiczny Instytut Chemii i Technologii Żywności Katedra Biotechnologii i Analizy Żywności mgr inż. Ewelina Ewa Dymarska Otrzymywanie kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger metodą hodowli wgłębnej w podłożach z glicerolem Rozprawa doktorska Promotor: prof. dr hab. inż. Jerzy Jan Pietkiewicz Promotor pomocniczy: dr inż. Małgorzata Janczar Smuga Wrocław

2 Składam serdeczne podziękowania Panu prof. dr hab. inż. Jerzemu J. Pietkiewiczowi za życzliwość, opiekę naukową, za cenne uwagi i sugestie oraz zaangażowanie, dzięki któremu możliwe było napisanie tej rozprawy doktorskiej Pani dr inż. Małgorzacie Janczar-Smudze za opiekę, zaangażowanie i poświęcony czas przy redagowaniu rozprawy doktorskiej Szczególnie dziękuję Rodzicom i najbliższym za cierpliwość wyrozumiałość i wsparcie duchowe 2

3 Spis treści Wykaz stosowanych symboli... 8 Wstęp Część teoretyczna Biosynteza kwasu cytrynowego z udziałem drobnoustrojów Właściwości i kierunki zastosowań kwasu cytrynowego Właściwości fizyczne Właściwości chemiczne Zastosowanie kwasu cytrynowego w przemyśle spożywczym Nowatorskie zastosowania kwasu cytrynowego Środek sieciujący i plastyfikator Środek antybakteryjny Deamidacja glutenu Ekstrahent Hamowanie adhezji białek Rynek kwasu cytrynowego Drobnoustroje produkujące kwas cytrynowy Otrzymywanie kwasu cytrynowego z użyciem grzybów Aspergillus niger Otrzymywanie kwasu cytrynowego z użyciem drożdży Yarrowia lipolytica Biochemiczne aspekty biosyntezy kwasu cytrynowego w komórkach Aspergillus niger Techniki produkcji kwasu cytrynowego Hodowle powierzchniowe w podłożach płynnych Hodowle powierzchniowe w podłożach stałych Hodowle wgłębne

4 Metody i warunki hodowli Aspergillus niger stosowane w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego Czynniki wpływające na produkcję kwasu cytrynowego Źródło azotu Źródło fosforu Mikroelementy Alkohole o niskiej masie cząsteczkowej Odczyn ph Napowietrzanie i szybkość mieszania Temperatura Substraty stosowane w biosyntezie kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger Tradycyjne i niekonwencjonalne źródła węgla Glicerol jako źródło węgla i energii w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger Cel pracy Część doświadczalna Materiały i metody Materiał biologiczny Podłoża hodowlane Podłoże do selekcji szczepu Aspergillus niger Podłoże do optymalizacji składu podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym Podłoże do optymalizacji składu podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym Środek przeciwpianowy Aparatura badawcza Inkubator z wytrząsaniem Bioreaktor laboratoryjny Przygotowanie inokulum Przygotowanie podłoży hodowlanych i aparatury do prowadzenia hodowli Sposoby prowadzenia hodowli Sposób prowadzenia okresowych hodowli wgłębnych w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem

5 Sposób prowadzenia okresowych hodowli wgłębnych w bioreaktorze Sposób prowadzenia zasilanych okresowych hodowli wgłębnych w bioreaktorze Kontrola przebiegu hodowli Pobieranie prób z hodowli prowadzonych w kolbach i zakres ich analiz Pobieranie prób z hodowli prowadzonych w bioreaktorach i zakres ich analiz. 61 Metody analityczne Oznaczanie stężenia biomasy Oznaczanie stężenia konidiów pleśni Aspergillus niger Oznaczanie stężenia cukrów redukujących Identyfikacja i oznaczanie zawartości kwasów organicznych Oznaczanie stężenia glicerolu Pomiar stężenia tlenu rozpuszczonego Pomiar stężenia tlenu w gazach odlotowych Pomiar stężenia ditlenku węgla w gazach odlotowych Oznaczanie zawartości ekstraktu Oznaczanie kwasowości ogólnej Obserwacje mikroskopowe Obliczanie parametrów kinetycznych hodowli Objętość podłoża hodowlanego Stężenie kwasu cytrynowego Szybkość napowietrzania Szybkość objętościowa wzrostu biomasy Szybkość właściwa wzrostu biomasy Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego Szybkość właściwa biosyntezy kwasu cytrynowego Szybkość objętościowa zużywania substratu Szybkość właściwa zużywania substratu Wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego... substratu Wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do zużytego substratu 68 Wydajność wzrostu biomasy w stosunku do wprowadzonego substratu Wydajność wzrostu biomasy w stosunku do zużytego substratu Współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego

6 Metody statystyczne Optymalizacja składu podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym Optymalizacja składu podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym Opracowanie i prezentacja wyników Wyniki badań Dobór szczepu Optymalizacja wielokryterialna składu podłoża hodowlanego do biosyntezy... kwas cytrynowego Optymalizacja wielokryterialna składu podłoża hodowlanego zawierającego.. glicerol bezwodny Końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego Współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego Optymalizacja wielokryterialna składu podłoża hodowlanego zawierającego.. glicerol odpadowy Końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego Współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego Wpływ początkowego stężenia glicerolu na szybkość i efektywność kwasu... cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Okresowe hodowle wgłębne prowadzone w podłożach z glicerolem bezwodnym Okresowe hodowle wgłębne prowadzone w podłożach z glicerolem odpadowym Wpływ dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Okresowe hodowle wgłębne prowadzone w podłożach z glicerolem bezwodnym Okresowe hodowle wgłębne prowadzone w podłożach z glicerolem odpadowym Wpływ początkowego stężenia glicerolu w podłożu oraz momentu zasilenia.. podłoża glicerolem na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych Dyskusja wyników

7 6. Wnioski Bibliografia Spis tabel Spis rysunków Streszczenie Summary

8 Wykaz stosowanych symboli A - szybkość napowietrzania (aeration rate), dm 3 dm -3 min -1 ; vvm % (m/m) - procent masowo masowy (percentage weight by weight) % (m/v) - procent masowo objętościowy (percentage weight by volume) BC CAA CAM d FBC - suma (sum) - hodowla okresowa (Batch Culture) - bezwodny kwas cytrynowy (anhydrous citric acid) - jednowodny kwas cytrynowy (monohydrate citric acid) - przyrost, ubytek (increment, decrement) - zasilana hodowla okresowa (Fed Batch Culture) Kef - współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego, w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy (efficiency coefficient of monohydrate citric acid biosynthesis), % g dm -3 h -1 Ko LSF P Pk QP QS QGC QGP QSC RP RPGC - kwasowość ogólna, ilość cm 3 roztworu 0,1 M NaOH zużyta do zobojętnienia 2 cm 3 podłoża hodowlanego (total acidity, quantity (cm 3 ) of 0,1 M NaOH used for neutralization of acids in 2 cm 3 of culture medium) - hodowla powierzchniowa (Liquid Surface Fermentation) - stężenie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym, w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy (monohydrate citric acid concentration in culture medium), g dm -3 - końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym, w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy (final monohydrate citric acid concentration in culture medium), g dm -3 - szybkość właściwa biosyntezy kwasu cytrynowego, w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy (specific rate of monohydrate citric acid biosynthesis), g g -1 h -1 - szybkość właściwa zużywania substratu (specific rate of substrate consumption), g g -1 h -1 - szybkość właściwa zużywania glicerolu odpadowego (specific rate of crude glycerol consumption), g g -1 h -1 - szybkość właściwa zużywania glicerolu bezwodnego (specific rate of anhydrous glycerol consumption), g g -1 h -1 - szybkość właściwa zużywania sacharozy (specific rate of sucrose consumption), g g -1 h -1 - szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego, w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy (volumetric rate of monohydrate citric acid biosynthesis), g dm -3 h -1 - szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego, w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy z glicerolu odpadowego (volumetric rate of monohydrate citric acid biosynthesis from crude glycerol), g dm -3 h -1 8

9 RPGP RS RSGC RSGP RSSC RX S SF SGC SGP SSC SK SKGC SKGP t tz V - szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego, w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy z glicerolu bezwodnego (volumetric rate of monohydrate citric acid biosynthesis from crude glycerol), g dm -3 h -1 - szybkość objętościowa zużywania substratu (volumetric rate of substrate consumption), g dm -3 h -1 - szybkość objętościowa zużywania glicerolu odpadowego (volumetric rate of crude glycerol consumption), g dm -3 h -1 - szybkość objętościowa zużywania glicerolu bezwodnego (volumetric rate of anhydrous glycerol consumption), g dm -3 h -1 - szybkość objętościowa zużywania sacharozy (volumetric rate of sucrose consumption), g dm -3 h -1 - szybkość objętościowa wzrostu biomasy (volumetric rate of biomass growth), g dm -3 h -1 - stężenie substratu w podłożu hodowlanym (substrate concentration in culture medium), g dm -3 - hodowla wgłębna (submerged fermentation) - stężenie glicerolu odpadowego w podłożu hodowlanym (crude glycerol concentration in culture medium), g dm -3 - stężenie glicerolu bezwodnego w podłożu hodowlanym (anhydrous glycerol concentration in culture medium), g dm -3 - stężenie sacharozy w podłożu hodowlanym (sucrose concentration in culture medium), g dm -3 - końcowe stężenie substratu w podłożu hodowlanym (residual substrate concentration in culture medium), g dm -3 - końcowe stężenie glicerolu odpadowego w podłożu hodowlanym (residual crude glycerol concentration in culture medium), g dm -3 - końcowe stężenie glicerolu bezwodnego w podłożu hodowlanym (residual anhydrous glycerol concentration in culture medium), g dm -3 - czas hodowli (culture time), h - moment zasilenia hodowli czas hodowli, po upływie którego zasilono hodowlę substratem (moment of substrate addition to the culture), h - objętość podłoża w bioreaktorze (volume of culture medium in bioreactor), dm 3 Vc - całkowita objętość bioreaktora (total bioreactor volume), dm 3 VG - szybkość dopływu powietrza (air flow rate), dm 3 h -1 VI - objętość inokulum (inoculum volume), dm 3 Vk V0 - objętość podłoża w bioreaktorze po zakończeniu hodowli (volume of final culture medium in bioreactor), dm 3 - objętość podłoża wprowadzonego do bioreaktora przed rozpoczęciem hodowli (volume of initial substrate added to the bioreactor before of culture), dm 3 9

10 Vp - objętość podłoża w bioreaktorze na początku hodowli po inokulacji (volume of initial culture medium in the bioreactor after inoculation), dm 3 Vr - objętość robocza bioreaktora (working volume), dm 3 Vrpm VZ X Y YP/GC YP/GP YP/Sw YP/Sz YX/Sw YX/Sz μ μmax - szybkość obrotowa wału mieszadła (rotation speed), obr min -1 ; (rpm) - objętość podłoża zasilającego wprowadzona do bioreaktora w czasie jednorazowego zasilenia (volume of substrate added to the culture in single feed), dm 3 - stężenie biomasy w podłożu hodowlanym (biomass concentration in culture medium), g dm -3 - wydajność (yield), % (m/m) - wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy w odniesieniu do wprowadzonego glicerolu odpadowego (yield of citric acid biosynthesis with respect to the introduced crude glycerol), % (m/m) - wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy w odniesieniu do wprowadzonego glicerolu bezwodnego (yield of citric acid biosynthesis with respect to the introduced anhydrous glycerol), % (m/m) - wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy w odniesieniu do wprowadzonego substratu (yield of citric acid biosynthesis with respect to the introduced substrate), % (m/m) - wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy w odniesieniu do zużytego substratu (yield of citric acid biosynthesis with respect to the introduced substrate), % (m/m) - wydajność wzrostu biomasy w odniesieniu do wprowadzonego substratu (yield of biomass with respect to the introdiuced substrate), % (m/m) - wydajność wzrostu biomasy w odniesieniu do zużytego substratu (yield of biomass with respect to the residual substrate), % (m/m) - szybkość właściwa wzrostu biomasy (specific rate of biomass growth), g g -1 h -1 - maksymalna szybkość właściwa wzrostu biomasy (maximal specific rate of biomass growth), g g -1 h -1 10

11 Wstęp Kwas cytrynowy występuje w tkankach roślinnych oraz zwierzęcych takich jak krew, tkanka kostna czy mięśniowa. Dla organizmów żywych kwas cytrynowy jest jednym z niezbędnych kwasów karboksylowych w szeregu reakcji cyklu Krebsa, w wyniku którego następuje utlenianie glukozy do dwutlenku węgla i wody z wydzieleniem energii. Ze względu na nieszkodliwą naturę a także właściwości chelatujące i sekwestrujące jony metali kwas cytrynowy znalazł zastosowanie w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym, chemicznym, a nawet metalurgicznym. Roczna produkcja kwasu cytrynowego na świecie sięga obecnie około 1,8 mln ton, a rynek kwasu cytrynowego należy do najszybciej rozwijającego się segmentu dodatków do żywności. Powodem ciągłego wzrostu produkcji kwasu cytrynowego jest jego szerokie zastosowanie nie tylko w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, ale również w produkcji biopolimerów, ochronie środowiska oraz biomedycynie. W produkcji przemysłowej kwasu cytrynowego dominuje metoda hodowli wgłębnych z udziałem szczepów Aspergillus niger, a głównymi substratami w jego są melasa buraczana, sacharoza oraz syrop glukozowy. Obecnie ze względu na rosnące na świecie zapotrzebowanie na kwas cytrynowy, prowadzone są prace nad udoskonaleniem technologii jego produkcji w celu poprawy wydajności bioprocesu oraz obniżenia kosztów produkcji. Badania koncentrują się m.in. na zastosowaniu niekonwencjonalnych surowców w biosyntezie kwasu cytrynowego. Wśród badanych substratów znajdują się głównie odpady z przetwórstwa owocowo warzywnego, porafinacyjne kwasy tłuszczowe, otręby, a także glicerol odpadowy. Glicerol powstaje jako frakcja odpadowa w produkcji biopaliw do silników wysokoprężnych tzw. biodiesla. Wzrost produkcji biodiesla w ostatnich latach generuje problem zagospodarowania fazy glicerynowej. Niestety wykorzystanie glicerolu niesie 11

12 ze sobą problemy wynikające z obecności zanieczyszczeń w nim szeregu, głównie metanolu. Jednym z rozwiązań tego problem może być zastosowanie glicerolu odpadowego jako składnika podłoży hodowlanych w biosyntezie metabolitów przez drobnoustroje. Zaletą glicerolu jest jego niska cena, a także wyższy stopień redukcji aniżeli cukrów prostych., jednak jego wykorzystanie w procesach fermentacyjnych jest utrudnione, ze względu na hamujące działanie zanieczyszczeń obecnych w fazie glicerynowej. Rozwiązaniem tego problemu może być zastosowanie połączenia glicerolu z innymi substratami lub zastosowanie hodowli z zasilaniem. Pomimo dużej podaży glicerolu odpadowego na rynku, zainteresowanie jego wykorzystaniem jako głównym substratem do biosyntezy kwasu cytrynowego z udziałem szczepów Aspergillus niger jest niewielkie. W literaturze prezentowane są głównie wyniki badań nad biosyntezą kwasu cytrynowego, w których glicerol jest traktowany jako dodatkowe źródło węgla w podłożach hodowlanych. Wynikać to może z faktu, że substancje zawarte w glicerolu mogą mieć inhibujący wpływ na przebieg procesu, natomiast sam glicerol może wywoływać represję kataboliczną węgla w stosowanych szczepach Aspergillus niger. Perspektywy wykorzystania glicerolu w procesie produkcji kwasu cytrynowego z udziałem szczepów Aspergillus niger mogą być bardzo duże, jednak wymaga to doboru właściwego szczepu oraz optymalizacji warunków hodowli. Powyższe argumenty były przesłanką do podjęcia badań nad biosyntezą kwasu cytrynowego w okresowych i zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger w podłożach zawierających glicerol bezwodny lub odpadowy. Przedmiotem badań w ramach prowadzonej rozprawy była optymalizacja składu podłoża hodowlanego z glicerolem i maksymalizacja biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach zawierających glicerol bezwodny lub odpadowy. 12

13 Część teoretyczna 1. Biosynteza kwasu cytrynowego z udziałem drobnoustrojów Właściwości i kierunki zastosowań kwasu cytrynowego Kwas cytrynowy [ ], C3H4(OH)(COOH)3 o masie molowej 192,12 g mol -1, według nomenklatury IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) nazywany jest również kwasem 2 hydroksypropano 1,2,3 trikarboksylowym (rysunek 1). Kwas cytrynowy jest wieloprotonowym α hydroksykwasem, jednak może być również sklasyfikowany jako β hydroksykwas [73]. O O OH O HO OH OH Rysunek 1. Wzór strukturalny kwasu cytrynowego Źródło: opracowanie własne. Kwas cytrynowy jest obecny w roślinach, komórkach zwierzęcych oraz płynach fizjologicznych. W niewielkich ilościach kwas cytrynowy występuje w owocach cytrusowych, zwłaszcza cytrynach i limonkach. W ilościach powyżej 1% znajduje się w cytrynach (4 8%), czarnych jagodach (1,5 3,0%), grejpfrutach (1,2 2,1%), a także w pomarańczach, malinach, truskawkach (0,6 1,3%) [23, 67]. Po raz pierwszy kwas cytrynowy został wyizolowany z soku cytrynowego w 1784 roku w Anglii przez Carla Scheele, który otrzymał cytrynian wapnia przez dodanie wapna do 13

14 soku z cytryn [182]. Od 1860 roku rozpoczęto produkcję kwasu cytrynowego z cytryn w Wielkiej Brytanii, Francji i Niemczech, jednak w celu znalezienia alternatywnej metody uzyskiwania kwasu cytrynowego nadal prowadzono intensywne badania [35]. W 1893 roku niemiecki botanik, Wehemer zaobserwował, że w trakcie produkcji szczawianów wapnia przez Penicilium glaucum, kwas cytrynowy powstaje jako produkt uboczny [182]. Produkcja kwasu cytrynowego z udziałem drobnoustrojów na skalę przemysłową została uruchomiana w 1917 roku przez Currie, który opracował metodę jego otrzymywania przy użyciu grzybów strzępkowych Sterigmatocystis nigra (obecnie Aspergillus niger), z zastosowaniem podłoży hodowlanych zawierających sacharozę [86, 182, 242]. Biochemiczne podstawy procesu biosyntezy kwasu cytrynowego zostały poznane w latach 50 tych ubiegłego wieku, wraz z odkryciem glikolizy oraz cyklu kwasów trójkarboksylowych [241]. Właściwości fizyczne Kwas cytrynowy jest słabym kwasem występującym w dwóch formach krystalicznych jako: bezwodny kwas cytrynowy (C6H8O7) oraz jednowodny kwas cytrynowy (C6H8O7 H2O). Bezwodny kwas cytrynowy krystalizuje z gorącego stężonego roztworu w temperaturze powyżej 36,6 o C, przyjmując postać białego krystalicznego proszku. Jednowodny kwas cytrynowy krystalizuje z zimnego roztworu w temperaturze poniżej 36,6 o C i przyjmuje postać bezbarwnych, przeźroczystych kryształów [23, 129, 186]. Bezwodny kwas cytrynowy nieznacznie absorbuje wodę w temperaturze 25 o C i przy wilgotności względnej w zakresie od 25 do 50%. Jeśli wilgotność wynosi od 50 do 75% absorbcja wody znacznie zrasta, natomiast gdy wilgotność względna zbliża się do wartości 75% kwas cytrynowy przyjmuje formę monohydratu. Forma bezwodna kwasu powstaje, jeśli wilgotność względna jest mniejsza niż 40%. Jednowodny kwas cytrynowy nieznacznie absorbuje wilgoć przy wilgotności względnej 65 75% [186]. Kwas cytrynowy jest dobrze rozpuszczalny w wodzie i rozpuszczalnikach organicznych: etanolu, 2 propanolu, eterze, octanie etylu, 1,4 dioksanie, tetrahydrofuranie, acetonitrylu, a także w mieszaninie etanol woda [238]. Charakteryzuje się on wyższą rozpuszczalnością w alkoholu niż w wodzie [165]. Rozpuszczalność kwasu cytrynowego w różnych rozpuszczalnikach można przedstawić w następującej kolejności: tetrahydrofuran < 1,4 dioksan < woda < 2 propanol < etanol < acetonitryl [54]. Kwas cytrynowy nie 14

15 rozpuszcza się w chloroformie, toluenie, benzenie, disiarczku węgla, czterochlorku węgla [186]. Właściwości chemiczne Kwas cytrynowy jest związkiem organicznym, trójkarboksylowym hydroksykwasem, posiadającym trzy funkcyjne grupy karboksylowe. Jest związkiem trójprotonowym, który posiada trzy stałe dysocjacji, stąd może tworzyć trzy rodzaje soli i wykazywać właściwości buforujące. Właściwości chemiczne i fizyczne kwasu cytrynowego przedstawiono w tabeli 1 [73, 244]. Podczas ogrzewania do temperatury 150 o C kwas cytrynowy zachowuje stabilność, może jedynie tracić wodę krystalizacyjną. W temperaturze powyżej 175 o C następuje proces topnienia i rozkładu kwasu cytrynowego. W wyniku dehydratacji kwas cytrynowy przechodzi w formę kwasu trans akonitowego. Zakłada się, że dalsze przemiany termiczne kwasu trans akonitowego w wyniku dehydratacji prowadzą do wytworzenia bezwodnika trans akonitowego. Dalsza dekarboksylacja bezwodnika trans akonitowego powoduje powstanie bezwodnika itakonowego, bezwodnika cytrakonowego bądź mieszaniny obu izomerów [244, 250]. Kwas cytrynowy tworzy krystaliczne sole mono, di, trizasadowe z wieloma kationami. Z technologicznego punktu widzenia najważniejsze znaczenie mają: cytrynian wapnia, cytrynian potasu oraz cytrynian sodu [129]. Poprzez formowanie wiązań pomiędzy metalem a grupą karboksylową i hydroksylową cząsteczki kwasu cytrynowego charakteryzuje zdolność do chelatowania jonów metali. Kwas cytrynowy i jego sole tworzą kompleksy z miedzią, niklem, żelazem, magnezem, cynkiem i cyną. Ta cenna właściwość pozwala zapobiegać zmianom potencjału chemicznego, wytrącaniu osadów lub zmianom właściwości chemicznych [129, 244]. Kwas cytrynowy estryfikuje z alkoholami w normalnych warunkach, w obecności katalizatora np. kwasu siarkowego, kwasu p toluenosulfonowego lub żywicy jonowymiennej. Reakcja estryfikacji kwasu cytrynowego z alkoholami, zachodząca w temperaturze powyżej 150ºC, nie wymaga obecności katalizatora. Kwas cytrynowy z polialkoholami, takimi jak sorbitol czy mannitol, tworzy poliestry. Przerwanie reakcji estryfikacji przed jej zakończeniem, powoduje powstanie wolnej grupy karboksylowej, co może służyć utworzeniu soli [244]. 15

16 Tabela 1. Właściwości chemiczne i fizyczne kwasu cytrynowego Właściwości Opis Źródło Masa cząsteczkowa Wygląd i postać Temperatura topnienia Bezwodny: 192,12 g mol -1 Monohydrat: 210,14 g mol -1 Sypkie, bezbarwne przeźroczyste kryształy lub biały, ziarnisty, drobny proszek Bezwodny: Jednoskośne kryształy holohedryczne Monohydrat: kryształy rombowe Bezwodny: 153 o C Monohydrat: 100 o C Temperatura wrzenia Brak, rozkład do wody i CO 2 > 175 o C [169] Ciśnienie pary 1, mmhg w 25 o C [238] Gęstość Współczynnik podziału oktanol/woda Współczynnik podziału Stała dysocjacji Bezwodny: 1,665 g cm -3 w 20 o C Monohydrat: 1,542 g cm -3 w 20 o C [73] [73] log POW = -1,72 ± 0,4 w 20 o C [238] log P = -1,198 ± 0,4 w 25 o C pk 1 = 3,128 pk 2 = 4,761 pk 3 = 6,396 w 25 o C Stała Henry ego K H = 2, Pam 3 mol -1 [169] [73] Rozpuszczalność Rozpuszczalność wzrasta wraz ze wzrostem temperatury: w wodzie od 54% w 10 o C do 84% w 100 o C w alkoholu 59,1 g/100 ml w 25 o C w mieszaninie eter alkohol 162 g/100 ml w 25 o C [73] Zastosowanie kwasu cytrynowego w przemyśle spożywczym Z punktu widzenia jakości zdrowotnej kwas cytrynowy oraz jego pochodne, takie jak: cytrynian wapnia, cytrynian żelaza, cytrynian manganu, cytrynian potasu, cytrynian sodu, cytrynian dwuamonowy, cytrynian izopropylu, cytrynian stearynowy, cytrynian trietylu, jako dodatki do żywności, otrzymały status GRAS (Generally Recognized As Safe), przyznawany przez FAO/WHO Expert Commite on Food Additives [73]. Kwas cytrynowy nie wykazuje toksycznego działania, stąd jego dopuszczalne dzienne pobranie (ADI Acceptable Daily Intake) nie wymaga limitowania [198, 228]. Kwas cytrynowy charakteryzuje niski koszt produkcji, łatwa dostępność, nietoksyczność, biokompatybilność, uniwersalność i nieszkodliwość produktów jego rozkładu. Z tego względu znalazł on zastosowanie w przemyśle spożywczym, 16

17 Tabela 2. Przykłady zastosowań kwasu cytrynowego w przemyśle spożywczym Przemysł Zastosowanie Źródło Napoje wina, soki, napoje bezalkoholowe, syropy Stosowany jako regulator kwasowości w napojach gazowanych i niegazowanych, bufor, regulator ph [67] Słodycze dżemy, galaretki, cukierki Produkty mleczne Wyroby mięsne Przemysł owocowo warzywny Oleje Stosowany jako przeciwutleniacz, środek przeciwbakteryjny, kontrolujący inwersje cukru oraz ph produktu w celu optymalnego żelowania, konserwant, środek zapewniający uczucie cierpkości i poprawiający smak Cytrynian sodu jest stosowany w produkcji kremów do stabilizacji kazeiny, zapobiega również powstawaniu kremów podczas produkcji gorących napojów mlecznych, działa jako emulgator w celu ustabilizowania faz wody i oleju w produkcji serów, wodne roztwory kwasu cytrynowego są stosowane do usuwania kamienia mlecznego z aparatury Działa jako czynnik chelatujący, pomaga zachować naturalny kolor i zapobiega przebarwieniom mięs konserwowych, działa jako antyoksydant, synergent środków przeciwbakteryjnych, cytrynian sodu jest stosowany w rzeźniach w celu zapobiegania koagulacji lub krzepnięciu świeżej krwi Kwas cytrynowy wraz z kwasem askorbinowym hamuje aktywność enzymów oraz reakcje utleniania, które mogą powodować pogorszenie kolorów i smaku Stosowany w procesie dezodoryzacji i uwodornienia oleju w celu chelatowania jonów metali, katalizuje proces jełczenia tłuszczy, przerywa reakcję tworzenia nadtlenków i innych produktów powstających w wyniku utlenienia nienasyconych kwasów tłuszczowych w procesie autooksydacji olejów Owoce morza Zapobiega powstawaniu przebarwień i rozwojowi niepożądanych zapachów, poprzez chelatowanie metali [67] [49] [73] [228] [49] [231] 17

18 Tabela 3. Przykłady zastosowań kwasu cytrynowego w różnych gałęziach przemysłu Przemysł Zastosowanie Źródło Przemysł farmaceutyczny Przemysł kosmetyczny Leki, preparaty farmaceutyczne, banki krwi Detergenty, kosmetyki, produkty toaletowe Stosowany jest jako środek przeciwzakrzepowy, musujący w połączeniu z wodorowęglanami lub węglanami, środek smakowo zapachowy i stabilizator, nadaje pożądany smak kwaśny, który pomaga maskować smaki lecznicze Dodawany do preparatów przeznaczonych do pielęgnacji włosów, kosmetyków, detergentów w celu regulacji ph, stosowany jako stabilizator, środek buforujący i chelatujący jony metali w celu uniknięcia przebarwień [73] Pasze dla zwierząt Zwiększa przyswajalność chelatów składników mineralnych poprawia smak, reguluje ph w żołądku i poprawia skuteczność pasz, w karmie dla zwierząt domowych stosowany jest jako wzmacniacz smaku [220] Rolnictwo Nawozy Tworzy chelaty z Fe, Cu, Mg i Zn, służy do korygowania gleby, zwiększa dostępność fosforu dla roślin, jest stosowany w celu usuwania ołowiu z zanieczyszczonych gleb, stosowany do chelatowania miedzi w preparatach stosowanych do hamowania rozwoju glonów w zbiornikach wodnych [81, 171] Przemysł tekstylny Stosowany jest do regulacji ph, jako bufor oraz jako czynnik chelatujący w procesie barwienia Inne zastosowania w przemyśle Przemysł metalurgiczny Galwanotechnika Inżynieria biomedyczna Służy do oczyszczania kotłów parowych z tlenków metali, oczyszczania tlenków żelaza i miedzi, wykorzystywanych podczas spawania w reaktorach jądrowych Stosowany jako czynnik chelatujący w celu kontrolowania szybkości osadzania metali na podłożach Stosowany jako kopolimer w nanomateriałach, w celu kapsułkowania związków biologicznie aktywnych, [231] [160] Oczyszczanie wody Roztwory kwasu cytrynowego są stosowane do usuwania żelaza, wapnia i innych kationów, które uszkadzają membranę octanu celulozy stosowaną w układach odwróconej osmozy [143] 18

19 farmaceutycznym i biomedycznym, chemicznym oraz rolnictwie i ochronie środowiska [60]. Przykłady zastosowań kwasu cytrynowego w przemyśle spożywczym i w różnych gałęziach przemysłu przedstawiono w tabelach 2 i 3. W produktach żywnościowych kwas cytrynowy pełni funkcje: regulatora kwasowości, konserwanta, przeciwutleniacza, emulgatora, substancji wzmacniającej smak i zapach, bufora oraz środka antybakteryjnego. Jego zdolność do chelatowania jonów metali oraz właściwości buforujące w połączeniu z cytrynianami sprawiają, że jest on idealnym dodatkiem w produkcji żywności oraz nutraceutyków [49, 243]. W przetwórstwie owocowo warzywnym oraz w produkcji napojów bezalkoholowych zadaniem kwasu cytrynowego jest poprawa smaku oraz pomoc w uzyskaniu pożądanego bukietu. Kwas cytrynowy wpływa na zwiększenie aromatu i utrzymanie jakości produktu, dzięki zdolności do chelatowania jonów metali, co w efekcie zapobiega reakcji utleniania, przyczyniającej się do zmiany smaku i utraty pożądanej barwy [45]. Kwas cytrynowy odgrywa istotną rolę jako przeciwutleniacz w produkcji olejów oraz ograniczaniu procesu utleniania lipidów w przetwórstwie mięsnym. Hamuje on oksydację lipidów poprzez formowanie wiązań pomiędzy prooksydacyjnymi jonami metali a grupą karboksylową lub hydroksylową kwasu [112]. W przetwórstwie mięsnym kwas cytrynowy zmniejsza różową barwę i zwiększa jasność mięsa poddanego obróbce cieplnej. W mięsie gotowanym kwas cytrynowy powoduje ograniczenie endogennego różowego zabarwienia, a także różowej barwy wywołanej azotynem sodu oraz nikotynamidem. Ograniczenie różowego zabarwienia mięsa może wynikać również z chelatowania żelaza hemowego przez kwas cytrynowy, co zapobiega wiązaniu hemu z ligandami o różowym zabarwieniu [212, 213]. W produkcji wina kwas cytrynowy jest używany zarówno przed rozpoczęciem, jaki i po zakończeniu fermentacji w celu regulacji ph. Ponadto jego zdolność do chelatowania metali zapobiega zmętnieniu wina, spowodowanego przez wiązanie metali z taninami lub fosforanami [67]. Kwas cytrynowy i jego sole są powszechnie stosowane w przemyśle spożywczym jako środki zapobiegające brązowieniu enzymatycznemu owoców i warzyw [137]. Dodatek kwasu cytrynowego do przechowywanych owoców i warzyw, pozytywnie wpływa na zachowanie koloru, jakość organoleptyczną oraz wydłuża okres ich przydatności [145]. Kwas cytrynowy zapobiega brązowieniu enzymatycznemu poprzez obniżanie ph środowiska, co w efekcie hamuje aktywność polifenolooksydazy (PPO), odpowiedzialnej za brązowienie produktów spożywczych. Aktywność PPO maleje stopniowo wraz ze wzrostem 19

