(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) IntCl7 A61K 35/74 A61P 15/02 Zastosowanie połączenia bakterii pałeczek kwasu mlekowego do wytwarzania (54) kompozycji farmaceutycznej i kompozycja farmaceutyczna do leczenia zakażeń pochwowych (30) Pierw szeństwo: ,EP, (73) U praw niony z patentu: Cavaliere Ved. Vesely Renata Maria Anna, Mediolan, IT De Simone Claudio, Ardea, IT (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 23/99 (72) Tw órcy w ynalazku: Renata Maria Anna Cavaliere Ved Vesely, Mediolan, IT Claudio De Simone, Ardea, IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/05 (74) Pełnom ocnik: Bartnik Urszula, POLSERVICE Sp. z o o PL B1 (57) 1. Zastosowanie połączenia bakterii pałeczek kwasu mlekowego z gatunku Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej stosowanej do podawania dopochwowego do leczenia waginozy i zapalenia pochwy. 7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca bakterie pałeczek kwasu mlekowego do leczenia zakazeń pochwy, znamienna tym, ze zawiera połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego z gatunku Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius.

2 Zastosowanie połączenia bakterii pałeczek kwasu mlekowego do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej i kompozycja farmaceutyczna do leczenia zakażeń pochwowych Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie połączenia bakterii pałeczek kwasu mlekowego z gatunku Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej stosowanej do podawania dopochwowego do leczenia waginozy i zapalenia pochwy. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego obejmuje ponadto jeden lub więcej gatunków pałeczek kwasu mlekowego wybranych z grupy obejmującej Lactobacillus salivarius podgatunek salivarius, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus minutus i Lactobacillus gasseri. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego obejmuje gatunki Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius i Lactobacillus gasseri. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego jest stosowane w stężeniu 107 do 1013 CFU/g. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest wytwarzana w postaci ciekłej, w postaci kremów lub maści, lub w postaci stałej, jak czopki lub tabletki pochwowe. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest wytwarzana w postaci tabletek zawierających co najmniej dwie warstwy, obie zawierające wymienione gatunki bakterii pałeczek kwasu mlekowego, związane z zwykłymi zarobkami i dodatkami, w taki sposób, że szybkość uwalniania bakterii warstwy zewnętrznej jest większa niż szybkość uwalniania bakterii warstwy wewnętrznej. 7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca bakterie pałeczek kwasu mlekowego do leczenia zakazeń pochwy, znamienna tym, że zawiera połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego z gatunku Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius. 8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego obejmuje ponadto jeden lub więcej gatunków bakterii pałeczek kwasu mlekowego wybranych z grupy obejmującej Lactobacillus salivarius podgatunek salivarius, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus minutus i Lactobacillus gasseri. 9. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego obejmuje gatunki Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius i Lactobacillus gasseri. 10. Kompozycja według zastrz. 7 albo 8, albo 9, znamienna tym, że połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego jest stosowane w stężeniu 107 do 1013 CFU/g. 11. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że jest w postaci ciekłej, w postaci kremów lub maści, lub w postaci stałej, jak czopki lub tabletki pochwowe. 12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że jest w postaci tabletek zawierających co najmniej dwie warstwy, obie zawierające wymienione gatunki bakterii pałeczek kwasu mlekowego, związane z zwykłymi zarobkami i dodatkami, w taki sposób ze szybkość uwalniania bakterii warstwy zewnętrznej jest większa niż szybkość uwalniania bakterii warstwy wewnętrznej. * * * Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania połączenia bakterii pałeczek kwasu mlekowego do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, jak również kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakazeń pochwowych.

