Sfingozyno-1-fosforan dyrygent wśród cząsteczek

Transkrypt

1 Sfingozyno-1-fosforan dyrygent wśród cząsteczek STRESZCZENIE Sfingozyno-1-fosforan (S1P) jest bioaktywnym lipidem z rodziny sfingolipidów, syntetyzowanym między innymi przez płytki krwi, magazynowanym w erytrocytach. Efekty działania tego związku na komórki są związane z obecnością na ich powierzchni swoistych receptorów (S1P1-S1P5). S1P działa między innymi na komórki układu krwiotwórczego i nerwowego, wpływając na ich migrację, adhezję, różnicowanie i długość życia. Odgrywa rolę mediatora w reakcjach zapalnych, procesach angiogenezy i gojeniu się ran. Przeciwdziała apoptozie w przeciwieństwie do sfingozyny i ceramidu. Doniesienia ostatnich lat dowodzą, że S1P jest czynnikiem uczestniczącym w procesie uwalniania komórek macierzystych ze szpiku kostnego i ich przechodzeniu do krwi obwodowej. Na ich liczbę mają wpływ: uszkodzenie komórek i tkanek, stres, wysiłek fizyczny i niektóre leki. Badania nad S1P w roli głównego czynnika chemotaktycznego dla komórek macierzystych mogą w dużym stopniu przyczynić się do rozwoju medycyny regeneracyjnej. WPROWADZENIE Sfingolipidy to ważna klasa lipidów występująca w błonach plazmatycznych wszystkich organizmów eukariotycznych [1]. Syntetyzowane są w siateczce endoplazmatycznej i w aparacie Golgiego, skąd są transportowane do błony komórkowej [2]. Biorą udział w regulacji licznych procesów komórkowych takich jak wzrost, różnicowanie, ruchliwość chemotaktyczna, kontrolowana śmierć komórki (apoptoza) w odpowiedzi na stres i działanie cytokin [1,3]. Cząsteczki sfingolipidów wykazują skłonność do samoorganizacji, tworząc w błonach komórkowych mikrodomeny błonowe zwane tratwami lipidowymi, uczestniczące w wielu procesach komórkowych, między innymi takich jak przekazywanie sygnałów czy endocytoza niezależna od klatryny [4]. Zaburzenia funkcjonowania tratw lipidowych mogą odgrywać istotną rolę w patogenezie cukrzycy typu 2, rozwoju otyłości, chorób nowotworowych, chorób neurodegeneracyjnych (np. choroby Alzheimera), mukowiscydozy, chorób autoimmunologicznych (np. SLE), lipidowych chorób spichrzeniowych oraz uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego [2,5]. Centralną pozycję w metabolizmie sfingolipidów zajmuje ceramid, cząsteczka prekursorowa wszystkich sfingolipidów. W reakcji katalizowanej przez enzym ceramidazę z cząsteczki ceramidu uwalniany jest aminoalkohol, sfingozyna (Ryc. 1) [1,6]. Z kolei kinaza sfingozyny katalizuje reakcję fosforylacji sfingozyny do sfingozyno-1-fosforanu (S1P), związku o olbrzymim znaczeniu z punktu widzenia procesów komórkowych [6]. Sfingozyna i ceramid odgrywają rolę w procesach hamowania wzrostu komórek oraz ich apoptozie w przeciwieństwie do S1P, który wpływa na wzrost i przeżywalność komórek. Wzajemne stosunki ilościowe pomiędzy tymi lipidami decydują o losie komórek, ich proliferacji lub apoptozie [3]. CHARAKTERYSTYKA SFINGOZYNO-1-FOSFORANU Sfingozyna (1,3-dihydroksy-2-amino-4-oktadeken) jest jednonienasyconym aminoalkoholem o konfiguracji trans. W fosforanie-1-sfingozyny (ang. membrane attack complex) reszta fosforanowa jest połączona wiązaniem estrowym z grupą hydroksylową sfingozyny (Ryc. 1). S1P jest związkiem o właściwościach amfipatycznych, nieprzechodzącym przez hydrofobowe błony komórkowe z powodu obecności w cząsteczce polarnej głowy fosforanowej [3]. Źródłem sfingozyno- -1-fosforanu w osoczu jest reakcja fosforylacji zewnątrzkomórkowej sfingozyny przy udziale kinaz uwalnianych przez komórki śródbłonka, a także płytki krwi (gdzie S1P jest syntetyzowany w dużych ilościach) oraz erytrocyty i komórki tuczne [7-9]. Molekularny mechanizm działania sfingozyno-1-fosforanu na komórki polega na wiązaniu się tej cząsteczki z receptorami błonowymi (S1P1- -S1P5) sprzężonymi z białkami G [10]. Daria Sałata 1,2,* Marta Budkowska 1,2 Barbara Dołęgowska 1,2 1 Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Medycyny Molekularnej, Pomorski Uniwersytet Medyczny, Szczecin 2 Katedra i Zakład Fizjologii, Pracownia Biochemii i Fizjologii Komórki Macierzystej, Pomorski Uniwersytet Medyczny, Szczecin * Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Medycyny Molekularnej, Zakład Analityki Medycznej, Pomorski Uniwersytet Medyczny, ul. Powstańców Wielkopolskich 72, Szczecin; tel.: (91) , daria_ salata@wp.pl Artykuł otrzymano 22 grudnia 2011 r. Artykuł zaakceptowano 23 maja 2012 r. Słowa kluczowe: sfingozyno-1-fosforan, metabolizm sfingozyno-1-fosforanu, sfingozyno- -1-fosforan w fizjologii, sfingozyno-1-fosforan w patologii, komórka macierzysta Wykaz skrótów: CXCR4 (ang. C-X-C chemokin receptor type 4) receptor dla chemokiny SDF- 1; FTY720 (ang. fingolimod) fingolimod, lek immunosupresyjny; GPCR (ang. G-protein coupled receptors) receptory sprzężone z białkiem G; HSCP (ang. hematopoietic stem and progenitor cells) hematopoetyczne komórki macierzyste szpiku kostnego; MAC (ang. membrane attack complex) kompleks atakujący błonę; PKC (ang. protein kinase C) kinaza białkowa C; S1P (ang. sphingosine-1-phosphate) sfingozyno-1-fosforan; SDF-1 (ang. stromalderived factor-1) stromalny czynnik wzrostu 1; SphK (ang. sphingosine kinase) kinaza sfingozyny; VSELs (ang. very small embryoniclike stem cells) małe komórki macierzyste podobne do embrionalnych Podziękowania: Publikacja powstała w trakcie realizacji projektu Innowacyjne metody wykorzystania komórek macierzystych w medycynie POIG, /09 współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka. Postępy Biochemii 58 (3)

2 Rycina 1. Metabolizm sfingolipidów. Tabela 1. Stężenie sfingozyno-1-fosforanu we krwi. Materiał biologiczny Metoda Stężenie S1P Piśmiennictwo OSOCZE SUROWICA PŁYTKI KRWI ERYTROCYTY radioizotopowa 191 ± 79 pmol/mol [17] ekstrakcja HPLC 368,8 ± 55,5 pmol/mol [18] radioizotopowa HPLC 145 pmol/mol [19] ekstrakcja HPLC 711 ± 11 pmol/mol [20] ekstrakcja HPLC 212 ± 59 pmol/mol [21] radioizotopowa 484 ± 82 pmol/mol [17] ekstrakcja HPLC 982 ± 89 pmol/mol [22] ekstrakcja HPLC 1760 ± 11 pmol/ml [20] ekstrakcja HPLC 84 ± 15 (pmol/10 8 komórek) [22] radioizotopowa HPLC 341 pmol/mol [19] radioizotopowa 141,4 ± 4 (pmol/10 8 komórek) Płytki krwi uważa się za jedno z głównych źródeł S1P. Wiąże się to ze stwierdzaną w nich wysoką aktywnością kinazy sfingozyny 1 (SphK 1) i brakiem aktywności liazy sfingozyno-1-fosforanu [11]. Sfingozyna ulegająca fosforylacji w płytkach krwi pochodzi z osocza lub powstaje w wyniku metabolizmu endogennych sfingolipidów [3]. Proces uwalniania S1P z zewnętrznej warstwy błony komórkowej płytek krwi do osocza zachodzi pod wpływem sił ścinania (ang. shear stress), a także po stymulacji trombiną i jest ściśle związany z aktywnością kinazy białkowej C (PKC). Biorą w nim udział białka transbłonowe ABC [3,8,12]. Erytrocyty magazynują S1P, chronią go przed degradacją oraz uwalniają do osocza. Nie stwierdza się w nich obecności enzymów rozkładających S1P (liaza S1P, fosfataza S1P), natomiast aktywność erytrocytarnej kinazy sfingozyny (SphK) jest niewielka. Erytrocyty prawdopodobnie odbierają S1P z tkanek podczas krążenia w organizmie lub też absorbują egzogenną sfingozynę z osocza i przekształcają ją w S1P [9,11,13]. Krwinki czerwone są określane jako osoczowy magazyn S1P i odgrywają główną rolę w regulacji stężenia S1P w osoczu [13]. Ito i wsp. wykazali, że ilość S1P w erytrocytach stanowi około połowę całkowitego stężenia tego sfingolipidu we krwi pełnej [14]. Erytrocyty stanowią rodzaj buforu kontrolującego stężenie S1P we krwi obwodowej oraz jego uwalnianie [15]. [17] ekstrakcja HPLC 14,1 ± 1,9 g/dl [18] radioizotopowa HPLC 589 pmol/mol [23] radioizotopowa 7,17 ± 1,66 pmol/mol [17] Czynniki zakaźne, stres, wysiłek fizyczny, uszkodzenie tkanek i narządów, a także niektóre leki, mogą prowadzić do aktywacji układu dopełniacza, w wyniku czego powstaje kompleks atakujący błonę (MAC). MAC jest odpowiedzialny za rozpad erytrocytów połączony z uwalnianiem S1P do osocza [16]. Sfingozyno-1-fosforan uwalniany z płytek po ich aktywacji oraz z erytrocytów stanowi stały składnik osocza i surowicy. W surowicy stężenia S1P są większe w porównaniu z osoczem, co jest spowodowane jego uwalnianiem z płytek podczas krzepnięcia krwi [8]. W osoczu S1P krąży w połączeniu z albuminą i lipoproteinami, głównie frakcją HDL (HDL>LDL>VLDL), dzięki czemu jest chroniony przed działaniem osoczowych fosfataz. Połączenie z białkiem i lipoproteinami reguluje również biodostępność S1P, chroniąc go przed związaniem się z receptorami dla S1P obecnymi na komórkach śródbłonka [11]. Doniesienia dotyczące stężeniach S1P w surowicy, osoczu oraz elementach morfotycznych krwi różnią się istotnie w zależności od zastosowanej przez autorów metody ekstrakcji i oznaczania tego sfingolipidu (Tab. 1) [8]

3 Na temat zawartości S1P w komórkach i tkankach człowieka wiadomo stosunkowo niewiele. Badania przeprowadzone na tkankach szczura wykazały w nich wielokrotnie mniejsze stężenia S1P w porównaniu z elementami morfotycznymi krwi. Wyjątek stanowią komórki nowotworowe, gdzie stężenie S1P jest wysokie ze względu na wysoką aktywność kinazy sfingozyny 1 (SphK1) [24]. METABOLIZM SFINGOZYNO-1-FOSFORANU Wewnątrzkomórkowy poziom S1P jest wynikiem równowagi między jego syntezą katalizowaną przez kinazę sfingozyny (SphK) i degradacją S1P katalizowaną przez fosfatazę S1P i liazę S1P [12]. Kinaza S1P katalizuje fosforylację sfingozyny do S1P (Ryc. 1) i tym samym ustala równowagę pomiędzy stężeniem S1P i sfingozyny. Scharakteryzowano dwie izoformy tego enzymu: kinazę sfingozyny 1 (SphK1) i kinazę sfingozyny 2 (SphK2). Kinaza SphK2, w odróżnieniu od Sphk1 występującej głównie w cytozolu, zależnie od typu komórki jest obecna w różnych przedziałach wewnątrzkomórkowych [25]. Obie kinazy mogą się przemieszczać do błony komórkowej, gdzie katalizują syntezę zewnątrzkomórkowej puli S1P [26]. SphK1 jest głównym enzymem, którego aktywność reguluje poziom S1P. Na aktywność kinaz S1P, a tym samym na zwiększenie poziomu S1P mogą wpływać między innymi czynniki wzrostu, agoniści receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), cytokiny, estry forbolu, witamina D3. W procesie aktywacji kinazy SphK1 następują kolejno fosforylacja, translokacja do błony komórkowej, gdzie znajduje się substrat (S1P) oraz oddziaływanie z fosfolipidami i/lub niektórymi białkami [12]. Zsyntetyzowany sfingozyno-1-fosforan może działać jako wewnątrzkomórkowy przekaźnik drugiego rzędu, a także autokrynnie lub parakrynnie za pośrednictwem receptorów S1P [11,12]. S1P wyprodukowany wewnątrz komórek może dotrzeć do receptorów na powierzchni błony za pomocą białek transportowych ABC, czego przykładem jest jego wydzielanie z aktywowanych komórek tucznych [27]. Rozmieszczenie tkankowe kinaz jest zróżnicowane. Najwyższe aktywności SphK1 stwierdzono w płucach, śledzionie i wątrobie. SphK2 występuje głównie w wątrobie, mózgu i w sercu. Podwyższone aktywności SphK1 i SphK2 stwierdza się także podczas rozwoju embrionalnego [28]. Geny kodujące SphK1 wykazują znaczną nadekspresję w wielu rodzajach nowotworów (mózgu, piersi, jelita grubego, płuc, jajnika, żołądka, macicy, nerki, odbytnicy i jelita cienkiego) w porównaniu ze zdrowymi tkankami. SphK1 odgrywa istotną rolę w progresji zmian nowotworowych. Obecność tego enzymu wiąże się z procesami angiogenezy, a także z opornością komórek nowotworowych na radioterapię oraz chemioterapię. Funkcja SphK2 jest jeszcze słabo poznana [3,29]. Liazy S1P i fosfatazy S1P są zlokalizowane w siateczce endoplazmatycznej. Liaza S1P (zależna od fosforanu pirydoksalu) katalizuje rozkład S1P do fosforanu etanoloaminy i heksadecenalu. Rozkład S1P przez liazy S1P wydaje się być główną drogą umożliwiającą przekształcanie sfingolipidów do glicerofosfolipidów. Liazy S1P wykazują swoją aktywność głównie w wątrobie, nerkach, płucach, sercu i mózgu. Nie występują w płytkach krwi i erytrocytach [10]. W badaniach przeprowadzonych na myszach pozbawionych liazy S1P stwierdzono patologiczne zmiany w płucach, sercu, drogach moczowych i w kościach oraz skrócony czas życia zwierząt [30]. Reakcja defosforylacji S1P jest katalizowana przez S1P- -specyficzne fosfohydrolazy SPP1 i SPP2 lub przez fosfohydrolazy o szerokiej specyficzności substratowej (LPP1, LPP2 i LPP3) [31]. Fosfataza SPP1 oraz kinaza SphK2 uczestniczą w procesie syntezy ceramidu i innych sfingolipidów. Zmniejszona aktywność SPP1 powoduje zwiększenie zawartości S1P w komórce, natomiast nadaktywność tego enzymu prowadzi do nadprodukcji ceramidu i inicjacji apoptozy. Znacznie mniej wiadomo na temat fizjologicznej funkcji SPP2 [32]. RECEPTORY SFINGOZYNO-1-FOSFORANU Do chwili obecnej zidentyfikowano pięć ludzkich receptorów sfingozyno-1-fosforanu, które sklasyfikowano jako S1P1-S1P5. Każdy z receptorów jest sprzężony z odpowiednim białkiem G (S1P1 białko G i, S1P2 oraz S1P3 białka G i, G q, G 13, S1P4 białko G i, G 12/13, S1P5 białko G i, G 12 ) Receptory S1P posiadają siedem domen transbłonowych wykazujących między sobą około 50% identyczności sekwencji aminokwasowej. Głównym ligandem jest dla nich S1P oraz wykazujący mniejsze powinowactwo dihydro-s1p [10,33]. Receptory S1P1-S1P5 są obecne w wielu komórkach organizmu. Obecność S1P1, S1P2, i