20 stężenia kwasu cytrynowego. Jednak stężenie kwasu cytrynowego stosowanego do hamowania aktywności PPO jest różne w zależności od aktywności PPO oraz stosowanych roztworów buforowych. Kwas cytrynowy przyczynia się również do obniżenia parametrów termodynamicznych polifenolooksydazy. Przyczyn tego upatruje się w zmniejszeniu stabilności PPO oraz liczby wiązań nie kowalencyjnych w strukturze enzymu, co z kolei prowadzi do zmian w strukturze II i III rzędowej białka [137]. Nowatorskie zastosowania kwasu cytrynowego Poszukiwania nowych zastosowań kwasu cytrynowego w przemyśle są obecnie przedmiotem wielu badań [82, 87, 133, 150, 164, 193]. Jednym z nowych zastosowań kwasu cytrynowego jest produkcja detergentów przeznaczonych dla gospodarstw domowych. Kwas cytrynowy chelatuje jony Mg 2+ i Ca 2+ odpowiedzialne za twardość wody, a także nie przyczynia się do eutrofizacji systemów wodnych, w przeciwieństwie do fosforanów obecnych w detergentach [45]. Nowe innowacyjne zastosowania kwasu cytrynowego w przemyśle spożywczym i nie tylko, w przyszłości będą prowadzić do wzrostu podaży, a w konsekwencji do dalszego zwiększania jego produkcji. Środek sieciujący i plastyfikator Kwas cytrynowy z powodzeniem może być stosowany w procesie sieciowania białek [194], polisacharydów [221] oraz hydroksyapatytu [232]. Przełomem w zastosowaniu kwasu cytrynowego jako środka sieciującego było odkrycie Rothenberga i Albertsa z Uniwersytetu w Amsterdamie, którzy dowiedli, że glicerol i kwas cytrynowy polimeryzują, w temperaturze powyżej 100 C i poniżej 130 C, tworząc termoutwardzalną żywicę, rozpuszczalną w wodzie i biodegradowalną [13]. Zastosowanie kwasu cytrynowego jako kompatybilizatora polisacharydów m.in. skrobi, skrobi termoplastycznej, bawełny, chitosanu i celulozy uzasadnia jego multikarboksylowa struktura [166]. Dzięki temu znajduje on zastosowanie jako środek sieciujący, a także plastyfikator i środek hydrolizujący [77]. Mechanizm reakcji sieciowania to dobrze znana reakcja estryfikacji Fishera pomiędzy grupami karboksylowymi kwasu cytrynowego a grupami hydroksylowymi, na przykład skrobi [167]. Reakcja estryfikacji pomiędzy skrobią a kwasem cytrynowym prowadzi do powstania mono, di i triestrów. Estryfikacja może przebiegać przede wszystkim w obrębie 20

21 punktów rozgałęzienia amylopektyny [148]. Powstanie wiązań estrowych może być katalizowanie przez redukcję ph lub dodanie kwasów Lewisa, czyli związków chemicznych mogących przyjąć parę elektronową od zasady będącej donorem pary elektronowej [167]. W wielu dotychczasowych badaniach dotyczących sieciowania skrobi stosowano temperatury powyżej 100ºC do inicjowania sieciowania [76]. Ogrzewanie kwasu cytrynowego powoduje odwodnienie i powstanie bezwodnika, który może wchodzić w reakcję ze skrobią formując cytrynian skrobi. Wraz z dalszym ogrzewaniem następuje dehydratacja cytrynianu i może zachodzić sieciowanie [70, 140]. Istnieje również możliwość przeprowadzenia reakcji sieciowania w niższych temperaturach (70ºC), przy zastosowaniu wyższych stężeń kwasu cytrynowego. Wydajność reakcji w takich warunkach jest jednak niska, ponieważ tylko niewielka ilość dodanego kwasu cytrynowego bierze udział w reakcji sieciowania. Ponadto kwas cytrynowy, który nie przereagował, może działać jako plastyfikator [148]. Zwiększa on wówczas wytrzymałość foli skrobiowych na rozciąganie, a poprawa wytrzymałości jest większa niż w przypadku zastosowaniu glicerolu jako plastyfikatora [248]. Spektroskopia FTIR i dyfraktometria X-ray folii z kwasem cytrynowym wykazała, że może on skutecznie hamować retrogradację skrobi, dzięki silnym wiązaniom wodorowym między skrobią, a kwasem cytrynowym [167]. Ponadto folie skrobiowe sieciowane przy użyciu kwasu cytrynowego, w porównaniu do folii nieusieciowanych, charakteryzuje większa nawet o 150%. wytrzymałość na rozciąganie Jednakże do uzyskania odpowiedniego wzrostu wytrzymałości materiału niezbędna jest optymalna ilość kwasu cytrynowego [195]. Stężenie kwasu cytrynowego poniżej 5% działa jako środek sieciujący i poprawia odporność folii skrobiowych na rozciąganie. Gdy stężenie wzrasta od 5 do 30% następuje obniżenie wytrzymałości na rozciąganie, ale zwiększa się elastyczność i adhezyjność materiału, co sugeruje, że nadmiar wolnego kwasu cytrynowego działa jako plastyfikator [224]. Główną wadą kwasu cytrynowego jako środka sieciującego i plastyfikatora barierowych folii skrobiowych jest rozkład skrobi spowodowany hydrolizą kwasową podczas przetwórstwa przemysłowego [167]. Hydrolizie wiązań glikozydowych skrobi sprzyja wysoka temperatura, niskie ph oraz wysokie stężenie kwasu cytrynowego [148]. Na drodze hydrolizy kwasowej wiązania glikozydowe skrobi ulegają rozszczepieniu pociągając za sobą protonowanie tlenu i addycję cząsteczki wody, w wyniku czego powstaje grupa cukru redukującego. Skutecznym sposobem zapobiegania hydrolizie skrobi podczas sieciowania w obecności kwasu cytrynowego jest utrzymanie ph = 4 i temperatury poniżej 105ºC [167]. 21

22 Kwas cytrynowy jako środek sieciujący wzmacnia wiązania poprzez włączenie wiązań kowalencyjnych, które uzupełniają międzycząsteczkowe wiązania wodorowe poprawiając odporność foli skrobiowych na działanie wilgoci. Silne wiązania wodorowe pomiędzy grupami karboksylowymi kwasu cytrynowego a grupami hydroksylowymi skrobi, skutkują poprawą interakcji pomiędzy cząsteczkami oraz obniżeniem rozpuszczalności foli w wodzie [80]. Kwas cytrynowy dodany w ilości od 1 do 10% do termoplastycznej skrobi znacząco zmniejsza przepuszczalność pary wodnej. Zjawisko to jest wynikiem zastąpienia grup hydrofilowych estrowymi ugrupowaniami hydrofobowymi, które utrudniają dyfuzję cząsteczek pary wodnej przez matrycę. Z drugiej strony, gdy stężenie kwasu wzrasta powyżej 10%, przepuszczalność pary wodnej się zwiększa. Przyczyn tego można upatrywać w efekcie plastyfikacji spowodowanym nadmiarem kwasu cytrynowego. Wzrost stężenia kwasu cytrynowego powoduje zwiększenie ruchliwości łańcucha i przestrzeni miedzyłańcuchowych, spowodowanych przyłączeniem wolnego kwasu cytrynowego do łańcucha polimeru. Rezultatem jest wzrost współczynnika dyfuzji pary wodnej i akceleracja przenikania pary wodnej przez folie skrobiowe [2, 76, 80]. Środek antybakteryjny Zapobieganie zakażeniom bakteryjnym w produkcji żywności jest trudne ze względu na to, że bakterie często występują na wszystkich etapach procesu technologicznego. Poszukiwanie nowych metod zwalczania drobnoustrojów podyktowane jest wykształceniem mechanizmów oporności przez niektóre drobnoustroje, koniecznością ograniczania środków chemicznych ze względu na ich niekorzystny wpływ na zdrowie człowieka oraz wzrostem świadomości konsumentów na temat jakości żywności [189]. Zastosowanie kwasów organicznych do kontroli flory bakteryjnej w żywności, wydłużenia okresu trwałości oraz poprawy bezpieczeństwa zdrowotnego produktów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego, stało się powszechną praktyką w przemyśle spożywczym. W Europie podstawę prawną do stosowania kwasów organicznych jako środków przyczyniających się do zwiększenia bezpieczeństwa produktów pochodzenia zwierzęcego stanowi Rozporządzenie 853/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady [84, 118, 217]. Kwasy organiczne są słabymi kwasami, więc nie ulegają całkowitej dysocjacji w środowisku wodnym, a ich aktywność mikrobiologiczna zależy od stopnia dysocjacji oraz 22

23 ph produktu spożywczego. Obniżenie ph prowadzi do zwiększenia koncentracji kwasu, zmniejszenia polarności cząsteczek, poprawy dyfuzji kwasów przez błony komórkowe do wnętrza komórek drobnoustrojów, a w konsekwencji zwiększenia aktywności antybakteryjnej [62, 144]. Skuteczność kwasów organicznych zależy również od ich stężenia, właściwości, temperatury, czasu ekspozycji oraz podatności drobnoustrojów [34, 189]. Wśród kwasów organicznych o działaniu niszczącym florę bakteryjną na uwagę zasługuje kwas cytrynowy. Kwas cytrynowy wykazuje skuteczność w zwalczaniu patogennej mikroflory zarówno w świeżym jak i przetworzonym mięsie wieprzowym, wołowym oraz drobiowym, a także w świeżych warzywach i owocach [34, 43, 75, 84, 142, 164]. Jego aktywność antybakteryjna polega na przenikaniu przez błony komórkowe do wnętrza komórek, gdzie ph jest wyższe niż w otaczającym środowisku. Mechanizm antybakteryjnego działania kwasu cytrynowego jest związany z zakwaszeniem cytoplazmy i w konsekwencji zaburzeniem procesów metabolicznych lub kumulacją zdysocjowanego anionu kwasowego do poziomu toksycznego [10, 144]. W mieszaninach z innymi kwasami organicznymi kwas cytrynowy wykazuje działanie synergiczne. Wzrost bakterii znacznie hamuje mieszanina kwasu kaprylowego i cytrynowego. Mechanizm działania obu kwasów jest związany z utratą integralności błony komórkowej oraz ze zmianami w jej przepuszczalności. Mechanizm synergicznego działania obu kwasów polega na zniszczeniu lub destabilizacji błony komórkowej, co prowadzi do zwiększenia przepuszczalności, a w konsekwencji do śmierci komórki. Uszkodzenie błony komórki bakteryjnej pozwala na przenikanie jonów wodorowych, co skutkuje silnym działaniem bakteriobójczym [43, 197]. Skuteczność antybakteryjnego działania kwasu cytrynowego jest zróżnicowana i zależy od wielu czynników. Kwas cytrynowy wykazuje optymalne działanie przeciwbakteryjne w środowisku o niskim ph, w niskiej temperaturze oraz zastosowany w wysokim stężeniu. Dostępne źródła literaturowe donoszą, że zastosowanie kwasu cytrynowego w stężeniach powyżej 2% może powodować niekorzystne zmiany organoleptyczne żywności [43, 235]. Efektywność przeciwbakteryjna kwasu zależy również od początkowej ilości mikroflory na powierzchni produktu. W zależności od początkowej liczby bakterii, kwas cytrynowy obniża liczbę drobnoustrojów w zakresie od 1 do 2 log jtk g -1 [84, 189]. 23

24 Deamidacja glutenu Gluten pszenny ma szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym, m.in. jako emulgator oraz środek nadający spoistość i sprężystość. Ze względu na niską rozpuszczalność w warunkach obojętnych jego użyteczność jest jednak ograniczona. Skuteczną metodą poprawy właściwości glutenu jest deamidacja z użyciem kwasów karboksylowych m.in. kwasu cytrynowego [187]. Reakcja deamidacji powoduje przekształcenie grup amidowych, głównie reszt glutaminy i asparaginy, do grup karboksylowych. W wyniku tej transformacji następuje wzrost odpychania elektrostatycznego, zerwanie wiązań wodorowych oraz dysocjacja polimerów, a w konsekwencji poprawa rozpuszczalności glutenu. Podczas traktowania glutenu kwasem cytrynowym dostępność wiązań peptydowych oraz jonów wodorowych wpływa na konkurencję pomiędzy hydrolizą a deamidacją. Stopień hydrolizy deamidowanego glutenu ulega zmniejszeniu wraz ze zwiększaniem się stężenia kwasu cytrynowego i czasu obróbki. Obniżenie stopnia hydrolizy przyczynia się do zwiększenia ilości białka rozpuszczalnego po deamidacji [133, 188]. Deamidacja kwasem cytrynowym zwiększa rozpuszczalność glutenu w ph 7 do około 70%. Przesunięcie punktu izoelektrycznego białka do kwaśnego ph potwierdza, że deamidacja zwiększa ilość polielektrolitów białkowych, co pociąga za sobą poprawę rozpuszczalności w obojętnym ph. Podczas deamidacji ma miejsce zerwanie wiązań peptydowych, co dowodzi, że głównie deamidacja zwiększa rozpuszczalność białka, a nie hydroliza [134, 188], Deamidacja glutenu kwasem cytrynowym znacząco poprawia właściwości emulgujące, pieniące oraz elastyczność glutenu. Emulsje stabilizowane deamidowanym glutenem charakteryzują się małą wielkością kropli emulsji, co świadczy o zdolności do zmniejszania napięcia powierzchniowego. Duża stabilność emulsji wynika ze zwiększonej elastyczności cząsteczki gliadyny lub jej cząsteczkowego przegrupowania [188]. Poprawa zdolności pieniących deamidowanego glutenu wynika ze zwiększenia elastyczności cząsteczki, a w konsekwencji poprawy adsorpcji i zakotwiczenia białka na granicy faz [135]. Deamidacja kwasem cytrynowym może przyczynić się do poprawy właściwości odżywczych glutenu, ponieważ z żywieniowego punktu widzenia nie jest on dobrym źródłem białka z powodu deficytu lizyny i treoniny. Deamidacja kwasem cytrynowym zwiększa ogólną ilość niezbędnych aminokwasów, a także lizyny (Lys) [188]. 24

25 Deamidowanie glutenu kwasem cytrynowym znacząco poprawia jego właściwości i umożliwia zastosowanie w projektowaniu nowych produktów oraz fortyfikacji żywności. Ekstrahent Kwas cytrynowy z powodzeniem może być stosowany jako skuteczny ekstrahent pektyn z wytłoków owocowych, zamiast toksycznych kwasów mineralnych, takich jak kwas siarkowy lub azotowy. Ekstrakcja pektyn z użyciem kwasu cytrynowego może przysłużyć się do ograniczenia odpadów z przetwórstwa owocowo warzywnego i ograniczenia szkodliwego oddziaływania na środowisko ścieków pochodzących z konwencjonalnych metod ekstrakcji [39, 258]. Proces ekstrakcji pektyn zazwyczaj przebiega w temperaturze około 97 C w ph = 2,5 przy użyciu wody zakwaszonej kwasem cytrynowym [35, 45]. Ekstrakcja pektyn ze skórek owoców cytrusowych przy użyciu kwasu cytrynowego pozwala na uzyskanie pektyn o wysokiej zawartości kwasu galakturonowego, mającego duże znaczenie w stosowaniu pektyn jako środka żelującego. Ekstrahowane pektyny charakteryzują się również wysokim ciężarem cząsteczkowym, co świadczy o wysokiej zawartości cukrów obojętnych. Natomiast ich lepkość wzrasta wraz ze wzrostem stężenia kwasu cytrynowego. Niższa wydajność procesu ekstrakcji, w porównaniu z metodami tradycyjnymi, świadczy o wysokiej czystości uzyskanych pektyn [123]. Pektyny wyekstrahowane z łuski kakaowca charakteryzują się wysokim stopniem acetylacji, zawierają rammnogalakturonian oraz łańcuchy boczne bogate w galaktozę. Pektyny te mimo wysokiego stopnia acetylacji tworzą żele w środowisku o niskim ph i przy wysokim stężeniu glukozy, co sugeruje możliwość ich zastosowania jako dodatek do produktów kwaśnych [245]. Hamowanie adhezji białek Adhezji białek do powierzchni stalowych generuje wiele problemów w produkcji i przetwórstwie żywności. Białka przylegające do powierzchni urządzeń stanowią pożywkę dla drobnoustrojów, co w konsekwencji może prowadzić do zanieczyszczenia produktu. Usuwanie alergenów i zapobieganie zanieczyszczeniom krzyżowym jest kluczowym punktem w procesie produkcji żywności. Jedną z metod hamujących adhezję białek jaja kurzego do powierzchni stali nierdzewnej jest zastosowanie roztworu kwasu cytrynowego [210]. 25

26 Efekt hamowania adhezji białek przez kwas cytrynowy polega na zmianie ładunku powierzchni stalowych z dodatniego na ujemny w środowisku o ph 7,4, pod wpływem przyłączających się zdysocjowanych grup karboksylowych kwasu. Prowadzi to do odpychania ujemnie naładowanych cząsteczek białek, takich jak owoalbumina i owomukoid [87, 210]. Zastosowanie kwasu cytrynowego wydaje się być skuteczną metodą usuwania zanieczyszczeń z urządzeń przeznaczonych do produkcji żywności. Rynek kwasu cytrynowego Regulatory kwasowości stanowią istotną część branży dodatków do żywności, ponieważ wpływają na smak żywności, a także przyczyniają się do poprawy jej trwałości. Szacuje się, że wartość rynku regulatorów kwasowości w 2018 roku sięgnie 5,2 mld dolarów. Obecnie na rynku regulatorów kwasowości dominuje kwas cytrynowy, co wynika z jego szerokiego zastosowania w branży napojów bezalkoholowych oraz zwrotu społeczeństwa w stronę bezpiecznej żywności [48]. W latach 30 tych ubiegłego wieku czołowymi producentami kwasu cytrynowego były amerykańskie przedsiębiorstwa Miles i Pfizer. W 1929 roku w Stanach Zjednoczonych wyprodukowano ton kwasu cytrynowego [35]. Prawie 50 lat później w 1978 roku, łączna produkcja przedsiębiorstw Pfizer i Miles wyniosła około ton, a w 1990 roku roczna sięgnęła już ton. Pomimo, że w latach 90 tych XX wieku najwięksi producenci kwasu cytrynowego znajdowali się w Stanach Zjednoczonych, to w Europie produkcja wynosiła około ton rocznie. W tym czasie w Ameryce Północnej produkowano ton, w Azji ton, w Afryce ton, w Australii ton, a w Ameryce Południowej ton kwasu cytrynowego w ciągu roku [106]. W 2004 roku światowa produkcja kwasu cytrynowego wyniosła około 1,5 mln ton rocznie. Największymi producentami były Chiny, Europa Zachodnia oraz Stany Zjednoczone [35]. Obecnie rynek kwasu cytrynowego uważany jest za najszybciej rozwijający się segment branży dodatków do żywności, co wynika z jego szerokiego zakresu zastosowań w różnych gałęziach przemysłu, a także z coraz szerszego zastosowania kwasu cytrynowego jako środka czyszczącego. W 2015 roku wartość rynku kwasu cytrynowego wyceniono na około 2,7 miliarda dolarów [3]. Ocenia się, że w 2020 roku wartość rynku wzrośnie do 3,6 mld dolarów, natomiast w 2026 roku może osiągnąć wartość 5 miliardów dolarów. Oczekuje się 26

27 również, że w latach skumulowany roczny wskaźnik wzrostu (CAGR Compaund Annual Growth Rate) światowego rynku kwasu cytrynowego wyniesie 4,7% [47]. Światowy rynek kwasu cytrynowego jest podzielony pomiędzy Amerykę Północną, Amerykę Łacińską, Europę Zachodnią, Europę Wschodnią oraz region Azja Pacyfik z wyłączeniem Japonii (APEJ Asia Pacific Excluding Japan). W 2016 roku region APEJ zdominował rynek kwasu cytrynowego pod względem jego wartości. Pod względem wielkości rynku kwasu cytrynowego liderem była Europa Zachodnia (Wielka Brytania, Niemcy, Włochy, Francja, Hiszpania). Zaraz za nią plasował się region APEJ, Ameryka Północna (Stany Zjednoczone, Kanada, Meksyk) i reszta świata. Ze względu na fakt, że produkcja największych udziałowców w rynku regulatorów kwasowości jest zlokalizowana w Chinach, pozostają one liderem rynku kwasu cytrynowego i cytrynianów. Obecnie ich udział w światowej produkcji i eksporcie wynosi odpowiednio 60% i 74%. Jak wskazują prognozy na lata Chiny pozostaną największym producentem i eksporterem kwasu cytrynowego [46]. Spośród producentów działających na rynku kwasu cytrynowego kluczowi producenci to Archer Daniels Midland Company, Schandong Juxian Honge Citric Acid Co. Ltd., Jungbunzlauer Suisse AG, Cargil Inc., Weifong Ensign Industry Co. Ltd., Tate&Lyle Plc., COFCO Biochemical Co. Ltd, RZBC Corp. i Pfizer Inc. [47]. W 2016 roku około 67% wyprodukowanego na świecie kwasu cytrynowego trafiło do przemysłu spożywczego, 16% do chemicznego, 8% do farmaceutycznego i kosmetycznego i 7% do pozostałych gałęzi przemysłu np. przemysłu tekstylnego i metalurgicznego [46]. Największym konsumentem kwasu cytrynowego w skali globalnej jest region Azja Pacyfik, którego udział sięga 28%. Kraje Ameryki Północnej z konsumpcją na poziomie 23% plasują się na drugim miejscu, natomiast Europa Zachodnia z udziałem sięgającym 22% na trzecim miejscu. Szacuje się, że roczna stopa wzrostu światowej konsumpcji kwasu cytrynowego wyniesie 3,7% w latach , co wynika ze znaczącego wzrostu zużycia kwasu w Chinach, Afryce i krajach Bliskiego Wschodu [46]. Obecnie problemem na rynku kwasu cytrynowego jest presja wywierana przez import z krajów Azjatyckich, a także wynikające z tego obniżenie cen sprzedaży. Ponadto europejscy producenci borykają się z wysokimi kosztami produkcji. Z tego względu w 2015 roku Komisja Europejska podtrzymała decyzje wydane w 2013 roku i ponownie nałożyła cło antydumpingowe na przywóz kwasu cytrynowego pochodzącego z Chińskiej Republiki Ludowej [51, 241]. 27

28 Drobnoustroje produkujące kwas cytrynowy W 1983 roku Wehmer otrzymał kwas cytrynowy jako produkt uboczny podczas biosyntezy kwasu szczawiowego przez Citromyces (obecnie Penicillium). Badania nad otrzymaniem kwasu cytrynowego na drodze mikrobiologicznej doprowadziły Zahorsky ego do uzyskania pierwszego patentu na produkcję kwasu cytrynowego z udziałem Sterigmatocystis nigra, obecnie nazywanego Aspergillus niger. Od momentu odkrycia możliwości otrzymywania kwasu cytrynowego przez drobnoustroje do dziś szczepy Aspergillus niger są preferowanymi mikroorganizmami w procesie produkcji kwasu cytrynowego [86, 182, 228]. Oprócz grzybów strzępkowych Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus aculeatus, Aspergillus fumaricus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus awamori, Aspergillus wentii, Aspergillus saitoi, Aspergillus flavus, Aspergillus foetidus, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus luchensis, Aspergillus phoenicis, Aspergillus saitoi, Aspergillus usumii Penicillium janthinellum, Penicillium restrictum, Trichoderma viride, Mucor piriformis, Talaromyces sp., Eupenicillium sp., Botrytis sp., Absidia sp., Ustulina vulgaris, obiecującymi producentami są również drożdże Yarrowia lipolytica, Candida tropicalis, Candida guilliermondii, Candida intermedia, Candida parapsilosis, Candida zeylanoides, Candida. fibriae, Candida. subtropicalix, Candida oleophila i bakterie Arthrobacter paraffineus, Bacillus licheniformis i Corynebacterium spp [19, 64, 182, 321]. Otrzymywanie kwasu cytrynowego z użyciem grzybów Aspergillus niger Obecnie w produkcji przemysłowej kwasu cytrynowego wykorzystuje się głównie grzyby strzępkowe Aspergillus niger [42, 215]. Do zalet tych mikroorganizmów należy zdolność do szybkiej adaptacji i wzrostu na różnych rodzajach substratów, możliwość regulacji i kontroli szlaków metabolicznych oraz wydzielanie kwasu cytrynowego z mitochondriów i cytozolu, co wpływa na akumulację kwasu cytrynowego oraz zapobiega jego degradacji kwasu cytrynowego w cyklu Krebsa. Ponadto hodowle prowadzone z użyciem Aspergillus niger charakteryzują się wysoką wydajnością produkcji oraz homofermentatywnością biosyntezy kwasu cytrynowego [58, 64, 173, 182, 228, 241, 243]. Szczepy Aspergillus niger zostały uznane za bezpieczne ze względu na to, że nie wydzielają ochratoksyny w kontrolowanych warunkach hodowli oraz nie wywołują silnych reakcji alergicznych u ludzi [219]. 28

29 Oprócz biosyntezy kwasu cytrynowego i innych kwasów organicznych Aspergillus niger jest wykorzystywany do produkcji enzymów takich jak: pektynazy, proteazy, aminoglukozydazy, katalazy, lipazy, oksydazy [219]. Do 1980 roku szczepy Aspergillus niger, wykorzystywane w produkcji przemysłowej, uzyskiwano na drodze badań skriningowych oraz mutagenizacji. Obecnie techniki mutagenizacji grzybów strzępkowych są nadal wykorzystywane i wciąż przynoszą dobre rezultaty na polu poprawy wydajności biosyntezy. Najczęściej wykorzystywane mutageny to czynniki fizyczne (promieniowanie γ i promieniowanie UV), czynniki chemiczne oraz metody hybrydowe, łączące czynniki fizyczne i chemiczne [163]. Rozwój bioinżynierii genetycznej sprawił, że technologie rekombinacji DNA zastosowano do doskonalenia szczepów, natomiast Aspergillus niger wykorzystano jako gospodarza ekspresji białek heterologicznych. Doskonalenie szczepów Aspergillus niger jest ograniczone niewielką liczbą wektorów plazmidowych dostępnych dla tych grzybów strzępkowych. W ostatnim czasie do poprawy właściwości szczepów zastosowano integrację i autonomiczną replikację wektorów plazmidowych, w celu manipulacji genomowej ukierunkowanej na wymianę genu [83]. Otrzymywanie kwasu cytrynowego z użyciem drożdży Yarrowia lipolytica Drożdże, szczególnie Yarrowia lipolytica oraz szczepy Candida, w produkcji kwasu cytrynowego były wykorzystywane od lat 60 tych ubiegłego wieku. Początkowo jako źródło węgla w hodowlach stosowano n alkany, z czasem zaczęto wdrażać inne substraty jak glikoza, octany, melasa, glicerol, inulina, oleje oraz kwasy tłuszczowe [130, 230]. Główne zalety szczepów Yarrowia lipolytica w porównaniu z grzybami strzępkowymi to lepsza tolerancja wysokich stężeń źródła węgla, mniejsza wrażliwość na jony metali ciężkich oraz niskie stężenie tlenu w podłożu hodowlanym, a co za tym idzie możliwość wykorzystanie szerokiego spektrum substratów. Ponadto biosynteza kwasu cytrynowego zużyciem drożdży Yarrowia lipolytica charakteryzuje się większą wydajnością, szybkością oraz łatwością kontroli [138, 25, 83, 215, 216, 243]. Do zalet drożdży należy również łatwość przeprowadzania modyfikacji genetycznych z wykorzystaniem technik molekularnych oraz brak konieczności uprzedniej obróbki substratu [243]. Istotną barierą w produkcji kwasu cytrynowego przez drożdże jest równoczesne wydzielanie kwasu izocytrynowego, który uważany jest za produkt niepożądany i zakłócający proces krystalizacji kwasu cytrynowego. Ilość akumulowanego kwasu 29

30 izocytrynowego zależy od rodzaju użytego szczepu oraz źródła węgla. W podłożach hodowlanych zawierających oleje roślinne lub n alkany jako źródło węgla, udział kwasu izocytrynowego wynosi 35 45%, podczas gdy w podłożach z glicerolem jest on ponad trzykrotnie mniejszy i wynosi 10 12%. W celu ograniczenia obecności kwasu izocytrynowego w płynie pohodowlanym zaczęto udoskonalać szczepy wykorzystując metody inżynierii genetycznej np.: poprzez wywołanie nadekspresji liazy izocytrynianowej powodującej znaczne zmniejszenie udziału izocytrynianów lub zwiększenie aktywności karboksylazy pirogronianowej [25, 236]. Pomimo, że produkcję kwasu cytrynowego przez Yarrowia lipolytica charakteryzuje wysoka wydajność i brak negatywnego oddziaływania na środowisko, nie wydaje się realnym zastąpienie biosyntezy kwasu cytrynowego z użyciem Aspergillus niger przez fermentację z ich udziałem [243]. Biochemiczne aspekty biosyntezy kwasu cytrynowego w komórkach Aspergillus niger Biochemiczny mechanizm, dzięki któremu Aspergillus niger akumuluje kwas cytrynowy, był przedmiotem zainteresowań naukowców od lat 30 tych ubiegłego wieku, kiedy to dla potrzeb produkcji przemysłowej ustalano warunki hodowli oraz oceniano wpływ różnych składników podłoża. Mimo, że od 1930 roku zaproponowano wiele modeli wyjaśniających zdolność Aspergillus niger do nagromadzania kwasu cytrynowego, to nadal wiele aspektów dotyczących przemian biochemicznych pozostaje niewyjaśnionych. Badania prowadzące do poznania szlaków metabolicznych i właściwości enzymów Aspergillus niger sprawiły, że jest on najlepiej poznanym grzybem strzępkowym [109]. Zdolność niektórych szczepów Aspergillus niger do biosyntezy kwasu cytrynowego jest określona genotypowo, natomiast zapewnienie odpowiednich warunków hodowli i ich kontrola pozwala na uzyskanie wysokich wydajności procesu. Wysoka wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger wymaga wysokiego stężenia źródła węgla w podłożu hodowlanym. Stężenie źródła węgla powyżej 5% prowadzi do akumulacji kwasu cytrynowego oraz stymuluje szybkość glikolizy [215]. Optymalną wydajność bioprocesu uzyskuje się przy niskim poziomie jonów metali: Mn 2+, Fe 2+, Zn 2+, a także źródła azotu. Kolejnym istotnym parametrem jest napowietrzanie, ponieważ optymalna wydajność jest obserwowana w warunkach nadmiaru tlenu [110]. Natomiast niskie ph hamuje 30