3 Prawidłowa pochwa i prawidłowa szyjka macicy jest zasiedlona przez wiele bakterii porównywalnych do bakterii z układu żołądkowo-jelitowego. Bakterie te są często przyczyną nie-gonokokowych zakażeń żeńskiego układu rozrodczego (takich jak na przykład: ropień sromowo-pochwowy i ropień gruczołu Bartholiniego (lub przedsionka większego), zapalenie śluzówki macicy, zapalenie jajowodu, ropień jajnika i zapalenie otrzewnej miednicy małej. W następstwie chorób zapalnych miednicy o charakterze chorób nie-wenerycznych, często jest znajdowana mieszanina bakterii tlenowych i beztlenowych; bakterie tego rodzaju mogą być odpowiedzialne za zakażenia po operacjach ginekologicznych, porodzie, aborcji i było skorelowane z zastosowaniem urządzeń śródmacicznych do zapobiegania zapłodnieniu (IUD). Waginoza bakteryjna jest następstwem interakcji bakteryjnej odpowiedzialnej za zastąpienie w obszarze pochwy pałeczek kwasu mlekowego dużą liczbą bakterii beztlenowych włącznie z Bacteroides, Peptostreptococcus, Peptococcus, Mobiluncus G. vaginalis. Zespół ten charakteryzuje się posiadającą zapach, jakkolwiek niezbyt drażniącą wydzieliną. To znaczy tylko niezwykle wyjątkowo występuje niewielki świąd i dyspauremia. Waginoza bakteryjna jest powszechnie diagnozowana wśród kobiet które mają kłopoty z pochwą, jakkolwiek u 50% kobiet odpowiadających kryteriom diagnozy dla waginozy bakteryjnej przebiega ona bezobjawowo. Waginoza bakteryjna jest związana z aktywnością seksualną i wzrasta wraz ze wzrostem ilości partnerów seksualnych; jakkolwiek uważa się że choroba ta nie jest przenoszona jedynie drogą płciową. Jakkolwiek waginoza bakteryjna jest niezbyt dokuczliwa może ona dawać skłonność do rozwoju poważniejszych infekcji układu płciowego w szczególności w czasie ciąży. Diagnoza waginozy bakteryjnej stawia się wtedy, gdy występują trzy z następujących czterech objawów: (1) jednorodna nie-zapalna wydzielina pochwy, przylegająca do ścianek pochwy; (2) płyn w pochwie ma ph większe niz 4.5; (3) wskaźnik komórek; i (4) mdlący zapach wydzieliny pochwy przed i po dodaniu 10% wodorotlenku potasowego (test Whifft'a). Zapalenie pochwy, w przeciwieństwie do tego, jest scharakteryzowane przez nieprawidłową wydzielinę pochwy, miejscowe podrażnienie i świąd sromu. Te powyższe objawy są symptomami miejscowej infekcji na skutek zakażenia T. vaginalis, lub Candida (Candida albicans). Waginoza bakteryjna i objawowe zapalenie pochwy są związane z cukrzycą, niewydolnością przytarczycy, zmienionej obronności organizmu gospodarza, leczenia kortykosterydami, antybiotykami o szerokim spektrum działania, doustnymi środkami antykoncepcyjnymi i ciążą. Świąd i wydzielanie są głównymi objawami zapalenia pochwy na skutek zakazenia Candida. Czasami występuje dyspauremia. Notuje się także czasami rumień i pleśniawkę sromowo-pochwową. Do postawienia diagnozy zapalenia pochwy na skutek zakażenia Candida wymagana je st obecność miejscowych objawów ponieważ zwykle kobiety mając w pochwie Candida bez wykazywania jakichkolwiek problemów zdrowotnych. Wyniki ostatnich badań potwierdzają informacje o dużej roli pełnionej przez pałeczki kwasu mlekowego w utrzymaniu prawidłowej równowagi bakteriologicznej w dynamicznym ekosystemie takim jak pochwa, i zapobiegania infekcjom układu rozrodczego spowodowanym przez organizmy chorobotwórcze. Dobrze wiadomo ze wiele bakterii pałeczek kwasu mlekowego kolonizuje pochwę zdrowych dorosłych kobiet. Rozprzestrzeniają się one zużywając jako źródło energii glikogen wydzielany przez błonę śluzową pochwy i współzawodniczą z czynnikami patogennymi, i dlatego bronią światło pochwy przed atakiem innych bakterii. Do leczenia powyżej wspomnianych chorób (na przykład, nie-specyficznego zapalenia pochwy, waginozy bakteryjnej i świądu sromu) stosowane były głównie sulfonamidy, antybiotyki i leki dezynfekujące. W szczególności, w ostatnich latach wraz z rozwojem wielu antybiotyków, często preparaty antybiotykowe były podawane pacjentom. Pałeczki kwasu mlekowego, obecne w pochwie, m ogą zginąć na skutek podania takich antybiotyków. Niestety, patogeniczne bakterie (na przykład Staphylococcus) mogą nabywać oporność na antybiotyki i dlatego utrudniać leczenie tych chorób przez podawanie antybiotyków.

