Hemoglobina glikowana problemy analityczne

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 Volume 48 Number Praca poglądowa Review Article Hemoglobina glikowana problemy analityczne Glycated hemoglobin analytical problems Krystyna Sztefko Zakład Biochemii Klinicznej P-A Instytut Pediatrii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków Streszczenie Pomiar stężenia hemoglobin glikowanej (HbA1c) ma istotną rolę w monitorowaniu kontroli glikemii u pacjentów z cukrzycą. Standaryzacja oznaczania HbA1c polepszyła dokładność oznaczenia i dała możliwości wykorzystania tego oznaczenia również do diagnostyki cukrzycy. Jednakże, problemy przedanalityczne i analityczne, różne rekomendacje dotyczące sposobu przedstawiania wyników oznaczeń, a także różne punkty odcięcia stwarzają praktyczne problemy związane z właściwym wykorzystaniem HbA1c w praktyce klinicznej. Summary The measurement of glycated hemoglobin (HbA1c) is central in the monitoring of glycemic control in diabetic patients. Standardization of HbA1c has greatly improved accuracy of measurement and opened the possibility to used this parameter not only for monitoring but also for diagnosis of patients with diabetes. However, preanalytical and analytical issues, different recommendations concerning reporting the final results, use of different units and cut-off points cause many problems for appropriate use of HbA1c in clinical practice. Słowa kluczowe: hemoglobina glikowana, HbA1c, standaryzacja Key words: glycated hemoglobin, HbA1c, standaryzation Wzrost częstości występowania cukrzycy jest problemem ogólnoświatowym. Schorzenie to, mające charakter przewlekły, można określić jako grupę chorób metabolicznych i które wymaga nie tylko stałej kontroli klinicznej ale także częstych oznaczeń laboratoryjnych. Utrzymywanie glikemii zbliżonej do prawidłowej, a tym samym podniesienie jakości życia pacjentów i przeciwdziałanie komplikacjom klinicznym, jest głównym celem terapii pacjentów z cukrzycą. Pomiar hemoglobiny glikowanej (HbA1c) jest podstawowym badaniem laboratoryjnym stosowanym do monitorowania wyrównania metabolicznego w okresie tygodni przed wykonaniem oznaczenia. Chociaż oznaczenie to wykonywane jest już około 30 lat, postęp w metodach oznaczania stężenia hemoglobiny glikowanej i ich standaryzacja, znacznie polepszyły porównywalność wyników pomiędzy metodami. Wprowadzone nowe nazewnictwo, nowe jednostki, nowe wytyczne dotyczące punktów decyzyjnych i dyskusje na temat stosowania hemoglobiny glikowanej do diagnostyki cukrzycy to problemy, które mają bezpośrednie znaczenie dla diagnostów laboratoryjnych. Od wiedzy diagnostów zależy w dużym stopniu wiarygodność wyników oznaczania stężenia hemoglobiny glikowanej. Proces nieenzymatycznej glikacji hemoglobiny Reakcja pomiędzy grupami aminowymi aminokwasów, białek i peptydów z cukrami redukującymi została badana przez Maillarda już sto lat temu [43], ale dopiero w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku nabrała znaczenia w badaniach nad hemoglobiną glikowaną. Reakcja Maillarda (nieenzymatyczna glikacja białek) wyjaśnia biochemicznie, dlaczego podwyższone poziomy glukozy we krwi prowadzą do przewlekłych komplikacji w przebiegu cukrzycy [8]. W wyniku nieenzymatycznej glikacji w pierwszym etapie cukry redukujące (glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, ksyluloza, pentozy) reagują z grupami aminowymi różnych białek, a powstające niestabilne aldiminy (zasady Schiffa) na skutek rearanżacji przechodzą w stabilne produkty Amadoriego. Reakcje te nie wymagają udziału enzymów, a zmienne, które je regulują in vivo to stężenie glukozy i białka, przepuszczalność komórek dla glukozy, czas półtrwania białka i jego reaktywność w sensie wolnych grup aminowych. U dorosłego człowieka hemoglobina HbA stanowi 97% całkowitej hemoglobiny, hemoglobina HbA 2 stanowi 2,5-3,0% a hemoglobina płodowa (HbF) około 0.5%. W warunkach prawidłowych HbA składa się z dwóch α- i dwóch β-łańcuchów 303

2 Hemoglobina glikowana problemy analityczne polipeptydowych (α 2 β 2 ). Amino-końcowy łańcuch β-globiny stanowi miejsce, gdzie przyłączyć się może glukoza i inne cukry redukujące, mocznik oraz salicylany. W wyniku reakcji glukozy z N-końcową grupą aminową waliny na każdym β- łańcuchu HbA powstaje zasada Schiffa (aldimina), w której podwójne wiązanie pomiędzy węglem i tlenem w grupie aldehydowej glukozy jest zamieniane w podwójne wiązanie pomiędzy węglem grupy aldehydowej a azotem pochodzącym z grupy aminowej waliny. Hemoglobina z przyłączoną glukozą do N -końcowej waliny łańcucha beta nosi nazwę hemoglobiny glikowanej (HbA1c). W pierwszym etapie reakcja ta zachodzi szybko i ma charakter odwracalny, dlatego często stosuje się pojęcie labilna HbA1c. W dalszym etapie zachodzi przegrupowanie Amadoriego, w wyniku którego powstaje ketoamina będąca stabilną HbA1c. Ta ostatnia reakcja jest już procesem znacznie wolniejszym ale szybkość powstawania produktu Amadoriego jest znacznie większa aniżeli reakcja w kierunku odwrotnym, co powoduje że reakcja ta jest praktycznie nieodwracalna a produkt glikacji Amadoriego nagromadza się na białkach. Przegrupowanie Amadoriego zasady Schiffa do produktów Amadoriego w przypadku glikacji hemoglobiny zachodzi prawdopodobnie