31 oksydazę glukozową pojawiającą się we wczesnej fazie fermentacji i warunkującą konwersję glukozy do kwasu glukonowego [173]. Już 60 lat temu Cleland i Janson [50] wykazali, że kwas cytrynowy powstaje na drodze glikolizy (szlak Embdena Meyerhoffa Parnasa) oraz konsolidacji związku czterowęglowego (szczawiooctanu) z jednostką dwuwęglową (grupą acetylową). W trofofazie, czyli w trakcie wzrostu grzybni Aspergillus niger, następuje wychwyt heksoz lub innych węglowodanów na drodze glikolizy oraz szlaku pentozofosforanowego. Udział szlaku pentozofosforanowego w metabolizmie węglowodanów jest bardzo mały i znacząco spada w trakcie produkcji kwasu cytrynowego, w idiofazie [125]. Glukoza po przedostaniu się do wnętrza komórki ulega fosforylacji przechodząc w glukozo 6 fosforan. Etap ten katalizuje heksokinaza i glukokinaza. Heksokinaza jest enzymem katalizującym przenoszenie grup fosforanowych z ATP na glukozę i fruktozę, natomiast glukokinaza wykazuje wysokie powinowactwo tylko w stosunku do glukozy [110]. Aktywność heksokinazy jest silnie hamowana przez trehalozo 6 fosforan. W celu zwiększenia wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego zablokowano gen tpsa odpowiadający za ekspresję syntazy trehalozo 6 fosforanu [24]. Następny etap glikolizy to izomeryzacja glukozo 6 fosforanu do fruktozo 6 fosforanu. Reakcję tę katalizuje izomeraza fosfoglukozy. Po reakcji izomeryzacji następuje reakcja fosforylacji katalizowana przez fosfofruktokinazę, będącą kluczowym enzymem szlaku glikolitycznego. W wyniku tej, reakcji fruktozo 6 fosforan jest przekształcany w fruktozo 1,6 bifosforan [33]. Aktywność fosfofruktokinazy jest hamowana przez wysokie stężenie ATP, powodujące zmniejszenie jej powinowactwa do fruktozo 6 fosforanu. Oznacza to, że aktywność fosfofruktokinazy wzrasta, gdy zmniejszeniu ulega ładunek energetyczny [246]. Inhibitorami fosfofruktokinazy są również wysokie stężenie manganu, cytrynianu oraz fosfoenolopirogronianu. Stymulujący efekt na aktywność fosfofruktokinazy wywierają jony NH4 +, Zn 2+, Mg 2+, a także adenozynomonofosforan (AMP) [109, 256]. W drugiej fazie glikolizy następuje rozszczepienie fruktozo 1,6 bifosforanu na aldehyd 3 fosfoglicerynowy i fosfodihydroksyaceton. Ta odwracalna reakcja jest katalizowana przez aldolazę. Powstały aldehyd 3 fosfoglicerynowy przechodzi bezpośrednio do szlaku glikolitycznego. Z kolei fosfodihydroksyaceton ulega przekształceniu pod wpływem izomerazy triozofosforanowej [33]. Pierwszą reakcją w trzecim etapie glikolizy jest przekształcenie aldehydu 3 fosfoglicerynowego w 1,3 bifosfoglicerynian. Proces ten jest katalizowany przez 31

32 dehydrogenazę aldehydu 3 fosfoglicerynowego i obejmuje utlenianie aldehydu z udziałem NAD + do kwasu karboksylowego oraz utworzenie 1,3 bifosfoglicerynianu. W dalszym etapie glikolizy kinaza fosfoglicerynowa katalizuje przeniesienie grupy fosforanowej z 1,3 bifosfoglicerynianu i utworzenie ATP oraz 3 fosfoglicerynianu. Końcowy etap glikolizy to przekształcenie 3 fosfoglicerynianu do pirogronianu z wytworzeniem ATP. W tym etapie kluczowym enzymem jest kinaza pirogronianowa katalizująca nieodwracalne przeniesienie grupy fosforanowej na ATP [33, 110, 125, 256]. Na drodze glikolizy glukoza zostaje przekształcona w dwie cząsteczki pirogronianu. Następnie pirogronian ulega przekształceniu do prekursorów cytrynianu, szczawiooctanu i acetylo CoA. Szczawiooctan powstaje w wyniku reakcji karboksylacji pirogronianu katalizowanej przez karboksylazę pirogronianową. W trakcie tej reakcji Aspergillus niger zużywa CO2 powstały podczas tworzenia acetylo CoA [173]. Pirogronian zostaje przetransportowany do mitochondrium, gdzie ulega dekarboksylacji oksydacyjnej do acetylo CoA, w wyniku nieodwracalnej reakcji katalizowanej przez dehydrogenzę pirogronianową. Reakcja powstawania acetylo CoA z pirogronianu jest pomostem pomiędzy szlakiem glikolitycznym a cyklem kwasu cytrynowego. Cykl kwasu cytrynowego przebiega w matrycy mitochondrialnej i rozpoczyna się od kondensacji szczawiooctanu i acetylo CoA oraz H2O, w wyniku czego powstaje cytrynian oraz CoA. Enzym katalizujący tę reakcję to syntaza cytrynianowa [33]. Następnie cytryniany ulegają izomeryzacji do izocytrynianu w toku reakcji katalizowanych przez akonitazę. W przeszłości przypuszczano, że nagromadzanie kwasu cytrynowego w cyklu kwasu cytrynowego zachodzi w wyniku zahamowania aktywności akonitazy, dehydrogenazy izocytrynianowej NADP oraz dehydrogenazy oksoglutaranowej, przez czynniki zewnętrzne (jony metali, ph, Cu 2+ ) lub czynniki wewnętrzne (glicerol, cytryniany) [110]. Nagromadzanie kwasu cytrynowego wiąże się z aktywnością przenośników trikarboksylanów, konkurujących o cytryniany z akonitazą. Powinowactwo transportera trikarboksylanu do cytrynianu jest znacznie większe aniżeli akonitazy. W konsekwencji następuje uwalnianie cytrynianów z mitochondrium bez potrzeby hamowania cyklu Krebsa. Transport cytrynianów przez nośniki trikarboksylanów działa poprzez wymianę z jabłczanem znajdującym się w cytozolu. Stąd jabłczan może być traktowany jako potencjalny wyzwalacz akumulacji kwasu cytrynowego, gdyż wzrost jego koncentracji poprzedza nagromadzanie cytrynianów [109]. 32

33 Techniki produkcji kwasu cytrynowego Obecnie ponad 90% światowej produkcji kwasu cytrynowego wytwarzane jest z użyciem trzech metod: hodowli wgłębnej (SF Submerged Fermentation), hodowli powierzchniowej w podłożach płynnych (LSF Liquid Surface Fermentation) oraz hodowli w podłożach stałych (SSF Solid State Fermentation) [231]. Zalety i wady różnych metod hodowli stosowanych w biosyntezie kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger przedstawiono w tabeli 4. Hodowle powierzchniowe w podłożach płynnych W pierwszej połowie XX wieku do przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego wykorzystywano wyłącznie metodę hodowli powierzchniowej, prowadzoną w ciekłych podłożach melasowych. Metoda ta nadal jest stosowana w małej i średniej skali przemysłowej ze względu na prostą technologię i niskie koszty produkcji [182]. W hodowlach powierzchniowych grzyby Aspergillus niger rosną na powierzchni podłoża hodowlanego i przyjmują formę grubej warstwy plechy. Proces ten przebiega w komorach fermentacyjnych, na tacach wykonanych z wysokiej jakości stali, aluminium lub polietylenu. Komory fermentacyjne wyposażone są w system napowietrzania, który kontroluje temperaturę oraz poziom wilgotności. Powietrze dostarczane do komór fermentacyjnych jest filtrowane przy użyciu filtrów bakteriologicznych, aby zapobiec zanieczyszczeniom spowodowanym przez Penicillium, inne szczepy Aspergillus niger lub bakterie kwasu mlekowego [119]. W trakcie hodowli powierzchniowych wytwarzana jest duża ilość ciepła, co wymaga dużej szybkości napowietrzania w celu utrzymania odpowiedniej temperatury [228]. Hodowle powierzchniowe w podłożach stałych W latach 60 tych XX wieku w Japonii opracowano metodę produkcji kwasu cytrynowego w podłożach stałych, tzw. proces Koji lub solid state. Ta metoda hodowli polega na wzroście drobnoustrojów w podłożach stałych. Proces hodowli w podłożach stałych jest uważany za reakcję w układzie heterogenicznym z równoczesnym wieloskładnikowym transportem masy i ciepła [52, 119, 172]. Jako substraty w tej metodzie mogą zostać wykorzystane odpady rolno przemysłowe np. odpady z przetwórstwa owocowo warzywnego. Do produkcji kwasu cytrynowego w podłożach stałych wykorzystuje się bioreaktory bębnowe, kolumnowe oraz obrotowe [229]. 33

34 Tabela 4. Zalety i wady różnych metod hodowli stosowanych w biosyntezie kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger Rodzaj hodowli Parametry procesu biosyntezy kwasu cytrynowego Zalety procesu Wady procesu Źródło Hodowla powierzchniowa w podłożach płynnych (LSF) Czas trwania procesu: 8 12 dni Wydajność procesu: 70 75% Łatwość obsługi Energooszczędna Prosta technicznie Długotrwała Wrażliwa na zakażenia przez inne drobnoustroje Wymaga dużych powierzchni produkcyjnych Generowanie dużych ilości ciepła Produkcja na mała i średnią skale przemysłową [55, 86, 228] Prosta technicznie i technologicznie Hodowla powierzchniowa w podłożach stałych (SSF) Czas trwania procesu: 4 dni Niski koszt substratów Energooszczędna Niskie ryzyko zakażeń Mała ilość generowanych odpadów Niska wrażliwość na zanieczyszczenia metalami ciężkimi Trudności w kontroli parametrów procesu (ph, wilgotność, temperatura) Duże zanieczyszczenie produktu Wysoki koszt uzyskiwania produkty [52, 119, 172, 229] Możliwość kontroli parametrów procesu Hodowle wgłębne (SF) Czas trwania procesu: 4 dni Wysoka wydajność procesu Niskie koszty produkcji Łatwość utrzymania jałowych warunków Wrażliwość na hamujące działania pierwiastków śladowych Duża ilość generowanych odpadów [55, 86, 119, 173] 80% światowej produkcji kwasu cytrynowego 34

35 Niewątpliwą zaletą tej metody jest niskie zapotrzebowanie na energię oraz niewielka ilość generowanych odpadów, co jest korzystne dla środowiska. Dodatkowo, proces ten w warunkach optymalnych trwa około 4 dni, a więc znacznie krócej aniżeli hodowle wgłębne i powierzchniowe w podłożach ciekłych [119, 228]. Hodowle Aspergillus niger w podłożach stałych zyskały na znaczeniu w przeciągu ostatnich lat, jednak ze względu na niski poziom automatyzacji procesu oraz brak poprawy konstrukcji bioreaktorów, w małym stopniu znajdują zastosowanie w produkcji przemysłowej kwasu cytrynowego [58]. Hodowle wgłębne Obecnie około 80% światowej produkcji kwasu cytrynowego jest wytwarzana metodą hodowli wgłębnej. Do produkcji kwasu cytrynowego tą metodą stosuje się bioreaktory zbiornikowe wykonane z wysokogatunkowej stali kwasoodpornej, wyposażone w systemy napowietrzania i mieszania. Jako źródło węgla najczęściej wykorzystywana jest sacharoza oraz produkty uboczne jej produkcji, tj. melasa [228]. Przewagą hodowli wgłębnych nad powierzchniowymi jest niski koszt, niskie ryzyko zanieczyszczeń, wysoki poziom automatyzacji oraz wyższa wydajność procesu. W celu uzyskania wysokich wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego w hodowlach wgłębnych konieczna jest kontrola parametrów procesu oraz staranny dobór składu podłoża hodowlanego [22]. W produkcji kwasu cytrynowego w skali przemysłowej najczęściej wykorzystywana jest metoda hodowli okresowej (BC Batch Culture). Do produkcji kwasu cytrynowego stosowane są również zasilane hodowle okresowe (FBC Feed Batch Culture), hodowle półciągłe (SC Semicontinous Culture) [226]. Metody i warunki hodowli Aspergillus niger stosowane w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego Czynniki wpływające na produkcję kwasu cytrynowego Na przebieg hodowli Aspergillus niger i szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego metodą wgłębną wpływa wiele czynników m.in. rodzaj źródła węgla i jego stężenie, rodzaj i stężenie jonów metali występujących w podłożach hodowlanych, alkohole o niskiej masie cząsteczkowej, morfologia grzybni a także temperatura, ph, szybkość napowietrzania oraz mieszania. 35

36 Źródło azotu Na wzrost Aspergillus niger i biosyntezę kwasu cytrynowego w hodowlach wgłębnych oraz solid state zasadniczy wpływ ma stężenie oraz źródło azotu. Najbardziej preferowanym źródłem azotu są sole azotu m.in. azotan amonu, siarczan amonu oraz chlorek amonu. Wśród innych źródeł azotu możemy wyróżnić mocznik, pepton i ekstrakt drożdżowy [146]. Według danych literaturowych najbardziej korzystnym źródłem azotu jest azotan amonu [12, 56, 91, 97, 176]. Związki amonowe prowadzą do korzystnego obniżenia ph podłoża hodowlanego poniżej 2, co stanowi warunek konieczny do produkcji kwasu cytrynowego. Ograniczenie źródła azotu w trakcie hodowli przyczynia się do zahamowania wzrostu biomasy grzybni oraz zwiększenia produkcji kwasu cytrynowego [173]. Optymalne stężenie źródła azotu powinno wynosić około 0,2%, ponieważ sprzyja biosyntezie kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger. Najwyższa wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego zostaje osiągnięta, gdy wewnątrzkomórkowe stężenie jonów amonowych wynosi od 2,0 do 3,0 mm g -1. Natomiast obniżenie wydajności procesu następuje przy wewnątrzkomórkowym stężeniu jonów azotu wynoszącym 1,0 mm g -1 biomasy [19, 56, 91, 97]. W celu zwiększenia szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego zasila się podłoża hodowlane w trakcie trwania hodowli. Ponadto, oprócz odpowiedniej ilości dodanego źródła azotu istotne znaczenie ma również czas dodania, ponieważ zasilenie w niewłaściwej fazie fermentacji może zmniejszyć szybkość akumulacji kwasu cytrynowego [182]. Źródło fosforu Na wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego wpływa również obecność fosforu w podłożu hodowlanym. Za najlepsze źródło fosforu uważa się KH2PO4 oraz K2HPO4. Ograniczenie stężenia fosforu w podłożu hodowlanym podobnie jak w przypadku azotu ma krytyczny wpływ na przebieg produkcji kwasu cytrynowego. Na zwiększenie wydajności procesu pozwala stężenie fosforu w zakresie od 0,006 do 0,32 g dm -3. Do prawidłowego wzrostu grzyby strzępkowe wymagają obecności fosforu w stężeniu od 0,01 do 0,02% [19, 242]. Wysokie stężenia fosforu stymulują wzrost grzybni oraz wywołują wtórne reakcje enzymatyczne, a także hamują produkcję kwasu cytrynowego [91]. 36

37 Mikroelementy Pierwiastki śladowe są zasadniczym czynnikiem wpływającym na wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego. Szczególne znaczenie mają mangan, cynk, miedź oraz żelazo [242]. W celu uzyskania wysokiej wydajności procesu, szczególnie w przypadku hodowli wgłębnych, konieczne jest zastosowanie podłoży o kontrolowanej zawartości pierwiastków śladowych. Wynika to z ich istotnego wpływu na wzrost i fizjologię Aspergillus niger oraz wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego [173]. Do prawidłowego wzrostu Aspergillus niger oraz produkcji kwasu cytrynowego niezbędny jest magnez, ze względu na rolę kofaktora jaką pełni w reakcjach enzymatycznych. Maksymalną wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskiwano przy stężeniach siarczanu magnezu w zakresie od 0,020 do 0,025% [19, 86]. Dodatek manganu do podłoża hodowlanego odgrywa istotną rolę w nagromadzaniu kwasu cytrynowego, a także w syntezie ściany komórkowej, zarodnikowaniu oraz produkcji metabolitów wtórnych [173]. W stężeniu 10,0 mg dm -3 mangan ogranicza wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego, natomiast w stężeniu niższym niż 3,0 µg dm -3 znacząco obniża wydajność procesu. Niedobory manganu przyczyniają się do ograniczenia syntezy tłuszczów, a także zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej, co wynika z faktu zmniejszenia stężenia niektórych enzymów biorących udział w procesach anabolicznych [120]. W produkcji kwasu cytrynowego kluczowe znaczenie ma ograniczenie obecności żelaza w podłożu hodowlanym. W celu uzyskania wysokiej wydajności procesu potrzeba około 1 mg żelaza na litr podłoża hodowlanego. Wyższe stężenie żelaza może wywołać nagromadzanie kwasu szczawiowego [19]. Szkodliwy wpływ nadmiaru jonów żelaza redukuje obecność jonów miedzi. Ponadto miedź znana jest jako inhibitor jonów manganu. Optymalne stężenie CuSO4 7H2O w podłożu hodowlanym powinno wynosić 78,0 mg dm -3 [242]. Obecność miedzi w różnych stężeniach wpływa na kształtowanie morfologii grzybni Aspergillus niger. Stąd jej obecność warunkuje uzyskanie odpowiedniej struktury grzybni, pozwalającej na uzyskanie wysokiej wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego [173]. Alkohole o niskiej masie cząsteczkowej Do potencjalnych stymulatorów fermentacji cytrynowej należą alkohole o niskiej masie cząsteczkowej np. alkohol metylowy, etylowy i n-propylowy [89]. Alkohol etylowy dodany 37

38 do podłoży hodowlanych hamuje wzrost grzybni i zarodnikowanie, zmniejsza zużycie substratu, zwiększa przepuszczalność błony komórkowej, a także wpływa na zwiększenie aktywności syntazy cytrynianiowej oraz ograniczenie aktywności akonitazy [29, 127, 18]. Alkohol metylowy, w przeciwieństwie, do etanolu nie jest asymilowany przez Aspergillus niger i nie ulega konwersji do acetylo-coa, będącego prekursorem cyklu Krebsa. Mechanizm oddziaływania metanolu na biosyntezę kwasu cytrynowego zarówno w podłożach syntetycznych, jak i naturalnych, nie został do końca wyjaśniony. Alkohol metylowy w podłożach o wysokim stopniu czystości zaburza procesy metaboliczne oraz wzrost biomasy, co skutkuje obniżeniem produkcji kwasu cytrynowego. Powoduje również zaburzenia w syntezie białek komórkowych we wczesnych etapach hodowli [159, 201]. Alkohol metylowy wpływa na przepuszczalność błon komórkowych, czego przyczyną mogą być zmiany w składzie fosfolipidów i trójgliceroli [183]. Według Jernejec i wsp. [104] fosfolipidy odgrywają istotną rolę w regulacji przepuszczalności błon dla kwasu cytrynowego. Alkohol metylowy może zaburzać kształtowanie się struktury grzybni poprzez efekt chelatowania jonów metali takich jak jony miedzi (II), które odgrywają istotną rolę w regulowaniu zawartości kwasów tłuszczowych, glikolipidów i fosfolipidów [32]. W badaniach Maddox i wsp. [141] metanol w podłożach syntetycznych, zawierających galaktozę jako źródło węgla, wywoływał efekt toksyczny poprzez ograniczenie wzrostu grzybni i zmniejszenie zużycia substratu, ale równocześnie zwiększał wydajność procesu produkcji kwasu cytrynowego. Ponadto alkohol metylowy hamował aktywność dehydrogenazy 2-oksyglutarowej, co pociągało za sobą zwiększenie akumulacji kwasu cytrynowego. Również Yaykaşlı i wsp. [259] dowodzą, że alkohol metylowy w procesie biosyntezy przy użyciu unieruchomionych konidiów Aspergillus niger w podłożach z sacharozą, przyczynia się do zwiększenia produkcji kwasu cytrynowego. Większość dostępnych danych literaturowych donosi o pozytywnym wpływie niższych stężeń alkoholu metylowego na wydajność procesu produkcji kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger w podłożach naturalnych, charakteryzujących się niższą czystością np. w podłożach melasowych [26, 89, 111, 155, 159, 183, 199, 223]. Stymulujący wpływ alkoholu metylowego dodanego do podłoży naturalnych, wynika z ograniczenia negatywnego wpływu na proces biosyntezy, zawartych w podłożu jonów metali takich jak: mangan, żelazo i cynk, na które szczepy Aspergillus niger wykazują wysoką wrażliwość. Alkohol metylowy natomiast zwiększa tolerancję Aspergillus niger na zawartość jonów żelaza, manganu oraz cynku występujących w podłożach [154]. Alkohol metylowy powoduje zmiany w normalnej ścieżce metabolizmu węglowodanów zwiększając zdolności glikolityczne, a w 38

39 konsekwencji akumulację kwasu cytrynowego. W podłożach naturalnych stymuluje produkcję kwasu cytrynowego wpływając na wzrost grzybni oraz zmianę składu lipidów ściany komórkowej [223]. Odczyn ph Większość grzybów strzępkowych rozwija się w zakresie ph od 3 do 6. W dużej mierze również ich aktywność metaboliczna zależy od ph podłoża hodowlanego W produkcji kwasu cytrynowego wartość ph odgrywa istotną rolę podczas kiełkowania zarodników, kiedy to ph powinno być wyższe od 5, a także podczas produkcji kwasu cytrynowego, kiedy wymagane jest niskie ph podłoża hodowlanego (ph 2) [20, 27, 191]. W czasie produkcji kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger w hodowlach wgłębnych i powierzchniowych stosuje się ph w zakresie od 2 do 6. Niski poziom ph zmniejsza ryzyko zakażenia hodowli innymi mikroorganizmami. Ponadto ph poniżej 3 zapobiega produkcji kwasu szczawiowego i glukonowego [20]. Z kolei wzrost ph do poziomu 4,5 może wpływać na zmniejszenie wydajności produkcji kwasu cytrynowego nawet o 80% [173]. Wartość ph podłoża hodowlanego może wpływać również na morfologię grzybni Aspergillus niger. Przy wartościach ph od 2,0 do 2,2 grzybnia przyjmuje formę małych agregatów i krótkich strzępek, która jest najbardziej pożądana w produkcji kwasu cytrynowego. Przy ph o wartości 1,6 rozwój morfologiczny grzybni zostaje zaburzony, a wydajność procesu znacząco spada. W podłożach, w których wartość ph wynosi 3,0 grzybnia tworzy większe agregaty, sprzyjające biosyntezie kwasu szczawiowego [173, 174]. Napowietrzanie i szybkość mieszania Szybkość napowietrzania ma istotny wpływ na biosyntezę kwasu cytrynowego prowadzoną metodą hodowli wgłębnej. W hodowlach wgłębnych wydajność procesu wzrasta wraz ze wzrostem szybkości napowietrzania oraz ciśnienia (0,10 0,17 MPa.) [19]. W przypadku niedostatecznej ilości tlenu w podłożu lub przerw w dostarczaniu tlenu może nastąpić zahamowanie produkcji kwasu cytrynowego, a także wzrostu grzybni [57, 86]. Krytycznym czynnikiem mającym wpływ na wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego jest odpowiednie stężenie tlenu rozpuszczonego w podłożu hodowlanym [182, 183]. Właściwe stężenie tlenu rozpuszczonego w podłożu hodowlanym wpływa na szybkość glikolizy, co z kolei wiąże się z wysokim poziomem ATP, a tym samym ze zwiększonym wydzielaniem cytrynianów [19]. 39

40 W produkcji przemysłowej szybkość napowietrzania jest regulowana w zależności od aktualnego zapotrzebowania grzybni. Na początku hodowli szybkość napowietrzania wynosi około 0,1 vvm, natomiast w fazie intensywnego wzrostu grzybni zostaje zwiększona do około 0,5 vvm [182]. W celu zwiększenia wydajności procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w hodowlach wgłębnych stosowano napowietrzanie w zakresie od 0,9 do 1,3 vvm [19, 241]. Niewłaściwa szybkość napowietrzania może niekorzystnie wpływać na wydajność bioprocesu [173]. Odpowiednie napowietrzanie oraz wysokie stężenie tlenu rozpuszczonego przyczyniają się do obniżenia aktywności enzymów zależnych od cytochromu i zwiększenia aktywności alternatywnej oksydazy, a w konsekwencji uruchomienia alternatywnej drogi oddechowej. Proces ten pozwala na oszczędność energii, ponieważ omija konieczność tworzenia ATP. W konsekwencji fermentacja cytrynowa wymaga ciągłego chłodzenia, ponieważ w wyniku swobodnego transportu elektronów wytwarza się ciepło [109]. Istotnym parametrem towarzyszącym napowietrzaniu jest szybkość mieszania, która wpływa na dyspersję grzybni, stężenie tlenu rozpuszczonego w podłożu, a nawet aktywność enzymów, np. syntazy cytrynianowej, akonitazy oraz dehydrogenazy izocytrynianowej. Aktywność syntazy cytrynianowej zmniejsza się wraz ze wzrostem szybkości mieszania, podczas gdy aktywność akonitazy i dehydrogenazy cytrynianowej wzrasta wraz ze wzrostem szybkości mieszania. Optymalna szybkość mieszania w bioreaktorach laboratoryjnych zawiera się w zakresie od 300 do 1000 obr min -1 [19]. Intensywne mieszanie wiąże się również z uzyskaniem grzybni, w postaci krótkich rozgałęzionych strzępek, którą charakteryzuje duża zdolność nadprodukcji kwasu cytrynowego. Przyczynia się również do fragmentacji grzybni i jej ponownego wzrostu. Zjawisko to może okazać się korzystne, ponieważ najbardziej podatne na fragmentację są metabolicznie nieaktywne i silnie zwakuoalizowane strzępki grzybni, natomiast fragmentacja generuje powstanie nowych włókien grzybni Aspergillus niger [173, 174]. Temperatura Temperatura to kolejny parametr wpływający na aktywność enzymatyczną oraz systemy transportowe drobnoustrojów, a w konsekwencji na wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego. W procesie produkcji kwasu cytrynowego optymalna temperatura zawiera się w przedziale między 28 C a 30 C. Liczne badania wykazały, że najwyższą wydajność procesu uzyskano w temperaturze 30 C [69, 71, 191, 222]. Temperatura powyżej 30 C 40

41 powoduje denaturację syntazy cytrynianowej, ograniczenie akumulacji kwasu cytrynowego w podłożu i wzrostu biomasy, a także produkcję kwasu szczawiowego. Hodowle prowadzone w niższych temperaturach obniżały aktywność enzymatyczną [191, 196]. Substraty stosowane w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger Tradycyjne i niekonwencjonalne źródła węgla Poszukiwanie nowych substratów do biosyntezy kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger było przedmiotem wielu badań [4, 5, 11, 15, 16, 18, 27, 72]. W produkcji kwasu cytrynowego mogą być stosowane substraty o wysokim stopniu czystości, takie jak sacharoza, glukoza, fruktoza oraz maltoza. Przykłady wykorzystania surowców o wysokim stopniu czystości w procesie produkcji kwasu cytrynowego z użyciem Aspergillus niger przedstawiono w tabeli 5. Najbardziej korzystnym źródłem węgla jest sacharoza, co wynika z niskiej masy cząsteczkowej, ułatwionego transportu przez błony komórkowe drobnoustrojów oraz szybkiej hydrolizy przez inwertazę aktywowaną w środowisku o niskim ph [242, 253]. Substraty o wysokiej czystości umożliwiają prowadzenie kontrolowanego procesu produkcji kwasu cytrynowego o wydajności większej niż 70% [19, 182]. Jednak stosowanie czystego cukru w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego wiąże się z wysokimi kosztami, ponieważ często cena surowca przewyższa cenę otrzymanego produktu [79]. Dlatego też w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger jako tanie i odnawialne źródło węgla, wykorzystuje się odpady rolno przemysłowe [226]. Przykłady wykorzystania odpadów rolno przemysłowych w procesie produkcji kwasu cytrynowego z użyciem Aspergillus niger przedstawiono w tabeli 6. Zainteresowanie wykorzystaniem odpadów i ścieków przemysłowych w biosyntezie kwasu cytrynowego spowodowane jest większą troską o środowisko naturalne oraz wysokimi kosztami eliminacji generowanych zanieczyszczeń. Do odpadów stosowanych w produkcji kwasu cytrynowego należą: melasa buraczana [105, 139, 183], melasa trzcinowa [8], celuloza [261], lipidy [11, 28], serwatka [68], wytłoki owocowe [58, 59, 60], inulina [63], surowce skrobiowe [4, 192], słodkie ziemniaki [36, 233], maniok [5, 146], wodorosty [191], glicerol [31, 218]. Odpady przemysłowe uważa się za najlepsze źródło węgla w hodowlach prowadzonych metodą solid state [228]. 41

42 Tabela 5. Substraty o wysokiej czystości stosowane w produkcji kwasu cytrynowego przez szczepy Aspergillus niger Substrat Sacharoza Glukoza Galaktoza Hydrolizaty skrobiowe Skrobia Szczep Stężenie substratu Metoda hodowli Wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego Aspergillus niger C g dm -3 SF 77,7% (m/m) Aspergillus niger C g dm -3 SF 81,2% (m/m) Aspergillus niger NCIM705 Źródło [182] 60 g dm -3 SF 30,7 g dm -3 [114] Aspergillus niger PM kg m -3 SF 121 kg m -3 [175] Aspergillus niger Yang no. 2. Aspergillus niger ATCC Aspergillus niger ATCC Aspergillus niger ATCC Aspergillus niger IMI Aspergillus niger IMI Aspergillus niger UE 1 Aspergillus niger GCB 47 0,12 mg dm -3 SF 15,4 mg ml -1 [200] 100 g dm -3 SF 0,3% 100 g dm -3 SF 0,4% 100 g dm -3 SF 0,1% 100 g dm -3 SF 2,3% 100 g dm -3 SF 1,5% 15% (ekwiwalent glukozowy) [141] LSF 490 g kg -1 [153] 150 g dm -3 SF 45,1 g dm -3 Aspergillus niger GCMC 150 g dm -3 SF 69,5 g dm -3 [89] Podstawowym surowcem w produkcji kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger jest melasa trzcinowa i buraczana, co jest podyktowane niską ceną tego substratu [22, 242]. Melasa charakteryzuje się wysoką zawartością węglowodanów (około 50%), w postaci sacharozy, glukozy i fruktozy Jej skład chemiczny jest zamienny i niejednorodny co może hamować proces biosyntezy. W celu poprawy jakości podłoża hodowlanego melasę poddaje się obróbce z użyciem żelazocyjanku, kwasu solnego, fosforanu trójwapniowego z kwasem solnym, szczawianu amonu i fosforanu diamonu, wapna oraz frakcjonowaniu [14, 22, 92]. Oprócz melasy trzcinowej i buraczanej, jako tanie i łatwo dostępne źródła węgla wymienia się produkty skrobiowe i lignocelulozowe, ze względu na dużą zawartość węglowodanów [90, 157, 223]. Zastosowanie tych surowców jest ograniczone z powodu zanieczyszczenia metalami ciężkimi, aminokwasami lub białkami oraz z powodu konieczności poddania ich hydrolizie. 42

43 Tabela 6. Odpady rolno przemysłowe stosowane w produkcji kwasu cytrynowego przez szczepy Aspergillus niger Substrat Szczep Aspergillus niger Metoda hodowli Wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego Źródło Aspergillus niger ATCC Makuch trzciny 9142 SSF 97,81 g kg -1 [254] cukrowej Aspergillus niger 14/20 SSF 50,01 μg g -1 [8] Aspergillus niger DS 1 SSF 31,8 % [121] Aspergillus niger ATCC SF 106,65 g dm -3 [40] 9142 Melasa trzcinowa Aspergillus niger EB 3 SSF 0,112 mg dm -3 [103] Aspergillus niger GCMC 7 SF 96,1 g dm -3 [98] Aspergillus niger A20 SLF 29,7 g dm -3 Melasa buraczana Aspergillus niger A20 SF 8,6 g dm -3 [6] Aspergillus niger W78B SF 110 g dm -3 [185] Aspergillus niger FUO 2 SF 88,73 g dm -3 [5] Maniok Aspergillus niger NRRL 2001 SSF 88,0 g kg -1 [240] Odpady anansowe Aspergillus niger DS 1 SSF 54,2% [122] Odpady jabłkowe Aspergillus niger NRRL 567 SSF 65,6 Aspergillus niger NRRL 567 SF 8,3 g dm -3 [60] Odpady owocowe Parkia biglobosa Aspergillus niger SF 1,15 g dm -3 [27] Olej palmowy Aspergillus niger IBO 103MNB SSF 337,94 g kg -1 [11] Skrobia Aspergillus niger ATCC 9142 SF 2,7 g dm -3 [18] Serwatka Aspergillus niger ATCC 9642 SFC 2,43 g dm -3 [68] Syrop daktylowy Aspergillus niger J4 SF 56,7 g dm -3 [152] Torf Aspergillus niger NRRL 567 SF 82,0 g kg -1 [113] Wywar gorzelniczy Aspergillus niger ATCC 9142 SSF 6,15 g kg -1 [252] Aspergillus niger ATCC SF 71,63% [251] Melasa (14%) + skrobia kukurydziana Aspergillus niger NCIM (14%) + sacharoza 1055 SF 0,13 mg dm -3 [223] (5%) Skrobia kukurydziana + sacharoza (15%) Aspergillus niger SSF 138,24 g kg -1 [4] Odpady daktylowe + Aspergillus niger ATCC serwatka 6275 SF 32,4 g dm -3 [147] Odpady pomarańczy + melasa trzcinowa Aspergillus niger von Tiegh 1867 SF 640 g kg -1 [88] 43

