Zakład Farmakologii Doświadczalnej i Klinicznej

Transkrypt

1 Zakład Farmakologii Doświadczalnej i Klinicznej Szczecin, dr hab. Mateusz Kurzawski, prof. nadzw. PUM Zakład Farmakologii Doświadczalnej i Klinicznej Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Olgi Kuzawińskiej pt. Wpływ reakcji zapalnej na przebieg reakcji bólowej w rejonie unerwienia nerwu trójdzielnego Zależność pomiędzy reakcją zapalną a bólem jest dobrze udokumentowana i od lat wykorzystywana, choćby przez zastosowanie leków o działaniu przeciwzapalnym w terapii bólu. Molekularne podstawy reakcji bólowej w przebiegu schorzeń o różnej patogenezie są natomiast bardzo złożone i pomimo wieloletnich badań, nie zostały do końca wyjaśnione, zarówno w odniesieniu do mechanizmów obwodowych jak i ośrodkowych. Do schorzeń związanych z patologicznym, wymagającym leczenia bólem, które stanowią cel prowadzonych w wielu ośrodkach na całym świecie intensywnych badań naukowych należą, m. in., migrena, klasterowe bóle głowy czy też neuralgia nerwu trójdzielnego. Choroby te charakteryzują się odmienną patogenezą, epidemiologią, przebiegiem i objawami, natomiast łączy je udział (w mniejszym lub większym stopniu) zmienionej pobudliwości i przewodnictwa bodźców bólowych przez nerw trójdzielny oraz zmian zapalnych i naczynioruchowych. W ten aktualny nurt badań wpisuje się przedstawiona do oceny rozprawa doktorska, w której zaprezentowano wyniki badań, dotyczących ekspresji wybranych cytokin prozapalnych (IL-1B, IL-6, TNF), mediatorów reakcji bólowej (CGRP, BDNF) oraz receptora dla kapsaicyny (TRPV1) w zwojach nerwu trójdzielnego w modelu mysim. Praca przedstawiona do recenzji ma typowy układ, liczy 133 strony, zawiera 22 wykresy i ryciny oraz 6 tabel (głównie przedstawiających uzyskane wyniki). Imponująca jest liczba wykorzystanych pozycji Katedra Farmakologii Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego, al. Powstańców Wlkp. 72, Szczecin, tel (91) ; fax: (91) , farmakol@pum.edu.pl

2 literaturowych (375), dobrze merytorycznie dobranych, w przeważającej mierze aktualnych prac anglojęzycznych z ostatnich kilkunastu lat. Obszerny wstęp stanowi bardzo szerokie i aktualne wprowadzenie do tematyki podejmowanych badań. Autorka szczegółowo opisuje podstawy anatomiczne i fizjologiczne przewodzenia bodźców bólowych za pośrednictwem nerwu trójdzielnego, charakteryzuje także pod względem funkcjonalnym najczęstsze stany patologiczne, związane ze zmienioną pobudliwością bólową, dotyczące rejonu unerwionego przez ten nerw. Wstęp zawiera bardzo aktualną syntezę dostępnych danych dotyczących roli czynników zapalnych w rozwoju bólu patologicznego oraz interakcji pomiędzy układem immunologicznym a nocycepcją. Wyczerpująco opisana została także funkcja peptydu pochodnego genu kalcytoniny (CGRP) w przewodzeniu bodźców bólowych oraz patogenezie bólów głowy. CGRP, wazodylator i mediator w układzie nocyceptywnym (którego ekspresję badano, między innymi, w ocenianej pracy) jest przedmiotem wielu badań jako potencjalny cel leczenia migreny, a leki syntetyczne i biologiczne, ingerujące w związany z CGRP szlak sygnalny są obecnie testowane w badaniach klinicznych, co zostało również opisane przez Doktorantkę. Ocena ekspresji CGRP w ramach rozprawy niewątpliwie włącza przeprowadzone doświadczenia w bardzo aktualny nurt badań prowadzonych przez wiodące ośrodki badawcze i firmy farmaceutyczne na całym świecie. W ostatnim rozdziale wstępu Doktorantka zebrała dostępne dane na temat przyczyn zależnych od płci różnic w częstości występowania i przebiegu migreny oraz klasterowych bólów głowy. Wstęp do pracy sam w sobie stanowi ciekawą, aktualną pracę poglądową. Mimo użycia specjalistycznej nomenklatury, jest napisany w sposób zrozumiały, klarowny i - co najważniejsze - w pełni uzasadnia podjęcie realizowanych badań. Założenia i cele pracy zostały sformułowane w sposób klarowny, precyzyjny i jednoznaczny. W rozdziale Materiał i metody Autorka w sposób przejrzysty i precyzyjny charakteryzuje model zwierzęcy wykorzystany w pracy oraz wykorzystane techniki badawcze (tj. metody oceny nasilenia reakcji bólowej, PCR w czasie rzeczywistym oraz analiza preparatów immunohistochemicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej). Należy stwierdzić, że metodologia pracy jest prawidłowa, a użyte narzędzia nowoczesne i adekwatne do zakładanych celów badania. Dla pełnej przejrzystości, należałoby rozważyć dołączenie informacji (np. w formie tabelarycznego zestawienia) dotyczących liczebności poszczególnych grup eksperymentalnych, których dotyczą dane przedstawione w rozdziale Wyniki, z uwzględnieniem zastosowanych procedur, punktów czasowych i płci zwierząt. Strona 2 z 6