przez etap pośredni, którym jest forma enolowa. Z produktów Amadoriego (jak i samej glukozy) powstają różne związki karbonylowe, będące jedną z przyczyn powstawania końcowych produktów glikacji białek (ryc.1). Reakcja glikacji hemoglobiny nie zachodzi wyłącznie z udziałem N -końcowej waliny, ale także w co najmniej 10 innych miejscach cząsteczki co daje inne, z punktu widzenia struktury i ładunku chemicznego, rodzaje hemoglobiny glikowanej. Takim miejscem są grupy ε-aminowe lizyny wewnątrz każdego łańcucha. Na podstawie badań z zastosowaniem spektrometru masowego (MS) wykazano, że nie tylko beta-globina [51], ale także alfa-globina hemoglobiny ulega glikacji [39]. HbA1c stanowi nie więcej jak 60% wszystkich hemoglobin glikowanych [61]. Powstawanie hemoglobiny glikowanej zależy nie tylko od stężenia glukozy w środowisku, w którym krążą erytrocyty, ale również od czasu ekspozycji erytrocytów na wysoką glikemię. Metody oznaczania hemoglobiny glikowanej Metody pomiaru stężenia każdej substancji są uzależnione od ich własności fizykochemicznych. Przyłączenie glukozy do hemoglobiny wpływa na różnice w punkcie izoelektrycznym i budowie chemicznej hemoglobiny glikowanej i hemoglobiny nieglikowanej, co wykorzystywane jest w metodach służących do oznaczania HbA1c. a) Metody wykorzystujące różnice w ładunku Hemoglobina HbA1c i hemoglobina HbA różnią się w niewielkim stopniu punktem izoelektrycznym, co oznacza, że przy odpowiednim ph mają różny ładunek elektryczny a to stanowi podstawę oznaczenia HbA1c metodą chromatografii jonowymiennej, elektroforezy i ogniskowania izoelektrycznego [71]. Chromatografia jonowymienna wykorzystuje żywice kationowymienne (ujemnie naładowane) wykazujące powinowactwo do hemoglobin. W odpowiednio ustalonych warunkach hemoglobiny glikowane nie wiążą się do żywicy i eluowane są z kolumny jako pierwsze. Spektrofotometryczny pomiar każdej z hemoglobin pozwala na procentowe wyrażenie ilości HbA1c. Większość metod opierających się o chromatografię kationowymienną wykorzystuje do tego celu jonowymienną HPLC. Rycina 1 Proces nieenzymatycznej glikacji białek. 304

3 b) Metody w oparte o różnice strukturalne: Hemoglobina glikowana różni się od hemoglobiny A obecnością glukozy połączonej z N-końcową waliną β-globiny co zostało wykorzystane do oznaczenia całkowitej glikowanej hemoglobiny lub HbA1c metodą chromatografii powinowactwa, metodami immunochemicznymi i spektrometrią masową. W metodach chromatografii powinowactwa rozdział opiera się na wiązaniu cis-diolowych grup glukozy związanych z hemoglobiną do kwasu m-aminofenyloboranowego połączonego z agarozą. W wyniku tego połączenia powstaje odwracalny pięcioczłonowy kompleks, co powoduje, że hemoglobiny glikowane są zatrzymywane na kolumnie a hemoglobiny nieglikowane eluują się jako pierwsze. Elucja hemoglobin glikowanych z kolumny zachodzi przy pomocy sorbitolu [57]. Z pomiaru absorbancji hemoglobiny glikowanej i nieglikowanej obliczany jest procent hemoglobiny glikowanej. Przy pomocy chromatografii powinowactwa mierzona jest całkowita hemoglobina glikowana, a więc nie tylko HbA1c, ale także ketoaminowe struktury glikowane na resztach lizyny i waliny zarówno α- jak i β-łańcuchów globiny. Frakcje glikowane rozdzielane na kolumnach chromatografii powinowactwa zawierają około 10% HbA1a+b, 52% HbA1c i 38% glikowanych form HbA [1]. Niektóre metody chromatografii powinowactwa są standaryzowane na HbA1c ( ekwiwalent HbA1c ) na podstawie korelacji pomiędzy całkowitą hemoglobiną glikowaną a HbA1c. W metodach immunochemicznych stosowane jest przeciwciało skierowane przeciwko produktowi Amadoriego (ketoamina plus pierwsze cztery do ośmiu aminokwasów od N -końca łańcucha beta hemoglobiny). Najczęściej do pomiaru HbA1c stosowano test aglutynacji lateksowej. Na cząsteczkach lateksu opłaszczone są monoklonalne przeciwciała anty-hba1c. Aglutynator (syntetyczny polimer) zawierający wiele kopii immunoreaktywnej części HbA1c wiąże się z przeciwciałem anty-hba1c. Aglutynacja powoduje duże rozproszenie światła (wysoka absorbancja). HbA1c z próbki pacjenta konkuruje o miejsca wiązania na cząsteczkach przeciwciała anty-hba1c opłaszczonych na lateksie, co powoduje hamowanie aglutynacji i w konsekwencji uzyskuje się mniejsze rozproszenie światła (spadek absorbancji) (ryc. 2). Stosowane są też inne metody immunochemiczne, np. metody immunoenzymatyczne czy chemiluminescencyjne. Przeciwciała stosowane w metodach immunochemicznych nie rozpoznają labilnych pośrednich postaci HbA1c i innych hemoglobin glikowanych, takich jak np. HbA1a i HbA1b. Na początku lat 2000 stosowano też metodę, w której zlizowane próbki krwi poddawano proteolitycznemu trawieniu. Glikowane cząsteczki waliny były uwalniane i służyły jako substrat dla oksydazy fruktozylowaliny. Powstały nadtlenek wodoru mierzono przy użyciu chromogenu i odpowiedniej peroksydazy. Wyniki hemoglobiny glikowanej uzyskane przy pomocy różnych metod są bardzo dobrze skorelowane, ale nie ma odpowiednich danych wskazujących na przewagę analityczną czy użyteczność kliniczną którejkolwiek z metod. Najważniejszym jest jednak, aby wszystkie z ponad 100 metod produkowanych obecnie na świecie przez ponad 20 producentów były oparte o ten sam wzorzec a laboratorium miało świadomość, którą hemoglobinę glikowaną dana metoda mierzy. Innymi słowy, istotna jest nie tylko wiedza o podziale metod w zależności od własności fizykochemicznych hemoglobiny glikowanej i nieglikowanej na dwie grupy, ale także, która metoda może być wykorzystana do pomiaru całkowitej hemoglobiny glikowanej a która do pomiaru HbA1c (ryc. 3). Z punktu widzenia szybkości oznaczania i komfortu pacjen- Rycina 2 Przykład metody immunoturbidymetrycznej oznaczania stężenia hemoglobiny HbA1c. 305