S1P3 stwierdzono w mózgu, sercu, płucach, śledzionie i wątrobie oraz w mniejszym stopniu w nerkach, mięśniach i grasicy. S1P4 występuje głównie w tkankach limfatycznych (grasicy, śledzionie, węzłach chłonnych) oraz w płucach. S1P5 jest obecny głównie w układzie nerwowym i skórze [34,35]. Identyfikacja receptorów S1P przyczyniła się do lepszego zrozumienia ich roli w utrzymaniu homeostazy oraz w wielu procesach patologicznych [36]. Aktywacja receptorów S1P powoduje dysocjację białek G na podjednostki alfa i beta co zapoczątkowuje dalsze ścieżki sygnałowe decydujące o przebiegu wielu procesów fizjologicznych, między innymi takich jak migracja komórek, krążenie limfocytów, przepuszczalność naczyń czy prawidłowa czynność serca [33,35]. Funkcje poszczególnych receptorów i związanych z nimi białek G przedstawiono w tabeli 2. MECHANIZMY DZIAŁANIA SFINGOZYNO-1-FOSFORANU Sfingozyno-1-fosforan za pośrednictwem swoistych receptorów S1P wywiera istotny wpływ na migrację, adhezję, różnicowanie i przeżywalność wielu komórek [37]. Migracja komórek in vivo lub in vitro jest zapoczątkowywana przez stymulację receptorów na powierzchni komórek i przekazywanie zewnątrzkomórkowego sygnału, który wywołuje Postępy Biochemii 58 (3)

4 Tabela 2. Charakterystyka receptorów S1P [37]. Receptor Białko G Szlak sygnalny Obecność w tkankach Fizjologiczne działanie Agonista/Antagonista S1P1 Gi/o AC, ERK, PLC, PI3K/Akt, enos, Rac, Rho szeroka dystrybucja ruchliwość komórek FTY720-P cyrkulacja limfocytów KRP-203 angiogeneza SEW2871 neurogeneza VPC S1P2 Gi/o,Gq, G12/13 AC, PLC, JNK, p38, Rho, Rac szeroka dystrybucja, komórki mięśni gładkich naczyń hamowanie ruchliwości, proliferacji komórek, pobudzenia neuronalne, słuch JTE 013 S1P3 Gi/o,Gq, G12/13 AC, ERK, PLC, Rac, Rho serce, płuca, śledziona, nerki, jelita, przepona, tkanka chrzęstna bradykardia nabłonkowa bariera płuc, słuch FTY720-P VPC S1P4 Gi/o,Gs, G12/13 ERK, PLC komórki odporności, leukocyty cytokineza?? FTY720-P S1P5 Gi/o,G12/ AC, ERK, JNK, p54jnk ośrodkowy układ nerwowy, komórki NK ruchliwość komórek FTY720-P AC cyklaza adenylanowa; ERK kinazy regulowane przez sygnały wewnątrzkomórkowe; PLC fosfolipaza C; PI3K 3-kinaza fosfatydyloinozytolu; enos śródbłonkowa syntaza tlenku azotu; JNK c-jun, NH 2 -terminalne kinazy; Rac małe białko G z rodziny Rho; Ras małe białko G kodowane przez protoonkogen ras (homolog wirusowego onkogenu zidentyfikowanego w wirusie mięsaka myszy) szereg zmian prowadzących do przebudowy cytoszkieletu [38]. W zależności od typu aktywowanego receptora, S1P może zarówno zwiększyć jak i zmniejszyć migrację komórek. W przypadku komórek nowotworowych S1P działający za pośrednictwem receptorów S1P1 oraz S1P3 nasila ich migrację. Natomiast gdy S1P aktywuje receptor S1P2, proces ten ulega zahamowaniu (np. w komórkach nowotworowych żołądka) [39]. Uważa się że promigracyjny efekt pobudzenia receptorów S1P1 i S1P3 wynika z ich połączenia z białkiem G i. Receptor S1P2 występuje głównie w połączeniu z białkiem G 12/13, chociaż także może się łączyć z białkiem G i. Konsekwencją sprzężenia receptora S1P2 z białkiem G 12/13 jest silna aktywacja białka Rho, hamowanie białka Rac i migracji komórek [40]. Na migrację komórek wpływają także czynniki wzrostu współdziałające z S1P. Stężenie sfingozyno-1-fosforanu oraz aktywność SphK modulują odpowiedź komórkową na szereg czynników takich jak płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) [41], nerwowy czynnik wzrostu (NGF) [42], epidermalny czynnik wzrostu (EGF) [43], transformujący czynnik wzrostu (TGF-β) [44]. W fibroblastach i komórkach mięśni gładkich receptor S1P1 wraz z receptorem PDGFβ tworzą kompleks, którego pobudzenie stymuluje migrację tych komórek [40]. Sfingozyno-1-fosforan jest kluczowym mediatorem zarówno w procesach migracji, jak i różnicowania komórek śródbłonka oraz mięśni gładkich, w angiogenezie, zapaleniu i gojeniu się ran [38,45]. S1P odgrywa główną rolę w migracji limfocytów i komórek tucznych do antygenów oraz do miejsc infekcji [3]. Sfingolipidy wpływają na poziom wapnia w komórce. Ceramid powoduje uwalnianie wapnia z siateczki endoplazmatycznej i prowadzi do zwiększenia zawartości wapnia w cytoplazmie i mitochondrium. W regulacji homeostazy wapnia w komórkach ssaków może także uczestniczyć S1P [46]. Badania sugerują, że S1P jest przekaźnikiem drugiego rzędu, który może aktywować kanały wapniowe. Sfingozyno-1-fosforan wpływa na wewnątrzkomórkowy poziom Ca 2+ za pośrednictwem receptorów S1P2 i S1P3 powodując uwalnianie jonów wapnia z magazynów, głównie z siateczki endoplazmatycznej [47]. S1P może również indukować uwalnianie jonów wapnia z permeabilizowanych komórek na drodze niereceptorowego mechanizmu zależnego od trifosforanu inozytolu [48]. Równowaga pomiędzy stężeniem ceramidu, sfingozyny i S1P decyduje o śmierci lub przeżyciu komórki. Jej przesunięcie w kierunku zwiększonego stężenia ceramidu i sfingozyny prowadzi do śmierci komórki. Z kolei przeżywalność i/lub proliferacja komórki wymaga obecności zwiększonego stężenia S1P [49]. Antyapoptotyczne działanie S1P jest związane z kilkoma różnymi procesami komórkowymi. W niektórych populacjach komórek S1P może zapobiegać apoptozie poprzez hamowanie zmiany potencjału błony mitochondrialnej i uniemożliwiając tym samym uwolnienie z mitochondriów cytochromu c [50]. W innych komórkach S1P bezpośrednio stymuluje kinazę MAP (kinaza aktywowana mitogenami) 284

5 na szlaku antyapoptotycznym, prowadząc do aktywacji kinazy Akt i hamowania kilku białek z rodziny kaspaz. S1P wpływa na utrzymanie równowagi pomiędzy liczbą,,prawidłowych komórek i komórek apoptotycznych [51]. Interesującym wydaje się fakt, że SphK1 i SphK2 wykazują różny wpływ na przeżywalność komórek. Podczas badań na różnych typach komórek stwierdzono, że nadaktywność SphK1 i zwiększenie syntezy S1P promuje przeżywalność komórki, indukując jej przejście z fazy G1 do fazy S i wzrost w fazie S. W porównaniu do SphK1, nadaktywność SphK2 hamuje wzrost komórek i nasila apoptozę [46]. W badaniach in vitro na komórkach fibroblastów oraz komórkach nowotworowych wykazano, że nadekspresja genu kodującego kinazę SphK2 powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego, aktywację kaspazy 3, uwolnienie cytochromu c, czego konsekwencją jest apoptoza komórek. Apoptoza indukowana przez kinazę SphK2 jest niezależna od aktywacji receptorów S1P [52]. Przypuszcza się, że S1P powstający przy udziale SphK1, w normalnych warunkach może działać bezpośrednio lub pośrednio jako negatywny regulator enzymów uczestniczących w syntezie ceramidu, takich jak