4 W patencie US-A proponowano stosowanie pałeczek kwasu mlekowego w ginekologicznym leczeniu infekcji pochwy. Dokument ten wymienia następujące bakterie: Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei podgatunek pseudoplantarum i Lactobacillus crispatus, i podaje stężenie bakterii wynoszące 103 do 1010 CFU/g, korzystnie około 106 CFU/g. Jednakże, wszystkie wymienione w tym dokumencie kompozycje, jako zasadnicze komponenty zawierają Lactobacillus casei i/lub Lactobacillus fermentum w stężeniu 1 x 106 CFU/g. Dlatego, praktycznie dokument ten wskazuje że Lactobacillus casei i/lub Lactobacillus fermentum są podstawowymi komponentami do przygotowywania kompozycji farmaceutycznych do leczenia zakażeń pochwy i że te kompozycje farmaceutyczne są skuteczne w stężeniu 1 x 106 CFU/g (skrót CFU oznacza Jednostka tworząca kolonię ). Znane ze stanu techniki zawierające pałeczki kwasu mlekowego kompozycje farmaceutyczne wytworzone w postaci czopków lub tabletek do stosowania dopochwowego, nie są wystarczająco skuteczne do odtworzenia kolonizacji pochwy. Ponadto zaznaczyć trzeba, ze ważna część komórek bakteryjnych ginie wskutek wpływu warunków fizycznych w momencie wytwarzania czopków i liczba ich się dalej zmniejsza wtedy, gdy dyfundują one w świetle pochwy i powinno rozpoczynać się ich rozprzestrzenianie. Dlatego też, istnieje potrzeba wytworzenia odpowiednich gatunków bakterii pałeczek kwasu mlekowego, lub ich mieszanin, i zawierających ich kompozycji farmaceutycznych, które wolne są od wad kompozycji znanych ze stanu techniki. Szczególnie zaś, istnieje potrzeba opracowania kompozycji do zastosowania dopochwowego mającej tak dobrą jakość, że podanie jej pacjentowi jest rzeczywiście dla niego korzystne. Ponadto, postacie kompozycji farmaceutycznej powinny być zdolne do utrzymania na stałym poziomie ilości rozprzestrzeniających się bakterii pałeczek kwasu mlekowego oraz zapewniać ciągłe i stałe działania w czasie, tych pałeczek kwasu mlekowego podczas ich dyfuzji w świetle pochwy. Zgłaszający stwierdził, że może otrzymać kompozycję farmaceutyczną na bazie bakterii pałeczek kwasu mlekowego, znacznie skuteczniejszą w leczeniu zakażenia pochwy, spełniającą w najwyższym stopniu następujące cechy: (a) wyselekcjonowany szczep bakterii pałeczek kwasu mlekowego musi mieć wysokie powinowactwo w stosunku do nabłonka pochwy, to znaczy wysoką zdolność do przyczepiania się do komórek nabłonkowych pochwy i która to własność pozwala bakteriom na interakcję z błoną śluzową pochwy zarówno w fizjologicznych jak i patologicznych warunkach (tym samym spełniając działania konkurujące z mikroorganizmami chorobotwórczymi, o miejsca receptorowe nabłonka) i odtworzenie mikroflory pochwy oraz optymalnych warunków ph; (b) co najmniej jeden wyselekcjonowany szczep pałeczek kwasu mlekowego musi mieć wysoką zdolność wytwarzania nadtlenku wodoru pełniąc działania hamujące w stosunku do organizmów patogenetycznych; i (c) co najmniej jeden wybrany szczep pałeczek kwasu mlekowego musi charakteryzować się wysoką zdolnością zakłócania w sposób kompetycyjny, przyczepiania się Candida albicans do komórek HeLa. Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie połączenia bakterii pałeczek kwasu mlekowego z gatunku Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej stosowanej do podawania dopochwowego do leczenia waginozy i zapalenia pochwy. Połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego obejmuje ponadto jeden lub więcej gatunków bakterii pałeczek kwasu mlekowego wybranych z grupy obejmującej Lactobacillus salivarius podgatunek salivarius, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus minutus i Lactobacillus gasseri. Bardziej korzystnie połączenie to obejmuje gatunki Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius i Lactobacillus gasseri. Stosowane stężenie połączenia bakterii pałeczek kwasu mlekowego w zastosowaniu według wynalazku wynosi 107 do 1013 CFU/g.