44 Biosynteza kwasu cytrynowego z niezhydrolizowanych surowców skrobiowych może być przeprowadzona z użyciem szczepów Aspergillus niger o właściwościach amylolitycznych. Proces ten jednak charakteryzuje się niską wydajnością [19, 90]. W przypadku surowców skrobiowych hydroliza enzymatyczna obejmuje traktowanie α amylazą, amyloglukozydazą, izoamylazą lub pullulanazą [19]. W celu przeprowadzenia hydrolizy celulozy wykorzystuje się β endoglukonazy, β egzoglukonazy oraz β glukozydazy [158]. Oprócz rodzaju źródła węgla również jego stężenie odgrywa istotną rolę w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego. Na osiągnięcie wysokiej wydajności i szybkości biosyntezy kwasu cytrynowego pozwalają węglowodany szybko pobierane i metabolizowane przez grzyby strzępkowe. Węglowodany w stężeniu powyżej 200 g dm 3 powodują redukcję szybkości biosyntezy kwasu cytrynowego, co może wynikać z przyrostu stężenia biomasy grzybni, zwiększenia lepkości podłoża i syntezy polialkoholi. Z kolei stężenia węglowodanów poniżej 50 g dm 3 skutkują niską wydajnością biosyntezy kwasu cytrynowego i akumulacją kwasu szczawiowego [173, 239]. Glicerol jako źródło węgla i energii w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger Wzrost cen paliw, zanieczyszczenie środowiska oraz konieczność ograniczenia uwalniania CO2 do atmosfery, przyczynił się do rozwoju odnawialnych źródeł energii. Jednym z nich jest biodiesel otrzymywany na drodze reakcji transestryfikacji kwasów tłuszczowych alkoholami alkilowymi (głównie metanolem), w obecności wodorotlenku sodu lub potasu. W procesie tym oprócz pożądanej mieszaniny estrów, powstaje produkt uboczny, jakim jest odpadowa frakcja glicerynowa, zawierająca również kwasy tłuszczowe, mydła, mono i diacyloglicerole. W zależności od warunków procesu estryfikacji faza glicerynowa zawiera od 30 do 80% glicerolu. Na każde 100 kg otrzymanego biodiesla przypada około 11 kg fazy glicerynowej [61, 179, 214]. Największym producentem biodiesla jest Europa, a zaraz za nią Ameryka Północna. Produkcja biodiesla w 2016 r w krajach Unii Europejskiej sięgnęła 25 mln litrów. Według prognoz w 2017 roku przewiduje się wzrost produkcji o około 0,5 mln litrów biodiesla. Szacuje się, że rynek biodiesla na świecie w 2021 roku osiągnie wartość 41,18 mld dolarów [37]. 44

45 Wzrost produkcji biodiesla doprowadził do zalania rynku ogromną ilością glicerolu, co sprawiło, że poszukuje się nowych metod jego zagospodarowania. Jednak wykorzystanie fazy glicerynowej jest ograniczone głównie ze względu na jej zanieczyszczenie metanolem (od 5 do 9%). Rozwiązaniem tego problemu może być wykorzystanie odpadowej frakcji glicerynowej lub częściowo oczyszczonego glicerolu jako źródła węgla i energii do hodowli drobnoustrojów. Glicerol jako redukujące źródło węgla może odgrywać istotną rolę jako substrat i źródło energii dla wielu mikroorganizmów. Ponadto jest on prekursorem wielu składników komórki, reguluje szlaki metaboliczne, potencjał redoks oraz gospodarkę fosforu w komórce [53]. Biokonwersja glicerolu przez drobnoustroje pozwala na ominięcie niedogodności związanych z jego chemiczną konwersją, wiążącą się z zastosowaniem wysokich temperatur lub ciśnień, a w konsekwencji z wysokimi kosztami [117]. Drobnoustroje posiadają zdolność konwertowania glicerolu do metabolitów takich jak: kwasy organiczne, etanol, 1,3 propanendiol, dihydroksyaceton [78, 131]. W tabeli 7 przedstawiono przykłady wykorzystania glicerolu przez mikroorganizmy. Glicerol może stanowić źródło węgla do produkcji kwasu cytrynowego przez drobnoustroje. W literaturze naukowej jest wiele publikacji poświęconych biosyntezie kwasu cytrynowego z odpadowego glicerolu przez drożdże Yarrowia lipolytica [130, 178]. W biosyntezie kwasu cytrynowego z udziałem drożdży Yarrowia lipolytica w podłożach z glicerolem uzyskuje się wysokie stężenia kwasu cytrynowego (154 g dm -3 ) [206]. Istnieje jednak niewiele doniesień naukowych dotyczących wykorzystania glicerolu do biosyntezy kwasu cytrynowego oraz innych kwasów organicznych przez Aspergillus niger. Grzyby strzępkowe Aspergillus niger posiadają zdolność do biosyntezy kwasu szczawiowego z użyciem podłoży zawierających czysty lub odpadowy glicerol. Musiał i Rymowicz [156] otrzymali 34,0 42,0 g dm -3 kwasu szczawiowego z użyciem szczepu Aspergillus niger XP w podłożach zawierających glicerol i wolne kwasy tłuszczowe. Natomiast w podłożach zawierających glicerol odpadowy Aspergillus niger NRRL364 wyprodukował 20,5 21,5 g dm -3 kwasu szczawiowego [96]. West w podłożach zawierających glicerol odpadowy po 192 godzinach hodowli Aspergillus niger otrzymał kwas jabłkowy w stężeniu 20,0 g dm -3 [247]. 45

46 Tabela 7. Przykłady biokonwersji glicerolu przez drobnoustroje Produkt Mikroorganizmy Źródło Clostridium butyricum [177] 1,3 propanediol Erytrol Kwasy tłuszczowe Kwas cytrynowy Kwas szczawiowy Kwas jabłkowy Kwas mlekowy Kwas propionowy Kwas bursztynowy Enterobacter aerogenes [170] Clostridium butyricum JKT37 [237] Klebsiella pneumoniae [94] Yarrowia lipolytica [204] Yarrowia lipolytica [190] Yarrowia lipolytica LFMB 19 Rhodotorula sp. LFMB 6 Rhodotorula sp. LFMB 22 Candida curvata NRRLY 1511 [41, 179] Candida boidinii ATCC Candida oleophilia ATCC Mucor sp. LGAM 365 Mortinela isabellina MUCL Yarrowia lipolytica 1.31 [205] Yarrowia lipolytica NCIM 3589 [99] Yarrowia lipolytica [178] Yarrowia lipolytica NRRL YB-423 [130] Yarrowia lipolytica SWJ- 1b [236] Aspergillus niger W78B [74] Aspergillus niger [21] Aspergillus niger [156] Aspergillus niger ATCC Aspergillus niger ATCC [247] Aspergillus niger ATCC 9142 Bacillus laevalacticus Lactobacillus delbrueckii [44] Lactobacillus pentosus Lactococcus lactis Enterobacter aerogenes ATCC [124] Propionibacterium jensenii Propionibacterium acidipropionici [262] Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Yarrowia lipolytica [132] Crotalaria juncea [209] Mannheimia succiniciproducens [124] 46

47 Wykorzystanie szczepów Aspergillus niger do biosyntezy kwasu cytrynowego z użyciem glicerolu jako jedynego źródła węgla, nie było dotąd przedmiotem szeroko zakrojonych badań. Zastosowanie czystego glicerolu jako głównego źródła węgla było badane przez Foryś i wsp. Autorzy w wyniku przeprowadzonych badań uzyskali 59,0 g dm - 3 kwasu cytrynowego produkowanego z wydajnością 0,39 g g -1 [74]. W badaniach wykorzystujących glicerol jako źródło węgla w hodowlach Aspergillus niger, był on stosowany głównie w kombinacji z innymi substratami. Schneider i wsp. [218] W hodowlach prowadzonych w podłożach stałych z wykorzystaniem odpadów pochodzących z produkcji oleju tungowego jako głównego źródła węgla, zastosowali dodatek glicerolu w zakresie od 0 do 40%. Autorzy najwyższą wydajność (350,0 g kg -1 ) otrzymali po 7 dniach hodowli przy 20% dodatku glicerolu [218]. Bauwelers i Grosenker [31] w hodowlach powierzchniowych z zastosowaniem melasy jako głównego źródła węgla z 30% dodatkiem glicerolu odpadowego, poddanego wcześniej działaniu CaO w stężeniu 3,0 g kg -1, otrzymali 95% wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego. Ci sami autorzy w hodowlach wgłębnych z użyciem podłoży zawierających 70% mąki z manioku, 20% maki kukurydzianej oraz 10% glicerolu odpadowego osiągnęli wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego na poziomie 88%. Natomiast w podłożach zawierających 60% mąki z manioku, 20% maki kukurydzianej oraz 20% glicerolu odpadowego wydajność bioprocesu była nieco niższa i wynosiła 85% (tabela 8) [31]. Tabela 8. Przykłady wykorzystania glicerolu do biosyntezy kwasu cytrynowego przez szczepy Aspergillus niger Substrat Szczep Metoda hodowli Wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego Źródło glicerol bezwodny melasa trzcinowa (70%) + glicerol odpadowy (30%) mąka z manioku (70%) + mąka kukurydziana (20%) + glicerol odpadowy (10%) mąka z manioku (60%) + mąka kukurydziana (20%) + glicerol odpadowy (20%) glukoza (80%) + glicerol odpadowy (20%) Aspergillus niger W78B Aspergillus niger SF 59,0 g dm -3 [74] SLF 95% SF 88% [31] SF 85% SF 90% W literaturze przedmiotu istnieje niewiele doniesień naukowych dotyczących wykorzystania glicerolu bezwodnego lub odpadowego, jako głównego źródła węgla do 47

48 biosyntezy kwasu cytrynowego, przez głównych producentów jakimi są szczepy Aspergillus niger. Brak zainteresowania wynika prawdopodobnie z przekonania, że glicerol wpływa na spowolnienie szybkości wzrostu grzybów strzępkowych oraz nie sprzyja wytwarzaniu kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger. Z drugiej strony podczas metabolizmu glicerolu powstają podwójne ilości redukujących ekwiwalentów w porównaniu z metabolizmem glukozy, co oznacza że glicerol dostarcza więcej energii do dalszych przemian. Istnieją więc realne przesłanki do rozwoju badań nad biokonwersją glicerolu przez Aspergillus niger, czemu dodatkowo sprzyja problem zagospodarowania fazy glicerynowej pochodzącej z produkcji biodiesla oraz wzrostu zapotrzebowania na produkty użyteczne przemysłowo, jak kwas cytrynowy, kwas dokozaheksaenowy, kwas propionowy, kwas mlekowy czy dihydroksyaceton. 48

49 2. Cel pracy Celem podjętych badań była maksymalizacja biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach zawierających glicerol poprzez zastosowanie okresowych i zasilanych okresowych hodowli wgłębnych Aspergillus niger. Realizacja celu wymagała: doboru szczepu Aspergillus niger charakteryzującego się dużą szybkością i wysoką efektywnością biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych w podłożach z glicerolem jako źródłem węgla, optymalizacji składu podłoża hodowlanego do biosyntezy kwasu cytrynowego, badania wpływu początkowego stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych, badania wpływu dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego z glicerolem na poprawę szybkości i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych, badania początkowego stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym oraz momentu i sposobu zasilania podłoża glicerolem na poprawę szybkości i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych, porównania efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger w podłożach z glicerolem o różnym stopniu czystości i z sacharozą. Etapy badań prowadzonych w ramach tej pracy przedstawiono na rysunku 2. 49

50 ETAP I Dobór szczepu Aspergillus niger Hodowle wgłębne w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem, z użyciem glicerolu bezwodnego i odpadowego ETAP II Optymalizacja składu podłoża hodowlanego do biosyntezy kwasu cytrynowego Hodowle wgłębne w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem z użyciem glicerolu bezwodnego Hodowle wgłębne w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem, z użyciem glicerolu odpadowego ETAP III Wpływ początkowego stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych ETAP IV Wpływ dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego z glicerolem na poprawę szybkości i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych ETAP V Wpływ początkowego stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym oraz momentu zasilania podłoża glicerolem na poprawę szybkości i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych ETAP VI Porównanie i ocena efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger w podłożach z glicerolem o różnym stopniu czystości i z sacharozą Rysunek 2. Schemat doświadczeń dotyczących biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger metodą hodowli wgłębnej zużyciem glicerolu 50

51 Część doświadczalna 3. Materiały i metody Materiał biologiczny W badaniach wstępnych stosowano 19 kultur szczepu Aspergillus niger pochodzących z Kolekcji Czystych Kultur Katedry Biotechnologii i Analizy Żywności Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu. Charakterystykę stosowanych w badaniach szczepów Aspergillus niger przedstawiono w tabeli 9. Czyste kultury Aspergillus niger przechowywano na skosach ziemniaczanych w temperaturze 4 5 C i co 4 miesiące pasażowano szczepy na świeże podłoże. Podłoża hodowlane Do sporządzania podłoży hodowlanych jako źródło węgla stosowano glicerol bezwodny cz.d.a. (Firma Chempur Piekary Śląskie) o czystości 99,5%, glicerol farmaceutyczny II gatunku uzyskiwaną w wyniku rafinacji glicerolu odpadowego (Wratislavia Biodiesel S.A.) o czystości 98,5%, glicerol odpadowy pochodzącą z produkcji biodiesla (Wratislavia Biodiesel S.A.) o czystości 88,3%, oraz sacharozę w postaci cukru białego Słodka łyżeczka pochodzącego z Cukrowni ROPCZYCE S.A. Charakterystykę organoleptyczną i fizykochemiczną stosowanych substratów przedstawiono w tabeli 10 i 11. Ponadto do sporządzania podłoży hodowlanych stosowano: wodę wodociągową, z miejskiej sieci wodociągowej, NH4NO3 (Firma Chempur Piekary Śląskie), KH2PO4 (Firma Chempur Piekary Śląskie), MgSO4 7H2O (Firma Chempur Piekary Śląskie). 51

52 Podłoże do selekcji szczepu Aspergillus niger Podłoże hodowlane stosowane w badaniach przesiewowych zawierało (w g dm -3 ): glicerol bezwodny lub odpadowy 100,0; NH4NO3 2,0; KH2PO4 0,2; MgSO4 7H2O 0,2 oraz wodę wodociągową. Kwasowość czynną (ph) podłoża regulowano dodając wodny roztwór 5M HCl i ustalono na poziomie 3,0. Tabela 9. Charakterystyka szczepów Aspergillus niger użytych w badaniach Lp. Nazwa szczepu Właściwości 1. Aspergillus niger B I 2. Aspergillus niger B Aspergillus niger C 12 Charakteryzujący się zarodnikami o ciemnobrązowym zabarwieniu Charakteryzujący się czarnymi zarodnikami, uzyskany na drodze mutagenizacji, stosowany w produkcji kwasu cytrynowego z czystych surowców węglowodanowych [128] Charakteryzujący się czarnymi zarodnikami i wysoką stabilnością cech technologicznych w produkcji kwasu cytrynowego w skali przemysłowej, wywodzący się ze szczepu Aspergillus niger B 64 5 [128, 182] 4. Aspergillus niger C WL Charakteryzujący się czarnymi zarodnikami 5. Aspergillus niger KMS Charakteryzujący się zarodnikami o ciemnobrązowym zabarwieniu 6. Aspergillus niger LAN I Charakteryzujący się zarodnikami o czarnym zabarwieniu 7. Aspergillus niger LBK Charakteryzujący się zarodnikami o beżowym zabarwieniu 8. Aspergillus niger LC 4 Charakteryzujący się zarodnikami o ciemnobrązowym zabarwieniu 9. Aspergillus niger LC 10 Charakteryzujący się zarodnikami o czarnym zabarwieniu 10. Aspergillus niger LC 12 Charakteryzujący się zarodnikami o czarnym zabarwieniu 11. Aspergillus niger LI Charakteryzujący się zarodnikami o beżowym zabarwieniu 12. Aspergillus niger LP Charakteryzujący się zarodnikami o czarnym zabarwieniu 13. Aspergillus niger LS Charakteryzujący się zarodnikami o czarnym zabarwieniu [38] 14. Aspergillus niger LX 15. Aspergillus niger NC 12 Charakteryzujący się zarodnikami o ciemnobrązowym zabarwieniu Charakteryzujący się czarnymi zarodnikami, wywodzący się ze szczepu Aspergillus niger B Aspergillus niger PD 66 Charakteryzujący się zarodnikami o czarnym zabarwieniu 17. Aspergillus niger S 18. Aspergillus niger W 78 B 19. Aspergillus niger W 78 C Charakteryzujący się czarnymi zarodnikami, wywodzący się ze szczepu Aspergillus niger B 64 5, stosowany w biosyntezie kwasu cytrynowego z surowców skrobiowych Charakteryzujący się jasnobrązowymi zarodnikami, charakteryzujący się wysoką produktywnością i homofermentatywności we wgłębnych hodowlach okresowych na podłożach zawierających melasę jako źródło węgla [185] Charakteryzujący się czarnymi zarodnikami, uzyskany w drodze mutagenizacji i selekcji [185] 52

53 Tabela 10. Cechy organoleptyczne i skład chemiczny glicerolu o różnym stopniu czystości stosowanego jako źródło węgla do sporządzania podłoży hodowlanych Lp. Właściwości Jednostka Glicerol bezwodny Opis cechy, zawartość Glicerol odpadowy 1. Forma - ciecz gęsta ciecz gęsta 2. Barwa - bezbarwny żółta 3. Zapach - swoisty charakterystyczny 4. Klarowność roztworu - klarowny klarowny 5. Zawartość gliceryny % (m/m) 99, ,3 6. Zawartość popiołu % (m/m) 0,0001 3,92 7. Zawartość metanolu % (m/m) - 0,04 8. Zawartość wody % (m/m) 0,5 6,67 9. Zawartość pozostałych związków organicznych (MONG ) % (m/m) 0,001 1, ph - 5,0 7,4 MONG Matter Organic Non Glycerol Tabela 11. Cechy organoleptyczne i fizykochemiczne cukru białego stosowanego do sporządzania podłoży hodowlanych Lp. Cecha Jednostka Opis cechy, zawartość 1. Barwa - biała 2. Wygląd i konsystencja - kryształy, sypkie, bez zlepów i grudek 3. Zapach - bez obcego zapachu 4. Smak - słodki, charakterystyczny dla cukru 5. Klarowność roztworu - śladowa opalizacja 6. Zawartość sacharozy w przeliczeniu na suchą masę % (m/m) 99,87 7. Zawartość wilgoci % (m/m) 0, Zawartość substancji redukujących % (m/m) 0, Zabarwienie roztworu cukru jednostki ICUMSA 38,4 10. Zawartość popiołu % (m/m) 0, Zanieczyszczenia ferromagnetyczne mg kg -1 nie obecne 12. Arsen mg kg -1 nie wykryto 13. Ołów mg kg -1 0, Miedź mg kg -1 0, Kadm mg kg -1 nie wykryto 16. Rtęć mg kg -1 0,001 53

54 Podłoże do optymalizacji składu podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym Do doboru optymalnego składu podłoża hodowlanego do biosyntezy kwasu cytrynowego z użyciem glicerolu bezwodnego jako głównego źródła węgla, zastosowano plan rotatabilny II stopnia. W badaniach optymalizowano stężenie: glicerolu bezwodnego, NH4NO3, KH2PO4, MgSO4 7H2O. Zgodnie z utworzonym planem eksperymentu otrzymano warianty składu podłoży hodowlanych do doboru stężenia głównego źródła węgla i makroelementów, które przedstawiono w tabeli 12. Tabela 12. Skład podłoży hodowlanych stosowanych do optymalizacji stężenia glicerolu bezwodnego i makroelementów Wariant hodowli w planie rotatabilnym II stopnia Glicerol bezwodny NH4NO3 KH2PO4 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] [g dm -3 ] [g dm -3 ] [g dm -3 ] 1 100,00 1,50 0,15 0, ,00 1,50 0,15 0, ,00 1,50 0,25 0, ,00 1,50 0,25 0, ,00 2,50 0,15 0, ,00 2,50 0,15 0, ,00 2,50 0,25 0, ,00 2,50 0,25 0, ,00 1,50 0,15 0, ,00 1,50 0,15 0, ,00 1,50 0,25 0, ,00 1,50 0,25 0, ,00 2,50 0,15 0, ,00 2,50 0,15 0, ,00 2,50 0,25 0, ,00 2,50 0,25 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 1,00 0,20 0, ,00 3,00 0,20 0, ,00 2,00 0,10 0, ,00 2,00 0,30 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0,20 54

55 Podłoże do optymalizacji składu podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym Do doboru optymalnego składu podłoża hodowlanego do biosyntezy kwasu cytrynowego z użyciem glicerolu odpadowego jako głównego źródła węgla, zastosowano plan rotatabilny II stopnia. W badaniach optymalizowano stężenie glicerolu odpadowego oraz NH4NO3. Stężenie KH2PO4 i MgSO4 7 H2O dla każdego wariantu zostało ustalone na poziomie 0,2 g dm -3. Zgodnie z utworzonym planem eksperymentu otrzymano warianty składu podłoży hodowlanych do doboru stężenia głównego źródła węgla oraz azotanu amonu, które przedstawiono w tabeli 13. Tabela 13. Skład podłoży hodowlanych stosowanych do optymalizacji stężenia glicerolu odpadowego i azotanu amonu Wariant hodowli w planie rotatabilnym II stopnia Glicerol bezwodny NH4NO3 KH2PO4 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] [g dm -3 ] [g dm -3 ] [g dm -3 ] 1 80,00 2,00 0,20 0, ,00 3,00 0,20 0, ,00 2,00 0,20 0, ,00 3,00 0,20 0, ,71 2,50 0,20 0, ,28 2,50 0,20 0, ,00 1,79 0,20 0, ,00 3,20 0,20 0, ,00 2,50 0,20 0, ,00 2,50 0,20 0, ,00 2,50 0,20 0, ,00 2,50 0,20 0, ,00 2,50 0,20 0,20 Środek przeciwpianowy Jako środek przeciwpianowy w hodowlach prowadzonych w bioreaktorze stosowano rafinowany olej rzepakowy z pierwszego tłoczenia Kujawski pochodzący z Zakładów Tłusczowych Kruszwica S.A. 55

56 Aparatura badawcza Inkubator z wytrząsaniem Część eksperymentów obejmujących badanie okresowych hodowli wgłębnych prowadzono w kolbach stożkowych typu Erlenmeyer o pojemności 500 cm 3, do których wprowadzano 100 cm 3 podłoża hodowlanego, umieszczonych w inkubatorze z wytrząsaniem typ GFL Prędkość wstrząsania wynosiła 200 obr min -1, a temperatura hodowli 30ºC. Bioreaktor laboratoryjny Badania z zastosowaniem okresowych hodowli wgłębnych oraz zasilanych okresowych hodowli wgłębnych prowadzono w bioreaktorze laboratoryjnym Biomer 10 o pojemności całkowitej 7,0 dm 3 i roboczej 5,0 dm 3. Schemat bioreaktora przedstawiono na rysunku 3. Bioreaktor był wyposażony w urządzenia do pomiaru i rejestracji zawartości tlenu (VO2) i ditlenku węgla (VCO2) w gazach odlotowych. Zawartość tlenu i ditlenku węgla w gazach odlotowych mierzono w sposób ciągły, za pomocą paramagnetycznych analizatorów SERVOMEX O2 ANALYSER 1400 (SERVOMEX LTD East Sussex Anglia) i SERVOMEX CO2 ANALYSER 1400 (SERVOMEX LTD East Sussex Anglia). W celu doprowadzania środka przeciwpianowego do podłoża hodowlanego w bioreaktorze stosowano pompę perystaltyczną Zalimp 315 (ZALIMP Warszawa). Przygotowanie inokulum Jako inokulum stosowano zawiesinę konidiów Aspergillus niger w wodzie demineralizowanej. W celu przygotowania inokulum, do szklanych kolb płaskodennych o pojemności 750 cm 3 wprowadzano 100 cm 3 wody demineralizowanej oraz 0,5 cm 3 Tween 80. Podłoża sterylizowano w autoklawie w temperaturze 121ºC przez 30 minut. Po sterylizacji i ochłodzeniu do kolby wprowadzano konidia Aspergillus niger znajdujące się na jednym skosie ziemniaczanym. Następnie oznaczano ilość konidiów w 1 cm 3 metodą bezpośredniego liczenia w komorze Thoma. Tak przygotowane zawiesiny konidiów pozostawiano w temperaturze pokojowej na około 6 godzin, co pewien czas wstrząsając. W tym czasie następowało pęcznienie konidiów, którymi szczepiono podłoża hodowlane. 56

57 BIOMER 10 sprzęgło skraplacz w ody w gazach pofermentacyjnych uchw yt montażow y P T ph Eh O 2 gniazda czujników pomiarow ych regulator poziomu piany w ał mieszadła króciec przelew ow y o C termoregulator rotametr łamacz w irów V rpm regulator i w skaźnik szybkości obrotow ej mieszadło sygnalizator w yłączeń energii elektrycznej dysza napow ietrzajaca zespół w łączników chłodnica zaw ór do pobierania prób WE WY manometry Rysunek 3. Bioreaktor laboratoryjny BIOMER 10 Źródło: [182] Rys. 1. Bioreaktor laboratoryjny BIOMER 10. Przygotowanie podłoży hodowlanych i aparatury do prowadzenia hodowli Przygotowanie podłoża hodowlanego polegało na rozpuszczeniu w wodzie wodociągowej odważonej ilości glicerolu bezwodnego lub glicerolu odpadowego, sacharozy oraz soli mineralnych NH4NO3, KH2PO4, MgSO4 7H2O. Kwasowość czynną (ph) podłoża ustalano na poziomie około 3,0 za pomocą 5M wodnego roztworu HCl. W badaniach prowadzonych w fermentorze, do uprzednio wymytego bioreaktora laboratoryjnego wprowadzano przygotowane podłoże hodowlane, a następnie szczelnie 57

58 zamykano wszystkie otwory i króćce. Na króćcach doprowadzających powietrze i odprowadzających gazy pofermentacyjne montowano filtry membranowe MidiSart o średnicy porów 0,2 μm (SARTORIUS Niemcy) służące do wyjaławiania powietrza. Po sprawdzeniu szczelności, bioreaktor wstawiano do autoklawu i sterylizowano w temperaturze 121ºC przez 30 minut. Razem z bioreaktorem sterylizowano środek przeciwpianowy, podłoże służące do zasilania hodowli okresowych oraz węże pomp dozujących środek przeciwpianowy do fermentora. Po zakończeniu sterylizacji, bioreaktor montowano w obudowie, uruchamiano mieszanie, napowietrzanie i chłodzenie. Po obniżeniu temperatury podłoża hodowlanego do około 35ºC w bioreaktorze montowano elektrodę temperaturową oraz tlenową, uprzednio wyjałowione metodą chemiczną przy użyciu 70% (v/v) wodnego roztworu alkoholu etylowego. Następnie uruchamiano i kalibrowano aparaturę pomiarowo-regulacyjną służącą do pomiarów i kontroli przebiegu procesu hodowli. Sposoby prowadzenia hodowli Sposób prowadzenia okresowych hodowli wgłębnych w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem Okresowe hodowle wgłębne prowadzono w kolbach stożkowych o pojemności 500 cm 3, do których wprowadzano po 100 cm 3 podłoża hodowlanego. Każdy wariant hodowli prowadzono w trzech powtórzeniach. Przed rozpoczęciem hodowli do schłodzonego do temperatury pokojowej sterylnego podłoża hodowlanego zawartego w kolbach, dodawano odpowiednią ilość uprzednio przygotowanego inokulum tak, aby stężenie konidiów (I0) wynosiło 10 5 cm -3. Następnie kolby umieszczano w inkubatorze z wytrząsaniem, którego szybkość obrotowa wynosiła 200 obr min -1. Hodowle prowadzono przez około 15 dni w temperaturze 30ºC. Wskaźnikiem końca hodowli był brak przyrostu kwasowości ogólnej. Sposób prowadzenia okresowych hodowli wgłębnych w bioreaktorze Do bioreaktora przygotowanego do prowadzenia okresowej hodowli wgłębnej (BC), zawierającego 5 dm 3 sterylnego podłoża hodowlanego (V0) wprowadzano obliczoną i odmierzoną objętość inokulum (VI), tak aby stężenie konidiów (I0) wynosiło 10 5 cm -3 (rysunek 4). Następnie pobierano próbę zerową i ten moment traktowano jako początek hodowli. 58

59 Rysunek 4. Schemat okresowej hodowli wgłębnej (Batch Culture BC) Źródło: opracowanie własne na postawie [182] Hodowle prowadzono w temperaturze 30ºC przy ciągłym mieszaniu i napowietrzaniu. W celu zapewnienia odpowiedniego poziomu stężenia tlenu rozpuszczonego w podłożu hodowlanym wraz z przyrostem biomasy grzybni, w kolejnych dniach trwania bioprocesu stopniowo podnoszono szybkość obrotową wału mieszadła (Vrpm) i zwiększano szybkość napowietrzania (Tabela 14). Tabela 14. Szybkość obrotowa wału mieszadła i szybkość napowietrzania w okresowych hodowlach wgłębnych Czas hodowli (t) Szybkość obrotowa (Vrpm) Szybkość dopływu powietrza (VG) Szybkość napowietrzania (A) [h] [obr min -1 ] [g dm -3 ] [dm 3 dm -3 min -1 ] od 0 do ,13 od 25 do ,18 od 49 do ,25 od ,30 W czasie prowadzenia hodowli w sposób ciągły mierzono: szybkość obrotową wału mieszadła (Vrpm), szybkość dopływu powietrza (VG), temperaturę, ph, stężenie tlenu rozpuszczonego (po2) w podłożu hodowlanym, stężenie tlenu (VO2) i ditlenku węgla (VCO2) w gazach pofermentacyjnych oraz ilość wdozowanego środka przeciwpianowego. Znaczny 59

60 spadek aktywności oddechowej grzybni i brak przyrostu kwasowości wskazywały koniec hodowli. Sposób prowadzenia zasilanych okresowych hodowli wgłębnych w bioreaktorze Zasilane okresowe hodowle wgłębne (FBC) stosowano w celu zbadania wpływu jednorazowego zasilenia podłoża hodowlanego glicerolem bezwodnym na szybkość wzrostu biomasy, szybkość zużywania substratu oraz szybkość, wydajność i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego. Do bioreaktora przygotowywanego do prowadzenia hodowli zawierającego 5 dm 3 sterylnego podłoża hodowlanego wprowadzano obliczoną i odmierzoną objętość inokulum (VI), tak aby stężenie konidiów w podłożu (I0) wynosiło 10 5 cm -3. Następnie pobierano próbę zerową i ten moment traktowano jako początek zasilanej okresowej hodowli wgłębnej (rysunek 5). Rysunek 5. Schemat zasilanej okresowej hodowli wgłębnej (Feed Batch Culture FBC) Źródło: opracowanie własne na postawie [182] Hodowle zasilano jednorazowo między 60 a 120 godziną hodowli, gdy następowało obniżenie stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym znajdującym się w bioreaktorze. Pozostałe warunki przebiegu i kontroli tych hodowli były takie same, jak w okresowych hodowlach wgłębnych omówionych w punkcie