4 Hemoglobina glikowana problemy analityczne ta niektóre z metod wykorzystywane są w systemie POCT (point of care testing). Jednak oznaczanie stężenia HbA1c w systemie POCT nie jest wystarczająco dokładne do diagnostyki cukrzycy [56]. Nazewnictwo hemoglobin glikowanych Hemoglobina jest białkiem heterogennym, co wykazano wiele lat temu w oparciu o różne metody chemiczne [5]. Początkowo w oparciu o chromatografię na CM-celulozie Huisman i Meyering [33] określili frakcje eluujące się kolejno z kolumny jako HbA1, HbA0, HbF i HbA2. Główną frakcję, ponad 80% wszystkich hemoglobin, stanowiła HbA0. Udowodniono, że HbA1 i HbA0 mają ten sam skład aminokwasowy [5]. Allen i wsp. [2] na podstawie chromatografii jonowymiennej stwierdził, że HbA1 można rozdzielić na trzy hemoglobiny eluujące się z kolumny w kolejności HbA1a, HbA1b, HbA1c. Ta ostatnia frakcja okazała się być istotnie podwyższona u chorych na cukrzycę [50]. Niewielka część HbA jest również glikowana w kilku innych miejscach, takich jak łańcuch alfa globiny i niektóre reszty lizyny (β-lizyna-66, α-lizyna-61 i β-lizyna-17) [11]. Ze względu na możliwość przyłączenia do hemoglobiny nie tylko glukozy, ale i innych pochodnych cukrów oraz powstawanie pośrednich produktów glikacji, a także różnorodność stosowanych metod, stosowane nazewnictwo dla różnych glikohemoglobin jest często mylące. HbA, jak wspomniano, stanowi największą frakcję nieglikowanej hemoglobiny, a określenie HbA0 stanowi synonim HbA [48,57]. Hemoglobina glikowana HbA1a oznacza dwie hemoglobiny: HbA1a1 z przyłączonym fruktozo-1,6,difosforanem i HbA1a2 z przyłączonym glukozo-6-fosforanem do N-końcowej waliny łańcucha β-globiny. Stężenia HbA1a1 i HbA1a2 są prawidłowe u osób z cukrzycą. HbA1b posiada przyłączony kwas pirogronowy, a najbardziej istotna z diagnostycznego punktu widzenia HbA1c posiada przyłączoną glukozę do N -końcowej waliny [57]. Te trzy hemoglobiny (HbA1a, HbA1b i HbA1c) często są nazywane i oznaczane wspólnie jak HbA1. Określenie pre-hba1c określa niestabilną zasadę Schiffa (aldiminę). Z analitycznego punktu widzenia zdefiniowania wymaga określenie całkowita glikowana hemoglobina (GHb), która zawiera HbA1 i inne produkty hemoglobiny z przyłączonymi cukrami prostymi w innych miejscach niż N-końcowa walina łańcucha beta globiny, takie jak (α-val-1-deoksyfruktoza) 2 β 2, α 2 (β-(lys-glukoza) n ) 2 i (α-(lys-glukoza) n β 2. W piśmiennictwie można znaleźć wiele określeń dla hemoglobin zmodyfikowanych w nieenzymatycznej glikacji glukozą: glikowana hemoglobina, glikohemoglobina, glikozylowana hemoglobina (nazwa niepoprawna i już nie stosowana), glukozylowana hemoglobina, HbA1 i HbA1c. Te nazwy nie powinny być używane zamiennie, a obecnie akceptowany termin to hemoglobina glikowana (GHb) [55]. International Federation od Clinical Chemistry (IFCC) zdefiniowało HbA1c jak hemoglobinę, która jest nieodwracalnie glikowana z jedną lub oboma N-końcowymi cząsteczkami waliny łańcuchów beta [38]. Przed definicją IFCC, HbA1c była definiowana jako określony pik w systemie HPLC. IFCC, European Association for the Study of Diabetes and International Diabetes Federation i the American Diabetes Association w 2007 roku uzgodniły, że HbA1c jest terminem, który powinien być używany dla wszystkich wyników GHb. Jednakże w różnego rodzaju materiałach edukacyjnych I rekomendacjach może także stosowany być skrót A1c [16, 28]. Standaryzacja metod oznaczania stężenia HbA1c Długoterminowe badania kliniczne Diabetes Control and Complications Trial (DCCT), Epidemiology of Diabetes Intervention and Complication (EDIC) i United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPS) udowodniły, że intensyw- Rycina 3 Metody oznaczania hemoglobiny glikowanej HbA1c i całkowitej hemoglobiny glikowanej (GHb). HbA1a1 HbA z przyłączonym fruktozo- 1,6,difosforanem do N-końca łańcucha β, HbA1a2 - HbA z przyłączonym glukozo-6-fosforanem N-końca łańcucha β do, HbA1b HbA z przyłączonym kwasem pirogronowym do N-końca łańcucha β, HbA1c HbA z przyłączoną glukozą do N-końcowej waliny łańcucha β-globiny. Inne pochodne glikowane: glikacja przy ε-reszt lizyny (β-lizyna-66), α-lizyna-61 i β-lizyna-17). 306

5 na kontrola glikemii u pacjentów z cukrzycą pozwala na znaczne obniżenie ryzyka komplikacji takich jak retinopatia czy nefropatia [69, 72]. Monitorowanie i cel kliniczny leczenia oparto o oznaczanie hemoglobiny glikowanej (HbA1c) i glikemii. Metodą stosowaną do oznaczania HbA1c w badaniu DCCT była kationowo wymienna chromatografia HPLC. W latach dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku w laboratoriach wykorzystywano ponad 30 różnych metod do oznaczania HbA1c, które różniły się rodzajem oznaczanej hemoglobiny glikowanej (HbA1c, GHb, HbA1) i nieglikowanej, zmiennością analityczną oraz klinicznym punktem docelowym [15]. Każda z tych metod miała swoją definicję analitu i nie była prawidłowo wystandaryzowana ze względu na brak wzorca pierwszorzędowego, ale we wszystkich metodach wyniki oznaczania HbA1c podawano jako procent hemoglobiny całkowitej. Brak standaryzacji stosowanych wówczas różnych metod nie pozwalał na jakiekolwiek porównywanie badań klinicznych prowadzonych w różnych ośrodkach i na ustalenie jednakowych punktów diagnostycznych, bowiem różnice w stężeniach hemoglobiny glikowanej były nawet dwukrotne [42]. Istotne znaczenie HbA1c do monitorowania glikemii u pacjentów z cukrzycą i konieczność ustalenia jednoznacznych algorytmów postępowania z chorym na cukrzycę doprowadziły do powstania różnych programów standaryzacji HbA1c, z których najważniejszy to The National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) w Stanach Zjednoczonych [41]. Inne programy standaryzacji prowadzono także w Japonii [62] i w Szwecji [20]. Każdy z tych programów bazował na swojej metodzie oznaczania i swoim wzorcu, czego konsekwencją były różne kliniczne wartości odcięcia. NSGP w oparciu o metodę HPLC z żywicą jonowymienną BioRex 70 standaryzował wyniki oznaczania hemoglobiny glikowanej do wartości równoważnych w DCCT [27]. Proces standaryzacji różnych metod względem NGSP istotnie obniżył zmienność oznaczeń hemoglobiny glikowanej miedzy laboratoriami. Szczegółowe informacje na temat standaryzacji HbA1c według różnych programów można znaleźć w piśmiennictwie polskim [10]. International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) powołało grupę ekspertów, których zadaniem było wypracowanie materiału referencyjnego i referencyjnej procedury dla oznaczania HbA1c zgodnie z koncepcją zgodności pomiarowej. W 2001 roku IFCC ustaliło metodę referencyjną dla HbA1c i definicję analitu [38, 65]. IFCC zdefiniowało HbA1c jako hemoglobinę, w której jedna lub obie N -końcowe waliny łańcuchów beta są nieodwracalnie glikowane glukozą (βn- 1-deoxyfruktozylo-hemoglobina). Ta definicja nie zawiera hemoglobin glikowanych w innych miejscach łańcucha alfa lub beta cząsteczki hemoglobiny. Jako pierwszorzędowy materiał do kalibracji metody referencyjnej posłużyła czysta HbA1c i HbA0 wyizolowane w oparciu o chromatografię powinowactwa i chromatografię jonowymienną a cząsteczki te scharakteryzowano stosując ogniskowanie izoelektryczne i EC-MS [12]. W metodzie referencyjnej w pierwszym etapie przy pomocy endoproteinazy Glu-C N-końcowy heksapeptyd był odszczepiony z łańcucha beta hemoglobiny glikowanej i hemoglobiny nieglikowanej, a drugi etap polegał na ilościowym pomiarze obu hemoglobin metodą HPLC z elektroforezą kapilarną lub HPLC z MS [34, 70]. Wyniki uzyskane referecyjnym systemem pomiarowym IFCC były bardzo dobrze skorelowane z wynikami NGSP/DCCT [31]. Ponieważ pomiar HbA1c metodą referencyjną IFCC jest bardzo swoisty i metoda ta mierzy tylko jeden rodzaj cząsteczki hemoglobiny glikowanej (HbA1c), zatem hemoglobiny nie- HbA1c nie były mierzone. Z tego powodu wyniki stężenia HbA1c otrzymane przy użyciu metody IFCC były o 1,5-2,0 punktów procentowych niższe niż wyniki uzyskane w programie NGSP (zgodność pomiarowa do DCCT), jak również w programach Szwedzkim i Japońskim [44]. Aby uzyskać zgodność pomiędzy wynikami i polepszyć w ten sposób opiekę nad pacjentem sformalizowano zależność pomiędzy tymi metodami. Ustalono liniową zależność pomiędzy wynikami z dwóch sieci programów standaryzacji: NGSP (%) = (0,948 x [IFCC %] + 2,152 [27]. W 2007 IFCC zarekomendowało, aby stężenie HbA1c, mierzone i standaryzowane wg IFCC, wyrażać w mmol/mol. Przy zastosowaniu nowych jednostek zależność między wynikami uzyskiwanymi w oparciu o oba programy standaryzacji wyrażano następująco: NGSP = (0,09148 x [IFCC mmol/mol] + 2,152). Dzięki tej zmianie unika się nieporozumień przy interpretacji wyników stężenia HbA1c mierzonych metodami standaryzowanymi według NGSP i IFCC. Równania pozwalające na przeliczanie wartości hemoglobiny glikowanej w zależności od programu standaryzacji przedstawiono w tabeli I. Współcześnie rekomenduje się, aby metody oznaczania hemoglobiny glikowanej HbA1c były certyfikowane przez National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) [4, 25, 68]. Producenci metod do oznaczania HbA1c powinni także wykazać zgodność pomiarową (traceability) do metody referencyjnej IFCC [54]. Również laboratoria, które oznaczają HbA1c, powinne uczestniczyć w kontroli zewnętrzlaboratoryjnej, w której stosuje się próbki świeżej krwi z ustaloną wartością przez sieć laboratoriów NGSP [41, 54]. Tabela I Przeliczniki wartości stężenia hemoglobiny HbA1c w zależności od programów standaryzacji. Metoda porównawcza (MP) IFCC do MP MP do IFCC NGSP (USA) NGSP = ( xIFCC) IFCC = (10.93xNGSP) JDS/ISCC (Japonia) JDS = ( xIFCC) IFCC = (10.78xJDS) Mono-S (Szwecja) Mono-S = ( xIFCC) IFCC = (10.11)xMono-S)

6 Hemoglobina glikowana problemy analityczne Stosowanie próbek świeżej krwi niweluje w dużym stopniu problemy z komutabilnością pomiędzy próbkami wzorca, próbkami kontrolnymi i próbkami pacjenta. Ujednolicenie przedstawiania wyników HbA1c Według American Diabetes Association, the European Association for the Study of Diabetes, the International Diabetes Federation, the IFCC and the International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes wyniki HbA1c powinny być wystandaryzowane na poziomie światowym, a jedynym systemem referencyjnym jest ten przygotowany przez IFCC; stężenie HbA1c powinno być podawane w jednostkach układu SI (mmol/mol, bez miejsc po przecinku) i jednostkach pochodnych NGSP (%, jedno miejsce dziesiętne), stosując wzorcowe równanie przeliczeniowe IFCC-NGSP [28]. Standaryzacja metod oznaczania HbA1c i ujednolicenie jednostek pozwala na ogólnoświatową harmonizację metod, ale pojawił się problem konieczności stosowania nowych jednostek przez lekarzy a przede wszystkim przez pacjentów. Na podstawie badań retrospektywnych wykazano, że pomiędzy stężeniem HbA1c i przeciętnym stężeniem glukozy z okresu trzech miesięcy (eag) istnieje liniowa korelacja [53]. Liniowa zależność pomiędzy HbA1c i eag jest udowodniona również u dzieci [19]. W międzynarodowym badaniu A1c Derived Average Glucose (ADAG Study Group) wykazano liniową korelację między stężeniem HbA1c i przeciętną wartością glukozy w grupie 506 osób, wśród których 268 osób miało cukrzycę typu I, 159 osób było z cukrzycą typu II a 80 osób było bez cukrzycy. Zależność ta przedstawia się następująco [46]: (eag mg/dl = 28.7 x Hb A 1c 46.7) (eag mmol/l 1.59 x Hb A 1c -2.59) Określenie przeciętnego stężenia glukozy może stanowić pomoc dla pacjentów z cukrzycą, bowiem tak przedstawiony wynik hemoglobiny glikowanej może być pomocny w zrozumieniu wartości diagnostycznej HbA1c. Ponieważ czas życia erytrocytów wynosi około 120 dni oczywistym jest, że stężenie HbA1c w dowolnym momencie czasowym zależy od liczby wszystkich erytrocytów i że glikemia w ostatnich 30 dniach przed pomiarem przyczynia się bardziej do końcowego wyniku HbA1c niż glikemie np dni wcześniej. Udowodniono, że młode krwinki czerwone mają niższy poziom HbA1c niż starsze komórki [22]. Zmierzone stężenie HbA1c zatem wyraża ważone przeciętne stężenie glukozy. Z tego powodu obliczenie eag nie może w pełni zastępować informacji zawartej w wyniki HbA1c. Wartość eag jest dodatkową informacją, a jej zastosowanie w praktyce klinicznej jest na razie kontrowersyjne i szeroko dyskutowane [6, 7, 37]. W tabeli II podano współzależność pomiędzy HbA1c (wg NSGP i IFCC) oraz oszacowanym stężeniem glukozy (mg/dl i mmol/l) Interferencje i ograniczenia przy pomiarach HbA1c Pomiar HbA1c, jak w przypadku każdego oznaczenia biochemicznego, ma ograniczenia a na ostateczny wynik mają także wpływ różne czynniki interferujące. Stosunek labilnej (odwracalnej) i stabilnej (nieodwracalnej) frakcji zasady Schiffa istotnie zmienia się przy ostrych zmianach poziomu glukozy i z tego powodu w niektórych metodach labilna frakcja może zawyżać wyniki, zatem musi być usunięta przed oznaczeniem [35,58]. Do czynników interferujących w oznaczenie stężenia HbA1c należy: obecność we krwi nieprawidłowych hemoglobin, karbamylowanych hemoglobin, acetylowanych hemoglobin i hyperlipidemia [32, 35, 58]. Hemoglobina chemicznie zmieniona wskutek reakcji z mocznikiem, w wyniku czego powstaje karbamylowana pochodna hemoglobiny, stwarza problemy analityczne oznaczania HbA1c u chorych z niewydolnością nerek. U dializowanych pacjentów z cukrzycą pomiar HbA1c daje zaniżone wyniki [49]. Witamina C i witamina E, poprzez hamowanie procesu glikacji, powodują uzyskiwanie fałszywie zaniżonych wyników HbA1c [12, 18, 23]. Szybkość glikacji jest także uzależniona genetycznie [14, 64]. W niektórych metodach hypertriglicerydemia i hiperbilirubinemia, a także w przewlekłym alkoholiźmie i przy przewlekłym stosowaniu salicylanów uzyskuje się fałszywe zawyżenie wyników [9, 26]. Wykaz czynników mogących powodować interferencje w pomiar HbA1c można znależć na Dużym ograniczeniem w klinicznym wykorzystaniu wyników hemoglobiny glikowanej jest pomiar stężenia HbA1c u pacjentów z nieprawidłowym czasem życia erytrocytów, jak to Tabela II Współzależność pomiędzy stężeniem HbA1c a oszacowanym przeciętnym stężeniem glukozy. HbA1c (IFCC) (mmol/mol) HbA1c (NGSP) (%) Oszacowane przeciętne stężenie glukozy (mg/dl) Oszacowane przeciętne stężenie glukozy (mmol/l)

7 ma miejsce w przypadku anemii hemolitycznej (wyniki za niskie), ciężkich anemii z niedoboru żelaza (wyniki za wysokie, terapia zastępcza żelazem obniża stężenie HbA1c) [13, 67]. Wiadomo, że malonylodialdehyd, którego poziom jest podwyższony u pacjentów z anemią z niedoboru żelaza [66], zwiększa glikację hemoglobiny [59]. Stężenie HbA1c jest również podwyższone u zdrowych kobiet w późnej ciąży z powodu niedoboru żelaza [29]. Chociaż oznaczenie stężenia HbA1c u takich pacjentów jest poprawne z analitycznego punktu widzenia użyteczność kliniczna uzyskiwanych wyników jest ograniczona. Innym ograniczeniem przy oznaczaniu hemoglobiny glikowanej jest obecność we krwi różnych wariantów hemoglobiny, takich jak HbS, HbE, HbC i HbD, HbJ a także HbF (białaczki, anemia i dziedzicznie przetrwała hemoglobina płodowa). W 2005 roku znanych było 893 wariantów hemoglobiny a każdy z nich może interferować w oznaczenie HbA1c [45]. Warianty hemoglobiny ulegają również glikacji, co przekłada się na błędy oznaczenia HbA1c. Generalnie HbS i HbC interferują w niektórych metodach immunochemicznych (Abbott Architect, Roche Cobas Integra, Siemens ADVIA), a HbE i HbD w metody HPLC (Bio-Rad Variant I i Turbo A1c) [9]. Problem interferencji analitycznej w przypadku obecności wariantów hemoglobiny jest często trudny do uchwycenia, bowiem wiele osób mających nieprawidłowe hemoglobiny ogólnie jest zdrowa. Dlatego zaleca się, aby wyniki stężenia HbA1c, np. >15%, wyniki wskazujące na zbyt dużą zmianę stężenia HbA1c od ostatniego pomiaru bez wyraźnej przyczyny lub wyniki oznaczenia hemoglobiny glikowanej u pacjentów pochodzących z niektórych regionów świata były interpretowane ostrożnie. HbA1c jest np. wyższa u Afro-Amerykanów i dla populacji hiszpańskiej w porównaniu z populacją kaukaską przy tym samym poziomie glikemii [30, 54, 60, 74]. Problemy z interpretacją wyników występują u pacjentów z talasemią [17]. Inne czynniki przedanalityczne i analityczne Poziom HbA1c zmienia się z wiekiem (wzrost od 0.1% do 0.3% na dekadę życia) [47,73,74]. Jest to marker, który koreluje z glikemią pacjenta w ostatnich 4-6 tygodni przed pomiarem, zatem osoby mające tą samą wartość glukozy na czczo mogą mieć różne stężenia HbA1c. Zmienność wewnątrzosobnicza dla HbA1c u osób nie mających cukrzycy jest bardzo niska (<2%) [36, 52]. Zalecane jest, aby współczynniki zmienności oznaczeń wewnątrzlaboratoryjnej i międzylaboratoryjnej wynosiły odpowiednio <2% i <3% [54]. Zmiany stężenia HbA1c (np. ±0,3%) odzwierciedlają zmienność analityczną a nie zmiany w poziomie glikemii. Biorąc pod uwagę różnego rodzaju interferencje dobrą praktyką laboratoryjną jest weryfikacja wyniku, jeżeli HbA1c jest poniżej dolnej granicy przedziału referencyjnego lub >15% (>140 mmol/mol). Powtórne oznaczenie powinno być wykonane metodą, której podstawa fizykochemiczna jest inna niż w metodzie pierwotnie zastosowanej. Pomiar stężenia HbA1c nie wymaga, aby pacjent był na czczo. Krew pobiera się najczęściej na EDTA, ale wymagania w tym zakresie mogą zależeć od metody i producenta odczynników. Próbki krwi są stabilne do jednego tygodnia w teperaturze 4 0 C [40]. Próbki mogą być przechowywane w temp C (lub niższej) co najmniej rok. Interpretacja wyników HbA1c Pomiar hemoglobiny glikowanej HbA1c jest podstawowym oznaczeniem w monitorowaniu długoterminowej kontroli glikemii u pacjentów z cukrzycą, co ułatwia dopasowanie indywidualnej terapii i podnosi jakość życia pacjentów a także obniża prawdopodobieństwo wystąpienia komplikacji choroby. Istnieje silna korelacja pomiędzy stężeniem HbA1c a ryzykiem wystąpienia komplikacji klinicznych u cukrzyków [69]. W oparciu o poziom HbA1c można ocenić ryzyko wystąpienia chorób naczyniowo-sercowych nawet wewnątrz normalnego zakresu stężeń [63]. Dla metod certyfikowanych względem NGSP przedział referencyjny nie powinien odbiegać od zakresu 4%-6% (20-42 mmol/mol). Obecnie rekomendowany cel leczenia pacjentów cukrzycowych zależy od indywidualnego pacjenta, np. dla pacjentów z cukrzycą typu I <6.5%, u kobiet ciężarnych <6.1% a u osób starszych 7,5-8,0%. Dotyczy to również dzieci, nastolatków, pacjentów z ograniczonym czasem przeżycia krwinek, pacjentów z hipoglikemią w wywiadzie lub zaawansowanymi komplikacjami [54]. Zastosowanie pomiaru stężenia HbA1c do diagnostyki cukrzycy jest na razie dyskusyjne. Jako punkt decyzyjny sugeruje się wartość HbA1c 6,5% (48 mmol/mol) [56] a poziomy w zakresie 5,7%-6,4% (39-46 mmol/mol) powinno traktować się jako wskaźnik ryzyka rozwoju cukrzycy [3]. Z punktu widzenia diagnosty laboratoryjnego wydaje się, że przyjęcie jednego rygorystycznego punktu odcięcia HbA1c do diagnostyki cukrzycy bez uwzględnienia zmienności analitycznej i zmienności biologicznej a także podejmowanie decyzji klinicznych tylko na podstawie pojedynczego pomiaru nie powinno mieć miejsca. Zawsze w pobliżu ustalonego punktu odcięcia będzie istniała szara strefa stężeń HbA1c a decyzja musi być podejmowana na podstawie obrazu klinicznego indywidualnego pacjenta i innych oznaczeń biochemicznych wykonywanych standaryzowanymi metodami, z których najistotniejsze jest stężenia glukozy. Piśmiennictwo 1. Abraham EC, Perry RE, Stallings M. Application of affinity chromatography for separation and quantification of glycosylated hemoglobins. J Lab Clin Med 1983; 102: Allen DW, Schroeder WA, Balog J. Observations on the chromatographic heterogeneity of normal adult and fetal human hemoglobin. J Am Chem Soc 1958; 80: American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes Diabetes Care 2010; 33: 11-S American Diabetes Association. Tests of glycemia in diabetes. Diabetes Care 2000; 23: Atassi MZ. Clinical studies on haemoglobins A and A. Biochem 1 0 J 1964; 93: Barth JH, Marshall SM, Watson ID. Consensus meeting on reporting glycated haemoglobin and estimated average glucose in the UK: Report to the National Director for Diabetes, Depart- 309