5 Korzystnie w zastosowani według wynalazku kompozycja farmaceutyczna jest wytwarzana w postaci ciekłej, w postaci kremów lub maści, lub w postaci stałej, jak czopki lub tabletki pochwowe. Bardziej korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest wytwarzana w postaci tabletek zawierających co najmniej dwie warstwy, obie zawierające wymienione gatunki pałeczek kwasu mlekowego, związane z zwykłymi zarobkami i dodatkami, w taki sposób że szybkość uwalniania bakterii warstwy zewnętrznej jest większa niż szybkość uwalniania bakterii warstwy wewnętrznej. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca bakterie pałeczki kwasu mlekowego do leczenia zakażeń pochwy, charakteryzująca się tym, że zawiera połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego z gatunku Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego oraz ponadto jeden lub więcej gatunków bakterii pałeczek kwasu mlekowego wybranych z grupy obejmującej Lactobacillus salivarius podgatunek salivarius, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus minutus i Lactobacillus gasseri. Bardziej korzystnie kompozycja według wynalazku stanowi połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego obejmujące gatunki Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius i Lactobacillus gasseri. W kompozycji według wynalazku połączenie bakterii pałeczek kwasu mlekowego jest w stężeniu 107 do 1013 CFU/g. Kompozycja ta może być w postaci ciekłej, w postaci kremów lub maści, lub w postaci stałej, jak czopki lub tabletki pochwowe. Także korzystnie kompozycja według wynalazku może być w postaci tabletek zawierających co najmniej dwie warstwy, obie zawierające wymienione gatunki pałeczek kwasu mlekowego, związane z zwykłymi zarobkami i dodatkami, w taki sposób ze szybkość uwalniania bakterii warstwy zewnętrznej jest większa niż szybkość uwalniania bakterii warstwy wewnętrznej. Powyższe i dalej opisane przedmioty wynalazku, które staną się oczywiste w następstwie szczegółowego opisu, będą osiągnięte przez niniejszy wynalazek, przedmiotem którego w pierwszym jego aspekcie, jest zastosowanie skojarzonych pałeczek kwasu mlekowego Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinus, do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej w celu podawania przy leczeniu takich zakażeń pochwy jak na przykład, zapalenie pochwy i waginoza bakteryjna. W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest dostarczenie takiej kompozycji farmaceutycznej. W szczególnych postaciach niniejszego wynalazku m ogą być stosowane bakterie, Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius pdgatunek salicinius, w połączeniu z jednym lub większa liczbą gatunków pałeczek kwasu mlekowego wybranych z Lactobacillus salivarius podgatunek salivarius, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus minutus i Lactobacillus gasseri. Korzystnie, skojarzenie zastosowanych bakterii w kompozycji farmaceutycznej zgodnie z niniejszym wynalazkiem zawiera lub stanowi Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius pdgatunek salicinius i Lactobacillus gasseri. Szczególnymi przykładami stosowanych pałeczek kwasu mlekowego są: - Lactobacillus brevis ATCC 4006 i ATCC Lactobacillus salivarius pdgatunek salicinius ATCC Lactobacillus gasseri ATCC Przez ATCC rozumie się American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. Korzystnie, stężenie połączenia bakterii stosowanych według niniejszego wynalazku, wynosi od 108do 1012 CFU/g, bardziej korzystnie od 108 do 1012 CFU/g. Korzystnie, w takim połączeniu bakterii każdy gatunek jest obecny w stężeniu od 108 do 1012 CFU/g.

6 Hodowle bakterii korzystnie są w postaci liofilizowanej. Do zastosowania praktycznego, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są wytwarzane w postaci płynnej (roztworów do płukania), w postaci kremów lub maści, lub w postaci stałej, to znaczy czopków lub tabletek pochwowych, wkładek lub podobnych. Kompozycje farmaceutyczne wytwarzane w postaci tabletek mogą być jednowarstwowe lub dwu lub wielo warstwowe mające różny czas uwalniania. Szczególnie kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być wytwarzane w postaci tabletek obejmujących co najmniej dwie warstwy, obie zawierające te gatunki pałeczek kwasu mlekowego związane z zwykle stosowanymi zarobkami i domieszkami, w taki sposób ze szybkość uwalniania bakterii z warstwy zewnętrznej jest większe niż szybkość uwalniania z warstwy wewnętrznej. Szczególnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku, może być sporządzona w postaci tabletek zawierających co najmniej dwie warstwy, obie zawierające wymienione gatunki pałeczek kwasu mlekowego, związane ze zwykłymi zarobkami i dodatkami, w taki sposób ze szybkość uwalniania bakterii z warstwy zewnętrznej jest większa niz szybkość uwalniania bakterii z warstwy wewnętrznej. Jako przykład, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być sporządzona w postaci tabletek zawierających co najmniej dwie warstwy. Takie dwie warstwy mogą być wykonane w taki sposób, ze bakterie w warstwie zewnętrznej są uwalniane w okresie czasu minut, na przykład minut, podczas gdy bakterie warstwy wewnętrznej są uwalniane stopniowo w okresie czasu minut, na przykład minut. W korzystnym wykonaniu wynalazku, kompozycja farmaceutyczna zawiera także czynnik buforowy zdolny do podtrzymania, przez kilka godzin po podaniu, ph śródpochwowego stabilizowanego w zakresie 3 i 5,5. Czynnik buforowy jest układem buforującym zawierającym słaby kwas wybrany z jakiegokolwiek akceptowalnego farmaceutycznie nieorganicznego lub organicznego słabego kwasu, takiego na przykład jak kwas borowy, kwas mlekowy, kwas askorbinowy, kwas cytrynowy lub kwas octowy, w połączeniu z odpowiednią solą sodową lub inną akceptowalną farmaceutycznie solą skoniugowanej zasady i słabego kwasu. Korzystnie, ph jest buforowane w przedziale 4,2 do 4,5 i korzystnie stosowany jest jako czynnik buforowy układ buforujący wykonany z: kwasu mlekowego i mleczanu sodowego lub kwasu askorbinowego i askorbinianu sodowego. Dalszymi komponentami lub składnikami, które mogą być włączane w trakcie sporządzania niniejszego wynalazku są środki smakowe: mentol, esencja eukaliptusowa, salicynian metylu jako miejscowy czynnik orzeźwiający, hydrokotyzon lub inne przeciwzapalne steroidy (0,01 do 500 mg/g), leki przeciwzapalne, przeciwbakteryjne i czynniki zwilżające (EDTA, glikol dodekaetylenomonolaurynianowy i tym podobne), estriol (0,001 do 1 mg/g) i/lub inne substancje hormonalne lub substancje wywołujące aktywność hormonalną, skrobię kukurydzianą lub skrobię ziemniaczaną witaminy, antyoksydanty, enzymy, (hialuronidazę), heparynoidy, lidokainę i inne miejscowe środki znieczulające, wyciągi roślinne (Belladonna), cynk, wapń i bizmut. W celu przygotowania kompozycji wodnej do obmywania i przepłukiwania, stosuje się małe butelki które są zaopatrzone w zbiorniki zawierające liofilizowane mikroorganizmy i które są rozcieńczane przed użyciem w odpowiednim ciekłym medium zawartym w osobnych małych butelkach. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest praktycznie wolna od jakichkolwiek toksyn i nie daje jakiegokolwiek wzrostu adsorpcji układowej, tak że podanie jej pacjentkom w ciąży, jak również w przypadku uczuleń na leki antymiotyczne i antybakteryjne, jest dozwolone. Zgodnie z dotychczasową praktyką kliniczną schemat leczenia obejmuje podawanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku w postaci tabletek, kremów i czopków, które są podawane przed snem oraz, uznane za bardzo odpowiednie i skuteczne, stosowane po tym rano obmywanie. Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami. Przykład I. Przyleganie pałeczek kwasu mlekowego do komórek HeLa. W próbie tej badano zdolność różnych szczepów pałeczek kwasu mlekowego z American Type Culture Collection (ATCC) do przylegania do komórek HeLa, linii komórkowej po-