61 Kontrola przebiegu hodowli Pobieranie prób z hodowli prowadzonych w kolbach i zakres ich analiz Z okresowych hodowli wgłębnych (BC) prowadzonych w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem próby zerowe pobierano po wprowadzeniu inokulum, a następnie każdego dnia po upływie 5 doby hodowli. Próby pobierano pipetą automatyczną z zachowaniem wszelkich zasad sterylności. W celu zapobieżenia zmianom warunków hodowli w trakcie pobierania prób z pracującego inkubatora wyciągano po jednej kolbie na około 30 sekund. Objętość próbek pobieranych na początku i w czasie hodowli wynosiła 2 cm 3. W próbie zerowej oznaczano ph, stężenie glicerolu bezwodnego (SGP) lub glicerolu odpadowego (SGC), stężenie sacharozy (SSC) i zawartość ekstraktu (E0). W próbach pobieranych w czasie trwania hodowli oznaczano: kwasowość ogólną (K0) oraz określano makroskopową i mikroskopową charakterystykę morfologiczną grzybni. W próbach pobranych po zakończeniu hodowli oznaczano ph, kwasowość ogólną (K0), stężenie kwasu cytrynowego (P), stężenie glicerolu bezwodnego (SGP) lub glicerolu odpadowego (SGC), stężenie sacharozy (SSC), stężenie biomasy (X), zawartość ekstraktu (E) oraz określano charakterystykę morfologiczną grzybni. Pobieranie prób z hodowli prowadzonych w bioreaktorach i zakres ich analiz Z okresowych hodowli wgłębnych (BC) i zasilanych okresowych hodowli wgłębnych (FBC) prowadzonych w bioreaktorach laboratoryjnych próby zerowe pobierano na początku hodowli, tj. zaraz po wprowadzeniu inokulum do podłoża znajdującego się w bioreaktorze. Próby podłoża hodowlanego, w celu kontroli i określenia charakterystyki przebiegu bioprocesu pobierano co 24 godziny oraz po zakończeniu hodowli. Objętość pobieranych prób wynosiła około 50 cm 3. W próbach zerowych oznaczano ph, stężenie konidiów pleśni (I0), stężenie glicerolu bezwodnego (SGP) lub glicerolu odpadowego (SGC), stężenie sacharozy (SSC) i zawartość ekstraktu (E0) na początku hodowli. W próbach pobieranych w czasie trwania hodowli i zaraz po jej zakończeniu oznaczano: kwasowość ogólną (K0), stężenie kwasu cytrynowego (P), stężenie glicerolu bezwodnego (SGP) lub glicerolu odpadowego (SGC), stężenie sacharozy (SSC), stężenie biomasy (X), ph, zawartość ekstraktu (E) oraz prowadzono obserwacje mikroskopowe i makroskopowe grzybni. 61

62 Metody analityczne Oznaczanie stężenia biomasy Stężenie suchej substancji biomasy grzybni (X) oznaczano metodą suszarkowograwimetryczną. Z pobranej próby odmierzano cylindrem miarowym 25 cm 3 podłoża hodowlanego, a następnie odfiltrowywano grzybnię na drodze filtracji próżniowej na uprzednio wysuszonym i zważonym krążku bibuły. Oddzieloną grzybnię w czasie filtracji przemywano 50 cm 3 wody destylowanej, a następnie suszono do uzyskania stałej masy w wagosuszarce Sartorius 30 MA w temperaturze 105ºC. Oznaczanie stężenia konidiów pleśni Aspergillus niger Do oznaczania stężenia konidiów pleśni Aspergillus niger w inokulum i w podłożach hodowlanych stosowano metodę bezpośredniego liczenia w komorze Thoma. Komorę Thoma umieszczano na stoliku mikroskopu laboratoryjnego Studar M1 PZO Warszawa. Obserwacje preparatów i liczenie ilości konidiów prowadzono w 64 losowo wybranych prostopadłościanach komory Thoma przy powiększeniu mikroskopu 40x10x1,25. Stężenie konidiów w inokulum (NI) lub w podłożu hodowlanym po inokulacji obliczano na podstawie równania: 6 N a 4 10 [szt cm -3 ] w którym: a średnia ilość konidiów w jednym prostopadłościanie komory Thoma, szt., stała komory. Oznaczanie stężenia cukrów redukujących Stężenie cukrów redukujących w podłożach hodowlanych, po uprzednim odwirowaniu biomasy, oznaczano metodą spektrofotometryczną z wykorzystaniem odczynnika DNS (kwas 3,5 dinitrosalicylowy). W celu pomiaru absorbancji stosowano spektrofotometr Marcel Media. Absorbancję próby analizowano przy długości fali λ = 540 nm wobec próby kontrolnej. 62

63 Identyfikacja i oznaczanie zawartości kwasów organicznych Identyfikację i oznaczanie zawartości kwasów organicznych w podłożu hodowlanym, po uprzednim odwirowaniu biomasy, oznaczano chromatograficznie z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) na chromatografie Perkin Elmer, wyposażonym w detektor UV/VIS CE Detector przy długości fali 210 nm. W czasie analiz stosowano kolumnę Knauer Eurokat H65, utrzymywaną w temperaturze 60ºC w termostacie Cobrabid Type KB Prędkość przepływu próby ustalono na poziomie 0,6 cm 3 min -1, z zastosowaniem wody do HPLC (Firma Chempur Piekary Śląskie) jako eluentu. Czas trwania analizy wynosił 30 minut. Każdą próbę filtrowano przez nylonowy filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 μm. Objętość nastrzykiwanej próby wynosiła 20 μl. Oznaczanie stężenia glicerolu Stężenie glicerolu w podłożu hodowlanym, po uprzednim odwirowaniu biomasy, oznaczano z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC na chromatografie Perkin Elmer, wyposażonym w detektor RI Perkin Elmer Series 200. W czasie analiz stosowano kolumnę Knauer Eurokat H65, utrzymywaną w temperaturze 60ºC w termostacie Cobrabid Type KB Prędkość przepływu próby ustalono na poziomie 0,6 cm 3 min -1, z zastosowaniem wody do HPLC (Firma Chempur Piekary Śląskie) jako eluentu. Czas trwania analizy wynosił 30 minut. Każdą próbę filtrowano przez nylonowy filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 μm. Objętość nastrzykiwanej próby wynosiła 20 μl. Pomiar stężenia tlenu rozpuszczonego Stężenie tlenu rozpuszczonego w podłożu hodowlanym mierzono w procentach stanu nasycenia, w sposób ciągły za pomocą membranowego czujnika tlenowego O2 Sensor T Type, Mettler Toledo USA, podłączonego do bioreaktora Biomer 10. Pomiar stężenia tlenu w gazach odlotowych Zawartość tlenu w gazach odlotowych mierzono w sposób ciągły w procentach objętościowych, za pomocą paramagnetycznego analizatora SERVOMEX O2 ANALYSER 1400 (SERVOMEX LTD East Sussex Anglia). 63

64 Pomiar stężenia ditlenku węgla w gazach odlotowych Zawartość ditlenku węgla w gazach odlotowych mierzono w sposób ciągły w procentach objętościowych za pomocą paramagnetycznego analizatora SERVOMEX CO2 ANALYSER 1400 (SERVOMEX LTD East Sussex Anglia). Oznaczanie zawartości ekstraktu Zawartość ekstraktu (E) oznaczano metodą refraktometryczną przy użyciu refraktometru firmy Atago Digital refractometer DBX 85. Oznaczanie kwasowości ogólnej Kwasowość ogólną (K0), w cm 3 0,1M NaOH/2 cm 3 podłoża hodowlanego, oznaczano metodą miareczkową wobec fenoloftaleiny. Obserwacje mikroskopowe Obserwacje mikroskopowe preparatów przyżyciowych grzybni Aspergillus niger w kropli spłaszczonej prowadzono za pomocą mikroskopu laboratoryjnego Studar M1 PZO Warszawa, przy powiększeniu mikroskopu 500x. Zdjęcia obrazów mikroskopowych wykonywano dla każdej pobranej próby hodowli przy powiększeniu mikroskopu 125x i 500x. Obliczanie parametrów kinetycznych hodowli Objętość podłoża hodowlanego Objętość podłoża hodowlanego na początku hodowli (VP) stanowiła suma objętości podłoża wprowadzonego do bioreaktora przed rozpoczęciem hodowli (V0) i objętości inokulum (VI), czyli: V P V V [dm 3 ] O I Stężenie kwasu cytrynowego Stężenie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym (P), w przeliczeniu na jednowodny kwas cytrynowy, obliczano z kwasowości ogólnej (K0) z równania: 64

65 K ,0070 P K0 3,5 [g dm -3 ] 2 w którym: K0 kwasowość ogólna, cm 3 0,1 molowy NaOH/2 cm 3 próby, 1000 liczba cm 3 w jednym litrze, cm 3 dm-3, 0,0070 ilość gramów jednowodnego kwasu cytrynowego neutralizowana przez 1 cm 3 0,1M NaOH, g cm -3, 2 objętość miareczkowanej próby, cm 3. Szybkość napowietrzania Szybkość napowietrzania podłoży hodowlanych (A), wyrażoną dm 3 powietrza dostarczanego do napowietrzania jednego dm 3 podłoża hodowlanego znajdującego się w bioreaktorze w ciągu jednej minuty, (vvm), obliczano z równania: VG A [dm 3 dm-3 min-1 ] V w którym: VG szybkość dopływu powietrza do podłoża hodowlanego znajdującego się w bioreaktorze, dm 3 min-1, V objętość podłoża hodowlanego znajdującego się w bioreaktorze, dm 3. Szybkość objętościowa wzrostu biomasy Objętościową szybkość wzrostu biomasy grzybni (RX) obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: dx X [g dm -3 h-1 ] dt R BC w którym: dx przyrost stężenia biomasy w podłożu hodowlanym w czasie dt, g dm -3, dt czas hodowli, h. w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: 65

66 dx X [g dm -3 h-1 ] dt R FBC Szybkość właściwa wzrostu biomasy Szybkość właściwą wzrostu biomasy (μ) obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: R BC BC X dx [g g -1 h-1 ] X dt X w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: R FBC FBC X dx [g g -1 h-1 ] X dt X Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego Szybkość objętościową biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (Rp) obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: dp P [g dm -3 h-1 ] dt R BC w którym: dp przyrost stężenia jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym w czasie dt, g dm -3. w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: dp P [g dm -3 h-1 ] dt R FBC Szybkość właściwa biosyntezy kwasu cytrynowego Szybkość właściwą biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (QP) obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: 66

67 Q BC P BC RP dp [g g -1 h-1 ] X dt X w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: Q FBC P FBC RP dp [g g -1 h-1 ] X dt X Szybkość objętościowa zużywania substratu Szybkość objętościową zużywania substratu (RS) obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: ds S [g dm -3 h-1 ] dt R BC w którym: ds ubytek stężenia substratu w podłożu hodowlanym w czasie dt, g dm -3 w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: ds S [g dm -3 h-1 ] dt R FBC Szybkość właściwa zużywania substratu Szybkość właściwą zużywania substratu (QS) obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: Q BC S BC RS ds [g g -1 h-1 ] X dt X w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: Q FBC S FBC RS ds [g g -1 h-1 ] X dt X 67

68 Wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego substratu Wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (YP/S) w stosunku do wprowadzonego substratu obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: BC PK YP / Sw 100 [%] S 0 w którym: ΔP masa wyprodukowanego jednowodnego kwasu cytrynowego, g, ΔS masa substratu wprowadzonego do hodowli, g, S0 stężenie substratu w podłożu hodowlanym, g dm -3. w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: FBC PK Y P / Sz 100 [%] S S 0 F Wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do zużytego substratu Wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego (YP/S) w stosunku do zużytego substratu obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: BC PK YP / Sz 100 [%] S S 0 w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: FBC PK Y 100 / S S ) S P Sz [%] ( 0 F w którym: SF stężenie glicerolu w podłożu zasilającym, g dm

69 Wydajność wzrostu biomasy w stosunku do wprowadzonego substratu Wydajność wzrostu biomasy w stosunku do wprowadzonego substratu (YX/S) obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: X X / 100 [%] S S Y BC Sz w którym: ΔX masa biomasy grzybni uzyskanej w czasie hodowli, g, 0 w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: FBC X Y X / Sw 100 [%] S S 0 F Wydajność wzrostu biomasy w stosunku do zużytego substratu Wydajność wzrostu biomasy w stosunku do zużytego substratu (YX/S) obliczano z równań: w okresowych hodowlach wgłębnych: X X / 100 [%] S S Y BC Sz 0 w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych: FBC X Y 100 / S S ) S X Sz [%] ( 0 F Współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego Współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef) obliczano z następującego równania (Leśniak, 1972): K ef = R P Y P/Sw [g dm -3 h -1 %] w którym: RP szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego, g dm -3 h -1 69

70 YP/Sw wydajność kwasu cytrynowego w odniesieniu do wprowadzonego substratu, % Metody statystyczne W planowaniu eksperymentu wykorzystano kompozycyjny plan rotatabilny II stopnia [59, 92, 102, 168]. Do utworzenia planu eksperymentu, analizy statystycznej oraz obliczenia równań regresji zastosowano program STATISTICA 12 Statsoft Inc. Optymalizacja składu podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym W pierwszej kolejności wytypowano następujące cztery zmienne niezależne (wejściowe) w celu określenia ich wpływu na przebieg biosyntezy kwasu cytrynowego: x1 stężenie gliceryny bezwodnej cz.d.a., g dm -3, x2 stężenie azotanu amonu, g dm -3, x3 stężenie diwodorofosforanu potasu, g dm -3, x4 stężenie siedmiowodnego siarczanu magnezu, g dm -3, Wszystkie pozostałe zmienne zostały ustalone: temperatura 30 C, szybkość mieszania 200 obr min -1, kwasowość czynna ph = 3,0. Z szerokiego zakresu parametrów kinetycznych opisujących biosyntezę kwasu cytrynowego jako zmienne zależne (wyjściowe) wybrano y1 końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu (PK), g dm -3, y2 szybkość objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP), g/dm -3 h -1, y3 współczynnik efektywności biosyntezy (Kef), % g dm -3 h -1. Kryterium optymalizacji była maksymalizacja końcowego stężenia produktu (y1), szybkości biosyntezy kwasu cytrynowego (y2) oraz uzyskanie najwyższej wartości współczynnika efektywności (y3). Zmienne opisujące biosyntezę kwasu cytrynowego podano na rysunku 6 przedstawiającym strukturę procesu w postaci czarnej skrzynki. Po ustaleniu liczby zmiennych, wyznaczono maksymalne (xi max ) i minimalne (xi min ) wartości zmiennych naturalnych (xi): x1 stężenie gliceryny bezwodnej: x1 max 250,0 g dm -3, x1 min 50,0 g dm -3, x2 stężenie azotanu amonu: x2 max 2,5 g dm -3, 70

71 x2 min 1,5 g dm -3, x3 stężenie diwodorofosforanu potasu: x3 max 0,25 g dm -3, x3 min 0,15 g dm -3, x4 stężenie siedmiowodnego siarczanu magnezu: x4 max 0,25 g dm -3, x4 min 0,15 g dm -3. Rysunek 6. Struktura biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger PD 66 metodą hodowli wgłębnych wstrząsanych. Źródło: opracowanie własne Wyznaczono naturalne wartości punktu centralnego (jądro planu) oraz krok zmiennej (δxi). Naturalne współrzędne punktu centralnego i krok zmiennej podano w tabelach 15 i 16. Spośród zmiennych wybranych do badań utworzono plan rotatabilny drugiego stopnia, dobierając jako jądro planu, całkowity plan czynnikowy typu 2 4, 8 punktów gwiezdnych (ramię gwiezdne α = ± 2,000) i 7 doświadczeń w punkcie centralnym. Wartość ramienia punktu gwiezdnego dla planu czynnikowego 2 4 obliczono ze wzoru: 4 α =

72 Liczba doświadczeń w punkcie centralnym wynosi 7, co wynika z wymagania, aby wariancja obliczanej wartości y była taka sama w punkcie centralnym planu, jak i punktach leżących na kuli o promieniu 1. Macierz eksperymentu w postaci zmiennych kodowanych przedstawiono w tabeli 17. Plan ten stanowił podstawę do realizacji doświadczeń. Doświadczenia wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach w kolejności losowej. Tabela 15. Środek planu oraz krok zmiennej. Zmienna naturalna, xi Środek planu x i 0 = x i max + x i min 2 Krok zmiennej x i = x i max x i min 2 x1 150,0 50,0 x2 2,0 0,5 x3 0,2 0,05 x4 0,2 0,05 Tabela 16. Dopuszczalny obszar eksperymentu, jądro i środek planu Zmienna naturalna, xi Jądro i centrum planu oraz obszar eksperymentu (zmienna kodowana, xi) ( 2,000) ( 1) (0) (+1) (+2,000) x1 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 x2 1,00 1,5 2,00 2,5 3,00 x3 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 x4 0,10 0,15 0,20 0,25 0,20 Po wykonaniu doświadczeń według zaprojektowanego planu eksperymentów przeprowadzono analizę statystyczną obejmującą ocenę efektów analizowanych parametrów, analizę wariancji ANOVA, określenie wartości optymalnych zmiennych wejściowych i ich wzajemnych interakcji. Otrzymano również modele matematyczne w formie funkcji kwadratowej opisujące zależności końcowego stężenia kwasu cytrynowego w podłożu (PK), szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) i współczynnika efektywności biosyntezy (Kef) w zależności od parametrów metody. W celu wyznaczenia wartości optymalnych zmiennych wejściowych ze względu na trzy wybrane kryteria końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu (PK), szybkość objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) i współczynnik efektywności biosyntezy (Kef) wykorzystano metodę funkcji użyteczności [92, 116]. Wartość każdego kryterium oceniono za pomocą bezwymiarowej funkcji liniowej o wartościach z przedziału [0,1]. Wartość 0 oznaczono jako wartość funkcji kryterium o najmniejszej użyteczności, a wartość 72

73 Środek planu Punkty gwiezdne, α Jądro planu 1 dla wartości funkcji kryterium o największej użyteczności. Wartości minimalne oznaczono jako 0,5. Po zdefiniowaniu funkcji użyteczności dla każdego kryterium zbudowano model użyteczności całkowitej jako średnią geometryczną funkcji użyteczności wybranych kryteriów opisujących proces. Następnie zbudowano model dla użyteczności całkowitej, wykorzystując metodę najmniejszych kwadratów jako metodę dopasowania powierzchni do wartości użyteczności. W celu wygenerowania wartości optymalnych wielkości wejściowych posłużono się metodą optimum w węzłach siatki. Tabela 17. Plan rotatabilny dla trzech zmiennych niezależnych kodowanych Zmienne kodowane Nr doświadczenia x1 x2 x3 x4 Glicerol bezwodny NH4NO3 KH2PO4 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] [g dm -3 ] [g dm -3 ] [g dm -3 ]

74 Optymalizacja składu podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym W pierwszym etapie wytypowano następujące dwie zmienne niezależne (wejściowe) w celu określenia ich wpływu na przebieg biosyntezy kwasu cytrynowego: x1 stężenie glicerolu odpadowego, g dm -3, x2 stężenie azotanu amonu, g dm -3. Wartości pozostałych zmiennych zostały ustalone na podstawie badań własnych: stężenie KH2PO4 0,2 g dm -3, MgSO4 7H2O 0,2 g dm -3, temperatura 30 C, szybkość mieszania 200 obr min -1, kwasowość czynna (ph) 3,0. Z szerokiego zakresu parametrów kinetycznych opisujących biosyntezę kwasu cytrynowego jako zmienne zależne (wyjściowe) wybrano: y1 końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu (PK), g dm -3, y2 szybkość objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP), g dm -3 h -1, y3 współczynnik efektywności biosyntezy (Kef), % g dm -3 h -1. Kryterium optymalizacji była maksymalizacja końcowego stężenia produktu (y1), szybkości biosyntezy kwasu cytrynowego (y2) oraz uzyskanie najwyższej wartości współczynnika efektywności (y3). Zmienne opisujące biosyntezę kwasu cytrynowego podano na rysunku 7 przedstawiającym strukturę procesu w postaci czarnej skrzynki. Po ustaleniu liczby zmiennych wyznaczono maksymalne (xi max ) i minimalne (xi min ) wartości zmiennych naturalnych (xi): x1 stężenie glicerolu odpadowego: x1 max 140,0 g dm -3, x1 min 60,0 g dm -3, x2 stężenie azotanu amonu: x2 max 3,0 g dm -3, x2 min 2,0 g dm

75 Rysunek 7. Struktura biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger PD 66 metodą hodowli wgłębnych wstrząsanych. Źródło: opracowanie własne Wyznaczono naturalne wartości punktu centralnego (jądro planu) oraz krok zmiennej (δxi). Naturalne współrzędne punktu centralnego i krok zmiennej podano w tabelach 18 i19. Tabela 18. Środek planu oraz krok zmiennej Zmienna naturalna, xi Środek planu x i 0 = x i max + x i min 2 Krok zmiennej x i = x i max x i min 2 x1 120,0 20,0 x2 2,5 0,5 Tabela 19. Dopuszczalny obszar eksperymentu, jądro i środek planu Zmienna naturalna, xi Jądro i centrum planu oraz obszar eksperymentu (zmienna kodowana, xi) ( 1,414) ( 1) (0) (+1) (+1,414) x1 71,71 80,00 100,00 120,00 128,28 x2 1,79 2,00 2,50 3,20 3,00 Spośród zmiennych wybranych do badań utworzono plan rotatabilny drugiego stopnia, dobierając jako jądro planu, całkowity plan czynnikowy typu 2 2, 4 punktów gwiezdnych 75

76 Środek planu Punkty gwiezdne, α Jądro planu (ramię gwiezdne α = ± 1,41421) i 5 doświadczeń w punkcie centralnym. Wartość ramienia punktu gwiezdnego dla planu czynnikowego 2 2 obliczono, ze wzoru: 4 α = 2 2 Liczba doświadczeń w punkcie centralnym wynosi 5, co wynika z wymagania, aby wariancja obliczanej wartości y była taka sama w punkcie centralnym planu, jak i punktach leżących na kuli o promieniu 1. W tabeli 20 przedstawiono plan rotatabilny w zmiennych kodowanych. Plan ten stanowił podstawę do realizacji doświadczeń. Doświadczenia wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach w kolejności losowej. Tabela 20. Plan rotatabilny dla dwóch zmiennych niezależnych kodowanych Zmienne kodowane Nr doświadczenia x1 x2 Glicerol odpadowy NH4NO3 g dm -3 g dm , , , , Po wykonaniu doświadczeń według zaprojektowanego planu eksperymentów przeprowadzono analizę statystyczną obejmującą ocenę efektów analizowanych parametrów, analizę wariancji ANOVA, określenie wartości optymalnych zmiennych wejściowych i ich wzajemnych interakcji. Otrzymano również modele matematyczne w formie funkcji kwadratowej opisujące zależności końcowego stężenie kwasu cytrynowego w podłożu (PK), szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) i współczynnika efektywności biosyntezy (Kef) w zależności od parametrów metody. W celu określenia optymalnych wartości zmiennych wejściowych zastosowano metodę funkcji użyteczności omówioną w punkcie

77 Opracowanie i prezentacja wyników Wyniki analiz i pomiarów prowadzonych w ramach badań realizowanych w niniejszej pracy przedstawiono jako: zakresy wartości, średnie arytmetyczne lub wartości z odchyleniami standardowymi. Do prezentacji wyników badań w postaci tabelarycznej i na rysunkach w postaci wykresów stosowano aplikacje Word i Excel z pakietu Office 365 Education 2016 Win-64 English, Microsoft. Analizę statystyczną przeprowadzono z wykorzystaniem programu Statistica 12, StatSoft Inc. Do przygotowania rysunków wzorów chemicznych wykorzystano program ChemSketch 2016 Advanced Chemistry Development, Inc. 77

78 4. Wyniki badań Dobór szczepu W początkowym etapie badań dokonano przeglądu szczepów Aspergillus niger, pochodzących z Kolekcji Czystych Kultur Katedry Biotechnologii i Analizy Żywności, pod kątem ich przydatności do prowadzenia biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach zawierających glicerol i wybrano 19 szczepów, które poddano badaniom przesiewowym. Celem tych badań było wyselekcjonowanie szczepu Aspergillus niger, który charakteryzował się wysoką wydajnością oraz szybkością biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożach zawierających glicerol odpadowy lub glicerol bezwodny, jako źródło węgla. Badania w kierunku biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger wykonano metodą okresowych hodowli wgłębnych prowadzonych w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem. Porównanie wydajności, efektywności i szybkości objętościowych produkcji kwasu cytrynowego, w podłożach zawierających glicerol odpadowy, z udziałem badanych szczepów Aspergillus niger przedstawiono na rysunku 8. Stwierdzono, że wszystkie badane szczepy syntezowały kwas cytrynowy z glicerolu odpadowego. Analiza wyników badań wykazała, że najwyższe końcowe stężenie kwasu cytrynowego (PK=41,1 g dm -3 ) uzyskano w hodowli prowadzonej w podłożach z odpadowym glicerolem z udziałem szczepu Aspergillus niger PD 66, drugim szczepem był Aspergillus niger S (PK=34,5 g dm -3 ), natomiast trzecim w kolejności był Aspergillus niger CW L (PK=33,5 g dm -3 ). Szczep Aspergillus niger PD 66 produkował kwas cytrynowy z największą objętościową szybkością biosyntezy kwasu cytrynowego (RPGC=0,117 g cm -3 h -1 ), z najwyższą całkowitą wydajnością (YPGC=41,1%), a także charakteryzował się najwyższą efektywnością biosyntezy (Kef=4,7 % g dm -3 h -1 ). 78

79 B-I B-64-5 C-12 C-WL KMS LAN-I LBK LC-4 LC-10 LC-12 LI LP LS LX NC-12 PD-66 S W78B W78C Y P/GC [%]; K ef [% g dm -1 h -3 ] R P/GC [g dm -1 h -1 ] ,150 0,135 0,120 0,105 0,090 0,075 0,060 0,045 0,030 0,015 0,000 Aspergillus niger Ypgc Kef Rpgc Rysunek 8. Porównanie wydajności (YPGC), efektywności (K ef) i szybkości objętościowych (RPGC) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych badanych szczepów Aspergillus niger w podłożach z glicerolem odpadowym Na podstawie przeprowadzonej analizy wyników do drugiego etapu badań przesiewowych, spośród 19 testowanych szczepów Aspergillus niger, wybrano szczepy: Aspergillus niger PD 66, Aspergillus niger S oraz Aspergillus niger CW L. Porównanie wydajności, efektywności i szybkości objętościowych biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych w podłożach z glicerolem odpadowym oraz z glicerolem bezwodnym przedstawiono odpowiednio na rysunkach 9 i 10. Analiza wyników badań wykazała, że szczep Aspergillus niger PD 66 zarówno w podłożach z glicerolem odpadowym jak i glicerolem bezwodnym produkował kwas cytrynowy z najwyższą średnią szybkością objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RPGC=0,117 g cm -3 h -1 i RPGP=0,178 g cm -3 h -1 ), z najwyższą wydajnością biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego substratu (YPGC=41,1% i YPGP=64,2%), a także charakteryzował się najwyższą efektywnością biosyntezy kwasu cytrynowego wynoszącą odpowiednio Kef=4,7 % g dm -3 h -1 i Kef=11,5 % g dm -3 h -1. Na podstawie przeprowadzonej analizy wyników badań, spośród 19 testowanych szczepów, do dalszych badań wybrano szczep Aspergillus niger PD

80 Y PGP [%]; K ef [% g dm -3 h -1 ] R PGP [g dm -3 h -1 ] Y PGC [%]; K ef [% g dm -3 h -1 ] R PGC [g dm -3 h -1 ] 45,0 40,0 35,0 0,120 0,100 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,080 0,060 0,040 0,020 0,0 C-WL S PD-66 Aspergillus niger 0,000 Ypgc Kef Rpgc Rysunek 9. Porównanie wydajności (Y PGC), efektywności (K ef) i szybkości objętościowych (R PGC) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych szczepów Aspergillus niger w podłożach z glicerolem odpadowym 70,0 60,0 0,200 0,180 0,160 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,0 C-WL S PD-66 Aspergillus niger Ypgp Kef Rpgp 0,000 Rysunek 10. Porównanie wydajności (Y PGP), efektywności (K ef) i szybkości objętościowych (R PGP) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych szczepów Aspergillus niger w podłożach z glicerolem bezwodnym 80

81 Optymalizacja wielokryterialna składu podłoża hodowlanego do biosyntezy kwasu cytrynowego Optymalizacja wielokryterialna składu podłoża hodowlanego zawierającego glicerol bezwodny do biosyntezy kwasu cytrynowego Celem eksperymentu było ustalenie optymalnego składu podłoża hodowlanego do biosyntezy kwasu cytrynowego z użyciem glicerolu bezwodnego jako źródła węgla oraz identyfikacja modelu matematycznego opisującego wpływ stężenia glicerolu bezwodnego oraz stężenia makroelementów w podłożu hodowlanym na biosyntezę kwasu cytrynowego. Spośród zmiennych wybranych do badań utworzono i wykonano rotatabilny plan czynnikowy II stopnia. Doświadczenia według zaprojektowanego planu eksperymentów wykonano w kolejności losowej metodą okresowych hodowli wgłębnych prowadzonych w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem. Zbadano wpływ stężenia glicerolu bezwodnego (x1), azotanu amonu (x2), diwodorofosforanu potasu (x3), siedmiowodnego siarczanu magnezu (x4) na końcowe stężenie produktu (y1), szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego (y2) współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (y3). Plan eksperymentu w postaci zmiennych naturalnych i kodowanych oraz wyniki otrzymane i obliczone z modelu z modelu II stopnia dla zmiennych zależnych przedstawiono w tabeli 21. Analiza uzyskanych wyników wykazała, że najwyższe stężenie kwasu cytrynowego (PK=58,03 g dm -3 ) oraz najwyższą szybkość objętościową biosyntezy kwasy cytrynowego (RP=0,173 g dm -3 h -1 ) uzyskano w wariancie 25, którego skład podłoża odpowiadał punktowi centralnemu: glicerol bezwodny 150,0 g dm -3, NH4NO3 2,0 g dm -3, KH2PO4 0,2 g dm -3, MgSO4 7H2O 0,2 g dm -3. Najwyższy współczynnik efektywności (Kef=7,09 % g dm -3 h -1 ) osiągnięto w wariancie 8, w podłożu hodowlanym o składzie: glicerol bezwodny 100,0 g dm -3, NH4NO3 2,5 g dm -3, KH2PO4 0,25 g dm -3, MgSO4 7H2O 0,25 g dm -3. Końcowe stężenie kwasu cytrynowego powyżej 50 g dm -3 uzyskano w wariancie 19 i 29, w których stężenie NH4NO3 było odpowiednio najniższe (NH4NO3 1,0) i najwyższe (NH4NO3 3,0). W wariancie 17 uzyskano najniższe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym (PK=16,80 g dm -3 ). Niskie stężenie kwasu cytrynowego (PK=19,80 g dm -3 ) oraz niska wartość współczynnika efektywności (Kef=0,46% g dm -3 h -1 ) wystąpiła w wariancie 18, w którym stężenie glicerolu bezwodnego było najwyższe i wynosiło 250 g dm -3. Podobnie niskie stężenie kwasu cytrynowego (PK=17,46 g dm -3 ) uzyskano w wariancie 21, w którym stężenie diwodorofosforanu potasu było najniższe (KH2PO4 0,1 g dm -3 ). 81

82 Tabela 21. Macierz eksperymentu oraz wyniki otrzymane i obliczone z modelu matematycznego, dotyczącego optymalizacji składu podłoża hodowlanego z użyciem glicerolu bezwodnego Nr doświad. Glicerol bezwodny x 1 Zmienne naturalne [g dm -3 ] i kodowane NH 4NO 3 x 2 KH 2PO 4 x 3 MgSO 4 7H 2O x 4 Wyniki P [g dm -3 ] R P [g dm -3 h -1 ] K ef [% g dm -3 h -1 ] Otrzymane Obliczone Otrzymane Obliczone Otrzymane Obliczone 1 100,00-1 1,50-1 0,15-1 0, ,35 35,88 0,123 0,108 5,09 3, ,00-1 1,50-1 0,15-1 0, ,70 34,28 0,106 0,103 3,79 3, ,00-1 1,50-1 0,25 1 0, ,36 40,47 0,108 0,121 3,93 4, ,00-1 1,50-1 0,25 1 0, ,62 32,53 0,124 0,100 5,16 3, ,00-1 2,50 1 0,15-1 0, ,70 31,65 0,134 0,103 5,57 4, ,00-1 2,50 1 0,15-1 0, ,80 34,35 0,100 0,114 3,13 3, ,00-1 2,50 1 0,25 1 0, ,50 45,00 0,146 0,146 6,64 6, ,00-1 2,50 1 0,25 1 0, ,20 41,36 0,157 0,141 7,09 5, ,00 1 1,50-1 0,15-1 0, ,39 36,76 0,108 0,112 1,97 2, ,00 1 1,50-1 0,15-1 0, ,31 32,42 0,108 0,096 1,96 1, ,00 1 1,50-1 0,25 1 0, ,85 42,91 0,154 0,128 4,00 2, ,00 1 1,50-1 0,25 1 0, ,64 32,23 0,076 0,095 0,98 1, ,00 1 2,50 1 0,15-1 0, ,05 28,75 0,072 0,083 0,86 1, ,00 1 2,50 1 0,15-1 0, ,28 28,71 0,108 0,083 1,96 0, ,00 1 2,50 1 0,25 1 0, ,71 43,66 0,136 0,127 3,11 2, ,00 1 2,50 1 0,25 1 0, ,20 37,28 0,108 0,111 1,95 2, ,00-2 2,00 0 0,20 0 0, ,80 23,73 0,070 0,089 2,35 4, ,00 2 2,00 0 0,20 0 0, ,60 20,53 0,058 0,064 0,46-0, ,00 0 1,00-2 0,20 0 0, ,66 51,60 0,139 0,150 4,32 4, ,00 0 3,00 2 0,20 0 0, ,50 52,42 0,147 0,161 4,86 5, ,00 0 2,00 0 0,10-2 0, ,46 22,92 0,052 0,068 0,60 1, ,00 0 2,00 0 0,30 2 0, ,69 36,08 0,100 0,109 2,25 3, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,93 44,91 0,119 0,133 3,16 4, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,06 36,93 0,101 0,112 2,30 2, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,03 55,53 0,173 0,165 6,68 6, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,30 55,53 0,168 0,165 6,29 6, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,20 55,53 0,164 0,165 6,05 6, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,80 55,53 0,145 0,165 4,73 6, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,60 55,53 0,171 0,165 6,58 6, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,90 55,53 0,166 0,165 6,20 6, ,00 0 2,00 0 0,20 0 0, ,90 55,53 0,169 0,165 6,42 6,14 82