8 Hemoglobina glikowana problemy analityczne ment of Health. Ann Clin Biochem 2008; 45: Bloomgarden ZT, Inzucchi SE, Karnieli E et al. The proposed terminology A(1c) derived average glucose is inherently imprecise and should not be adopted. Diabetologia 2008; 51: Brownlee M, Cerami A, Vlassara H. Advanced glycosylation end products and the biochemical basis of diabetic complications. N Engl J Med 1988; 318: Bry L, Chen PC, Sacks DB. Effects of hemoglobin variants and chemically modified derivatives on assays for glycated hemoglobin. Clin Chem 2001; 47: Bryśkiewicz ME, Majkowska L. Aspekty standaryzacji oznaczania hemoglobin glikowanej (HbA1c). Pol.Merk.Lek. 2011, XXX, 176, Bunn HF, Shapiro R, McManus M et al. Struktural heterogeity of human hemoglobin A due to nonenzymatic glycosylation. J Biol Chem 1979; 254: Ceriello A, Giugliano D, Quatraro A et al. Vitamin E reduction of protein glycosylation in diabetes. New prospect for prevention of diabetic complications? Diabetes Care 1991; 14: Coban E, Ozdogan M, Timuragaoglu A. Effect of iron deficiency anemia on the levels of hemoglobin A1c in nondiabetic patients. Acta Haematol 2004; 112: Cohen RM, Snieder H, Lindsell CJ et al. Evidence for independent heritability of the glycation gap (glycosylation gap) fraction of HbA1c in nondiabetic twins. Diabetes Care 2006; 29: College of American Pathologists. Electrophoresis/chromatography survey 1993, set EC-C. North-field (IL): College of American Pathologists; Consensus Committee. Consensus statement on the worldwide standardization of the hemoglobin A1c measurement: the American Diabetes Association, European Association for the Study of Diabetes, International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, and the International Diabetes Federation. Diabetes Care 2007; 30: Danescu LG, Levy S, Levy J. Markedly low hemoglobin A1c in a patient with an unusual presentation of beta-thalasemia minor. Endocrinol Pract 2010; 16: Davie SJ, Gould BJ, Yudkin JS. Effects of vitamin C on glycosylation of proteins. Diabetes 1992; 41: Diabetes Research in Children Network (DirecNet) Study Group. Relationship of A1C to glucose concentrations in children with type 1 diabetes: assessments by high-frequency glucose determinations by sensors. Diabetes Care 2008; 31: Eckerbom S, Bergqvist Y, Jeppsson JO. Improved method for analysis of glycated haemoglobin by ion exchange chromatography. Ann Clin Biochem 1994; 31: Finke A, Kobold U, Hoelzel W, et al. Preparation of a candidate primary reference material for the international standardization of HbA1c determinations. Clin Chem Lab Med 1998; 36: Fitzgibbons JF, Koler RD, Jones RT. Red cell age-related changes in hemoglobins AIa+b and A1c in normal and diabetic subjects. J. Clin. Invest 1976, 58: Gallagher EJ, LeRoith D, Bloomgarden Z. Review of hemoglobin A(1c) in the management of diabetes. J Diabetes 2009; 1: Garlick RL, Mazer JS, Higgins PJ et al. Characterization of glycosylated hemoglobins. Relevance to monitoring of diabetic control and analysis of other proteins. J Clin Invest 1983;71: Goldstein DE, Little RR, Lorenz RA, et al. Tests of glycemia in diabetes. Diabetes Care 2004; 27: Goldstein DE, Little RR, Wiedmeyer HM et al. Glycated hemoglobin: methodologies and clinical applications. Clin Chem 1986; 32: Goldstein DE, Little RR. Bringing order to chaos: the National Glycohemoglobin Standardization Program. Contemp Int Med 1997; 9: Hanas R, John G consensus statement on the worldwide standardization of the hemoglobin A1c measurement. Clin Chem 2010; 56: Hashimoto K, Noguchi S, Morimoto Y, et al. A1C but not serum glycated albumin is elevated in late pregnancy owing to iron deficiency. Diabetes Care 2008; 31: Herman WH, Ma Y, Uwaifo G, et al. Differences in A1C by race and ethnicity among patients with impaired glucose tolerance in the Diabetes Prevention Program. Diabetes Care 2007; 30: Hoelzel W, Weykamp C, Jeppsson J, et al. IFCC reference system for measurement of haemoglobin A1 in human blood and the national standardization schemes in the United States, Japan, and Sweden: a Method comparison study. Clin Chem 2004; 50: Hoshino T, Nakayama T, Kuwa K, et al. Survey and assessment of the actual state of routine measurement of glycohaemoglobin/gh by commercial methods: warning to the users and the providers. J Pharm Biomed Anal 1997; 15: Huisman TH, Meyering CA. Studies on the heterogeneity of hemoglobin. I. The heterogeneity of different human hemoglobin types in carboxymethylcellulose and in amberlite IRC-50 chromatography qualitative aspects. Clin Chim Acta 1960; 5: Jeppsson JO, Kobold U, Barr J, et al. Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human blood. Clin Chem Lab Med 2002; 40: John WG. Glycated haemoglobin analysis. Ann Clin Biochem 1997; 34: Kilpatrick ES, Maylor PW, Keevil BG. Biological variation of glycated hemoglobin. Implications for diabetes screening and monitoring. Diabetes Care 1998; 21: Kilpatrick ES. Haemoglobin A1c in the diagnosis and monitoring of diabetes mellitus. J Clin Pathol 2008; 61: Kobold U, Jeppsson JO, Dülffer T, et al. Candidate reference methods for hemoglobin A1c based on peptide mapping. Clin Chem 1997; 43: Lapolla A, Fedele D, Plebani M et al. Evaluation of glycated globins by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Clin Chem 1999; 45: xref-ref Little RR, Rohlfing CL, Tennill AL, et al. Effects of sample storage conditions on glycated hemoglobin measurement: evaluation of five different high performance liquid chromatography methods. Diabetes Technol Ther 2007; 9: Little RR, Rohlfing CL, Wiedmeyer HM, et al. NGSP Steering Committee. The national glycohemoglobin standardization program: a five-year progress report. Clin Chem 2001; 47: Little RR, Wiedmeyer HM, England JD, et al. Interlaboratory standardization of measurements of glycohemoglobins. Clin Chem 1992; 38: Maillard LC, Gautier MA. Action des acides amines sur les sucres: formation des melanoidies par voie methodique C.R. Seances Acad Sci. III 1912; 154: Mosca A, Goodall I, Hoshino T et al. Global standardization of glycated hemoglobin measurement: the position of the IFCC Working Group. Clin Chem Lab Med 2007: Nanda S, Sharma SG, Bhatt SP, et al. Conundrum of elevated HbA1c and hypoglikemia a rare cause. Am J Med Sci 2008; 335: Nathan DM, Kuenen J, Borg R, et al. Translating the A1C assay into estimated average glucose values. Diabetes Care 2008; 31:

9 48. Pani LN, Korenda L, Meigs JB, et al. Effect of aging on A1C levels in individuals without diabetes: evidence from the Framingham Offspring Study and the National Health and Nutrition Examination Survey Diabetes Care 2008; 31: Peacock I. Glycosylated haemoglobin: Measurement and clinical use. J Clin Pathol 1984; 37: Peacock TP, Shihabi ZK, Bleyer AJ, et al. Comparison of glycated albumin and hemoglobin A(1c) levels in diabetic subjects on hemodialysis. Kidney Int 2008; 73: Rahbar S. An abnormal hemoglobin in reed cells of diabetics. Clin Chim Acta 1968; 22: Roberts NB, Green BN, Morris M. Potential of electrospray mass spectrometry for quantifying glycohemoglobin. Clin Chem 1997; 43: Rohlfing C, Wiedmeyer HM, Little R, et al. Biological variation of glycohemoglobin. Clin Chem 2002; 48 : Rohlfing CL, Wiedmeyer HM, Little RR, et al. Defining the relationship between plasma glucose and HbA(1c): analysis of glucose profiles and HbA(1c) in the Diabetes Control and Complications Trial. Diabetes Care 2002; 25: Saaddine JB, Fagot-Campagna A, Rolka D, et al. Distribution of HbA 1c levels for children and young adults in the U.S.: Third National Health and Nutrition Examination Survey. Diabetes Care 2002; 25: Sacks DB, Arnold M, Bakris G, et al. Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management od diabetes mellitus. Clin Chem 2011; 57: e Sacks DB, Arnold M, Bakris GL, et al. Executive summary: Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem 2011; 57: Sacks DB, Carbohydrates. W Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE (ed.). wyd.4, 2006: Schwartz JC. The role of glycohemoglobin and other proteins in diabetes management. Diabetes Rev 1995; 3: Selvaraj N, Bobby Z, Sathiyapriya V. Effect of lipid peroxides and antioxidants on glycation of hemoglobin: an in vitro study on human erythrocytes. Clin Chim Acta 2006; 366: Selvin E, Steffes MW, Zhu H, et al. Glycated hemoglobin, diabetes, and cardiovascular risk in nondiabetic adults. N Engl J Med 2010; 362: Shaklai N, Garlick RL, Bunn HF. Nonenzymatic glycosylation of human serum albumin alters its conformation and function. J Biol Chem 1984; 259: Shima K, Endo J, Oimomi M et al. Interlaboratory differences in GHb measurement in Japan, an interim report of the committee on an interlaboratory standardization of HbA1c determination, the Japanese Diabetes Society. J Japan Diab Soc 1994; 37: Singer DE, Nathan DM, Anderson KM, et al. Association of HbA1c with prevalent cardiovascular disease in the original cohort of the Framingham Heart Study. Diabetes 1992; 41: Snieder H, Sawtell PA, Ross L, et al. HbA(1c) levels are genetically determined even in type 1 diabetes: evidence from healthy and diabetic twins. Diabetes 2001; 50: Steffes M, Cleary P, Goldstein D et al. Hemoglobin A1c measurements over nearly two decades: sustaining comparable values throughout the Diabetes Control and Complications Trial and the Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications study. Clin Chem 2005; 51: Sundaram RC, Selvaraj N, Vijayan G, et al. Increased plasma malondialdehyde and fructosamine in iron deficiency anemia: effect of treatment. Biomed Pharmacother 2007; 61: Tarim O, Kucukerdogan A, Gunay U, et al. Effects of iron deficiency anemia on hemoglobin A1c in type 1 diabetes mellitus. Pediatr Int 1999; 41: The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1993; 329: U.K. Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Lancet 1998; 352: Weykamp C, John WG, Mosca A, et al. The IFCC reference measurement system for HbA1c: a 6-year progress report. Clin Chem 2008; 54 : Weykamp CW, Penders TJ, Miedema K, et al. Standardization of glycohemoglobin results and reference values in whole blood studied in 103 laboratories using 20 methods. Clin Chem 1995; 41: White NH, Sun W, Cleary PA, et al. Prolonged effect of intensive therapy on the risk of retinopathy complications in patients with type 1 diabetes mellitus: 10 years after the Diabetes Control and Complications Trial. Arch Ophthalmol 2008; 126: Wiener K, Roberts NB. Age does not influence levels of HbA1c in normal subject. QJ M 1999; 92: Ziemer DC, Kolm P, Weintraub WS, et al. Glucose-independent, black-white differences in hemoglobin A1c levels: a cross-sectional analysis of 2 studies. Ann Intern Med 2010; 152: Zaakceptowano do publikacji: Adres do korespondencji: prof. dr hab. n. med. Krystyna Sztefko Zakład Biochemii Klinicznej P-A Instytut Pediatrii Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński Kraków, ul. Wielicka misztefk@cyf-kr.edu.pl 311