7 chodzącej z ludzkiego raka szyjki macicy. Komórki HeLa są utrzymywane jako pojedyncza warstwa komórek w hodowli komórkowej w butelkach w MEM (syntetycznej pożywce m inimalnej) z dodatkiem (10%) surowicy płodowej wołowej (FBS). Reakcja przylegania była prowadzona w wielo-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowej zawierających sterylnie pokrywający skrawek (24mm x 24mm) w każdej studzience. W każdej studzience wysiewano 1 ml zawiesiny komórek HeLa w stężeniu 1,2 x 105 komórek/ml i płytki inkubowano przez 24 godziny w 37 C w atmosferze 5% CO2. Przed przeprowadzeniem testu na przyleganie, wszystkie szczepy były umieszczane w bulionie przedhodowlanym MRS (Difco). Po 24 godzinach inkubacji w 37 C w warunkach beztlenowych (15% CO2) bakterie były wzmacniane w nowym bulionie i następnie inkubowane przez całą noc w takich samych warunkach doświadczalnych. Środowisko beztlenowe było otrzymywane przez inkubowanie bakterii w słoju zawierającym specyficzne torebki z Anaerogenem (Oxid). W celu przeprowadzenia testu na przyleganie, różne roztwory zawiesiny bakteryjnej w MEM były inkubowane na warstwie pojedynczych komórek przez jedną godzinę w 37 C w warunkach mikroaerofilowych. Po wielokrotnym przemyciu w PBS, w celu usunięcia tych mikroorganizmów które nie uległy przylgnięciu, komórki były utrwalane w 0,4 ml May Grumweld na studzienkę przez 4 minuty, przemywane, przez 15 minut, rozpuszczoną w wodzie Giemzą przed oglądaniem w mikroskopie optycznym. Stężenia robocze były wybrane opierając się na procentowej ilości komórek mających przylgnięte bakterie i ilość bakterii/komórkę. Maksymalne przyleganie było uzyskane przy stężeniu 5 x 109 bakterii/ml. Otrzymane wyniki zestawione w tabeli 1, wskazują że testowane pałeczki kwasu mlekowego zdolne były do przylegania do komórek HeLa, wskazując różny stopień przylegania do komórek gospodarza. Najwyzszy stopień przylegania stwierdzony został dla Lactobacillus brevis i Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius. Lactobacillus casei, ponadto że posiada mały stopień przylegania, jest inwazyjny i dlatego nie jest wykorzystany do przygotowywania farmaceutycznej kompozycji według niniejszego wynalazku. Tabela 1 Przyleganie różnych szczepów pałeczek kwasu mlekowego do komórek HeLa. Pałeczki kwasu mlekowego A) L. salivarius podgatunek salicinius (ATCC 11742) nr przylgniętych bakterii/komórkę Przyleganie bakterii % komórek z przylgniętymi bakteriami inwazyjność (a) B) L. brevis (ATCC 4006) C )L. brevis (ATCC 14869) L. crispatus (ATCC 33197) /- E) L. gasseri (ATCC 9857) F) L casei (ATCC 8530) Ilościowe oznaczenie przylegania bakterii jest wyrażone jako procent z 300 przypadkowo wybranych komórek z przylgniętymi bakteriami i jako średnia ilość przylgniętych bakterii na komórkę. (a) + = inwazyjność; +/- + niewielka inwazyjność; - + brak inwazyjności Przykład II. Wpływ pałeczek kwasu mlekowego skierowany przeciwko Candida Badano zdolność różnych gatunków pałeczek kwasu mlekowego wpływania w sposób kompetycyjny na przyleganie Candida albicans do komórek HeLa (i dlatego nie skutecznych dla Candida albicans). W celu dokonania oceny wpływu pałeczek kwasu mlekowego na poziom przylegania Mycetes (C. albicans) do komórek gospodarza, hodowane w 24 studzienkowych płytkach za-

8 wierających sterylnie pokryte skrawki komórki HeLa, posiewano 0,1 ml mieszaniny pałeczek kwasu mlekowego i C. albicans (dwie próbki kliniczne pobrane z ludzkiej pochwy oznaczono w tych badaniach odpowiednio jako CA2 i CA3) rozpuszczono w PBS do końcowego stężenia, odpowiednio 5 x 10 bakterii/ml i 5 x 10 Mycetes/ml. Po jednej godzinie inkubacji w 37C w warunkach mikroaerofilowych, komórki były myte pięć razy w PBS, utrwalone w May Grunwald i w Giemzie. Następnie, skrawki były sprawdzone w mikroskopie optycznym (powiększenie 1000x) i poziom przylegalności do komórek HeLa był oceniony. Otrzymane wyniki przedstawione w tabeli 2, wskazują ze wszystkie testowane pałeczki kwasu mlekowego są zdolne do zredukowania przylegania C. albicans do komórek HeLa, najwyzszą aktywność hamującą wykazały L. brevis ATCC 4006, które powodowały około 50% redukcję liczby komórek z przylgniętymi Candida i redukowały do około połowy liczbę Mycetes/komórkę w porównaniu z liczbą komórek kontrolnych. Mikroorganizm Tabela 2 Eliminowanie kompetycyjne przylegania C. albicans do komórek Hela przez pałeczki kwasu mlekowego % komórek Średnia liczba mikroorganizmów/komórkę Mycetes bakterie Mycetes bakterie CA CA A) L. salivarius podgatunek salicinius (ATCC 11742) B) L. brevis (ATCC 4006) C) L gasseri ATCC D) L casei ATCC CA2 + A CA3 + A CA2 + B CA3 + B CA2 + C CA3 + C CA3 + D CA3 + D W teście eliminująco-kompetycyjnym pałeczki kwasu mlekowego oraz Mycetes są stosowane do końcowego stężenia, odpowiednio 5% x 109/studzienkę i do 5% x 10 /studzienkę. Przykład III. Wytwarzanie nadtlenku wodoru przez pałeczki kwasu mlekowego Badano zdolność pięciu gatunków pałeczek kwasu mlekowego do wytwarzania H2O2. Bakterie do hodowli umieszczano na płytkach agar-agar z tetrametylbenzydyną. Po trzech dniach inkubacji w 37 C w słoju, w warunkach beztlenowych, płytki agar-agar wystawiano na powietrze. W ten sposób, obecna w pożywce hodowlanej peroksydaza reaguje z H2 O2 wytwarzanym przez pałeczki kwasu mlekowego. Następująca po tym oksydacja tetrametylbenzydyny jest ujawniana w postaci niebieskiej pigmentacji kolonii produkujących H2 O2. Otrzymane wyniki, przedstawione w tabeli 3, pokazują że L. salivarius podgatunek salicinius ATCC i L. gasseri ATCC 3857 są pozytywne w odniesieniu do H2O2. L. cassei ATCC 8530 nie wykazywał żadnego wyniku dodatniego. Inne testowane szczepy były pozba-

9 wionę jakiejkolwiek reaktywności. Wyniki te wskazują nie istnieje korelacja pomiędzy wytwarzaniem H2O2 przez pałeczki kwasu mlekowego i wykluczeniem przez kompetycję przylegalności C. albicans do komórek HeLa przez bakterie. Tabela 3 W ym arzanie nadtlenku wodoru przez pałeczki kwasu mlekowego Lactobacilli Wytwarzanie H2O2 A) Lactobacillus salivarius podgatunek salicinius (ATCC 11742) + B) Lactobacillus brevis (ATCC 4006) C) Lactobacillus brevis (ATCC 14869) - D) Lactobacillus gasseri (ATCC 3857) - E) Lactobacillus casei (ATCC 8530) - + = niebieska pigmentacja wszystkich kolonu bakterii +/- = jasno niebieska pigmentacja = brak kolonii z pigmentacją W celu ilustracji, wynalazek niniejszy został zobrazowany przykładami korzystnych farmaceutycznych kompozycji, które to kompozycje są przeznaczone do wytworzenia tabletek, czopków, kremów i ciekłych roztworów do podawania dopochwowego liofilizowanego produku hodowli bakteryjnych składającego się z połączenia wielu gatunków bakterii. Przykłady preparatów dopochwowych Przykład IV Jednostkowa kompozycja do przygotowania tabletek szybko-uwalniających, lekko musujących, zawierających nośniki i liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej (1 x 1010 CFU/g) zawierający połączone L. brevis ATCC 4006 i L. salivarius podgatunek salicinius ATCC (w stosunku 1:1): Liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej 500 mg Laktoza 350 mg Skrobia kukurydziana 200 mg Kwas adipinowy 67 mg Dwuwęglan sodowy 67 mg Stearynian magnezowy 11 mg Kwas stearynowy 3 mg Krzemionka koloidalna 2 mg Do przygotowania tabletek mających powyżej opisany skład, wymagane jest wcześniejsze przygotowanie granulatu lub peletek. Nasmarowane peletki są następnie dodawane do 500,0 g wspomnianego liofilizowanego produktu hodowli bakteryjnej wstępnie przesianego przez 300 µm sito, i mieszane ponownie przez 15 minut. Otrzymane, w ten sposób peletki, są poddawane następnie procesowi sprasowywania stosując wirujące urządzenie prasujące, zaopatrzone w matrycę o owalnym kształcie, i w ten sposób są otrzymywane tabletki o średnim ciężarze 1200 mg do zastosowania dopochwowego. Otrzymane tabletki m ają czas rozkładu około 15 minut, przy zastosowaniu aparatury opisanej w Farmacopea Ufficiale Italiana. Przykład V Jednostkowa kompozycja do przygotowania tabletek szybko-uwalniających zawierających nośniki i taki sam jak w przykładzie IV liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej: Liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej 500 mg Mannitol 560 mg Hydroksypropylometylolceluloza 80 mg Talk 18 mg Stearynian magnezowy 19 mg Krzemionka koloidalna 3 mg