palmitoilotransferaza serynowa lub syntaza ceramidu. Ta regulacja biosyntezy ceramidu przez S1P może prowadzić do hamowania zależnej od ceramidu apoptozy. Fosfataza SPP poprzez zmniejszenie stężenia S1P także może pośrednio regulować stężenie ceramidu i w konsekwencji proces apoptozy [46]. ROLA SFINGOZYNO-1-FOSFORANU W ORGANIZMIE Sfingozyno-1-fosforan jest kluczowym mediatorem w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych [37] (Ryc. 2). Zwiększone zainteresowanie tą cząsteczką w ostatnich latach spowodowało odkrycie wielu nowych funkcji tego sfingolipidu. Poniżej omówiono najbardziej znane procesy, w których uczestniczy S1P oraz nową koncepcję na temat roli tego lipidu w fizjologii komórek macierzystych. Sfingozyno-1-fosforan pełni główną rolę w uwalnianiu limfocytów z pierwotnych i wtórnych narządów limfatycznych [53]. Znane są dwa mechanizmy tego procesu: kontrola migracji limfocytów oraz kontrola wyjścia limfocytów ze zrębu. W pierwszym mechanizmie kluczową rolę odgrywają receptory S1P1 znajdujące się na powierzchni limfocytów. Stężenie S1P we krwi obwodowej odpowiada za ukierunkowaną migrację limfocytów z narządów limfatycznych do chłonki i dalej do krwi [54]. Lek immunosupresyjny fingolimod (FTY720) posiadający wysokie powinowactwo do wszystkich receptorów dla S1P, hamuje ten proces poprzez zmniejszenie dostępności do receptora S1P1 na powierzchni komórek. Powoduje to brak reakcji limfocytów na bodziec chemotaktyczny jakim jest wzrost stężenia S1P [55]. W mechanizmie kontroli wyjścia limfocytów ze zrębu istotną rolę odgrywają receptory S1P1 obecne w komórkach śródbłonka oraz w warunkach prawidłowych przepuszczalne dla limfocytów połączenia śródbłonkowo-komórkowe. Wysokie stężenie S1P, czy syntetyczni agoniści receptora S1P1 uruchamiają procesy, w wyniku których dochodzi do zamknięcia połączeń pomiędzy komórkami śródbłonka i limfocyty gromadzą się w narządach limfatycznych [55,56]. Sfingozyno-1-fosforan uczestnicząc w ukierunkowanej migracji komórek T z grasicy i drugorzędowych narządów limfatycznych odgrywa ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu układu odpornościowego. Stwierdzono, że układ odpornościowy jest wrażliwy na zmiany aktywności enzymów uczestniczących w metabolizmie S1P [57]. S1P można zatem wiązać z rozwojem wielu chorób autoimmunologicznych takich jak toczeń rumieniowaty układowy (SLE), stwardnienie rozsiane, łuszczyca, choroby zapalne jelit czy cukrzyca [57,58]. Fingolimod poprzez swoje działanie na receptory S1P okazał się skutecznym lekiem stosowanym między innymi u pacjentów po przeszczepach narządowych [59,60], w chorobach autoimmunologicznych oraz w stwardnieniu rozsianym [61]. Badania nad tym lekiem przyczyniły się do poznania roli S1P w regulacji odporności [59,60,61]. ANGIOGENEZA Sfingozyno-1-fosforan za pośrednictwem receptorów sprzężonych z białkiem G (głównie S1P1) wpływa na komórki śródbłonka (ECs) i komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (SMCs) oddziałując na ich migrację, proliferację, powstawanie struktur tubularnych oraz tworzenie połączeń komórka-komórka [56,62]. S1P wzmacnia integralność bariery śródbłonkowej. W hodowli komórek śródbłonka S1P powoduje zwiększenie ilości włókien aktyny i włókien naprężeniowych [63]. Rycina 2. Udział sfingozyno-1-fosforanu w patogenezie wielu chorób (wg [25]). PROCESY ODPORNOŚCIOWE Sfingozyno-1-fosforan odgrywa istotną rolę w angiogenezie (neowaskularyzacji) [64]. W procesie tym uczestniczą czynniki stymulujące kinazę sfingozyny, między innymi czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), czynnik martwicy nowotworu (TNFα), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) [12,37,65]. S1P aktywuje z kolei błonową metaloproteinazę macierzy zewnątrzkomórkowej typu 1 (MT1- -MMP) indukującą migrację komórek śródbłonkowych [66]. W terapeutycznej neowaskularyzacji S1P lub jego syntetyczny analog (FTY720) zwiększają skuteczność przeszcze- Postępy Biochemii 58 (3)

6 pionych progenitorowych komórek śródbłonka (EPCs) i jednojądrzastych komórek szpiku kostnego (BMCs) [67]. UKŁAD SERCOWO-NACZYNIOWY W badaniach eksperymentalnych u zwierząt stwierdzono, że zmiany stężenia S1P prowadzą do zmian ciśnienia krwi, stężenia wapnia, przerostu miocytów, skurczu tętnic wieńcowych i bradykardii [68]. Wykazano także, że podczas uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IR) w mięśniu sercowym dochodzi do aktywacji kinazy SphK. Podczas uszkodzenia IR pobudzane są receptory S1P2 i S1P3, za pośrednictwem których S1P zwiększa przeżywalność kardiomiocytów. Z kolei receptor S1P1 wykazuje zwiększoną aktywność w proliferujących komórkach mięśni gładkich naczyń i w blaszkach miażdżycowych [69]. S1P oraz fingolimod działając na komórki macierzyste za pośrednictwem receptorów S1P3 uruchamiają w nich szlaki sygnałowe wpływające stymulująco na receptory CXCR4 dla SDF-1 (stromalny czynnik wzrostu 1). Stężenie S1P w surowicy może być wskaźnikiem choroby wieńcowej. Wyniki badań wskazują, że zwiększenie stężenia S1P we krwi może stanowić zapowiedź incydentu niedokrwienia mięśnia sercowego [67,70]. NOWOTWORY W warunkach patologicznych metabolizm i działanie S1P może ulegać modyfikacjom. W powstawanie i progresję nowotworów zaangażowane są enzymy odpowiedzialne za katabolizm S1P. W komórkach nowotworowych jelita grubego geny kodujące fosfatazę i liazę S1P są antyonkogenami. W innych typach komórek nowotworowych, na przykład w raku jajnika zwiększona aktywność liazy S1P jest przyczyną oporności na chemioterapię [56]. Liczne badania wykazały, że gen dla SphK1 może działać jako onkogen [71]. Zwiększoną aktywność kinazy stwierdzono w wielu nowotworach, między innymi płuc, okrężnicy, piersi, jajnika, mózgu, żołądka, macicy i nerek [56]. SphK1 moduluje kumulację czynnika HIF-1α (czynnik 1 indukowany przez hipoksję) w komórkach nowotworowych, a także hamuje syntezę czynnika stymulującego inwazyjność niektórych komórek nowotworowych, urokinazowego aktywatora plazminogenu (upa) oraz jego receptora upar [56,72]. Podczas badań nad glejakiem wielopostaciowym stwierdzono nadekspresję genu kodującego białko receptorowe S1P1 oraz aktywację upa, co sugeruje, że szlak sygnałowy uruchamiany przez S1P/S1P1 zwiększa inwazyjność tego nowotworu, pobudzenie receptora S1P1 prowadzi do migracji komórek nowotworowych [73]. Aktywacja receptora S1P2 wywołuje efekt odwrotny. W metastazie istotna jest zatem równowaga między podtypami receptorów dla S1P. Rola jaką S1P odgrywa w rozwoju niektórych nowotworów sugeruje zastosowanie związków działających na receptory dla S1P jako jeden z