83 Na podstawie uzyskanych wyników dla każdej zmiennej wyjściowej zbadano za pomocą analizy wariancji, które wielkości wejściowe znacząco wpływają na wielkości wyjściowe, wyznaczono modele matematyczne w formie funkcji kwadratowej oraz odpowiednie powierzchnie odpowiedzi. Pierwszy krok analizy statystycznej obejmował sprawdzenie jednorodności wariancji testem Browna Forsytha a. Jest to warunek konieczny do spełnienia, ponieważ brak jednorodności wariancji uniemożliwia poszukiwanie funkcji obiektu badań. W przypadku badanych zmiennych wykazano jednorodność wariancji, ponieważ przeprowadzony test dał wyniki nieistotny statystycznie (p>0,05). Następnie przeprowadzono analizę statystyczną wyników dla każdej zmiennej wyjściowej. Końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu, y1 Dane uzyskane w wyniku wykonanego planu eksperymentu posłużyły do wyznaczenia współczynników równania regresji (bi) określających wpływ badanych czynników na końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu (PK). Wyniki obliczeń współczynników równania regresji oraz wyniki testu t przedstawiono w tabeli 22. Po zrealizowaniu obliczeń otrzymano następujące równanie regresji, pozwalające na obliczenie końcowego stężenia kwasu cytrynowego w podłożu: PK = 187, x1 0,003x1 2 5,95x2 3,53x ,11x3 2603,04x ,47x4 1461,04x4 2 0,04x1x2 +0,16x1x3 0,27x1x4 + 87,65x2x 3+ 43,00x2x4 634,00x3x4 Współczynnik dobroci dopasowania (R 2 ) stworzonego modelu wyniósł 0,8371, co pozwala założyć, że model matematyczny wyjaśnia 83,71% zmiennej zależnej, natomiast 16,3% stanowią inne czynniki, w tym losowe. W celu sprawdzenia czy wpływ wielkości wejściowych na stężenie kwasu cytrynowego jest istotny statystycznie przeprowadzono analizę wariancji ANOVA z wykorzystaniem testu F Snedecora (Fishera). Przeprowadzona analiza wariancji wykazała istotny statystycznie wpływ stężenia gliceryny bezwodnej w liniowym zakresie zmienności, stężenia diwodorofosforanu potasu oraz siedmiowodnego siarczanu magnezu zarówno w liniowym jak i nieliniowym zakresie zmienności na końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu. Wyniki analizy wariancji z zastosowaniem testu F zaprezentowano w tabeli

84 Tabela 22. Współczynniki równania regresji i wyniki testu t dla zmiennej końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem bezwodnym Zmienne wejściowe Wsp. regresji SE t p Granica ufności -95% +95% Średnia / Stała -187,88 33,0672-5,68 0, ,79-106,97 C3H8O3 [g dm -3 ] (1) (L) 1,09 0,1296 8,38 0, ,77 1,40 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) -0,00 0, ,30 0, ,00-0,00 NH4NO3 [g dm -3 ] (2) (L) -5,95 13,7473-0,43 0, ,59 27,69 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) -3,53 2,3365-1,51 0, ,24 2,19 KH2PO4 [g dm -3 ] (3) (L) 1035,11 137,4730 7,53 0, , ,50 KH2PO4 [g dm -3 ] (Q) -2603,04 233, ,14 0, , ,31 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (4) (L) 626,47 137,4730 4,56 0, ,09 962,86 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (Q) -1461,04 233,6536-6,25 0, ,77-889,31 1L względem 2L -0,04 0,0312-1,21 0, ,11 0,04 1L względem 3L 0,16 0,3124 0,49 0, ,61 0,92 1L względem 4L -0,27 0,3124-0,88 0, ,04 0,49 2L względem 3L 87,65 31,2366 2,81 0, ,22 164,08 2L względem 4L 43,00 31,2366 1,38 0, ,43 119,43 3L względem 4L -634,00 312,3656-2,03 0, ,33 130,33 R 2 = 83,7%; t test t; p poziom istotności; SE błąd standardowy; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 Tabela 23. Analiza wariancji ANOVA dla zmiennej końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem bezwodnym Zmienne wejściowe SS df MS F p C3H8O3 [g dm -3 ] (1) (L) 15, ,36 1,57 0, C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) 1994, ,41 204,40 0, NH4NO3 [g dm -3 ] (2) (L) 1,00 1 1,00 0,10 0, NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) 22, ,21 2,28 0, KH2PO4 [g dm -3 ] (3) (L) 259, ,78 26,62 0, KH2PO4 [g dm -3 ] (Q) 1210, ,99 124,11 0, MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (4) (L) 95, ,60 9,80 0, MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (Q) 381, ,51 39,10 0, L względem 2L 14, ,29 1,46 0, L względem 3L 2,43 1 2,43 0,25 0, L względem 4L 7,54 1 7,54 0,77 0, L względem 3L 76, ,83 7,87 0, L względem 4L 18, ,49 1,90 0, L względem 4L 40, ,19 4,12 0, Brak dopasowania 641, ,19 6,58 0, Czysty błąd 58,54 6 9,75 Całkowita SS 4300,21 30 R 2 = 83,71%; SS suma kwadratów; MS wariancja; df stopnie swobody; F test Fishera; p poziom istotności; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 84

85 Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego, y2 Na podstawie analizy statystycznej wyników planu rotalnego uzyskano współczynniki równania (tabela 24) regresji oraz zaproponowano następującą funkcję aproksymacyjną pozwalającą na obliczenie szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego: RP = 0,55 + 0,003x1 0,00001x1 2 0,008x2 0,01x ,00 x 3 7,69 x ,78x4 4,29 x4 2 0,0003x1x2 + 0,0002x1x3 0,001x1x4 + 0,29x2x3 + 0,16x2x4 0,16x3x4 Współczynnik korelacji R2 wyniósł 0,8275, co pozwala założyć, że stworzony model matematyczny wyjaśnia 82,75% zmienności szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego. Tabela 24. Współczynniki równania regresji i wyniki testu t dla zmiennej szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem bezwodnym Zmienne wejściowe Wsp. regresji SE t p Granica ufności -95% +95% Średnia / Stała -0,5536 0, ,63 0, , ,31285 C3H8O3 [g dm -3 ] (1) (L) 0,0032 0, ,38 0, , ,00418 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) -0, , ,78 0, , ,00001 NH4NO3 [g dm -3 ] (2) (L) -0,0082 0, ,20 0, , ,09186 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) -0,0099 0, ,43 0, , ,00709 KH2PO4 [g dm -3 ] (3) (L) 3,0017 0, ,34 0, , ,00282 KH2PO4 [g dm -3 ] (Q) -7,6901 0, ,06 0, , ,98850 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (4) (L) 1,7847 0, ,36 0, , ,78588 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (Q) -4,2912 0, ,17 0, , , L względem 2L -0,0003 0, ,65 0, , , L względem 3L 0,0001 0, ,18 0, , , L względem 4L -0,0011 0, ,25 0, , , L względem 3L 0,2908 0, ,13 0, , , L względem 4L 0,1623 0, ,75 0, , , L względem 4L -1,6308 0, ,75 0, , ,64392 R 2 = 82,75%; t test t; p poziom istotności; SE błąd standardowy; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 Przeprowadzona analiza wariancji ANOVA wykazała, że spośród wielkości wejściowych stężenie glicerolu bezwodnego w nieliniowym zakresie zmienności w największym stopniu wpływa na szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego. Wykazano również istotny wpływ stężenia glicerolu bezwodnego w liniowym zakresie zmienności oraz siedmiowodnego siarczanu magnezu i diwodorofosforanu potasu w liniowym i nieliniowym zakresie zmienności. Istotny wpływ w linowym charakterze zmienności wykazały stężenie 85

86 glicerolu bezwodnego i azotanu amonu oraz azotanu amonu i diwodorofosforanu potasu. Wyniki analizy wariancji zaprezentowano w tabeli 25. Tabela 25. Analiza wariancji ANOVA dla zmiennej szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem bezwodnym Zmienne wejściowe SS df MS F p C3H8O3 [g dm -3 ] (1) (L) 0, , ,97 0,01617 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) 0, , ,25 0,00001 NH4NO3 [g dm -3 ] (2) (L) 0, , ,25 0,18450 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) 0, , ,04 0,20355 KH2PO4 [g dm -3 ] (3) (L) 0, , ,41 0,00163 KH2PO4 [g dm -3 ] (Q) 0, , ,29 0,00003 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (4) (L) 0, , ,99 0,03004 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (Q) 0, , ,08 0, L względem 2L 0, , ,04 0, L względem 3L 0, , ,03 0, L względem 4L 0, , ,56 0, L względem 3L 0, , ,79 0, L względem 4L 0, , ,05 0, L względem 4L 0, , ,08 0,12992 Brak dopasowania 0, , ,71 0,01506 Czysty błąd 0, , Całkowita SS 0, R 2 = 82,75%; SS suma kwadratów; MS wariancja; df stopnie swobody; F test Fishera; p poziom istotności; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 Współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego, y3 Na podstawie otrzymanych wyników doświadczeń obliczono współczynniki równania regresji (tabela 26). Równanie regresji pozwalające na obliczenie współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego ma postać: Kef = 30,57 + 0,14x1 0,0004x ;32x2 0,86x ,01x3 401,68x ,59x4 271,60 x4 2 0,01x1x2 0,05x1x3 0,03x1x4 + 15,04x2x2 + 2,64x2x4 + 3,78x3x4 Współczynnik dobroci dopasowania R 2 pomiędzy wartościami aproksymowanymi a rzeczywistymi wyniósł 0,8160 co wskazuje, że 81,60% zmienności zostało uwzględnione w tym modelu matematycznym. Analiza wariancji ANOVA z wykorzystaniem testu Fishera potwierdziła, że największy wpływ na wartość współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego ma stężenie glicerolu bezwodnego i diwodorofosforanu potasu w liniowym i nieliniowym zakresie 86

87 Tabela 26. Współczynniki równania regresji i wyniki testu t dla zmiennej współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem bezwodnym Zmienne wejściowe Wsp. regresji R 2 = 81,60%; t test t; p poziom istotności; SE błąd standardowy; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 zmienności oraz siedmiowodnego siarczanu magnezu w nieliniowym zakresie zmienności. Wyniki analizy wariancji zaprezentowano w tabeli 27. SE t p Granica ufności -95% +95% Średnia / Stała -30,571 6, ,38 0, ,644-13,499 C3H8O3 [g dm -3 ] (1) (L) 0,141 0, ,15 0,0021 0,074 0,208 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) -0,0004 0, ,20 0,0002-0,001-0,000 NH4NO3 [g dm -3 ] (2) (L) 2,317 2, ,79 0,4549-4,781 9,415 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) -0,855 0, ,73 0,1337-2,061 0,352 KH2PO4 [g dm -3 ] (3) (L) 147,008 29, ,07 0, , ,986 KH2PO4 [g dm -3 ] (Q) -401,677 49, ,15 0, , ,041 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (4) (L) 100,593 29, ,47 0, , ,571 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (Q) -271,259 49, ,50 0, , ,622 1L względem 2L -0,014 0, ,082 0,0825-0,030 0,002 1L względem 3L -0,049 0, ,74 0,4871-0,210 0,112 1L względem 4L -0,026 0, ,39 0,7099-0,187 0,136 2L względem 3L 15,037 6, ,28 0,0626-1,090 31,165 2L względem 4L 2,640 6, ,40 0, ,487 18,768 3L względem 4L 3,778 65, ,06 0, , ,054 Tabela 27. Analiza wariancji ANOVA dla zmiennej współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem bezwodnym Zmienne wejściowe SS df MS F p C3H8O3 [g dm -3 ] (1) (L) 31, ,281 72,009 0,0001 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) 29, ,178 67,167 0,0002 NH4NO3 [g dm -3 ] (2) (L) 0, ,846 1,949 0,2122 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) 1, ,305 3,004 0,1337 KH2PO4 [g dm -3 ] (3) (L) 5, ,819 13,397 0,0106 KH2PO4 [g dm -3 ] (Q) 28, ,836 66,379 0,0002 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (4) (L) 1, ,971 4,539 0,0772 MgSO4 7H2O [g dm -3 ] (Q) 13, ,150 30,272 0,0015 1L względem 2L 1, ,883 4,335 0,0825 1L względem 3L 0, ,238 0,548 0,4871 1L względem 4L 0, ,066 0,152 0,7099 2L względem 3L 2, ,261 5,205 0,0627 2L względem 4L 0, ,069 0,160 0,7026 3L względem 4L 0, ,001 0,003 0,9561 Brak dopasowania 20, ,079 4,786 0,0342 Czysty błąd. 2, ,434 Całkowita SS 127, R 2 = 81,60%; SS suma kwadratów; MS wariancja; df stopnie swobody; F test Fishera; p poziom istotności; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 87

88 Na rysunkach 11, 12 i 13 przedstawiono wykresy powierzchni odpowiedzi prezentujące zależność zmiennych wyjściowych od stężenia glicerolu bezwodnego (x1) i stężenia azotanu amonu (x2). Ze względu na korzystny wpływ stężenia diwodorofosforanu potasu (x3) oraz siedmiowodnego siarczanu magnezu (x4) do dalszych analiz przyjęto optymalne stężenia KH2PO4 0,2 g dm -3 i MgSO4 7H2O 0,2 g dm -3 w podłożach hodowlanych. Na rysunku 11 przedstawiającym zależność końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK) od stężenia glicerolu bezwodnego i stężenia azotanu amonu, przy założeniu stałego, optymalnego stężenia KH2PO4 (x3=0,2 g dm -3 ) i MgSO4 7H2O (x4=0,2 g dm -3 ) można zaobserwować, że najwyższe stężenie kwasu cytrynowego (PK=56,90 g dm -3 ) osiągnięto przy początkowym stężeniu glicerolu bezwodnego i początkowym stężeniu azotanu amonowego w podłożu hodowlanym, wynoszącym odpowiednio x1=150 g dm -3, x2=2,0 g dm -3. Niższe stężenie glicerolu bezwodnego x1=100 g dm -3 oraz azotanu amonu x2=1,5 g dm -3 w podłożu hodowlanym powodowało zmniejszenie końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK =41,62 g dm -3 ). Podobnie w przypadku zwiększenia stężenia glicerolu bezwodnego x1=200 g dm -3 i azotanu amonu x2=1,5 g dm -3 następował znaczny spadek końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK =36,20 g dm -3 ). Rysunek 11. Powierzchnia odpowiedzi przedstawiająca zależność stężenia kwasu cytrynowego (P) od stężenia glicerolu bezwodnego (x 1) i stężenia azotanu amonu (x 2), przy założeniu stałego, optymalnego stężenia KH 2PO 4 (x 3=0,2 g dm -3 ) i MgSO 4 7H 2O (x 4=0,2 g dm -3 ) w podłożu hodowlanym 88

89 Z analizy zależności szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) (rysunek 12) od stężenia glicerolu bezwodnego (x1) i stężenia azotanu amonu (x2) w podłożu hodowlanym wynika, że najkorzystniejszy przedział zmiennych wejściowych to: x1= g dm -3 i x2=2,0 2,5 g dm -3. Maksimum szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (RP=0,169 g dm -3 h -1 ) przy x1=150 g dm -3 i x2=2,0 g dm -3. Zwiększenie stężenia glicerolu bezwodnego do x1=200 g dm -3 wpływało na znaczne zmniejszenie szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego. Rysunek 12. Powierzchnia odpowiedzi przedstawiająca zależność szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (R P) od stężenia glicerolu bezwodnego (x 1) i stężenia azotanu amonu (x 2), przy założeniu stałego, optymalnego stężenia KH 2PO 4 (x 3=0,2 g dm -3 ) i MgSO 4 7H 2O (x 4=0,2 g dm - 3 ) w podłożu hodowlanym Analiza interakcji pomiędzy współczynnikiem efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef) (rysunek 13) a stężeniem glicerolu bezwodnego (x1) i azotanu amonu (x2) wskazuje, że najkorzystniejszy przedział wartości zmiennych wejściowych to: x1= g dm -3 i x2=2,0 2,5 g dm -3. Z analizy danych zawartych na rysunku 13, że najwyższą wartość współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef=7,09 % g dm -3 h -1 ) została osiągnięta dla zmiennych wejściowych x1=100 g dm -3 i x2=2,5 g dm -3. Wzrost stężenia glicerolu bezwodnego w podłożu hodowlanym w zakresie od 200 do 250 g dm -3 powodował znaczne zmniejszenie wartości współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego. 89

90 Rysunek 13. Powierzchnia odpowiedzi przedstawiająca zależność współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef) od stężenia glicerolu bezwodnego (x 1) i stężenia azotanu amonu (x 2), przy założeniu stałego, optymalnego stężenia KH 2PO 4 (x 3=0,2 g dm -3 ) i MgSO 4 7H 2O (x 4=0,2 g dm -3 ) w podłożu hodowlanym W celu wyznaczenia wartości optymalnych zmiennych wejściowych ze względu na trzy wybrane kryteria końcowe: stężenie kwasu cytrynowego w podłożu (PK), szybkość objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) i współczynnik efektywności biosyntezy (Kef), wykorzystano metodę funkcji użyteczności. Wartość każdego kryterium oceniono za pomocą bezwymiarowej funkcji liniowej o wartościach z przedziału [0,1]. Wartość 0 oznaczono jako wartość funkcji kryterium o najmniejszej użyteczności, a wartość 1 dla wartości funkcji kryterium o największej użyteczności. Wartości minimalne oznaczono jako 0,5. Po zdefiniowaniu funkcji użyteczności dla każdego kryterium zbudowano model dla użyteczności całkowitej, wykorzystując metodę najmniejszych kwadratów jako metodę dopasowania powierzchni do wartości użyteczności. W celu wygenerowania wartości optymalnych wielkości wejściowych posłużono się metodą optimum w węzłach siatki. Profile aproksymowanych wartości zmiennych oraz ich użyteczności przedstawiono na rysunku 14. Największą wartość użyteczności 0,91 uzyskano dla następujących optymalnych wartości analizowanych parametrów składu podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym: 90

91 stężenie glicerolu bezwodnego 150,0 g dm -3 stężenie NH4NO3 2,0 g dm -3, stężenie KH2PO4 0,2 g dm -3, stężenie MgSO4 7H2O 0,2 g dm -3. Dla tak wyznaczonego składu podłoża hodowlanego przeprowadzono eksperyment weryfikacyjny w wyniku, którego uzyskano następujące wartości wybranych kryteriów optymalizacji PK=59,01 g dm -3, RP=0,178 g dm -3 h -1, Kef=7,00 % g dm -3 h -1. Ustalony optymalny skład podłoża hodowlanego z użyciem glicerolu bezwodnego stosowano w dalszych etapach badań procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger PD 66. C 3 H 8 O 3 [g dm -3 ] NH 4 NO 3 [g dm -3 ] KH 2 PO 4 [g dm -3 ] MgSO 4 7H 2 O [g dm -3 ] Użyteczność 70,00 58,42 55,53 52,64 P K [g dm -3 ],5 1, 58,03 37,42 0, 16,80 5,00 0,200 0,174 0,165 0,157 0,020 R P [ g dm -3 h -1 ] 0,,5 1, 0,172 0,112 0,052 9,00 6,75 6,14 5,53 K ef [% g dm -3 h -1 ] 0,,5 1, 7,09 3,78 0,46-3,00 0,9103 Użyteczność 50,0 150,0 250,0 1,0 2,0 3,0 0,1 0,2 0,3 0,1 0,2 0,3 Rysunek 14. Profile aproksymowanych wartości i użyteczność dla optymalnych wartości analizowanych parametrów składu podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym 91

92 Optymalizacja wielokryterialna składu podłoża hodowlanego zawierającego glicerol odpadowy do biosyntezy kwasu cytrynowego Celem tej serii badań było ustalenie optymalnego składu podłoża hodowlanego do biosyntezy kwasu cytrynowego oraz identyfikacja modelu matematycznego opisującego wpływ stężenia glicerolu odpadowego oraz stężenia azotanu amonu w podłożu hodowlanym na biosyntezę kwasu cytrynowego. Spośród wytypowanych do badań zmiennych utworzono i wykonano rotatabilny plan czynnikowy II stopnia. Badania wykonano w kolejności losowej metodą okresowych hodowli wgłębnych prowadzonych w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem. Zbadano wpływ stężenia glicerolu odpadowego (x1) oraz stężenia azotanu amonu (x2) na końcowe stężenie produktu (y1), szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego (y2) współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (y3). Plan eksperymentu w postaci zmiennych naturalnych i kodowanych oraz wyniki otrzymane i obliczone z modelu z modelu II stopnia dla zmiennych zależnych przedstawiono w tabeli 28. Z analizy wyników doświadczeń wynika, że najwyższe wartości końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK=38,15 g dm -3 ), szybkości objętościowej (RP=0,106 g dm - 3 h -1 ) oraz współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef=3,37 % g dm -3 h -1 ) uzyskano w wariancie 4, w którym skład podłoża hodowlanego był następujący: glicerol odpadowy 120,0 g dm -3, NH4NO3 3,0 g dm -3, KH2PO4 0,2 g dm -3, MgSO4 7H2O 0,2 g dm -3. W punkcie centralnym planu rotatabilnego najwyższe stężenie kwasu cytrynowego (PK=30,33 g dm -3 ), otrzymano w wariancie 12. W wariancie 1 uzyskano najniższe wartości końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK=5,60 g dm -3 ), szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (RP=0,021 g dm -3 h -1 ) oraz współczynnika efektywności (Kef =0,15 % g dm -3 h -1 ). Na podstawie uzyskanych wyników dla każdej zmiennej wyjściowej zbadano za pomocą analizy wariancji, które wielkości wejściowe znacząco wpływają na wielkości wyjściowe, wyznaczono modele matematyczne w formie funkcji kwadratowej oraz odpowiednie powierzchnie odpowiedzi. W pierwszej kolejności analiza statystyczna wyników obejmowała sprawdzenie jednorodności wariancji testem Browna Forsytha a. Przeprowadzony test wykazał jednorodność wariancji (p>0,05). Następnie przystąpiono do analizy statystycznej wyników dla każdej zmiennej wyjściowej. 92

93 Tabela 28. Macierz eksperymentu oraz wyniki otrzymane i obliczone z modelu matematycznego, dotyczące optymalizacji składu podłoża hodowlanego z użyciem glicerolu odpadowego Nr doświad. Zmienne naturalne [g dm -3 ] i kodowane Glicerol odpadowy x1 NH4NO3 x2 Wyniki PK [g dm -3 ] RP [g dm -3 h -1 ] Kef [% g dm -3 h -1 ] Otrzymane Obliczone Otrzymane Obliczone Otrzymane Obliczone 1 80,00-1 2,00-1 5,60 8,97 0,021 0,028 0,15 0, ,00-1 3, ,65 11,64 0,063 0,051 1,08 0, ,00 1 2, ,32 11,92 0,031 0,036 0,30 0, ,00 1 3, ,15 33,38 0,106 0,091 3,37 2, ,72-1,414 2,50 0 7,70 6,44 0,029 0,031 0,32 0, ,28 1,414 2, ,23 23,89 0,059 0,065 0,98 1, ,00 0 1,79-1,414 12,37 9,26 0,037 0,027 0,50 0, ,00 0 3,20 1,414 21,82 26,32 0,065 0,082 1,42 2, ,00 0 2, ,35 28,30 0,084 0,084 2,40 2, ,00 0 2, ,78 28,30 0,077 0,084 2,00 2, ,00 0 2, ,28 28,30 0,087 0,084 2,55 2, ,00 0 2, ,33 28,30 0,090 0,084 2,74 2, ,00 0 2, ,77 28,30 0,083 0,084 2,30 2,40 93

94 Końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu, y1 Na podstawie otrzymanych wyników doświadczeń obliczono współczynniki równania regresji (tabela 29). Równanie regresji, pozwalające na obliczenie końcowego stężenia kwasu cytrynowego w podłożu (PK), dla wszystkich współczynników ma postać: PK = 210, ,22x1 21,02x1 2 +2,42x2 0,02x ,47x1x2 Współczynnik korelacji wyniósł R 2 =0,9265, co oznacza że utworzony model matematyczny opisuje w 92,65% zmienność końcowego stężenie kwasu cytrynowego w podłożu (PK). Przeprowadzona analiza wariancji ANOVA (tabela 30) wykazała, że wszystkie badane zmienne wejściowe, zarówno w liniowym, jak i nieliniowym zakresie zmienności istotnie wpływały na końcowe stężenie kwasu cytrynowego (PK) w podłożu hodowlanym. Tabela 29. Współczynniki równania regresji i wyniki testu t dla zmiennej końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem odpadowym Zmienne wejściowe Wsp. regresji SE t p Granica ufności -95 % +95% Średnia / Stała -210,91 32,291-6,53 0, ,56-121,25 C3H8O3 [g dm -3 ] (L) (1) 70,22 15,595 4,50 0, ,91 113,52 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) -21,02 2,596-8,10 0, ,23-13,82 NH4NO3 [g dm -3 ] (L) (2) 2,42 0,389 6,20 0,0034 1,34 3,50 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) -0,02 0,002-10,12 0,0005-0,02-0,01 1L względem 2L 0,47 0,086 5,49 0,0054 0,23 0,70 R 2 = 92,65%; t test t; p poziom istotności; SE błąd standardowy; L liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 Tabela 30. Analiza wariancji ANOVA dla zmiennej końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem odpadowym Zmienne wejściowe SS df MS F p C3H8O3 [g dm -3 ] (L) (1) 290, ,98 99,29 0,0006 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) 192, ,17 65,57 0,0013 NH4NO3 [g dm -3 ] (L) (2) 304, ,50 103,91 0,0005 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) 300, ,13 102,42 0,0005 1L względem 2L 88, ,20 30,10 0,0053 Brak dopasowania 77, ,71 8,77 0,0312 Czysty błąd 11,72 4 2,93 Całkowita SS 1209,62 12 R 2 = 92,65%; SS suma kwadratów; MS wariancja; df stopnie swobody; F test Fishera; p poziom istotności; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 94

95 Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego, y2 Na podstawie analizy statystycznej wyników planu rotalnego uzyskano współczynniki równania (tabela 31) regresji oraz zaproponowano następującą postać funkcji aproksymacyjnej pozwalającą na obliczenie szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego: RP = 0,69 + 0,25x1 0,06x ,008x2 0,00005x ,0008x1x2 Współczynnik dobroci dopasowania R 2 pomiędzy wartościami aproksymowanymi a rzeczywistymi wyniósł 0,8820 co wskazuje, że 88,20% zmienności zostało uwzględnione w modelu. Analiza wariancji ANOVA (tabela 32) wykazała, że wszystkie badane zmienne wejściowe, zarówno w liniowym, jak i nieliniowym zakresie zmienności istotnie wpływały na szybkość objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP). Tabela 31. Współczynniki równania regresji i wyniki testu t dla zmiennej szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem odpadowym Zmienne wejściowe Wsp. Regresji SE t p Granica ufności -95% +95% Średnia / Stała -0, , ,17 0,0020-0, ,42197 C3H8O3 [g dm -3 ] (L) (1) 0, , ,42 0,0056 0, ,38033 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) -0, , ,60 0,0016-0, ,03730 NH4NO3 [g dm -3 ] (L) (2) 0, , ,55 0,0028 0, ,01083 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) -0, , ,36 0,0007-0, , L względem 2L 0, , ,19 0,0330 0, ,00152 R 2 = 88,82%; t test t; p poziom istotności; SE błąd standardowy; L liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 Tabela 32. Analiza wariancji ANOVA dla zmiennej szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem odpadowym Zmienne wejściowe SS df MS F p C3H8O3 [g dm -3 ] (L) (1) 0, , ,63 0,0004 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) 0, , ,82 0,0016 NH4NO3 [g dm -3 ] (L) (2) 0, , ,61 0,0027 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) 0, , ,66 0,0007 1L względem 2L 0, , ,21 0,0331 Brak dopasowania 0, , ,28 0,0202 Czysty błąd 0, ,00003 Całkowita SS 0, R 2 = 88,82%; SS suma kwadratów; MS wariancja; df stopnie swobody; F test Fishera; p poziom istotności; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 95

96 Współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego, y3 Na podstawie otrzymanych wyników doświadczeń obliczono współczynniki równania regresji (tabela 33). Równanie regresji, pozwalające na obliczenie współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego, dla wszystkich współczynników ma postać: Kef = 24,23 + 8,25x1 2,46x ,27x2 0,002x ,05x 1 x 2 Współczynnik dobroci dopasowania R 2 pomiędzy wartościami aproksymowanymi a rzeczywistymi wyniósł 0,8667 co wskazuje, że 86,67% zmienności zostało uwzględnione w modelu matematycznym. Analiza wariancji ANOVA z wykorzystaniem testu Fishera potwierdziła, że wszystkie badane zmienne wejściowe, zarówno w liniowym i nieliniowym zakresie zmienności istotnie wpływały na wartość współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef). Wyniki analizy wariancji zaprezentowano w tabeli 34. Tabela 33. Współczynniki równania regresji i wyniki testu t dla zmiennej współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem odpadowym Zmienne wejściowe Wsp. regresji SE t p Granica ufności -95% +95% Średnia / Stała -24,225 5,2415-4,62 0,009-38,778-9,6723 C3H8O3 [g dm -3 ] (L) (1) 8,251 2,5315 3,26 0,031 1,223 15,279 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) -2,456 0,4214-5,83 0,004-3,626-1,286 NH4NO3 [g dm -3 ] (L) (2) 0,272 0,0633 4,29 0,013 0,096 0,448 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) -0,002 0,0003-7,30 0,002-0,003-0,001 1L względem 2L 0,054 0,0139 3,85 0,018 0,015 0,092 R 2 = 86,67%; t test t; p poziom istotności; SE błąd standardowy; L liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 Tabela 34. Analiza wariancji ANOVA dla zmiennej współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym z glicerolem odpadowym Zmienne wejściowe SS df MS F p C3H8O3 [g dm -3 ] (L) (1) 3,51 1 3,51 45,48 0,0025 C3H8O3 [g dm -3 ] (Q) 2,62 1 2,62 33,97 0,0043 NH4NO3 [g dm -3 ] (L) (2) 1,43 1 1,43 18,46 0,0127 NH4NO3 [g dm -3 ] (Q) 4,12 1 4,12 53,35 0,0019 1L względem 2L 1,15 1 1,15 14,85 0,0182 Brak dopasowania 1,55 3 0,52 6,68 0,0489 Czysty błąd 0,31 4 0,08 Całkowita SS 13,93 12 R 2 = 86,67%; SS suma kwadratów; MS wariancja; df stopnie swobody; F test Fishera; p poziom istotności; L - liniowy zakres zmienności; Q - nieliniowy zakres zmienności; kolorem czerwonym zaznaczono wartości istotne statystycznie p<0,05 96

97 Na rysunkach 15, 16 i 17 przedstawiono wykresy powierzchni odpowiedzi prezentujące zależność zmiennych wyjściowych od stężenia glicerolu bezwodnego (x1) i stężenia azotanu amonu (x2). Podczas analiz powierzchni odpowiedzi przyjęto stałe stężenia: KH2PO4 = 0,2 g dm -3 i MgSO4 7H2O = 0,2 g dm -3. Z analizy danych przedstawiających zależność końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK) od stężenia glicerolu bezwodnego i stężenia azotanu amonu w podłożu hodowlanym (rysunek 15), przy założeniu stałego, optymalnego stężenia KH2PO4 (x3=0,2 g dm -3 ) i stężenia MgSO4 7H2O (x4=0,2 g dm -3 ) wynika, że najwyższe stężenie kwasu cytrynowego (PK=38,15 g dm -3 ) osiągnięto przy początkowym stężeniu glicerolu odpadowego w podłożu hodowlanym, wynoszącym x1=120,0 g dm -3 i początkowym stężeniu azotanu amonowego x2=3,0 g dm -3. Niższe stężenie glicerolu bezwodnego x1=80,0 g dm -3 oraz azotanu amonu x2=1,8 g dm -3 w podłożu hodowlanym powodowało znaczne zmniejszenie końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK=5,60 g dm -3 ). W przypadku zmniejszenie stężenia azotanu amonu do x2=2,0 g dm -3 następował znaczny spadek końcowego stężenia kwasu cytrynowego do PK=11,32 g dm -3. Rysunek 15 Powierzchnia odpowiedzi przedstawiająca zależność stężenia kwasu cytrynowego (P K) od stężenia glicerolu bezwodnego (x 1) i stężenia azotanu amonu (x 2) 97

98 Analiza interakcji pomiędzy szybkością objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) (rysunek 16), a stężeniem glicerolu bezwodnego (x1) i azotanu amonu (x2) wskazuje, że najwyższą szybkość objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP=0,106 g dm -3 h -1 ) uzyskano przy początkowym stężeniu glicerolu odpadowego w podłożu hodowlanym wynoszącym x1=120 g dm -3 i stężeniu azotanu amonu x2=3,0 g dm -3. Zmniejszenie stężenia azotanu amonu do x2=2,0 g dm -3 wpłynęło na znaczne zmniejszenie szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego. Rysunek 16. Powierzchnia odpowiedzi przedstawiająca zależność szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (R P) od stężenia glicerolu odpadowego (x 1) i stężenia azotanu amonu (x 2) Analiza interakcji pomiędzy współczynnikiem efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef) (rysunek 17), a stężeniem glicerolu bezwodnego (x1) i azotanu amonu (x2) wskazuje, że najkorzystniejszy przedział wartości zmiennych wejściowych to: x1 = g dm -3 i x2 = 2,5 3,0 g dm -3. Zmniejszenie stężenia glicerolu bezwodnego poniżej 80 g dm -3 oraz azotanu amonu poniżej 2,5 g dm -3 powodowało znaczne zmniejszenie wartości współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego 98

99 Rysunek 17. Powierzchnia odpowiedzi przedstawiająca zależność współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (K ef) od stężenia glicerolu odpadowego (x 1) i stężenia azotanu amonu (x 2) W celu wyznaczenia wartości optymalnych zmiennych wejściowych ze względu na trzy wybrane kryteria: końcowe stężenie kwasu cytrynowego w podłożu (PK), szybkość objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) i współczynnik efektywności biosyntezy (Kef), wykorzystano metodę funkcji użyteczności opisaną w podrozdziale Profile aproksymowanych wartości zmiennych oraz ich użyteczności przedstawiono na rysunku 18. Największą wartość użyteczności 0,84 uzyskano dla następujących optymalnych wartości analizowanych parametrów składu podłoża hodowlanego: stężenie glicerolu odpadowego 114,14 g dm -3, stężenie NH4NO3 2,85 g dm -3, stężenie KH2PO4 0,2 g dm -3, stężenie MgSO4 7H2O 0,2 g dm -3. Dla tak wyznaczonego składu podłoża hodowlanego przeprowadzono eksperyment weryfikacyjny w wyniku, którego uzyskano następujące wartości wybranych kryteriów optymalizacji PK=45,02 g dm -3, RP=0,130 g dm -3 h -1, Kef=5,13 % g dm -3 h -1. Ustalony optymalny skład podłoża hodowlanego z użyciem glicerolu odpadowego stosowano w dalszych badaniach procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z udziałem Aspergillus niger PD

100 NH 4 NO 3 [g dm 3 ] Glicerol odpadowy [g dm 3 ] Użyteczność 50,00 33,37 P K [g dm 3 ] 0,,5 1, 38,15 21,88 5,60-10,00 0,14 0,09 R P [g dm -3 h -1 ] 0,,5 1, 0,106 0,064 0,021-0,04 5,00 2,74-3,00 K ef [% g dm -3 h -1 ] 0,,5 1, 3,37 1,76 0,15 0,8391 Użyteczność 1,79 2,85 3,20 71,72 128,28 114,14 Rysunek 18. Profile aproksymowanych wartości i użyteczność dla optymalnych wartości analizowanych parametrów składu podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym Wpływ początkowego stężenia glicerolu na szybkość i efektywność kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Okresowe hodowle wgłębne prowadzone w podłożach z glicerolem bezwodnym W tym etapie badań okresowych hodowli wgłębnych (BC) badano wpływ początkowego stężenia glicerolu bezwodnego w podłożu hodowlanym w zakresie od 100 do 200 g dm -3 na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego. Okresowe hodowle wgłębne prowadzono w bioreaktorach laboratoryjnych BIOMER 10. Wpływ początkowego stężenia glicerolu bezwodnego w podłożu hodowlanym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze przedstawiono w tabeli 35 i na rysunku

101 Tabela 35. Wpływ początkowego stężenia glicerolu bezwodnego w podłożu hodowlanym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD-66 prowadzonych w bioreaktorze Symbol Jednostka Parametr Początkowe stężenie glicerolu w podłożu, G0 [g dm -3 ] 100,00 150,00 200,00 t h Czas trwania hodowli 185,00 236,00 258,00 GK g dm -3 RS g dm -3 h -1 RSmax g dm -3 h -1 Końcowe stężenie glicerolu bezwodnego w podłożu Średnia szybkość objętościowa zużywania substratu Maksymalna szybkość objętościowa zużywania substratu 0,28 1,72 39,99 0,555 0,618 0,626 0,830 1,002 0,982 QS g g -1 h -1 Średnia szybkość właściwa zużywania substratu 0,042 0,037 0,038 QSmax g g -1 h -1 Maksymalna szybkość właściwa zużywania substratu 0,133 0,135 0,166 XK g dm -3 Końcowe stężenie biomasy w podłożu 13,16 16,80 16,48 RX g dm -3 h -1 Średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,068 0,072 0,064 RXmax g dm -3 h -1 Maks. szybkość obj. wzrostu biomasy 0,190 0,177 0,243 µmax g g -1 h -1 Szybkość właściwa wzrostu biomasy 0,0003 0,001 0,003 PK g dm -3 RP g dm -3 h -1 RPmax g dm -3 h -1 QP g g -1 h -1 QPmax g g -1 h -1 Końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu Średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maksymalna szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maks. szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 86,11 121,10 122,46 0,465 0,513 0,475 0,897 0,379 0,423 0,035 0,031 0,029 0,068 0,022 0,026 YX/S % (m/m) Wydajność biosyntezy biomasy 12,79 11,44 8,18 YP/S % (m/m) Kef % g dm -3 h -1 Wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Współczynnik efektywności biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 83,69 82,05 61,23 38,95 42,10 29,06 Analiza uzyskanych wyników wykazała, że wraz ze wzrostem początkowego stężenia glicerolu bezwodnego w podłożu hodowlanym, w zakresie od 100 do 200 g dm -3, następował wzrost stężenia kwasu cytrynowego (PK) z 86,11 do 122,46 g dm -3. Najwyższą szybkość objętościową (RP=0,513 g dm -3 h -1 ) oraz najkorzystniejszy współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef=42,10 % g dm -3 h -1 ) otrzymano w hodowlach prowadzonych w podłożu hodowlanym zawierającym 150 g dm -3 glicerolu bezwodnego. Zarówno zwiększenie, jak i zmniejszenie stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym spowodowało obniżenie produktywności i efektywności, wyrażonej przez współczynnik 101

102 efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego. Wzrost stężenia substratu przyczynił się do wydłużenia czasu bioprocesu ze 185 do 258 godzin, a także zmniejszenia całkowitej wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego substratu (do wartości YP/S=61,23% (m/m)). Najwyższą całkowitą wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego (YP/S=83,69% (m/m)) uzyskano w hodowlach prowadzonych w podłożach hodowlanych zawierających 100 g dm -3 glicerolu bezwodnego. Wraz ze wzrostem stężenia glicerolu bezwodnego w podłożu hodowlanym wzrastała średnia szybkość objętościowa zużywania substratu (RS) z 0,555 do 0,626 g dm -3 h -1, a także końcowe stężenie nieprzefermentowanego glicerolu bezwodnego w podłożu. Jakościowa i ilościowa analiza kwasów organicznych wykazała obecność jedynie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym, co świadczyło wysokiej czystości chemicznej uzyskiwanego kwasu cytrynowego. Obserwacje makro i mikroskopowe wykazały, że wzrost grzybni Aspergillus niger PD 66 w bioreaktorze rozpoczynał się już w pierwszej dobie hodowli. Pod koniec pierwszej doby hodowli obserwowano kiełkujące zarodniki. Grzybnia Aspergillus niger przyjmowała formę mocno rozgałęzionych strzępek (około 50%) tworzących puszystą grzybnię. Krótkie strzępki o długości od 0,5 do 1,0 mm stanowiły około 35%, natomiast kuleczki o średnicy około 1,0 mm pozostałe 15% grzybni. W ostatnich dobach hodowli większość form grzybni stanowiły krótkie strzępki (około 80%) o długości około 1,0 mm. Przebieg przykładowej okresowej hodowli wgłębnej prowadzonej w podłożu zawierającym 150 g dm - 3 glicerolu bezwodnego oraz kształtowanie się parametrów charakteryzujących biosyntezę kwasu cytrynowego, zużywanie substratu oraz wzrost biomasy przedstawiono na rysunkach 20, 21 i 22. Z analizy przebiegu hodowli wynika, że w trzech pierwszych dobach obserwowano głównie wzrost grzybni w podłożu hodowlanym, który najwyższą szybkość właściwą biosyntezy biomasy (µ=0,050 g g -1 h -1 ) osiągnął w pierwszej dobie hodowli. W pierwszej i drugiej dobie hodowli przyrostowi grzybni towarzyszyła największa szybkość właściwa zużywania glicerolu bezwodnego, która wynosiła odpowiednio: 0,297 g g -1 h -1 i 0,120 g g - 1 h -1. Najwyższą szybkość objętościową wzrostu biomasy (RX), wynoszącą 0,120 g dm -3 h -1 i 0,117 g dm -3 h -1 odnotowano odpowiednio w czwartej i piątej dobie hodowli. W czwartej dobie procesu nastąpiło spowolnienie wzrostu grzybni, czego konsekwencją było znaczne obniżenie szybkości objętościowej i właściwej wzrostu biomasy. 102

103 P [g dm -3 ]; Y P/S [%] R P, R Pmax [g dm -3 h -1 ]; Q P, Q Pmax [g g -1 h -1 ] Y P/S [%]; K ef [g dm -3 h -1 ] R P [g dm -3 h -1 ] 90,00 80,00 83,69 0,465 0,513 82,05 0,475 0,540 0,480 70,00 60,00 61,23 0,420 0,360 50,00 40,00 30,00 38,95 42,10 29,06 0,300 0,240 0,180 20,00 0,120 10,00 0,060 0,00 100,00 150,00 200,00 0,000 G 0 [g dm -3 ] Yp/s Kef Rp Rysunek 19. Porównanie wydajności (Y P/S), szybkości objętościowych (R P) i współczynników efektywności (K ef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu o różnym początkowym stężeniu glicerolu bezwodnego 140,00 1, ,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0, t [h] P Yp/s Rp Rpmax Qp Qpmax Rysunek 20. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia kwasu cytrynowego (P), wydajności (Y P/S), szybkości objętościowej (R P), maksymalnej szybkości objętościowej (R Pmax), szybkości właściwej (Q P) oraz maksymalnej szybkości właściwej (Q Pmax) biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu zawierającym 150 g dm -3 glicerolu bezwodnego 103

104 X [g dm -3 ]; Y X/S [%] R X, R Xmax [g dm -3 h -1 ]; µ [g g -1 h -1 ] G [g dm-3] R S, R Smax [g dm -3 h -1 ]; Q S, Q Smax [g g -1 h -1 ] 160,0 1, ,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0, t [h] G Rs Rsmax Qs Qsmax Rysunek 21. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia glicerolu bezwodnego (G), szybkości objętościowej (R S), maksymalnej szybkości objętościowej (R Smax), szybkości właściwej (Q S) oraz maksymalnej szybkości właściwej (Q Smax) jego zużywania w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu zawierającym 150 g dm -3 glicerolu bezwodnego 18,00 0,210 16,00 14,00 12,00 0,180 0,150 10,00 0,120 8,00 0,090 6,00 4,00 2,00 0,060 0,030 0,00 0, t [h] X Yx/s Rx Rxmax µ Rysunek 22. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia biomasy (X), wydajności (Y X/S), szybkości objętościowej (R X), szybkości właściwej (µ) jej wzrostu w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu zawierającym 150 g dm -3 glicerolu bezwodnego 104

105 Ograniczenie wzrostu biomasy było wynikiem wyczerpania źródła azotu oraz mikroelementów w podłożu hodowlanym [182]. Nagromadzanie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym nastąpiło po upływie trzeciej doby hodowli. Najwyższą szybkość właściwą (QP=0,085 g g -1 h -1 ) oraz szybkość objętościową (RP=1,152 g dm -3 h -1 ) biosyntezy kwasu cytrynowego stwierdzono w piątej dobie hodowli. Wysoka szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego utrzymywała się do siódmej doby hodowli. Największy wzrost szybkości objętościowej zużywania glicerolu bezwodnego obserwowano w czwartej (RP=1,002 g dm -3 h -1 ) i piątej (RP=0,961 g dm -3 h -1 ) dobie hodowli, czyli w okresie największej szybkości biosyntezy kwasu cytrynowego oraz intensywnego wzrostu biomasy. Przeprowadzone badania potwierdziły, że określony w drodze optymalizacji, z użyciem funkcji użyteczności, skład podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym pozwolił na uzyskanie najwyższej efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego. Stąd podjęto decyzję, że do dalszych badań stosowane będzie podłoże zawierające 150,00 g dm -3 glicerolu bezwodnego. Okresowe hodowle wgłębne prowadzone w podłożach z glicerolem odpadowym W tym etapie badań przeprowadzono okresowe hodowle wgłębne (BC) w bioreaktorach z użyciem glicerolu odpadowego jako głównego źródła węgla. W hodowlach tych zbadano wpływ zoptymalizowanego składu podłoża hodowlanego zawierającego 114,14 g dm -3 glicerolu odpadowego, a także odpowiednio niższego (90 g dm -3 ) i wyższego (130 g dm -3 ) stężenia glicerolu w podłożu hodowlanym, przy zachowaniu zoptymalizowanego stężenia pozostałych składników podłoża na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego. Wyniki badań wpływu początkowego stężenia glicerolu odpadowego w podłożu hodowlanym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze przedstawiono w tabeli 36. Analiza uzyskanych wyników badań potwierdziła, że najkorzystniejsze parametry kinetyczne charakteryzujące biosyntezę kwasu cytrynowego uzyskano w hodowlach prowadzonych z użyciem wcześniej zoptymalizowanego składu podłoża hodowlanego. Czas przebiegu okresowej hodowli wgłębnej prowadzonej w podłożu zawierającym 114,14 g dm - 3 glicerolu odpadowego był najkrótszy i wynosił 157 godzin. Końcowe stężenie kwasu cytrynowego (PK) wynosiło 69,70 g dm -3, natomiast wydajność biosyntezy 105

106 kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego glicerolu odpadowego wynosiła 61,00% (m/m). Średnia szybkość objętościowa oraz właściwa biosyntezy kwasu cytrynowego wyniosły odpowiednio RP=0,444 g dm -3 h -1 i QP=0,023 g g -1 h -1. Uzyskano również najwyższą efektywność, wyrażoną przez współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef=27,08 % g dm -3 h -1 ). Tabela 36. Wpływ początkowego stężenia glicerolu odpadowego w podłożu hodowlanym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD-66 prowadzonych w bioreaktorze Symbol Jednostka Parametr Początkowe stężenie glicerolu w podłożu, G0 [g dm -3 ] 90,00 114,14 130,00 t h Czas trwania hodowli GK g dm -3 RS g dm -3 h -1 RSmax g dm -3 h -1 Końcowe stężenie glicerolu odpadowego w podłożu Średnia szybkość objętościowa zużywania substratu Maksymalna szybkość objętościowa zużywania substratu 1,20 0,50 12,10 0,421 0,724 0,420 0,707 0,977 0,858 QS g g -1 h -1 Średnia szybkość właściwa zużywania substratu 0,023 0,037 0,022 QSmax g g -1 h -1 Maksymalna szybkość właściwa zużywania substratu 0,081 0,149 0,160 XK g dm -3 Końcowe stężenie biomasy w podłożu 18,04 19,40 18,72 RX g dm -3 h -1 Średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,085 0,124 0,067 RXmax g dm -3 h -1 Maks. szybkość obj. wzrostu biomasy 0,254 0,183 0,233 µmax g g -1 h -1 Szybkość właściwa wzrostu biomasy 0,001 0,003 0,004 PK g dm -3 RP g dm -3 h -1 RPmax g dm -3 h -1 QP g g -1 h -1 QPmax g g -1 h -1 Końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu Średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maksymalna szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maks. szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 42,00 69,70 54,25 0,199 0,444 0,193 0,467 0,875 0,423 0,011 0,023 0,010 0,029 0,049 0,029 YX/S % (m/m) Wydajność biosyntezy biomasy 20,00 17,00 14,40 YP/S % (m/m) Kef % g dm -3 h -1 Wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Współczynnik efektywności biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 46,70 61,00 41,73 9,30 27,08 8,05 106

107 Y P/S [%]; K ef [% g dm -3 h -1 ] R P [g dm -3 h -1 ] Porównanie wydajności (YP/S), szybkości objętościowych (RP) i współczynników efektywności (Kef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu o różnym początkowym stężeniu glicerolu odpadowego przedstawiono na rysunku 23. Zwiększenie stężenia glicerolu odpadowego do 130 g dm -3 wpłynęło na wydłużenie czasu biosyntezy o 124 godziny. Podobnie w przypadku obniżenia stężenia glicerolu do 90 g dm -3 czas hodowli uległ wydłużeniu do 211 godzin. Zwiększenie stężenia substratu w podłożu hodowlanym przyczyniło się do obniżenia końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK=54,24 g dm -3 ) oraz wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego glicerolu odpadowego (YP/S=41,73 %(m/m)). Spowolnieniu uległa szybkość biosyntezy kwasu cytrynowego, która w hodowlach prowadzonych w podłożach z glicerolem w stężeniu 130 g dm -3 wynosiła RP=0,193 g dm -3 h ,00 60,00 0,444 61,00 0,490 0,420 50,00 40,00 46,70 43,62 41,73 0,350 0,280 30,00 0,199 0,193 0,210 20,00 0,140 10,00 6,82 6,09 0,070 0,00 90,00 114,14 130,00 Yp/s Kef Rp 0,000 G 0 [g dm -3 ] Rysunek 23. Porównanie wydajności (Y P/S), szybkości objętościowych (R P) i współczynników efektywności (K ef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu o różnym początkowym stężeniu glicerolu odpadowego Z analizy wyników przeprowadzonych badań wynika, że w przypadku glicerolu odpadowego użytego jako główne źródło węgla do biosyntezy kwasu cytrynowego, wyższe stężenia tego substratu wpływają na obniżenie efektywności bioprocesu. Wiąże się to ze 107

108 zwiększeniem ilości zanieczyszczeń obecnych w glicerolu odpadowym, takich jak metanol oraz chlorek sodu, które wpływają na obniżenie szybkości i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego. Makro i mikroskopowe obserwacje grzybni w hodowlach Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w podłożu zawierającym glicerol odpadowy wykazały, że grzybnia charakteryzowała się dużą gęstością i żółtą barwą, utrzymującą się do ostatniej doby hodowli. Grzybnia rosła głównie w postaci krótkich strzępek o długości od 0,5 do 2,0 mm. Obecna była również luźna bezpostaciowa grzybnia stanowiąca około 30%, natomiast pozostałą część stanowiły kuleczki o średnicy od 1,0 do 2,0 mm. W ostatniej dobie hodowli w podłożu dominowała grzybnia w formie krótkich kłaczkowatych strzępek oraz kuleczek. Przebieg przykładowej okresowej hodowli wgłębnej prowadzonej w podłożu zawierającym 114,14 g dm -3 glicerolu bezwodnego oraz kształtowanie się parametrów charakteryzujących biosyntezę kwasu cytrynowego, zużywanie substratu oraz wzrost biomasy przedstawiono na rysunkach 24, 25 i 26. Analiza przebiegu biosyntezy wykazała, że w pierwszych dwóch dobach hodowli obserwowano głownie przyrost grzybni, który najwyższą szybkość właściwą wzrostu (µ=0,077 g g -1 h -1 ) osiągnął w pierwszej dobie hodowli. Szybkiemu wzrostowi grzybni w pierwszej dobie hodowli towarzyszyła najwyższa szybkość objętościowa (RS=0,378 g dm - 3 h -1 ) i właściwa (QS=0,631 g g -1 h -1 ) zużywania glicerolu odpadowego. Najwyższą szybkość objętościową wzrostu biomasy stwierdzono w trzeciej i czwartej dobie hodowli wynoszącą odpowiednio 0,180 i 0,183 g dm -3 h -1. Nagromadzanie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym rozpoczęło się w trzeciej dobie hodowli. Począwszy od czwartej doby nastąpił znaczny wzrost szybkości objętościowej oraz właściwej biosyntezy kwasu cytrynowego. Duża szybkość biosyntezy utrzymywała się do ostatniej siódmej doby i wynosiła RP=0,444 g dm -3 h -1. Stężenie glicerolu odpadowego w podłożu hodowlanym malało od początku hodowli. W czwartej dobie hodowli obserwowano duży wzrost szybkości objętościowej zużywania substratu (do wartości RS=0,844 g dm -3 h -1.) spowodowany przede wszystkim wzrostem szybkości produkcji kwasu cytrynowego. Natomiast najwyższe szybkości objętościowe zużywania glicerolu odpadowego (RS), wynoszące odpowiednio 0,977 g dm -3 h -1 i 0,928 g dm -3 h -1 uzyskano w piątej i szóstej dobie hodowli. 108

109 G [g dm -3 ] R S, R Smax [g dm -3 h -1 ]; Q S, Q Smax [g g -1 h -1 ] P [g dm -3 ]; Y P/S [%] R P, R Pmax [g dm -3 h -1 ]; Q P, Q Pmax [g g -1 h -1 ] 80,0 70,0 60,0 1,200 1,050 0,900 50,0 0,750 40,0 0,600 30,0 0,450 20,0 0,300 10,0 0,150 0, t [h] 0,000 P Yp/s Rp Rpmax Qp Qpmax Rysunek 24. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia kwasu cytrynowego (P), wydajności (Y P/S), szybkości objętościowej (R P) maksymalnej szybkości objętościowej (R Pmax), szybkości właściwej (Q P) oraz maksymalnej szybkości właściwej (Q Pmax) biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu zawierającym 114,14 g dm -3 glicerolu odpadowego 120,0 1, ,0 1,000 80,0 0,800 60,0 0,600 40,0 0,400 20,0 0,200 0, t [h] 0,000 G Rs Rsmax Qs Qsmax Rysunek 25. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia glicerolu bezwodnego (G), szybkości objętościowej (R S), maksymalnej szybkości objętościowej (R Smax), szybkości właściwej (Q S) oraz maksymalnej szybkości właściwej (Q Smax) jego zużywania w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu zawierającym 114,14 g dm -3 glicerolu odpadowego 109

110 X [g dm -3 ]; Y X/S [%] R X, R Xmax [g dm -3 h -1 ]; µ [g g -1 h -1 ] 25,0 0,2 20,0 0,16 15,0 0,12 10,0 0,08 5,0 0,04 0, t [h] 0 X Yx/s Rx Rxmax µ Rysunek 26. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia biomasy (X), wydajności (Y X/S), szybkości objętościowej (R X) i szybkości właściwej (µ) jej wzrostu w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu zawierającym 114,14 g dm -3 glicerolu bezwodnego W oparciu o uzyskane wyniki stwierdzono, że w dalszych etapach hodowli Aspergillus niger PD 66 w podłożach zawierających glicerol odpadowy będzie stosowane podłoże zawierające 114,14 g dm -3 glicerolu odpadowego. Wpływ dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Okresowe hodowle wgłębne prowadzone w podłożach z glicerolem bezwodnym W celu maksymalizacji wydajności i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger PD 66 postanowiono zbadać wpływ dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego zawierającego glicerol jako główne źródło węgla. Sacharoza, ze względu na niską masę cząsteczkową oraz szybki transport do wnętrza komórki, jest najbardziej fizjologicznym źródłem węgla dla grzybów strzępkowych Aspergillus niger. Dlatego też jej dodatek do podłoża hodowlanego powinien umożliwić poprawę potencjału 110

111 metabolicznego komórek Aspergillus niger, a w efekcie zwiększenie szybkości i wydajności bioprocesu. W tym etapie badań okresowych hodowli wgłębnych Aspergillus niger PD 66 analizowano wpływ dodatku sacharozy (w ilości od 7,50 do 50 g dm -3 ) do podłoża hodowlanego na szybkość i wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego. W pierwszej serii tych badań oceniono wpływ początkowego stężenia sacharozy w podłożu hodowlanym z glicerolem bezwodnym na kształtowanie się parametrów biosyntezy kwasu cytrynowego. Wyniki badań dotyczące wpływu dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w bioreaktorze przedstawiono w tabeli 37 i na rysunku 27. Analiza wyników badań zawartych w tabeli 37 wykazała, że najlepsze paramenty charakteryzujące przebieg fermentacji i tworzenia produktu otrzymano w hodowlach, w których początkowe stężenie sacharozy w podłożu hodowlanym wyniosło 15 g dm -3 (10% (m/m)). Końcowe stężenie kwasu cytrynowego (PK) w tych hodowlach wynosiło 143,33 g dm -3. Średnia szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) wynosiła 0,607 g dm -3 h -1, a całkowita wydajność (YP/S) biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego substratu osiągnęła wartość 95,80% (m/m). W tym wariancie najkorzystniejszy był również współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef) równy 58,15 % g dm -3 h -1. Dodatek sacharozy, w stężeniach 37,50 g dm -3 (25% (m/m)) oraz 50 g dm -3 (33% (m/m)), wpłyną na zmniejszenie końcowego stężenia kwasu cytrynowego (PK) w podłożu hodowlanym nawet o 10%. Wraz ze wzrostem stężenia sacharozy w podłożu hodowlanym (od 15 do 50 g dm -3 ) obniżeniu uległa całkowita wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego (YP/S) w stosunku do wprowadzonego substratu, z 95,80% (m/m) do 86,88% (m/m). Współczynniki efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef), przy stężeniach sacharozy 37,5 oraz 50 g dm -3, były zbliżone do wartości uzyskiwanych w hodowlach bez dodatku sacharozy i wynosiły odpowiednio 48,34 i 47,87 % g dm -3 h -1. Sacharoza dodana do podłoża hodowlanego w stężeniu 7,50 g dm -3 (5% (m/m)) nie wpłynęła na poprawę parametrów opisujących biosyntezę kwasu cytrynowego. Średnia szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) w tych hodowlach wyniosła 0,474 g dm -3 h -1, a całkowita wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego (YP/S) była równa 93,50% (m/m). Współczynnik efektywności biosyntezy 111

112 kwasu cytrynowego wynosił 44,32 % g dm -3 h -1 i osiągnął wartości niższe, niż w hodowlach bez dodatku sacharozy. Tabela 37. Wpływ dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego z glicerolem bezwodnym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w bioreaktorze Symbol Jednostka Parametr Początkowe stężenie sacharozy w podłożu, SSC [g dm -3 ] 7,50 15,00 37,50 50,00 t h Czas trwania hodowli ,00 G0 g dm -3 Początkowe stężenie glicerolu w podłożu 142,50 135,00 112,50 100,00 S0 g dm -3 Początkowe stężenie substratu (glicerol+sacharoza) w podłożu 150,00 150,00 150,00 150,00 GK g dm -3 Końcowe stężenie glicerolu w podłożu 32,00 4,76 5,66 0,91 RS g dm -3 h -1 RSmax g dm -3 h -1 QS g g -1 h -1 QSmax g g -1 h -1 Średnia szybkość objętościowa zużywania substratu Maksymalna szybkość objętościowa zużywania substratu Średnia szybkość właściwa zużywania substratu Maksymalna szybkość właściwa zużywania substratu 0,496 0,605 0,550 0,630 0,983 0,888 1,206 1,120 0,039 0,430 0,041 0,050 0,172 0,117 0,125 0,228 XK g dm -3 Końcowe stężenie biomasy w podłożu 12,70 13,32 13,36 12,48 RX g dm -3 h -1 Średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,055 0,056 0,052 0,053 RXmax g dm -3 h -1 Maks. szybkość obj. wzrostu biomasy 0,147 0,003 0,175 0,180 µ g g -1 h -1 Szybkość właściwa wzrostu biomasy 0,0003 0,0030 0,0003 0,0003 PK g dm -3 RP g dm -3 h -1 RPmax g dm -3 h -1 QP g g -1 h -1 QPmax g g -1 h -1 Końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu Średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maksymalna szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maks. szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 110,40 143,33 135,68 128,80 0,474 0,607 0,526 0,551 0,869 0,962 0,345 0,986 0,037 0,046 0,039 0,440 0,080 0,093 0,950 0,120 YX/S % (m/m) Wydajność biosyntezy biomasy 8,500 8,900 9,100 8,40 YP/S % (m/m) Kef % g dm -3 h -1 Wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Współczynnik efektywności biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 93,50 95,80 91,90 86,88 44,32 58,15 48,34 47,87 112

113 Y P/S [%]; K ef [% g dm -3 h -1 ] R P [g dm -3 h -1 ] 120,00 0, ,00 80,00 93,50 0,474 95,80 0,607 91,90 0,526 86,88 0,551 0,600 0,500 60,00 44,32 58,15 48,34 47,87 0,400 0,300 40,00 0,200 20,00 0,100 0,00 7, ,5 50 Yp/s Kef Rp 0,000 S SC [g dm -3 ] Rysunek 27. Porównanie wydajności (Y P/S), szybkości objętościowych (R P) i współczynników efektywności (K ef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu o różnym początkowym stężeniu sacharozy Obserwacje mikro i makroskopowe wykazały, że we wszystkich hodowlach dominowała forma bezpostaciowej luźnej i nitkowatej grzybni. Obserwowano również nieliczne zbite skupiska grzybni (około 20%), a także kuleczki o średnicy około 0,5 mm (około 5%). Przebieg przykładowej okresowej hodowli wgłębnej prowadzonej w podłożu hodowlanym o początkowym stężeniu sacharozy 15 g dm -3 oraz kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących biosyntezę kwasu cytrynowego, zużywanie substratu oraz wzrost biomasy przedstawiono na rysunkach 28, 29, 30, 31. W pierwszej dobie hodowli obserwowano znaczny wzrost szybkości objętościowej (RS =0,820 g dm -3 h -1 ) i właściwej (QS=1,366 g g -1 h -1 ) zużywania substratu. W następnej dobie szybkość objętościowa substratu spadła i ponownie zaczęła wzrastać w czwartej dobie hodowli (rysunek 30). Analizując przebieg zmian parametrów charakteryzujących zużywanie glicerolu bezwodnego i sacharozy (rysunek 28) zaobserwowano, że w pierwszej dobie hodowli znacząco zwiększyła się szybkość objętościowa zużywania glicerolu bezwodnego (RS-PG=0,734 g dm -3 h -1 ). W drugiej dobie hodowli nastąpiło zwiększenie szybkości objętościowej zużywania sacharozy (RS- PG=0,196 g dm -3 h -1 ). i zmniejszenie szybkości objętościowej zużywania glicerolu bezwodnego (RS-SC=0,435 g dm -3 h -1 ). 113