10 Liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej jest kalibrowany za pomocą masy gąbki o otworach 270 µm; przesiany produkt jest dodawany do mannitolu, wstępnie przesianego przez sito o 279 µm, hydroksypropylometylolcelulozy, talku, stearynianu magnezowowego i krzemionki koloidalnej. Cała masa jest mieszana przez 30 minut w mieszalniku do proszków Turbula T2A. Otrzymana w ten sposób mieszanka jest poddawana operacji prasowywania, przy zastosowaniu wirującego urządzenia prasującego zaopatrzonego w matrycę o owalnym kształcie, w ten sposób są otrzymywane tabletki o średnim ciężarze 1200 mg, do zastosowania dopochwowego. Otrzymane tabletki mają czas rozkładu około 15 minut, przy zastosowaniu aparatury opisanej w Farmacopea Ufficiale Italiana. Przykład VI Sporządzanie dwu warstwowych (jedna warstwa szybko-uwajniająca i druga warstwa powoli-uwalniająca) tabletek zawierających nośnik i taki sam jak w Przykładzie IV liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej. Jednostkowa kompozycja do przygotowania warstwy szybko-uwalniającej (to znaczy warstwy lekko musującej): Liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej 250 mg Laktoza 240 mg Skrobia kukurydziana 41 mg Kwas adypinowy 30 mg Dwuwęglan sodowy 30 mg Stearynian magnezowy 6 mg Kwas stearynowy 2 mg Krzemionka koloidalna 3 mg Jednostkowa kompozycja do przygotowania warstwy powoli-uwalniającej: Liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej 250 mg M annitol 280 mg Hydroksypropylometylolceluloza 50 mg Talk 9 mg Stearynian magnezowy 10 mg Krzemionka koloidalna 1 mg Peletki stosowane do warstwy szybko-uwalniającej są sporządzane sposobem opisanym w przykładzie IV; mieszanina która stosowana do warstwy powoli-uwalniającej jest sporządzana sposobem opisanym w przykładzie V. Opisane peletki do warstwy szybkiego-uwalniania i opisana mieszanina do przygotowania warstwy powoli-uwalniającej są ładowane do dwóch różnych zsypni ładujących odpowiedniego urządzenia prasującego, zaopatrzonego w matrycę o otworach owalnego kształtu, zaadaptowanego do wytwarzania dwuwarstwowych tabletek (typ Manesty Layer Press). Urządzenie to jest nastawione w taki sposób, że otrzymywane są dwuwarstwowe tabletki o ciężarze w przybliżeniu około 1200 mg zawierające 2 warstwy po 600 mg każda i każda zawierająca po 250 mg liofilizowanego produktu hodowli bakteryjnej. Otrzymane dwuwarstwowe tabletki, poddane testowi rozkładu stosując aparaturę opisaną w Farmacopea Ufficiale Italiana, mają czas rozkładu około 15 minut dla warstwy szybkouwalniającej i minut dla warstwy powoli-uwalniającej. Przykład VII C zynnik aktywny: 1 g tego samego jak w przykładzie IV liofilizowanego produktu hodowli bakteryjnej. Zarobki: 2,5 g pół-syntetycznych glicerydów i skrobi ziemniaczanej. Przykład VIII Krem do pochwy (tubka 10 g) Czynnik aktywny: 1 g tego samego jak w przykładzie IV liofilizowanego produktu hodowli bakteryjnej. Zarobki: uwodorniona lanolina (2 g), olej wazelinowy (2 g), dwumetylopolisiloksan (3 g), S i02 (4 g).

11 Zarobki: uwodorniona lanolina (2 g), olej wazelinowy (2 g), dwumetylopolisiloksan (3 g), SiO2 (4 g). Przykład IX Mała butelka ze zbiornikiem Każda mała butelka zawiera: a) Zbiornik: 2 g tego samego jak w przykładzie IV liofilizowanego produktu hodowli bakteryjnej. b) Mała butelka (10 ml): glicerol 3 g i woda w wystarczającej ilości do 10 ml. Przykłady X do XV Przykład IV do IX były przygotowane według tego samego modelu jak opisano w wymienionych przykładach, z jedynie taką różnicą, że stosowany był liofilizowany produkt hodowli bakteryjnej (w stężeniu 1 x 1010), który zawierał L. brevis ATCC 14869, L. salivarius podgatunek salicinius ATCC i gatunek L. gasseri ATCC 9857 w stosunku 1:1. Wszystkie kompozycje farmaceutyczne otrzymane w przykładach IV do XIV okazały się bardzo skuteczne w leczeniu pacjentów cierpiących na waginozę i zapalenie pochwy.

12 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.