możliwych kierunków terapii przeciwnowotworowej. FTY720 hamuje unaczynienie guza, angiogenezę oraz pośredniczy w apoptozie komórek nowotworowych [74]. Antagonista S1P, VPC23019 hamuje pobudzaną przez S1P migrację komórek raka tarczycy i jajnika. Skuteczną w terapii nowotworowej może również okazać się neutralizacja S1P przeciwciałami monoklonalnymi anty-s1p lub zastosowanie inhibitorów SphK, na przykład dimetylosfingozyny (DMS), która hamuje wzrost komórek raka płuc i żołądka u myszy pozbawionych grasicy [75] lub SK1-I, który wpływa na ograniczanie wzrostu i przeżywalności komórek ludzkiej białaczki [76]. NOWO ODKRYTA ROLA S1P PRZYCIĄGANIE KOMÓREK MACIERZYSTYCH ZE SZPIKU KOSTNEGO DO KRWI OBWODOWEJ W początkowym okresie rozwoju człowieka progenitorowe komórki hematopoetyczne (HSPCs) krążą we krwi obwodowej i chłonce pomiędzy obszarami aktywnymi hematopoetycznie (np. śródbłonek aorty, wątroba płodu), skąd docierają do tkanki docelowej, szpiku kostnego, gdzie zasiedlają tak zwane nisze [77]. Obecność nisz podobnych do szpikowych stwierdzono także w innych tkankach, takich jak tkanki nerwowe, mięśnia sercowego, mózgu i innych [78]. W okresie życia pozapłodowego jedynie niewielka liczba komórek HSPCs jest uwalniana z nisz szpikowych do krwi obwodowej, z którą przenoszone są do różnych narządów [77]. Migracja progenitorowych komórek macierzystych w organizmie jest regulowana poprzez oddziaływanie chemokin z odpowiednimi receptorami chemokinowymi. Liczba komórek HSPCs uwalnianych ze szpiku kostnego może ulec zwiększeniu w odpowiedzi na stres, stany zapalne, uszkodzenie tkanek, wysiłek fizyczny i niektóre leki. Najbardziej znanymi lekami powodującymi uwalnianie progenitorowych komórek macierzystych ze szpiku kostnego są cytokiny (np. G-CSF czynnik stymulujacy tworzenie kolonii granulocytów), cytostatyki (np. cyklofosfamid), inhibitory receptora CXCR4 (np. AMD3100) [78,79]. Komórki macierzyste mogą ulegać ukierunkowanej migracji z nisz szpiku kostnego do krwi obwodowej i zasiedleniu w tkance docelowej. Procesy te, będąc elementami reakcji zapalnej i regeneracji tkanek wymagają obecności chemokin, aktywacji układu dopełniacza, a także niektórych fosfolipidów takich jak sfingozyno-1-fosforan. Stwierdzono, że niedokrwienie może być jednym z tych procesów, podczas których dochodzi do zwiększenia stężenia i aktywności chemoatraktantów (S1P), chemokin (SDF-1), czynników wzrostu (VEGF śródbłonka naczyniowego, HGF hepatocytów), cytokin (LIF czynnik hamujący białaczkę) oraz uruchomienia kaskady dopełniacza [80,81]. Początkowo sądzono, że czynnikiem pełniącym funkcję chemotaktyczną w stosunku do komórek macierzystych jest gradient SDF-1 (stromalny czynnik wzrostu -1). Wykazano jednak, że stężenie SDF-1 w osoczu nie zawsze koreluje z efektywnością migracji komórek macierzystych ze szpiku kostnego [15,82,83]. Badania in vitro chemotaksji mysich komórek HSPCs wykazały, że osocze krwi myszy poddawanych działaniu środków farmakologicznych silnie przyciąga komórki HSPCs w sposób niezależny od SDF-1. W badaniach tych stwierdzono również, że gradient stężeń SDF-1 pomiędzy szpikiem kostnym i krwią obwodową nie zawsze pełni kluczową rolę w uwalnianiu komórek macierzystych, co wskazuje na udział w tym procesie innych chemoatraktantów [15]. Co więcej, cieplna inaktywacja osocza nie powoduje zmniejszenia migracji komórek HSPCs, natomiast efekt ten uzyskuje się po usunięciu lipidów (ang. charcoal 286

7 Sfingozyno-1-fosforan jest bioaktywnym lipidem odpowiedzialnym za uwalnianie limfocytów do krwi i chłonki. Wpływa on także na migrację komórek progenitorowych ze szpiku kostnego do różnych tkanek i narządów [85]. Fizjologiczne stężenie tego sfingolipidu w osoczu jest większe od stężenia SDF-1. Podczas uwalniania komórek macierzystych z nisz szpiku kostnego indukowanego u myszy, stwierdzono istotne zwiększenie stężenia S1P we krwi obwodowej [15,86,87]. Zostało to potwierdzone również w badaniach u ludzi [91]. Działanie S1P na komórki macierzyste jest związane z obecnością na ich powierzchni swoistych receptorów. Komórki HSPCs ze szpiku migrują w kierunku wzrastającego stężenia S1P we krwi i chłonce. Proces ten jest zależny od receptorów S1P1 oraz S1P3 obecnych na powierzchni tych komórek [86]. Po związaniu się z cząsteczką S1P receptory są szybko internalizowane z błony komórkowej, podobnie jak receptory CXCR4 po ich połączeniu się z SDF-1 [84]. W wyniku przeprowadzonych doświadczeń udowodniono, że to nie SDF-1, a S1P jest kluczowym cherycina 3. Uwalnianie komórek macierzystych z nisz szpiku kostnego do krwi obwodowej, założenia moatraktantem dla różnych typów komórek nowej koncepcji (wg [15]). macierzystych [15,82-84,86-88]. Wniosek ten stał się podstawą dla nowej koncepcji opisustripping). Wyniki tych doświadczeń wskazują na istotny jącej proces uwalniania komórek macierzystych ze szpiku wpływ lipidów na procesy uwalniania i migracji komórek kostnego do krwi obwodowej (Ryc. 3) [15]. macierzystych [84]. Rycina 4. Proces uwalniania komórek macierzystych z nisz szpiku kostnego do krwi obwodowej z udziałem sfingozyno-1-fosforanu. C3,C5,C5b składowe układu dopełniacza; CXCR4 receptor dla chemokiny SDF-1; ECM macierz pozakomórkowa; G-CSF czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów; HSPC progenitorowa komórka macierzysta szpiku kostnego; MAC kompleks atakujący błonę; MT1-MMP receptor 1 metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej; SDF-1 stromalny czynnik wzrostu 1; S1P sfingozyno-1-fosforan; S1PR receptory dla sfingozyno-1-fosforanu; VCAM-1 cząsteczka adhezji komórkowej naczyń typu 1, VLA-4 ligand VCAM1. Postępy Biochemii 58 (3) 2012 Migracja komórek macierzystych między innymi może być indukowana przez stres, wysiłek fizyczny, urazy, niedokrwienie, niektóre leki i związki chemiczne [79]. Istotną częścią zmian molekularnych towarzyszących przyciąganiu komórek macierzystych z nisz szpiku kostnego do krwi jest aktywacja układu dopełniacza (Ryc. 4). Uszkodzone przez enzymy proteolityczne komórki podścieliska szpiku kostnego eksponują determinantę antygenową (neoepitop), która jest rozpoznawana przez tak zwane naturalne przeciwciała klasy IgM krążące we krwi obwodowej. Związanie IgM z neoepitopem aktywuje dopełniacz na drodze klasycznej. Może także dojść do aktywacji dopełniacza drogą alternatywną zapoczątkowywaną przez uwalniane proteazy [72,79]. Aktywacja układu komplementu i powstanie anafilotoksyn C3a i C5a moduluje aktywność granulocytów. Po pierwsze, mogą one zwiększać wydzielanie proteaz przez występujące w szpiku granulocyty, co prowadzi do enzymatycznej modyfikacji czynników warunkujących przyleganie HSPCs do nisz szpikowych (zniesienia oddziaływań SDF-1-CXCR4, VLA-4-VCAM-I). Po drugie, fragmenty C5 wraz z interleukiną 8, NAP-2 (białkiem aktywującym neutrofile 2) mogą 287