114 G, Ssc [g g dm -3 ] R S [g dm -3 ] Ponowny wzrost szybkości objętościowej zużywania glicerolu bezwodnego nastąpił w momencie wyczerpania sacharozy w podłożu hodowlanym. Nagromadzanie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym rozpoczęło się po upływie drugiej doby hodowli. Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego wzrastała w trakcie hodowli i utrzymywała się na wysokim poziome do ostatniej doby hodowli. Największą szybkość objętościową biosyntezy biomasy (RX), wynoszącą 0,130 g dm -3 h -1 stwierdzono w trzeciej dobie hodowli. Porównanie wydajności, szybkości objętościowych i współczynników efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu o różnym początkowym stężeniu sacharozy oraz bez dodatku sacharozy przedstawiono na rysunku ,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0, t [h] G Ssc Rs-g Rs-sc Rysunek 28. Przebieg zmian stężenia glicerolu bezwodnego, sacharozy oraz szybkości objętościowych ich zużywania w czasie okresowych hodowli wgłębnych prowadzonych w podłożu zawierającym 135 g dm -3 glicerolu bezwodnego i 15 g dm -3 sacharozy Zestawienie wyników uzyskanych w hodowli prowadzonej w podłożu z dodatkiem sacharozy z wynikami w hodowli bez jej dodatku wykazało, że suplementacja podłoża hodowlanego sacharozą wpłynęła na: zwiększenie końcowego stężenia kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym o około 20,00 g dm -3, 114

115 S [g dm -3 ] R S, R Smax [g dm -3 h -1 ]; Q S, Q Smax [g g -1 h -1 ] P [g dm -3 ]; Y P/S [%] R P, R Pmax [g dm -3 h -1 ]; Q P, Q Pmax [g g -1 h -1 ] 160,0 140,0 1,050 0, ,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 0,750 0,600 0,450 0,300 0,150 0, t [h] P Yp/s Rp Rpmax Qp Qpmax Rysunek 29. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia kwasu cytrynowego (P), wydajności (Y P/S), szybkości objętościowej (R P), maksymalnej szybkości objętościowej (R Pmax), szybkości właściwej (Q P) oraz maksymalnej szybkości właściwej (Q Pmax) biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowej hodowli wgłębnej Aspergillus niger PD 66 prowadzonej w podłożu zawierającym 135 g dm -3 glicerolu bezwodnego i 15 g dm - 3 sacharozy 160,0 140,0 120,0 1,600 1,400 1, ,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0, t [h] S Rs Rsmax Qs Qsmax Rysunek 30. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia substratu (glicerol+sacharoza) (S), szybkości objętościowej (R S), maksymalnej szybkości objętościowej (R Smax), szybkości właściwej (Q S) oraz maksymalnej szybkości właściwej (Q Smax) jego zużywania okresowej hodowli wgłębnej Aspergillus niger PD 66 prowadzonej w podłożu zawierającym 135 g dm -3 glicerolu bezwodnego i 15 g dm -3 sacharozy 115

116 Y P/S [%]; K ef [% g dm -3 h -1 ] R P [g dm -3 h -1 ] X [g dm -3 ]; Y X/S [%] R X, R Xmax [g dm -3 h -1 ]; µ max [g g -1 h -1 ] 14,0 0,240 12,0 0,200 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,160 0,120 0,080 0,040 0,0 0, t [h] X Yx/s Rx Rxmax µ Rysunek 31. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia biomasy (X), wydajności (Y X/S), szybkości objętościowej (R X), maksymalnej szybkości właściwej (µ) jej wzrostu w okresowej hodowli wgłębnej Aspergillus niger PD 66 prowadzonej w podłożu zawierającym 135 g dm -3 glicerolu bezwodnego i 15 g dm -3 sacharozy 120,00 0, ,00 80,00 0,513 82,07 93,50 0,474 95,80 0,607 91,900,526 0,551 86,88 0,600 0,500 60,00 40,00 42,11 44,32 58,15 48,34 47,87 0,400 0,300 0,200 20,00 0,100 0,00 0 7, ,5 50 Yp/s Kef Rp 0,000 S SC [g dm -3 ] Rysunek 32. Porównanie wydajności (Y P/S), szybkości objętościowych (R P) i współczynników efektywności (K ef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu o różnym początkowym stężeniu sacharozy oraz bez dodatku sacharozy 116

117 zwiększenie całkowitej wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego substratu o około 10%, przyśpieszenie rozpoczęcia nagromadzania kwasu cytrynowego po upływie drugiej doby hodowli, wydłużenie czasu intensywnej biosyntezy kwasu cytrynowego, zwiększenie szybkości objętościowej i właściwej biosyntezy kwasu cytrynowego, redukcję końcowego stężenia biomasy o około 30%. W oparciu o analizę przedstawionych wyników badań stwierdzono, że w dalszych etapach badań do podłoża hodowlanego, w którym głównym źródłem jest glicerol bezwodny o stężeniu 125 g dm -3 należy dodawać 15 g dm -3 sacharozy. Okresowe hodowle wgłębne prowadzone w podłożach z glicerolem odpadowym W tym etapie badań oceniano wpływ dodatku sacharozy (w ilości od 5,71 do 38,12 g dm -3, tj. od 5 do 33%), do podłoża hodowlanego zawierającego glicerol odpadowy, tak aby początkowe stężenie substratu wynosiło 114,14 g dm -3, na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego. Wyniki badań dotyczące wpływu dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w bioreaktorze przedstawiono w tabeli 38 i na rysunku 33. Analiza wyników wykazała, że najwyższą całkowitą wydajność w stosunku do wprowadzonego substratu (YP/S=79,30% (m/m)) oraz szybkość objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego (RP=0,492 g dm -3 h -1 ) uzyskano w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w podłożu początkowym stężeniu sacharozy wynoszącym 11,44 g dm -3 (10% (m/m)). Współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef) w tych hodowlach był najwyższy i wynosił 39,00 % g dm -3 h -1. W hodowlach w których początkowe stężenie sacharozy w podłożu hodowlanym wynosiło 28,54 g dm -3 (25% (m/m)) końcowe stężenie kwasu cytrynowego (PK) było równe 88,66 g dm -3, natomiast całkowita wydajność (YP/S) biosyntezy kwasu cytrynowego wyniosła 77,60% (m/m). Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) w tych hodowlach była niższa o 0,066 g dm -3 h -1. Podobnie jak w przypadku hodowli z glicerolem bezwodnym, 5%-wy 117

118 dodatek sacharozy spowodował obniżenie końcowego stężenie kwasu cytrynowego (PK) oraz całkowitej wydajności biosyntezy (YP/S) kwasu cytrynowego o ponad 50%. Początkowe stężenie sacharozy wynoszące 38,12 g dm -3 (33% (m/m)) również nie wpłynęło korzystnie na efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego. Tabela 38. Wpływ dodatku sacharozy do podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w bioreaktorze Symbol Jednostka Parametr Początkowe stężenie sacharozy w podłożu, Ssc [g dm -3 ] 5,71 11,44 28,54 38,12 t h Czas trwania hodowli G0 g dm -3 Początkowe stężenie glicerolu w podłożu 108,43 102,80 85,60 76,30 S0 g dm -3 Początkowe stężenie substratu (glicerol+sacharoza) w podłożu 114,14 114,14 114,14 114,14 Gk g dm -3 Końcowe stężenie glicerolu w podłożu 2,62 0,76 0,51 0,21 RS g dm -3 h -1 RSmax g dm -3 h -1 QS g g -1 h -1 QSmax g g -1 h -1 Średnia szybkość objętościowa zużywania substratu Maksymalna szybkość objętościowa zużywania substratu Średnia szybkość właściwa zużywania substratu Maksymalna szybkość właściwa zużywania substratu 0,534 0,616 0,546 0,62 0,400 0,916 0,833 1,093 0,032 0,036 0,034 0,036 0,100 0,140 0,116 0,168 XK g dm -3 Końcowe stężenie biomasy w podłożu 16,64 17,32 16,00 16,92 RX g dm -3 h -1 Średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,080 0,094 0,077 0,091 RXmax g dm -3 h -1 Maks. szybkość obj. wzrostu biomasy 0,200 0,171 0,185 0,210 µ g g -1 h -1 Szybkość właściwa wzrostu biomasy 0,001 0,003 0,002 0,001 PK g dm -3 RP g dm -3 h -1 RPmax g dm -3 h -1 QP g g -1 h -1 QPmax g g -1 h -1 Końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu Średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maksymalna szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maks. szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 40,30 91,00 88,60 66,5 0,193 0,492 0,426 0,356 0,365 0,860 0,802 0,729 0,012 0,028 0,027 0,021 0,031 0,059 0,054 0,051 YX/S % (m/m) Wydajność biosyntezy biomasy 14,60 15,10 14,02 14,82 YP/S % (m/m) Kef g dm -3 h -1 Wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Współczynnik efektywności biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 35,30 79,30 77,60 58,26 6,81 39,00 33,03 20,83 118

119 Y P/S [%]; K ef [% g dm -3 h -1 ] R P [g dm -3 h -1 ] 90,00 0,600 80,00 70,00 60,00 79,30 77,60 0,492 0,426 58,26 0,356 0,500 0,400 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 35,30 0,193 6,81 39,00 33,03 20,83 0,300 0,200 0,100 0,00 5,7 11,4 28,5 38,1 Yp/s Kef Rp 0,000 S SC [g dm -3 ] Rysunek 33. Porównanie wydajności (Y P/S), szybkości objętościowych (R P) i współczynników efektywności (K ef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu o różnym początkowym stężeniu sacharozy Obserwacje mikro i makroskopowe grzybni w tych hodowlach wykazały, że grzybnia począwszy od drugiej doby hodowli rosła głównie w postaci krótkich strzępek o długości od 0,5 do 2,0 mm oraz kuleczek o średnicy od 1,0 do 2,0 mm. Luźna bezpostaciowa grzybnia stanowiła około 10%. W ostatnich dobach hodowli grzybnia była gęsta i przyjmowała formę kuleczek o średnicy od 1,0 do 2,0 mm oraz krótkich strzępek o długości około 1,0 mm. Jakościowa i ilościowa analiza kwasów organicznych wykazała obecność jedynie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym. Przebieg przykładowej okresowej hodowli wgłębnej, prowadzonej w podłożu hodowlanym zawierającym glicerol odpadowy (o stężeniu 102,80 g dm -3 i 11,44 g dm -3 sacharozy) oraz kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących biosyntezę kwasu cytrynowego, zużycie substratu oraz wzrost biomasy przedstawiono na rysunkach 34, 35, 36,37. W pierwszej dobie hodowli stwierdzono szybki wzrost szybkości objętościowej (RP=0,344 g dm -3 h -1 ) oraz właściwej (QP=0,574 g g -1 h -1 ) zużywania substratu. Porównując przebieg zużywania sacharozy oraz glicerolu odpadowego (rysunek 34) zaobserwowano, że w czwartej dobie hodowli, w momencie wyczerpywania się sacharozy w podłożu, nastąpił znaczny wzrost szybkości objętościowej zużywania glicerolu bezwodnego. W tym czasie 119

120 G, Ssc [g g dm -3 ] R S [g dm -3 ] stwierdzono również intensywny wzrost szybkości objętościowej biomasy (RX), która wynosiła 0,130 g dm -3 h -1. Nagromadzanie kwasu cytrynowego w podłożu rozpoczęło się w czwartej dobie hodowli. Szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego osiągnęła najwyższą wartość w piątej i szóstej dobie hodowli. W ostatniej dobie nastąpiło zahamowanie szybkości biosyntezy kwasu cytrynowego ze względu na wzrost stężenia kwasu cytrynowego oraz niskie stężenie źródła węgla w podłożu hodowlanym. Porównanie przebiegu okresowych hodowli wgłębnych (rysunek 38), w których zastosowano dodatek sacharozy z hodowlami bez jej dodatku wykazało, że suplementacja podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym sacharozą wydłużała czas trwania hodowli o około 40 godzin, co spowodowało wydłużenie czasu intensywnego nagromadzania kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym. Z drugiej strony 10% dodatek sacharozy przyczynił się do zwiększenia końcowego stężenia kwasu cytrynowego o około 30% oraz znacznej poprawy wydajności i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego. Dodatkowo suplementacja sacharozą wpłynęła na redukcję stężenia biomasy o około 20% w stosunku do hodowli bez jej dodatku. 120,0 1, ,0 1,000 80,0 0,800 60,0 0,600 40,0 0,400 20,0 0,200 0,0 0, G Ssc Rs-g Rs-sc t [h] Rysunek 34. Przebieg zmian stężenia glicerolu bezwodnego, sacharozy oraz szybkości objętościowych ich zużywania w czasie okresowych hodowli wgłębnych prowadzonych w podłożu zawierającym 102,80 g dm -3 glicerolu odpadowego i 11,44 g dm -3 sacharozy 120

121 S [g dm -3 ] R S, R Smax [g dm -3 h -1 ]; Q S, Q Smax [g g -1 h -1 ] P [g dm -3 ]; Y P/S [%] R P, R Pmax [g dm -3 h -1 ]; Q P, Q Pmax [g g -1 h -1 ] 100,00 1,000 80,00 0,800 60,00 0,600 40,00 0,400 20,00 0,200 0,00 0, t [h] P Yp/s Rp Rpmax Qp Qpmax Rysunek 35. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia kwasu cytrynowego (P), wydajności (Y P/S), szybkości objętościowej (R P), maksymalnej szybkości objętościowej (R Pmax), szybkości właściwej (Q P) oraz maksymalnej szybkości właściwej (Q Pmax) biosyntezy kwasu cytrynowego w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w podłożu zawierającym 102,80 g dm -3 glicerolu odpadowego i 11,44 g dm -3 sacharozy 120,00 1, ,00 1,000 80,00 0,800 60,00 0,600 40,00 0,400 20,00 0,200 0,00 0, t [h] S Rs Rsmax Qs Qsmax Rysunek 36. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia substratu (glicerol+sacharoza) (S), szybkości objętościowej (R S), maksymalnej szybkości objętościowej (R Smax), szybkości właściwej (Q S) oraz maksymalnej szybkości właściwej (Q Smax) jego zużywania w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD-66 prowadzonych w podłożu zawierającym 102,80 g dm -3 glicerolu odpadowego i 11,44 g dm -3 sacharozy 121

122 Y P/S [%]; K ef [% g dm -3 h -1 ] R P [g dm -3 h -1 ] X [g dm -3 ]; Y X/S [%] R X, R Xmax [g dm -3 h -1 ]; µ [g g -1 h -1 ] 20,00 18,00 16,00 0,200 0,180 0,160 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0, t [h] X Yx/s Rx Rxmax µ Rysunek 37. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia biomasy (X), wydajności (Y X/S), szybkości objętościowej (R X), maksymalnej szybkości właściwej (µ) jej wzrostu w okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w podłożu zawierającym 102,80 g dm -3 glicerolu odpadowego i 11,44 g dm -3 sacharozy 90,00 80,00 70,00 60,00 61,00 0,444 0,492 79,30 77,60 0,426 58,26 0,356 0,540 0,480 0,420 0,360 50,00 40,00 30,00 20,00 27,08 35,30 0,193 39,00 33,03 20,83 0,300 0,240 0,180 0,120 10,00 6,81 0,060 0,00 0 5,7 11,4 28,5 38,1 Yp/s Kef Rp 0,000 S SC [g dm -3 ] Rysunek 38. Porównanie wydajności (Y P/S), szybkości objętościowych (R P) i współczynników efektywności (K ef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w okresowych hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorze w podłożu o różnym początkowym stężeniu sacharozy oraz bez dodatku sacharozy 122

123 W oparciu o przeprowadzoną analizę otrzymanych wyników badań uznano, że 10% dodatek sacharozy do podłoża hodowlanego z glicerolem odpadowym jako głównym źródłem węgla pozwala na uzyskanie najwyższej całkowitej wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego oraz wpływa na znaczną poprawę szybkości i efektywności, wyrażonej współczynnikiem efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego. Wpływ początkowego stężenia glicerolu w podłożu oraz momentu zasilenia podłoża glicerolem na szybkość i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych Po dokonaniu analizy przebiegu okresowych hodowli wgłębnych Aspergillus niger PD-66 stwierdzono, że poprawy wydajności i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego należy upatrywać w stosowaniu zasilanych okresowych hodowli wgłębnych (FBC). W celu oceny przydatności zasilanych okresowych hodowli wgłębnych do produkcji kwasu cytrynowego z użyciem podłoża hodowlanego zawierającego w swoim początkowym składzie 100,0 g dm -3 glicerolu bezwodnego i 15,0 g dm -3 sacharozy, zbadano wpływ momentu jednorazowego zasilenia glicerolem bezwodnym w stężeniu 35,0 g dm -3 na szybkość i wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego. Z analizy przebiegu hodowli wynika, że najwcześniejszym momentem zasilenia hodowli glicerolem bezwodnym jest koniec trzeciej doby hodowli, ponieważ w tym czasie stężenie biomasy w podłożu hodowlanym jest wystraczające, a biosynteza kwasu cytrynowego przebiega z odpowiednią szybkością. Wyniki badań wpływu momentu jednorazowego zasilenia hodowli glicerolem bezwodnym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w bioreaktorze przedstawiono w tabeli 39. Po dokonaniu analizy otrzymanych wyników stwierdzono, że najkorzystniejsze parametry charakteryzujące przebieg hodowli uzyskano w hodowlach zasilanych glicerolem bezwodnym pod koniec czwartej doby. Końcowe stężenie kwasu cytrynowego w tych hodowlach wynosiło 118,40 g dm -3, natomiast całkowita wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego w stosunku do wprowadzonego substratu wynosiła 77,10% (m/m). W tym wariancie hodowli otrzymano również najwyższą wartość współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef =35,23 % g dm -3 h -1 ). 123

124 Tabela 39. Wpływ momentu jednorazowego zasilenia hodowli glicerolem bezwodnym na kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących wzrost biomasy, zużywanie substratu i biosyntezę kwasu cytrynowego w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych Aspergillus niger PD 66 prowadzonych w bioreaktorze Symbol Jednostka Parametr Moment zasilenia hodowli, tz [h] t h Czas trwania hodowli G0 g dm -3 Początkowe stężenie glicerolu w podłożu 100,0 100,0 100,0 GK g dm -3 Końcowe stężenie glicerolu w podłożu 27,8 6,5 33,9 SSC g dm -3 Początkowe stężenie sacharozy w podłożu 15,0 15,0 15,0 GZ g dm -3 Ilość glicerolu dodanego w trakcie zasilania 35,0 35,0 35,0 GS g dm -3 Sumaryczne stężenie glicerolu w podłożu 135,0 135,0 135,0 S0 g dm -3 RS g dm -3 h -1 RSmax g dm -3 h -1 QS g g -1 h -1 QSmax g g -1 h -1 Sumaryczne tężenie substratu (glicerol+sacharoza) Średnia szybkość objętościowa zużywania substratu Maksymalna szybkość objętościowa zużywania substratu Średnia szybkość właściwa zużywania substratu Maksymalna szybkość właściwa zużywania substratu 150,00 150,00 150,00 0,398 0,544 0,555 0,724 0,839 0,840 0,029 0,036 0,050 0,060 0,078 0,123 XK g dm -3 Końcowe stężenie biomasy w podłożu 13,50 15,32 11,08 RX g dm -3 h -1 Średnia szybkość objętościowa wzrostu biomasy 0,044 0,059 0,053 RXmax g dm -3 h -1 Maks. szybkość obj. wzrostu biomasy 0,129 0,185 0,105 u g g -1 h -1 Szybkość właściwa wzrostu biomasy 0,002 0,004 0,001 PK g dm -3 RP g dm -3 h -1 RPmax g dm -3 h -1 QP g g -1 h -1 QPmax g g -1 h -1 Końcowe stężenie jednowodnego kwasu cytrynowego w podłożu Średnia szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maksymalna szybkość objętościowa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Średnia szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Maks. szybkość właściwa biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 113,50 118,40 66,20 0,372 0,457 0,317 0,773 1,079 0,671 0,028 0,030 0,029 0,084 0,090 0,072 YX/S % (m/m) Wydajność biosyntezy biomasy 9,10 10,21 7,40 YP/S % (m/m) Kef g dm -3 h -1 Wydajność biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego Współczynnik efektywności biosyntezy jednowodnego kwasu cytrynowego 76,10 77,10 57,90 28,31 35,23 18,35 Opóźnienie zasilania o jedną dobę wpłynęło na obniżenie wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego (YP/S) o około 20% oraz zmniejszenie szybkości objętościowej biosyntezy 124

125 Y P/S [%]; K ef [% g dm -3 h -1 ] R P [g dm -3 h -1 ] kwasu cytrynowego (RP) o 0,085 g dm - 3 h -1. Współczynnik efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef), w hodowlach zasilanych w piątej dobie wyniósł jedynie 18,35 % g dm -3 h -1 i był zdecydowanie niższy niż w hodowlach tradycyjnych. Zasilenie hodowli glicerolem bezwodnym w trzeciej dobie spowodowało obniżenie końcowego stężenia kwasu cytrynowego o około 5 g dm -3, a całkowitej wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego o 1%. W hodowlach zasilanych w trzeciej dobie nastąpiło znaczne wydłużenie czasu trwania hodowli oraz zmniejszenie szybkości objętościowej zużywania substratu (RS=0,398 g dm -3 h -1 ) oraz szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (RP=0,372 g dm -3 h -1 ). Jakościowa i ilościowa analiza kwasów organicznych wykazała obecność jedynie kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym. Porównanie wydajności (YP/S), szybkości objętościowych (RP) i współczynników efektywności (Kef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych i okresowej hodowli wgłębnej w podłożach z glicerolem bezwodnym zaprezentowano na rysunku ,00 100,00 0,607 95,80 0,700 0,600 80,00 76,10 77,10 0,457 0,500 60,00 0,372 57,90 0,317 58,15 0,400 0,300 40,00 28,31 35,23 0,200 20,00 18,35 0,100 0, ,000 FBC BC t z [h] Yp/s Kef Rp Rysunek 39. Porównanie wpływu momentu jednorazowego zasilenia hodowli bezwodnym glicerolem na wydajność (Y P/S), szybkość objętościową (R P) i współczynnik efektywności (K ef) biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskanych w zasilanych okresowych hodowlach wgłębnych z wynikami uzyskiwanymi w okresowej hodowli wgłębnej w podłożach z glicerolem bezwodnym 125

126 Obserwacje mikro i makroskopowe grzybni w tych hodowlach wykazały, że rosła ona głównie w postaci krótkich strzępek, które tworzyły luźną, puszystą grzybnię. Obserwowano również nieliczne zbite skupiska grzybni około (20%), a także kuleczki o średnicy około 0,5 mm (około 5%). Zestawienie wyników uzyskanych w tych hodowlach z wynikami z tradycyjnych okresowych hodowli wgłębnych wykazały, że jednorazowe zasilenie hodowli glicerolem bezwodnym w stężeni 35,00 g dm -3, w każdym zbadanym momencie zasilenia wyraźnie negatywnie wpłynęło na wydajność i efektywność biosyntezy kwasu cytrynowego. Jednorazowe zasilenie glicerolem bezwodnym spowodowało obniżenie końcowego stężenia kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym o około 20%, a szybkości objętościowej i współczynnika efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego nawet o 50%. Ponadto jednorazowe zasilenie źródłem węgla wpłynęło na zwiększenie ilości nieprzefermentowanego glicerolu w podłożu hodowlanym. Przebieg przykładowej zasilanej okresowej hodowli wgłębnej prowadzonej w podłożu hodowlanym zawierającym w początkowym składzie glicerol bezwodny o stężeniu 100,0 g dm -3 i sacharozę 15,0 g dm -3, do której w 93 godzinie dodano glicerol bezwodny w ilości 35,0 g dm -3 oraz kształtowanie się parametrów kinetycznych charakteryzujących biosyntezę kwasu cytrynowego, zużycie substratu oraz wzrost biomasy przedstawiono na rysunkach 40, 41, 42. Z analizy przebiegu zasilanej okresowej hodowli wgłębnej wynika, że w pierwszej dobie hodowli po dodaniu glicerolu bezwodnego zaobserwowano zmniejszenie szybkości objętościowej biosyntezy kwasu cytrynowego (RP) o 0,064 g dm -3 h -1. W kolejnej dobie szybkość objętościowa biosyntezy kwasu cytrynowego nie osiągnęła poziomu obserwowanego przed zasileniem, utrzymywała się jednak na stałym poziomie do ostatniej doby hodowli. Jednorazowe zasilenie glicerolem nie wpłynęło na zmiany w szybkości objętościowej (RX). Porównanie przebiegu zasilanej okresowej hodowli wgłębnej z tradycyjną hodowlą okresową wykazało, że jednorazowe zasilenie hodowli glicerolem bezwodnym przyczyniło się do: zmniejszenia końcowego stężenia kwasu cytrynowego w podłożu hodowlanym o około 20%, zmniejszenia całkowitej wydajności biosyntezy kwasu cytrynowego o około 20%, rozpoczęcia nagromadzania kwasu cytrynowego w drugiej dobie hodowli. 126

127 S [g dm -3 ] R S [g dm -3 h -1 ]; Q S [g g -1 h -1 ] P [g dm -3 ]; Y P/S [%] R P [g dm -3 h -1 ]; Q P [g g -1 h -1 ] 120,00 100,00 35 g dm -3 glicerolu bezwodnego 0,600 0,500 80,00 0,400 60,00 0,300 40,00 0,200 20,00 0,100 0,00 0, t [h] P Yp/s Rp Qp Rysunek 40. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia kwasu cytrynowego (P), wydajności (Y P/S), szybkości objętościowej (R P), szybkości właściwej (Q P) biosyntezy kwasu cytrynowego w zasilanej okresowej hodowli wgłębnej Aspergillus niger PD 66, którą zasilano 35 g dm -3 glicerolu bezwodnego po upływie 93 godziny hodowli 140,0 120,0 35 g dm -3 glicerolu bezwodnego 1,400 1, ,0 1,000 80,0 0,800 60,0 0,600 40,0 0,400 20,0 0,200 0,0 0, t [h] S Rs Qs Rysunek 41. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia substratu (S), szybkości objętościowej (R S) i szybkości właściwej (Q S) jego zużywania w zasilanej okresowej hodowli wgłębnej Aspergillus niger PD 66, którą zasilano 35 g dm -3 glicerolu bezwodnego po upływie 93 godziny hodowli 127

128 X [g dm -3 ]; Y X/S [%] R X [g dm -3 h -1 ] 16,0 14,0 12,0 35 g dm -3 glicerolu bezwodnego 0,320 0,280 0,240 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 0,200 0,160 0,120 0,080 0,040 0, X Yx/s Rx t [h] Rysunek 42. Kształtowanie się podstawowych parametrów kinetycznych charakteryzujących przebieg zmian stężenia biomasy (X), wydajności (Y X/S) szybkości objętościowej (R X) jej wzrostu w zasilanej okresowej hodowli wgłębnej Aspergillus niger PD 66, którą zasilano 35 g dm -3 glicerolu bezwodnego po upływie 93 godziny hodowli Wyniki uzyskane w tej serii badań wykazały, że jednorazowe zasilenie hodowli glicerolem odpadowym w stężeniu 35,00 g dm -3 nie wpłynęło na poprawę wydajności i efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego. 128

129 5. Dyskusja wyników Kwas cytrynowy, spośród kwasów organicznych otrzymywanych na drodze biotransformacji sacharydów, jest najczęściej stosowany w różnych dziedzinach przemysłu [215]. Udoskonalanie technologii jego wytwarzania jest dobrym przykładem współpracy pracowników nauki z przedsiębiorcami, co jest podyktowane ciągłym wzrostem zapotrzebowania na kwas cytrynowy, jak również problemem zagospodarowania odpadów generowanych przez przemysł. Prowadzone na szeroką skalę badania skupiają się na poprawie wydajności szczepów Aspergillus niger lub poszukiwaniu innych mikroorganizmów, minimalizacji zużycia substancji chemicznych oraz powstających odpadów, rozwoju nowych metod otrzymywania kwasu cytrynowego, a także na zastosowaniu nowych substratów do produkcji kwasu cytrynowego [30, 223]. Drobnoustrojami preferowanymi w produkcji kwasu cytrynowego na skalę przemysłową są szczepy Aspergillus niger, co wynika z dobrze rozwiniętych układów enzymatycznych tych mikroorganizmów [223, 228]. W celu poprawy produktywności szczepów wykorzystuje się dostępne techniki mutagenizacji, a następnie dokonuje selekcji otrzymanych mutantów [226, 231]. Grzyby strzępkowe Aspergillus niger, w zależności od zastosowanej metody hodowli mogą produkować kwas cytrynowy z różną wydajnością. Dlatego też, podczas badań skriningowych, w których testowane są alternatywne źródła węgla należy stosować znane szczepy produkcyjne [241]. Podstawą do rozpoczęcia prowadzonych w ramach tej rozprawy badań, dotyczących otrzymywania kwasu cytrynowego z użyciem glicerolu jako głównego źródła węgla, był dobór szczepu Aspergillus niger. Spośród wszystkich szczepów zbadanych pod kątem zdolności do biokonwersji glicerolu do kwasu cytrynowego, do dalszych badań wybrano szczep Aspergillus niger PD 66. Wyselekcjonowany szczep charakteryzował się wysoką produktywnością oraz stabilnością cech biochemicznych podczas długotrwałego przechowywania. W okresowych 129

130 hodowlach wgłębnych prowadzonych w kolbach w inkubatorze z wytrząsaniem, zarówno w podłożach z glicerolem bezwodnym, jak i glicerolem odpadowym nagromadzał on kwas cytrynowy z najwyższą całkowitą wydajnością wynoszącą odpowiednio: YPGC=41,1% i YPGP=64,2% oraz najwyższą szybkością objętościową biosyntezy kwasu cytrynowego, RPGC=0,117 g cm -3 h -1 i RPGP=0,178 g cm -3 h -1. W obu rodzajach stosowanych podłoży uzyskano również najkorzystniejszy współczynnik efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego (Kef=4,7 % g dm -3 h -1 i Kef=11,5 % g dm -3 h -1 ). Ponadto proces charakteryzował się wysoką czystością chemiczną, ponieważ w podłożu hodowlanym poza kwasem cytrynowym nie stwierdzono obecności innych kwasów organicznych. Wyniki otrzymane w tym etapie badań potwierdziły zdolność szczepów Aspergillus niger do metabolizowania glicerolu, a w konsekwencji wykorzystania go jako głównego źródła węgla w biosyntezie kwasu cytrynowego. Według badań prowadzonych przez Wittwen i wsp. [249] glicerol w komórkach Aspergillus niger ulega fosforylacji do 3 fosfoglicerolu, podobnie jak u Aspergillus nidulans i Saccharomyces cerevisiae. Reakcja ta katalizowana jest przez kinazę glicerynową, która u Saccharomyces cerevisiae jest produktem genu GUT1 [93, 162, 211]. Następnie 3-fosfoglicerol pod wpływem dehydrogenazy 3-fosfoglicerynowej zależnej od FAD + ulega utlenieniu do fosfodihydroksyacetonu. Ostatecznie fosfodihydroksyaceton zostaje włączony do szlaku glikolitycznego. Przemiany metaboliczne glicerolu u Aspergillus niger przedstawiono na rysunku 43. Rysunek 43. Przemiany metaboliczne glicerolu u Aspergillus niger Źródło: opracowanie własne na podstawie [115]. Katabolizm glicerolu u Aspergillus niger zależy głównie od obecności dwóch enzymów kinazy glicerolowej oraz dehydrogenazy 3 fosfoglicerynowej zależnej od FAD +. Aktywność 130