3 Metoda Pfaffl a, użyta do analizy wyników rtpcr uwzględnia różnice w rzeczywistej wydajności reakcji dla poszczególnych genów. Wydajność reakcji jest zwykle ustalana eksperymentalnie, za pomocą krzywej, wyznaczanej w oparciu o pomiar wartości C T dla szeregu rozcieńczeń wybranej próby. Dane dotyczące wydajności poszczególnych reakcji mogłyby zostać zamieszczone w pracy. Ponadto, można by również przedstawić zakres wartości C T uzyskanych dla poszczególnych genów, co pozwoliło by wstępnie ocenić, czy ekspresja badanych genów w zwojach jest wysoka czy też śladowa. Ilość przeprowadzonych procedur (szczególnie uwzględniwszy dużą liczbę zwierząt w eksperymencie) jest dość imponująca. W wyniku analizy uzyskanych danych, autorka zaobserwowała, między innymi, wpływ reakcji zapalnej na istotne zwiększenie ekspresji mrna interleukiny 1β (IL1B) i czynnika martwicy guza (TNF) w obrębie zwojów nerwów trójdzielnych oraz zwiększenie zawartości białka BDNF i TRPV1 w badanych preparatach. Bardzo ciekawa, w pewnym stopniu unikatowa i pionierska jest obserwacja dotycząca międzypłciowych różnic w ekspresji badanych czynników zapalnych w obrębie zwojów trójdzielnych: poziom transkryptu dla czynników prozapalnych (IL-1β, IL-6, TNF) oraz BDNF był istotnie wyższy w zwojach samców, natomiast receptorów dla TNF oraz CGRP istotnie wyższy u samic. Niewątpliwie, dane te mogą być przydatne w szerszej analizie podstaw molekularnych i czynników wpływających na międzypłciowe różnice w częstości występowania i przebiegu niektórych chorób związanych z patologicznym bólem, np. klasterowych bólów głowy czy migreny. Uzyskane wyniki są prawidłowo zinterpretowane, a przeprowadzenie badań z udziałem relatywnie dużej liczby zwierząt oraz odpowiednio dobranej kontroli nadało wykonanym analizom odpowiednią moc statystyczną, co niewątpliwie podnosi wiarygodność i siłę raportowanych obserwacji. Moje uwagi odnośnie rozdziału 4. Wyniki w żaden sposób nie podważają jakości uzyskanych danych ani ich interpretacji, ale odnoszą się do sposobu ich zaprezentowania, ewentualnie rozszerzenia analizy danych, jeśli miałyby one być publikowane w formie kolejnych artykułów: 1) Ponieważ w pracy zastosowano metodę analizy względnej ekspresji genów (relative quantity, RQ), zapewne poziom odniesienia (RQ=1) stanowiła jedna z analizowanych prób kontrolnych (nie jest to wyjaśnione w pracy). Częstym zabiegiem w badaniach ekspresji jest normalizacja wyników w odniesieniu do kontroli. Wówczas uzyskane wyniki są łatwiejsze do interpretacji dla czytelnika (np. wartość 200% w grupie badanej oznacza dwukrotny wzrost w stosunku do Strona 3 z 6