8 wspomagać migrację granulocytów z nisz szpiku kostnego do krwi obwodowej. Granulocyty zwiększają przepuszczalność bariery krew-szpik kostny, a tym samym torują drogę dla komórek HSPCs. We krwi obwodowej aktywacja składowej układu dopełniacza C5 zapoczątkowuje powstanie kompleksu atakującego błonę (C5b-9), który działając na erytrocyty powoduje uwalnianie z nich S1P. S1P uwolniony z krwinek czerwonych działa przyciągająco na komórki macierzyste dzięki obecności na ich powierzchni swoistych receptorów [15,89]. Szpik kostny osoby dorosłej jest zasiedlany przez małe populacje komórek macierzystych, które mogą być uwalniane do krwi i transportowane do uszkodzonych tkanek i narządów. Są to progenitorowe komórki śródbłonka (EPC), mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), a także odkryte w ostatnich latach małe podobne do embrionalnych komórki macierzyste (VSEL). To właśnie z komórkami VSEL wiąże się największe nadzieje w medycynie regeneracyjnej [90]. U zdrowych osób we krwi obwodowej i w tkankach można stwierdzić obecność bardzo niewielkiej liczby komórek VSEL. W czasie ostrego niedokrwienia mięśnia sercowego są one uwalniane z nisz szpiku kostnego do krwi obwodowej. Podczas tego procesu we krwi obwodowej stwierdza się zwiększone stężenia mrna markerów komórek pluripotencjalnych (wczesnych markerów komórek serca: GATA- 4, Nkx2.5/Csx oraz markerów komórek nerwowych: GFAP, nestyny, beta-iii-tubuliny, Olig1, Olig2, Sox2) [81,91]. Niedokrwienie tkanek zapoczątkowuje proces migracji komórek macierzystych ze szpiku kostnego (lub innych tkanek) do uszkodzonych narządów. Dochodzi do hamowania oddziaływania SDF-1-CXCR4, zatrzymującej komórki macierzyste w niszach szpiku kostnego. Brak chemotaktycznego działania SDF-1 w szpiku kostnym powoduje migrację komórek macierzystych w kierunku wzrastającego stężenia S1P we krwi obwodowej oraz w uszkodzonych tkankach [91]. Pierwsze próby zastosowania komórek macierzystych w terapii uszkodzeń narządowych zostały przeprowadzone na modelu mysim oraz u pacjentów po zawale mięśnia sercowego. Wyniki tych doświadczeń, chociaż obiecujące, wskazują na konieczność kontynuowania badań [4,92,93]. Sfingozyno-1-fosforan odgrywa bardzo ważną rolę w fizjologii komórek macierzystych. W wielu ośrodkach prowadzone są badania nad wpływem S1P na różne typy tych komórek (Ryc. 5). Sfingozyno-1-fosforan stymuluje proliferację mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego i z tkanki tłuszczowej z jednoczesnym zachowaniem ich multipotencjalności. Działanie S1P nie powoduje w tym przypadku żadnych istotnych skutków ubocznych, a komórki zachowują swoją morfologię, profil ekspresji markerów oraz kościotwórczy i tłuszczowy potencjał różnicowania [16]. Rycina 5. Typy komórek macierzystych migrujące w kierunku wzrastającego stężenia S1P (wg [88]). Funkcja S1P jako chemoatraktanta została potwierdzona w badaniach przeprowadzonych na embrionalnych komórkach macierzystych [23], neuronalnych komórkach progenitorowych [94] oraz mezangioblastach [95]. Podobne wyniki uzyskano w przypadku komórek macierzystych szpiku kostnego. Komórki te zasiedlały uszkodzoną wątrobę w odpowiedzi na gradient S1P [96]. W modelu mysim wykazano, że progenitorowe komórki śródbłonka migrują do uszkodzonych naczyń krwionośnych w odpowiedzi na gradient S1P spowodowany nieszczelnością naczyń, płytkami krwi oraz aktywacją układu krzepnięcia. W odpowiedzi na gradient S1P neuronalne komórki progenitorowe (NPC) są kierowane do miejsc uszkodzeń w mózgu. Sfingolipid ten powoduje także migrację i różnicowanie prekursorów osteoblastów [88]. PODSUMOWANIE W okresie ostatnich kilku lat poczyniono wielkie postępy w poznaniu roli sfingolipidów jako cząsteczek biorących udział w wielu istotnych procesach komórkowych. Obecnie wiadomo, że sfingozyno-1-fosforan jest cząsteczką o właściwościach plejotropowych. Odgrywa istotną rolę w procesach migracji, adhezji, różnicowania i przeżywalności wielu komórek. Z drugiej strony wpływa na patogenezę wielu chorób m.in. autoimmunologicznych, układu sercowo-naczyniowego oraz nowotworów. W chwili obecnej największe nadzieje wiąże się z faktem, że S1P jest kluczowym czynnikiem biorącym udział w migracji komórek macierzystych ze szpiku kostnego i innych tkanek do uszkodzonych narządów. Dalsze poznanie funkcji S1P pozwoli lepiej zrozumieć mechanizmy regeneracji w organizmie, a tym samym umożliwi w przyszłości opracowanie skutecznych metod leczniczych mających zastosowanie w medycynie regeneracyjnej. PIŚMIENNICTWO 1. Fyrst H, Saba JD (2010) An update on sphingosine-1-phosphate and other sphingolipid mediators. Nat Chem Biol 6: Bandorowicz-Pikuła J, Pikuła S, Tylki-Szymańska A (2011) Patogeneza lipidowych chorób spichrzeniowych. Postepy Biochem 57:

9 3. Kim RH, Takabe K, Milstien S, Spiegel S (2009) Export and functions of sphingosine 1-phosphate. Biochim Biophys Acta 1791: Zuba-Surma EK, Guo Y, Taher H, Sanganalmath SK, Hunt G, Vincent RJ, Kucia M, Abdel-Latif A, Tang XL, Ratajczak MZ, Dawn B, Bolli R (2011) Transplantation of expanded bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells (VSEL-SCs) improves left ventricular function and remodelling after myocardial infarction. J Cell Mol Med 15: Lingwood D, Kaiser HJ, Levental I, Simons K (2009) Lipid rafts as functional heterogeneity in cell membranes. Biochem Soc Trans 37: Mullen TD, Hannun YA, Obeid LM (2012) Ceramide synthases at the centre of sphingolipid metabolism and biology. Biochem J 441: Olivera A, Rivera J (2005) Sphingolipids and the balancing of immune cell function: lessons from the mast cell. J Immunol 174: Tani M, Sano T, Ito M, Igarashi Y (2005) Mechanisms of sphingosine and sphingosine 1-phosphate generation in human platelets. J Lipid Res 46: Jessup W (2008) Lipid metabolism: sources and stability of plasma sphingosine-1-phosphate. Curr Opin Lipidol 19: Pyne S, Pyne NJ (2002) Sphingosine 1-phosphate signalling and termination at lipid phosphate receptors. Biochim Biophys Acta 1582: Yatomi Y (2008) Plasma sphingosine 1-phosphate metabolism and analysis. Biochim Biophys Acta 1780: Alvarez SE, Milstein S, Spiegel S (2007) Autocrine and paracrine roles of sphingosine-1-phosphate. Trends Endocrinol Metab 18: Hänel P, Andrèani P, Gräler MH (2007) Erythrocytes store and release sphingosine 1-phosphate in blood. FASEB J 21: Ito K, Anada Y, Tani M, Ikeda M, Sano T, Kihara A, Igarashi Y (2007) Lack of sphingosine 1-phosphate-degrading enzymes in erythrocytes. Biochem Biophys Res Commun 357: Ratajczak MZ, Lee H, Wysoczynski M, Wan W, Marlicz W, Laughlin MJ, Kucia M, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak J (2010) Novel insight into stem cell mobilization-plasma sphingosine-1-phosphate is a major chemoattractant that directs the egress of hematopoietic stem progenitor cells from the bone marrow and its level in peripheral blood increases during mobilization due to activation of complement cascade/ membrane attack complex. Leukemia 24: He X, H ng SC, Leong DT, Hutmacher DW, Melendez AJ (2010) Sphingosine 1-Phosphate Mediates Proliferation Maintaining the Multipotency of Human Adult Bone Marrow and Adipose Tissue-derived. Stem Cells 2: Yatomi Y, Igarashi Y, Yang L, Hisano N, Asazuma N, Satoh K, Ozaki Y, Kume S (1997) Sphingosine 1-phosphate, a bioactive sphingolipid abundantly stored in platelets, is a normal constituent of human plasma and serum. J Biochem 121: Ohkawa R, Nakamura K, Okubo S, Hosogaya S, Ozaki Y, Tozuka M, Osima N, Kokota H, Kieda H, Yatomi Y (2008) Plasma sphingosine- -1-phosphate measurement in healthy subjects: close correlation with red blood cell parameters. Ann Clin Biochem 45: Yang L, Yatomi Y, Miura Y, Satoh K, Ozaki Y (1999) Metabolism and functional effects of sphingolipids in blood cells. Br J Haematol 107: Caligan TB, Peters K, Ou J, Wang E, Saba J, Merrill AH Jr (2000) A high-performance liquid chromatographic method to measure sphingosine 1-phosphate and related compounds from sphingosine kinase assays and other biological samples. Anal Biochem 15: Andréani P, Gräler MH (2006) Comparative quantification of sphingolipids and analogs in biological samples by high-performance liquid chromatography after chloroform extraction. Anal Biochem 15: Ruwisch L, Schafer-Korting M, Kleuser B (2001) An improved high- -performance liquid chromatographic method for the determination of sphingosine-1-phosphate in complex biological materials. Arch Pharmacol 363: Pèbay A, Wong RC, Piston SM, Wolvetang EJ, Peh GS, Filipczyk A, Koh KL, Tellis I, Nguyen LT, Pera MF (2005) Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells 23: Pyne S, Pyne NJ (2000) Sphingosine 1-phosphate signalling in mammalian cells. Biochem J 349: Maceyka M, Harikumar KB, Milstien S, Spiegel S (2012) Sphingosine- -1-phosphate signaling and its role in disease. Trends Cell Biol 22: Pitson SM, Xia P, Leclercq TM, Moretti PA, Zebol JR, Lynn HE, Wattenberg BW, Vadas MA (2005) Phosphorylation-dependent translocation of sphingosine kinase to the plasma membrane drives its oncogenic signalling. J Exp Med 20: Mitra P, Oskeritzian CA, Payne SG, Beaven MA, Milstien S, Spiegel S (2006) Role of ABCC1 in export of sphingosine-1-phosphate from mast cell. Proc Nat Acad Sci 103: Liu H, Sugiura M, Nava VE, Edsall LC, Kono K, Poulton S, Milstien S, Kohama T, Spiegel S (2000) Molecular cloning and functional characterization of a novel mammalian sphingosine kinase type 2 isoforms. J Biol Chem 275: Shida D, Takabe K, Kapitanov D, Milstein S, Spiegel S (2008) Targeting SphK1 as a new strategy against cancer. Curr Drug Targets 9: Vogel P, Donoviel MS, Read R, Hansen GM, Hazlewood J, Anderson SJ, Sun W, Swaffield J, Oravecz T (2009) Incomplete inhibition of sphingosine-1- phosphate lyase modulates immune system function yet prevents early lethality and non-lymphoid lesions. PLoS One 4: Mechtcheriakova D, Wlachos A, Sobanov J, Kopp T, Reuschel R, Bornancin F, Cai R, Zemann B, Urtz N, Stingl G, Zlabinger G, Woisetschläger M, Baumruker T, Billich A (2007) Sphingosine-1-phosphate phosphatase 2 is induced during inflammatory responses. Cell Signal 19: Pyne S, Pyne NJ (2011) Translational aspects of sphingosine-1-phosphate biology. Trends Mol Med 17: Taha TA, Argraves KM, Obeid LM (2004) Sphingosine-1-phosphate receptors: receptor specificity versus functional redundancy. Biochim Biophys Acta 1682: Gil PR, Japtok L, Kleuser B (2010) Sphingosine 1-phosphate mediates Chemotaxis of Human Primary Fibroblasts via the S1P-receptor subtypes S1P1 and S1P3 and Smad-signaling. Cytoskeleton 67: Sanchez T, Hla T (2004) Structural and Functional Characteristics of S1P Receptors. J Cell Biochem 92: Spiegel S, English D, Milstein S (2002) Sphingosine 1-phosphate signaling: providing cells with a sense of direction. Trends Cell Biol 12: Takabe K, Paugh SW, Milstien S, Spiegel S (2008) Inside-out signaling of sphingosine-1-phosphate: therapeutic targets. Pharmacol Rev 60: Gerthoffer WT (2007) Mechanisms of vascular smooth muscle cell migration. Circ Res 100: Yester JW, Tizazu E, Harikumar KB, Kordula T (2011) Extracellular and intracellular sphingosine-1-phosphate in cancer. Cancer Metastasis Rev 30: Sugimoto N, Takuwa N, Okamoto H, Sakurada S, Takuwa Y (2003) Inhibitory and stimulatory regulation of Rac and cell motility by the G12/13-Rho and Gi pathways integrated downstream of a single G protein-coupled sphingosine 1-phosphate receptor isoform. Mol Cell Biol 23: Roelofsen T, Akkers R, Beumer W, Apotheker M, Steeghs I, van de Ven J, Gelderblom C, Garritsen A, Dechering K (2008) Sphingosine- -1-phosphate acts as a developmental stage specific inhibitor of platelet-derived growth factor-induced chemotaxis of osteoblasts. J Cell Biochem 105: Nicol GD (2008) Nerve growth factor, sphingomyelins, and sensitization in sensory neurons. Sheng Li Xue Bao 60: Hsieh HL, Sun CC, Wu CB, Wu CY, Tung WH, Wang HH, Yang CM (2008) Sphingosine 1-phosphate induces EGFR expression via Akt/ NF-kappaB and ERK/AP-1 pathways in rat vascular smooth muscle cells. J Cell Biochem 103: Postępy Biochemii 58 (3)