4 kontroli, 50% - dwukrotny spadek, itd.). Doktorantka mogłaby rozważyć przeprowadzenie takiej normalizacji wyników w przyszłych publikacjach. 2) Nie jest jasne (brak jednoznacznego opisu), czy porównując poszczególne grupy badawcze, uwzględniono wyniki ze zwojów lewych, czy też zarówno lewych jak i prawych. Według mnie, warto by było dołączyć do pracy tabele zawierające porównanie wyników badania ekspresji poszczególnych genów z podziałem na płci, punkty czasowe i lokalizację zwoju, co umożliwiłoby szybkie zapoznanie się z wszystkimi opisywanymi różnicami. Wyniki są bardzo przejrzyście opisane w publikacji Doktorantki (Acta Neurobiologiae Experimentalis, 2014; 74: ), gdzie jednoznacznie określono liczebność poszczególnych grup, analizowano jedynie lewe zwoje oraz przeprowadzono porównania oddzielnie w grupie samic i samców. Czy w opinii Doktorantki, wobec tak znacznych różnic w ekspresji zależnych od płci, nie należałoby również w doktoracie przeprowadzić dodatkowej analizy statystycznej wpływu podania CFA na ekspresję badanych genów osobno u samców i u samic (tak jak w publikacji)? Dlaczego w doktoracie Autorka zdecydowała się na inny sposób przedstawienia wyników? 3) W metodyce rtpcr podano dwie pary starterów, osobno do badania CGRPα i CGRPβ, natomiast w wynikach nie różnicowano obu peptydów. Kwestia ta wymaga komentarza. 4) Przedstawione wyniki badań immunohistochemicznych były analizowane na dwa sposoby (odsetek komórek pozytywnych i wartość sygnału fluorescencji). Bardziej szczegółowa procedura powinna być opisana dla obu sposobów analizy. 5) Mając na względzie, że w wyniku realizacji rozprawy Doktorantka uzyskała wiele wyników dotyczących ekspresji genów na poziomie mrna, zawartości białka oraz ilościowe dane dotyczące progu bólowego, czy nie wydaje się zasadne przeprowadzenie dodatkowej analizy korelacji ekspresja/próg bólu czy też mrna/białko? Taka analiza mogłaby w mojej opinii stanowić źródło dodatkowych obserwacji i wniosków (i byłaby zgodna z literalnym zapisem celu nr 2, wskazanego w rozdziale 2). W rozdziale Dyskusja uzyskane wyniki zostały przez Doktorantkę szerzej omówione na tle dostępnej literatury. Dyskusja przeprowadzona jest precyzyjnie, rzeczowo i w prawidłowy sposób przedstawia najważniejsze osiągnięcia pracy w kontekście badań prowadzonych w innych ośrodkach naukowych na świecie. Umiejętności prawidłowej interpretacji uzyskanych wyników, oceny wagi poszczególnych obserwacji oraz porównania rezultatów badań własnych z rezultatami innych badaczy świadczą o dojrzałości naukowej Autorki i doświadczeniu w pracy naukowej. Lektura Strona 4 z 6

5 Dyskusji pozostawia jedynie niewielki niedosyt w kwestii identyfikacji potencjalnych ograniczeń pracy, wynikających z zastosowanego modelu i technik badawczych. Wydaje się jednak, że Doktorantka wykazuje należyty dystans do prowadzonych przez siebie badań, jako że bardzo trafnie wskazała ograniczenia metodologiczne we wspomnianej publikacji w czasopiśmie Acta Neurobiologiae Experimentalis, zwierającej część wyników recenzowanej rozprawy (np. cyt.: However, it s worth stressing that we have not yet assessed the synthesis and release of cytokines, which may differ from its mrna expression. ). Na podstawie analizy uzyskanych wyników, sformułowano trzy syntetyczne wnioski, dotyczące: 1. zmian ekspresji badanych genów pod wpływem reakcji zapalnej, 2. związku reakcji zapalnej z reakcją bólową, oraz 3. zależnych od płci różnic w ekspresji badanych genów. Wnioski te w pełni wynikają z przeprowadzonych badań i są całkowicie uzasadnione. Autorka nie ustrzegła się drobnych błędów edytorskich o różnym charakterze, co jest jednak typowe dla prac nie podlegających wcześniejszej recenzji. Należy podkreślić, że kwestia ta w żadnej mierze nie umniejsza wartości pracy i nie wydaje się istotna w zestawieniu z ogromem przeprowadzonych doświadczeń i uzyskanych wyników. Pomniejsze uwagi dotyczące treści pracy są następujące: Str. 13 (podsumowanie) W badanym modelu zaobserwowano wzrost poziomu białka cytokin prozapalnych zgodnie z zastosowaną metodyką badań, powinno być poziomu mrna/ekspresji genów. Termin intraplantar injection Doktorantka tłumaczy jako podanie dołapkowe (str. 36,38) lub podanie dopodeszwowe (str. 38). Należałoby ujednolicić nomenklaturę, przy czym to drugie sformułowanie wydaje się bardziej formalne. Str cytowanie [64] dotyczy pracy [65] wg piśmiennictwa. Str w zdaniu Testosteron wydaje się mieć działanie bardziej antynocyceptywne i ochronne, ponieważ stwierdzono korelację między zmniejszeniem stężenia androgenów i osłabieniem przewlekłego bólu [288]. jest pewna sprzeczność. st W badaniach względnej ekspresji genów na poziomie mrna, GAPDH stanowi jeden z często wybieranych genów referencyjnych. Nie jest właściwe użycie zamiast gen referencyjny terminu próbka referencyjna, bo to wskazuje na tzw. próbę kalibracyjną (odniesienia), czyli próbę, z którą porównujemy ekspresję analizowanego genu w próbie badanej. Str. 62 W rzeczywistości tzw. DEPC-treated water nie zawiera DEPC, bo jest on z wody usuwany przez autoklawowanie przed użyciem. Str. 63 w celu sprawdzenia specyficzności wiązań bardziej precyzyjnie byłoby w celu sprawdzenia swoistości amplifikacji, ew. sprawdzenia swoistości wiązania starterów. Strona 5 z 6

6 Strona 6 z 6