10 44. Gellings Lowe N, Swaney JS, Moreno KM, Sabbadini RA (2009) Sphingosine-1-phosphate and sphingosine kinase are critical for transforming growth factor-beta-stimulated collagen production by cardiac fibroblasts. Cardiovasc Res 82: Harvey KA, Welch Z, Sliva D, Siddiqui RA (2010) Role of Rho kinase in sphingosine 1-phosphate-mediated endothelial and smooth muscle cell migration and differentiation. Mol Cell Biochem 342: Hait NC, Oskeritzian CA, Paugh SW, Milstien S, Spiegel S (2006) Sphingosine kinases, sphingosine 1-phosphate, apoptosis and diseases. Biochim Biophys Acta 1758: Rapizzi E, Donati C, Cencetti F, Pinton P, Rizzuto R, Bruni P (2007) Sphingosine 1-phosphate receptors modulate intracellular Ca 2+ homeostasis. Biochem Biophys Res Commun 353: Strub GM, Maceyka M, Hait NC, Milstien S, Spiegel S (2010) Extracellular and intracellular actions of sphingosine-1-phosphate. Adv Exp Med Biol 688: Huang YL, Huang WP, Lee H (2011) Roles of sphingosine 1-phosphate on tumorigenesis. World J Biol Chem 2: Cuvillier O, Levade T (2001) Sphingosine 1-phosphate antagonizes apoptosis of human leukemia cells by inhibiting release of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria. Blood 98: Greenspon J, Li R, Xiao L, Rao JN, Marasa BS, Strauch ED, Wang JY, Turner DJ (2009) Sphingosine-1-phosphate protects intestinal epithelial cells from apoptosis through the Akt signaling pathway. Dig Dis Sci 54: Liu H, Toman RE, Goparaju SK, Maceyka M, Nava VE, Sankala H, Payne SG, Bektas M, Ishii I, Chun J, Milstien S, Spiegel S (2003) Sphingosine kinase type 2 is a putative BH3-only protein that induces apoptosis. J Biol Chem 278: Rosen H, Goetzl EJ (2005) Sphingosine 1-phosphate and its receptors: an autocrine and paracrine network. Nat Rev Immunol 5: Schwab SR, Pereira JP, Matloubian M, Xu Y, Huang Y, Cyster JG (2005) Lymphocyte sequestration through S1P lyase inhibition and disruption of S1P gradients. Science 309: Gräler MH, Goetzl EJ (2004) The immunosupresant FTY720 downregulates sphingosine 1-phosphate G-protein-coupled receptors. FASEB J 18: Leong WI, Saba JD (2010) S1P metabolism in cancer and other pathological conditions. Biochimie 92: Hla T (2004) Physiological and pathological actions of sphingosine 1-phosphate. Sein cell Dev Biol 15: Iwasaki T, Tsunemi S, Kitano S, Kanda C, Sekiguchi M, Kitano M, Sano H (2011) Role of sphingosine-1-phosphate signaling for the pathogenesis of autoimmune diseases. Inflamm Regen 31: Tedesco-Silva H, Mourad G, Kahan BD, Boira JG, Weimar W, Mulgaonkar S, Madsen S, Charpentier B, Pellet P, Vanrenterghem Y (2005) FTY720, a novel immunomodulator: efficacy and safety results from the first phase 2A study in de novo renal transplantation. Transplantation 79: Brinkmann V (2004) FTY720: mechanism of action and potential benefit in organ transplantation. Yonsei Med J 45: Kappos L, Antel J, Comi G, Montalban X, O Connor P, Polman CH, Haas T, Korn AA, Karisson G, Radue EW (2006) Oral fingolimod (FTY720) for relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med 355: Schuchardt M, Tölle M, Prüfer J, van der Giet M (2011) Pharmacological relevance and potential of sphingosine-1-phosphate in the vascular system. Br J Pharmacol 163: Lucke S, Levkau B (2010) Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cell Physiol Biochem 26: Igarashi J, Erwin PA, Dantas AP, Chen H, Michel T (2003) VEGF induces S1P1receptors in endothelial cells: implications for cross-talk between sphingolipid and growth factor receptors. Proc Natl Acad Sci 100: Takuwa Y, Okamoto Y, Yoshioka K, Takuwa N (2008) Sphingosine- 1-phosphate signaling and biological activities in the cardiovascular system. Biochim Biophys Acta 781: Langlois S, Gingras D, Béliveau R (2004) Membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP) cooperates with sphingosine 1-phosphate to induce endothelial cell migration and morphogenic differentiation. Blood 103: Keul HP, Levkau B, Zeiher AM, Dimmeler S, Aicher J, Urbich C, Spyridopoulos I, Chun J, Brinkmann V, Walter DH, Rochwalsky U, Reinhold J, Seeger F (2007) Receptor by Activation of the CXCR 4-Dependent Signaling Pathway via the S1P3. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: Karliner JS (2004) Mechanisms of cardioprotection by lysophospholipids. J Cell Biochem 92: Means CK, Xiao CY, Li Z, Zhang T, Omens JH, Ishii I, Chun J, Brown JH (2007) Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol 292: Wojakowski W, Tendera M, Kucia M, Zuba-Surma E, Paczkowska E, Ciosek J, Hałasa M, Król M, Kazmierski M, Buszman P, Ochała A, Ratajczak J, Machaliński B, Ratajczak MZ (2009) Mobilization of bone marrow-derived Oct-4+ SSEA-4+ very small embryonic-like stem cells in patients with acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol 53: Vadas M, Xia P, McCaughan G, Gamble J (2008) The role of sphingosine kinase 1 in cancer: oncogene or non-oncogene addiction? Biochim Biophys Acta 1781: Słowik-Żyłka D, Poziomkowska-Gęsicka I, Mikołajek-Bedner W (2009) Udział układu dopełniacza w regulacji krwiotworzenia. Post Biol Kom 36: Young N, Pearl DK, Van Brocklyn JR (2009) Sphingosine-1-phosphate regulates glioblastoma cell invasiveness through the urokinase plasminogen activator system and CCN1/Cyr61. Mol Cancer Res 7: LaMontagne K, Littlewood-Evans A, Schnell C, O Reilly T, Wyder L, Sanchez T, Probst B, Butler J, Wood A, Liau G, Billy E, Theuer A, Hla T, Wood J (2006) Antagonism of sphingosine-1-phosphate receptors by FTY720 inhibits angiogenesis and tumor vascularization. Cancer Res 66: Cuvillier O (2008) Downregulating sphingosine kinase-1 for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets 12: Paugh SW, Paugh BS, Rahmani M, Kapitonov D, Almenara JA, Kordula T, Milstien S, Adams JK, Zipkin RE, Grant S, Spiegel S (2008) A selective sphingosine kinase 1 inhibitor integrates multiple molecular therapeutic targets in human leukemia. Blood 112: Ratajczak MZ, Kim C, Wu W, Shin DM, Bryndza E, Kucia M, Ratajczak J (2012) The role of innate immunity in trafficking of hematopoietic stem cells-an emerging link between activation of complement cascade and chemotactic gradients of bioactive sphingolipids. Adv Exp Med Biol 946: Machaliński B (2008) Nieembrionalne komórki macierzyste, a regeneracja układu nerwowego. Pol Prz Neurol 4: Ratajczak MZ, Kim C (2011) Bioactive Sphingolipids and Complement Cascade as New Emerging Regulators of Stem Cell Mobilization and Homing. J Stem Cell Res Ther 1: Janowska-Wieczorek A, Marquez-Curtis LA, Shirvaikar N, Ratajczak MZ (2012) The role of complement in the trafficking of hematopoietic stem/progenitor cells. Transfusion, w druku 81. Wojakowski W, Kucia M, Zuba-Surma E, Jadczyk T, Książek B, Ratajczak MZ, Tendera M (2011) Very small embryonic-like stem cells in cardiovascular repair. Pharmacol Ther 129: Seitz G, Boehmler AM, Kanz L, Möhle R (2005) The role of sphingosine 1-phosphate receptors in the trafficking of hematopoietic progenitor cells. Ann N Y Acad Sci 1044: Marquez-Curtis LA, Turner AR, Sridharan S, Ratajczak MZ, Janowska-Wieczorek A (2010) The ins and outs of hematopoietic stem cells: studies to improve transplantation outcomes. Stem Cell Rev 7: Ratajczak MZ, Kim CH, Abdel-Latif A, Schneider G, Kucia M, Morris AJ, Laughlin MJ, Ratajczak J (2012) A novel perspective on stem cell homing and mobilization: review on bioactive lipids as potent chemoattractants and cationic peptides as underappreciated modulators of responsiveness to SDF-1 gradients. Leukemia 26: