(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/30 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 14/605 ( ) A61K 38/26 ( ) A61K 47/48 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Związki będące połączeniem GLP-1 z poli(glikolem etylenowym) (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2005/51 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/12 (73) Uprawniony z patentu: ELI LILLY AND COMPANY, Indianapolis, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 RICHARD DENNIS DIMARCHI, Carmel, US WOLFGANG GLAESNER, Indianapolis, US ROHN LEE JUNIOR MILLICAN, Indianapolis, US ANDREW MARK VICK, Fishers, US LIANSHAN ZHANG, Carmel, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis DZIEDZINA TECHNICZNA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy związków GLP-1 połączonych kowalencyjnie z jedną lub większą liczbą cząsteczek poli(glikolu etylenowego) lub jego pochodnej oraz powiązanych kompozycji użytecznych w leczeniu stanów lub zaburzeń, w których korzystne jest zmniejszenie stężenia glukozy we krwi, zmniejszenie ilości przyjmowanego pokarmu, zmniejszenie szybkości opróżniania żołądka lub jelit bądź zmniejszenie perystaltyki żołądka lub jelit. TŁO WYNALAZKU [0002] Peptyd glukagonopodobny 1 (GLP-1) wywołuje szereg działań biologicznych, takich jak stymulacja wydzielania insuliny, hamowanie wydzielania glukagonu, hamowanie opróżniania żołądka, hamowanie perystaltyki żołądka lub perystaltyki jelit, zwiększenie wykorzystania glukozy i wywoływanie utraty masy ciała. GLP-1 może ponadto działać zapobiegawczo wobec degeneracji komórek β trzustki występującej w przypadku progresji cukrzycy insulinoniezależnej (ang. NIDDM). Istotną właściwością GLP-1 jest jego zdolność do stymulacji wydzielania insuliny bez związanego z tym ryzyka hipoglikemii, które występuje, jeśli prowadzi się leczenie insuliną lub inne rodzaje leczenia doustnego, w wyniku którego zwiększa się ekspresja insuliny. [0003] Użyteczność leczenia z użyciem peptydów GLP-1 jest ograniczona w wyniku tego, że GLP-1(1-37) ma słabą aktywność, zaś dwa występujące naturalnie peptydy skrócone: GLP-1(7-37)OH i GLP-1(7-36)NH 2, są szybko usuwane in vivo i mają niezwykle krótki okres półtrwania in vivo. Wiadomo, że wytwarzana endogennie dipeptydylopeptydaza IV (DPP-IV) unieczynnia krążące peptydy GLP-1 poprzez usunięcie N-końcowych reszt histydyny i alaniny, i jest główną przyczyną krótkiego okresu półtrwania in vivo.

3 [0004] Różne metody próbowano zastosować w celu zwiększenia okresu półtrwania GLP-1 w fazie eliminacji lub zmniejszenia klirensu peptydu w organizmie przy zachowaniu jego aktywności biologicznej. Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5,705,483 ujawnia analogi peptydu GLP-1, których oporność na degradację przez DPP-IV uzyskano dzięki wprowadzeniu modyfikacji na końcu N peptydu. Alternatywną metodą wydłużenia okresu półtrwania peptydów GLP-1 jest derywatyzacja, w przypadku której do różnych aminokwasów GLP-1 przyłącza się duże grupy acylowe uniemożliwiające DPP-IV dostęp do końca N peptydu (patrz zgłoszenie międzynarodowe nr PCT/DK97/00340 dokonane 22 sierpnia 1997 r., pod tytułem GLP-1 Derivatives, opublikowane jako WO98/08871, które korzysta z duńskich zgłoszeń tymczasowych: nr 0931/96 dokonanego 30 sierpnia 1996 r., 1259/96 dokonanego 8 listopada 1996 r. i 1470/96 dokonanego 20 grudnia 1996 r.). [0005] Konkretne analogi GLP-1 omówiono w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki, numery kolejne 60/ dokonane 8 stycznia 2002 r. i 60/405,097 dokonane 21 sierpnia 2002 r., obecnie zgłoszenie międzynarodowe nr PCT/US03/00001 dokonane 3 stycznia 2003 r., opublikowane jako WO03/058203, wszystkie pod tytułem Extended Glucagon-Like Peptide-1 Analogs. W zgłoszeniach tych opisano analogi GLP-1(7-37)OH, w których różne aminokwasy przyłączone do końca C dają analogi peptydu GLP-1 mające wydłużony okres półtrwania i zmniejszony klirens w porównaniu do cząsteczki natywnej. Ponadto analogi GLP-1 o zwiększonej mocy działania opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, nr kolejny 60/314,573 dokonanym 23 sierpnia 2001 r., obecnie zgłoszenie międzynarodowe nr PCT/US02/21325 dokonane 14 sierpnia 2002 r., opublikowane jako WO03/018516, pod tytułem Glucagon-Like Peptide-1 Analogs. Eksendyna-4 może działać in vitro na receptor GLP-1 znajdujący się na niektórych typach komórek, w tym na komórkach wydzielających insulinę [Goke i wsp., J. Biol. Chem.,

4 (1993) 268: ]. Konkretne PEGylowane cząsteczki eksendyny i agonistów eksendyny opisano w zgłoszeniu międzynarodowym numer PCT/US00/11814, opublikowanym jako WO00/ [0006] Jakkolwiek dzięki różnym stosowanym metodom otrzymywano związki GLP-1 o dłuższym okresie półtrwania lub większej mocy działania w porównaniu do natywnego GLP-1, potrzebne są dodatkowe metody, które można by wykorzystywać samodzielnie lub w połączeniu z metodami znanymi, aby jeszcze bardziej zmniejszyć klirens związku GLP-1 oraz zwiększyć jego okres półtrwania, co w ten sposób zapewni optymalizację możliwości jego zastosowania jako środka terapeutycznego, który można podawać minimalną liczbę razy przez dłuższy okres. Przyłączanie kowalencyjne jednej lub większej liczby cząsteczek poli(glikolu etylenowego) do małego peptydu biologiczne czynnego, takiego jak GLP-1 lub eksendyna-4, powoduje ryzyko wprowadzenia niekorzystnych właściwości, na przykład nietrwałości cząsteczki i zmniejszenia jej aktywności biologicznej w na tyle dużym stopniu, że nie nadaje się ona do zastosowania jako środek terapeutyczny. Niniejszy wynalazek, jednak, powstał w oparciu o odkrycie, że przyłączenie kowalencyjne jednej lub większej liczby cząsteczek PEG do konkretnych reszt związku GLP-1 daje czynny biologicznie PEGylowany związek GLP-1 o wydłużonym okresie półtrwania i zmniejszonym klirensie w porównaniu do natywnego GLP-1 lub Val 8 -GLP-1 (lub natywnych peptydów eksendyny-4 lub zmodyfikowanej eksendyny-4 według wynalazku). [0007] PEGylowane związki GLP-1 według wynalazku są bardziej użyteczne jako środki terapeutyczne, a także wygodniejsze w zastosowaniu niż natywny GLP-1, ponieważ zachowują całkowicie lub częściowo aktywność biologiczną natywnego GLP-1, mając jednak wydłużony okres półtrwania i (lub) zmniejszony klirens w porównaniu do natywnego związku GLP-1 lub Val 8 -GLP-1(7-37)OH. GLP-1(7-37) ma okres półtrwania w surowicy wynoszący zaledwie 3 do 5 minut. Amid GLP-1(7-36) charakteryzuje czas działania

5 wynoszący około 50 minut po podaniu podskórnym. Nawet analogi GLP-1 i pochodne oporne na trawienie przez proteazy endogenne nie mają wystarczająco długiego okresu półtrwania, aby nie było konieczne wielokrotne podawanie w ciągu okresu 24 godzin. PEGylowane związki GLP-1 według wynalazku mogą mieć okres półtrwania przekraczający 24 godziny, co pozwala na zmniejszenie liczby dawek PEGylowanego związku GLP-1 przy utrzymaniu wysokiego poziomu związku we krwi przez dłuższy okres. Takie PEGylowane związki GLP-1 mogą być wykorzystywane terapeutycznie w leczeniu pacjentów z zaburzeniami, takimi jak między innymi cukrzyca, otyłość, zaburzenia perystaltyki żołądka i (lub) jelit, zaburzenia opróżniania żołądka i (lub) jelit, przy czym szczególną korzyścią jest to, że koniecznych jest mniej dawek PEGylowanych związków GLP-1 według wynalazku w okresie 24 godzin, co zwiększa wygodę dla pacjenta potrzebującego takiego leczenia oraz prawdopodobieństwo, że pacjent będzie przestrzegał zaleceń odnośnie dawkowania. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0008] Niniejszy wynalazek ujawnia związki GLP-1 połączone kowalencyjnie z jedną lub większą liczbą cząsteczek poli(glikolu etylenowego) (PEG) lub jego pochodnej, przy czym PEG jest przyłączony do aminokwasu Cys, dzięki czemu powstają PEGylowane związki GLP-1 o okresie półtrwania w fazie eliminacji wynoszącym co najmniej jedną godzinę, korzystnie co najmniej 3, 5, 7, 10, 15, 20 godzin i najkorzystniej co najmniej 24 godzin. PEGylowane związki GLP-1 według niniejszego wynalazku mają korzystnie wartość klirensu wynoszącą 200 ml/h/kg lub mniej, korzystniej 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg lub mniej i najkorzystniej mniej niż 50, 40 lub 20 ml/h/kg. [0009] Według niniejszego wynalazku ujawnia się PEGylowany związek GLP-1 zawierający sekwencję aminokwasową o wzorze IV (sekwencja o nr. ident. 6) Xaa 7 -Xaa 8 -Glu-Gly-Xaa 11 -Xaa 12 -Thr-Ser-Asp-Xaa 16 -Ser-Xaa 18 -Xaa 19 -Xaa 20 -Glu-Xaa 22 -Xaa 23 -Xaa 24 -Xaa 25 -Xaa 26 -Xaa 27 -Phe-Ile-Xaa 30 -Trp

6 6 -Leu-Xaa 33 -Xaa 34 -Xaa 35 -Xaa 36 -Xaa 37 -Xaa 38 -Xaa 39 -Xaa 40 -Xaa 41 -Xaa Xaa 43 -Xaa 44 -Xaa 45 -Xaa 46 -Xaa 47 Wzór IV (sekwencja o nr. ident. 6) w którym: Xaa 7 to L-histydyna, D-histydyna, deaminohistydyna, 2-aminohistydyna, -hydroksyhistydyna, homohistydyna, -fluorometylohistydyna lub -metylohistydyna; Xaa 8 to Val; Xaa 11 to Thr; Xaa 12 to Phe, Trp lub Tyr; Xaa 16 to Val, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr lub Cys; Xaa 18 to Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val; Xaa 19 to Tyr, Trp lub Phe; Xaa 20 to Leu, Phe, Tyr lub Trp; Xaa 22 to Gly, Glu, Asp lub Lys; Xaa 23 to Gln; Xaa 24 to Ala; Xaa 25 to Ala, Val, Ile lub Leu; Xaa 26 to Lys; Xaa 27 to Glu, Ile lub Ala; Xaa 30 to Ala lub Glu; Xaa 33 to Val lub Ile; Xaa 34 to Lys, Asp, Arg lub Glu; Xaa 35 to Gly; Xaa 36 to Gly, Pro lub Arg; Xaa 37 to Gly, Pro lub Ser; Xaa 38 to Ser, Pro, His lub Cys; Xaa 39 to Ser, Arg, Thr, Trp lub Lys; Xaa 40 to Ser lub Gly; Xaa 41 to Ala, Asp, Arg, Glu, Lys lub Gly; Xaa 42 to Pro, Ala, NH 2 lub nie występuje; Xaa 43 to Pro, Ala, NH 2 lub nie występuje; Xaa 44 to Pro, Ala, Arg, Lys, His, NH 2 lub nie występuje; Xaa 45 to Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH 2 lub nie występuje;

7 7 Xaa 46 to His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH 2 lub nie występuje oraz Xaa 47 to His, Ser, Arg, Lys, NH 2 lub nie występuje; i w którym 2 lub 1 reszta Cys jest połączona kowalencyjnie z cząsteczką PEG, przy założeniu, że jeśli Xaa 42, Xaa 43, Xaa 44, Xaa 45 lub Xaa 46 nie występuje, żaden dalszy aminokwas nie występuje i przy założeniu, że w cząsteczce występują 2 lub 1 Cys. [0010] Korzystnie, jeśli PEGylowany związek GLP-1 według niniejszego wynalazku nie różni się od GLP-1 (7-37)OH o więcej niż 3 aminokwasy w obrębie aminokwasów od 7 do 37. [0011] Według innego aspektu niniejszego wynalazku ujawnia się PEGylowany związek GLP-1 według niniejszego wynalazku do stosowania jako lek. [0012] Korzystnie PEGylowany związek GLP-1 jest przeznaczony do stosowania w leczeniu cukrzycy insulinoniezależnej, otyłości, udaru, zawału mięśnia sercowego, zespołu jelita drażliwego lub dyspepsji czynnościowej, najkorzystniej do stosowania w leczeniu cukrzycy insulinoniezależnej lub otyłości. [0013] Polimery będące poli(glikolem etylenowym) wykorzystywane w wynalazku ( PEG ) mają korzystnie ciężar cząsteczkowy od 500 do daltonów, korzystniej od do daltonów, najkorzystniej od do daltonów, mogą być cząsteczkami liniowymi lub rozgałęzionymi i mogą stanowić pochodne poli(glikolu etylenowego) opisywane w stanie techniki. [0014] Niniejszy wynalazek ujawnia sposób stymulacji receptora GLP-1 u pacjenta wymagającego takiej stymulacji, przy czym wspomniany sposób obejmuje etap podawania pacjentowi ilości skutecznej terapeutycznie PEGylowanego związku GLP-1 omawianego w dokumencie. Do pacjentów wymagających stymulacji receptora GLP-1 należą pacjenci z cukrzycą insulinoniezależną, hiperglikemią stresową, otyłością, zaburzeniami perystaltyki lub opróżniania żołądka i (lub) jelit, na przykład zespołem jelita drażliwego lub dyspepsją czynnościową.

8 SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0015] Peptyd glukagonopodobny 1 (GLP-1) jest peptydem o długości 37 aminokwasów wydzielanym przez komórki L w jelicie w reakcji na spożycie pokarmu. W stanie techniki opisano szereg analogów i pochodnych GLP-1. Niniejszy wynalazek opisuje modyfikacje związków GLP-1, które skutkują wydłużeniem okresu półtrwania w fazie eliminacji i (lub) zmniejszeniem klirensu. Wprowadzenie 1 lub 2 reszt Cys do określonych położeń aminokwasowych w peptydzie zapewnia grupę tiolową, do której można przyłączyć kowalencyjnie poli(glikol etylenowy) (PEG) lub pochodną PEG, dzięki czemu powstaje PEGylowany związek GLP-1 o wydłużonym okresie półtrwania w fazie eliminacji i zmniejszonym klirensie. GLP-1 (7-37)OH ma sekwencję aminokwasową według sekwencji o nr. ident. 1: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Gly-Phe Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (sekwencja o nr. ident. l) [0016] Określenie polipeptyd lub peptyd stosowane w dokumencie ma oznaczać dowolną formę strukturalną (np. formę pierwszorzędowa, drugorzędową lub trzeciorzędową) sekwencji aminokwasowej zawierającej więcej niż 5 reszt aminokwasowych, które można dalej modyfikować (np. acetylacja, karboksylacja, fosforylacja, lipidacja lub acylacja). Określenie natywny oznacza polipeptyd, który ma sekwencję aminokwasową identyczną z sekwencją występującą naturalnie. Określenie natywny ma obejmować warianty allelowe danego polipeptydu. [0017] Określenie aminokwas jest stosowane w dokumencie w najszerszym znaczeniu i obejmuje aminokwasy występujące naturalnie, a także aminokwasy inne niż występujące naturalnie, w tym warianty i pochodne aminokwasów. Specjalista w dziedzinie będzie wiedział na podstawie takiej szerokiej definicji, że odniesienie w dokumencie do aminokwasu obejmuje na przykład

9 występujące naturalnie L-aminokwasy białkowe; D-aminokwasy; aminokwasy zmodyfikowane chemicznie, na przykład warianty i pochodne aminokwasów; występujące naturalnie aminokwasy niebiałkowe, na przykład norleucynę, -alaninę, ornitynę itd., oraz syntetyzowane chemicznie związki mające właściwości, o których w stanie techniki wiadomo, że są charakterystyczne dla aminokwasów. Do przykładów aminokwasów innych niż występujące naturalnie należą -metyloaminokwasy (np. -metyloalanina), D-aminokwasy, aminokwasy podobne do histydyny (np. 2-aminohistydyna, -hydroksyhistydyna, homohistydyna, -fluorometylohistydyna i -metylohistydyna), aminokwasy mające dodatkową grupę metylenową w łańcuchu bocznym (homoaminokwasy) i aminokwasy, w których grupę funkcyjną kwasu karboksylowego zastąpiono grupą kwasu sulfonowego (np. kwas cysteinowy). Korzystnie, jednak, związki GLP-1 według niniejszego wynalazku obejmują wyłącznie aminokwasy występujące naturalnie, chyba że w dokumencie wyraźnie stwierdzono inaczej. [0018] Określenie związek GLP-1 stosowane w dokumencie obejmuje natywny GLP-1, [GLP-1(7-37)OH lub GLP-1(7-36)NH 2 ], analogi GLP-1, pochodne GLP-1, czynne biologicznie fragmenty GLP-1, wydłużony GLP-1 lub analog lub fragment wydłużonego peptydu GLP-1 (patrz np. WO03/058203), analogi eksendyny-4 i pochodne eksendyny-4 zawierające jedną lub dwie reszty Cys w określonych położeniach peptydu opisanych w dokumencie. [0019] W stanie techniki zwyczajowo końcowi aminowemu natywnego GLP-1(7-37)OH przypisuje się numer reszty 7, zaś końcowi karboksylowemu numer 37. Inne aminokwasy w polipeptydzie numeruje się kolejno, jak pokazano w sekwencji o nr. ident. 1. Na przykład w położeniu 12 w cząsteczce natywnej znajduje się fenyloalanina, zaś w położeniu 22 glicyna. [0020] Określenie fragment GLP-1" lub fragment związku GLP-1 oznacza w dokumencie czynny biologicznie polipeptyd otrzymywany po skróceniu jednego lub większej liczby aminokwasów na końcu

10 N i (lub) na końcu C związku GLP-1. Nazewnictwo wykorzystywane w opisie GLP-1 (7-37)OH dotyczy także fragmentów GLP-1. Na przykład GLP-1(9-36)OH oznacza fragment otrzymywany przez skrócenie dwóch aminokwasów na końcu N i jednego aminokwasu na końcu C. Aminokwasy we fragmencie oznacza się tym samym numerem co odpowiedni aminokwas w GLP-1(7-37)OH. Na przykład N-końcowy kwas glutaminowy w GLP-1(9-36)OH znajduje się w położeniu 9; położenie 12 zajmuje fenyloalanina, zaś położenie 22 zajmuje glicyna, jak w GLP-1(7-37)OH. [0021] Do związków GLP-1 należą analogi GLP-1 oraz analogi eksendyny-4. Dla uściślenia, analogi eksendyny-4" ujęte w grupie związków GLP-1" mają zawsze jedną lub dwie reszty Cys. Analog GLP-1 ma korzystnie sekwencję aminokwasową GLP-1(7-37)OH lub wydłużonego peptydu GLP-1 opisanego w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki, numery kolejne 60/ dokonane 1 sierpnia 2002 r. lub 60/405,097 dokonane 21 sierpnia 2002 r., opublikowane jako WO03/058203, oba pod tytułem Extended Glucagon-Like Peptide-1 Analogs, lub jego fragmentu, zmodyfikowanego w taki sposób, że 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 aminokwasów różni się w porównaniu do aminokwasu w odpowiednim położeniu GLP-1(7-37)OH lub fragmentu GLP-1(7-37)OH lub zmodyfikowanego w taki sposób, że 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 aminokwasów różni się w porównaniu do aminokwasu w odpowiednim położeniu wydłużonego peptydu GLP-1. [0022] Określenie PEGylowany stosowane w odniesieniu do związku GLP-1 według niniejszego wynalazku oznacza związek GLP-1, który zmodyfikowano chemicznie przez przyłączenie kowalencyjne jednej lub większej liczby cząsteczek poli(glikolu etylenowego) lub jego pochodnej. Ponadto określenie PEG ma oznaczać poli(glikol etylenowy) lub jego pochodną, znane w stanie techniki (parz np. patenty Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5,445,090; 5,900,461; 5,932,462; 6,436,386; 6,448,369; 6,437,025; 6,448,369; 6,495,659; 6,515,100 i 6,514,491). W PEGylowanych związkach GLP-1 według niniejszego wynalazku PEG (lub jego

11 pochodna) jest przyłączony kowalencyjnie do jednej lub większej liczby reszt cysteiny w związku GLP-1. Ewentualnie cząsteczki PEG mogą być przyłączone do związku GLP-1 przez cząsteczkę łącznika lub wstawki (patrz przykładowe cząsteczki wstawek opisywane w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki 6,268,343). [0023] W nazewnictwie stosowanym w niniejszym dokumencie do określania związków GLP-1 podaje się aminokwas zastępujący oraz jego położenie, po którym następuje nazwa peptydu wyjściowego. Na przykład Glu 22 -GLP-1(7-37)OH oznacza związek GLP-1, w którym glicyna znajdująca się normalnie w położeniu 22 GLP-1(7-37)OH została zastąpiona kwasem glutaminowym; Val 8 Glu 22 -GLP-1(7-37)OH (lub V 8 E 22 -GLP-1(7-37)OH) oznacza związek GLP-1, w którym alanina znajdująca się normalnie w położeniu 8 oraz glicyna znajdująca się normalnie w położeniu 22 GLP-1(7-37)OH zostały zastąpione odpowiednio waliną i kwasem glutaminowym. Val 8 -eksendyna-4 oznacza związek GLP-1, w którym seryna znajdująca się normalnie w położeniu 8 eksendyny-4 została zastąpiona waliną. Korzystnie związki GLP-1 według wynalazku mają działanie insulinotropowe. [0024] Działanie insulinotropowe oznacza zdolność do stymulacji wydzielania insuliny w reakcji na zwiększony poziom glukozy, dzięki czemu następuje wychwyt glukozy przez komórki i zmniejszenie poziomu glukozy w osoczu. Działanie insulinotropowe można oceniać sposobami znanymi w stanie techniki, w tym za pomocą doświadczeń in vivo oraz testów in vitro, w których mierzy się aktywność wiązania receptora GLP-1 lub aktywację receptora, na przykład w testach, w których wykorzystuje się komórki wysepek trzustkowych lub komórki guza insulinowego, zgodnie z opisem odpowiednio w EP 619,322 dla Gelfand i wsp. oraz w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5,120,712. Działanie insulinotropowe mierzy się rutynowo u ludzi poprzez pomiar poziomu insuliny lub poziomu peptydu C. [0025] Na potrzeby niniejszego wynalazku test przekazywania sygnału przez receptor GLP-1 in vitro wykorzystuje się do stwierdzenia, czy PEGylowany związek GLP-1 według niniejszego

12 wynalazku będzie miał działanie insulinotropowe in vivo. Działanie insulinotropowe to działanie, które można wykorzystać do wykazania, że PEGylowany związek GLP-1 jest czynny biologicznie. [0026] Określenie moc działania in vitro stosowane w dokumencie oznacza zdolność peptydu do aktywacji receptora GLP-1 w teście komórkowym. Moc działania in vitro wyraża się jako EC 50, czyli skuteczne stężenie związku, które daje 50% aktywności w doświadczeniu z podaniem dawki pojedynczej. Na potrzeby niniejszego wynalazku moc działania in vitro wyznacza się za pomocą testu fluorescencyjnego, w którym wykorzystuje się komórki HEK-293 ze stabilną ekspresją ludzkiego receptora GLP-1. W takich komórkach HEK-293 dokonano stabilnej integracji wektora DNA mającego element reagujący na camp (CRE) kierujący ekspresją genu β-laktamazy (BLAM). Oddziaływanie związku GLP-1 (lub jego agonisty) z receptorem inicjuje sygnał, który powoduje aktywację elementu reagującego na camp i późniejszą ekspresję β-laktamazy. Wtedy można dodać do komórek, które poddano działaniu określonej ilości agonisty GLP-1, substrat β-laktamazy CCF2/AM, emitujący fluorescencję po trawieniu β-laktamazą (PanVera LLC), dzięki czemu mierzy się moc działania agonistycznego GLP-1. Test opisano dokładniej w Zlokarnik i wsp. (1998) Science 279: Wartości EC 50 w przypadku związków podanych w przykładzie wyznaczono za pomocą testu BLAM opisanego powyżej. Względną wartość mocy działania in vitro można wyznaczyć wykorzystując Val 8 -GLP-1 (7-37)OH lub natywny GLP-1 jako kontrolę i przypisując jej wartość odniesienia 100%. [0027] Określenie okres półtrwania w osoczu oznacza czas, w którym połowa danych cząsteczek krąży w osoczu, zanim zostaną usunięte. Określeniem stosowanym alternatywnie jest okres półtrwania w fazie eliminacji. Określenie wydłużony lub dłuższy wykorzystywane w kontekście okresu półtrwania w osoczu lub okresu półtrwania w fazie eliminacji oznacza, że następuje

13 znaczny wzrost okresu półtrwania PEGylowanego związku GLP-1 względem wartości dla cząsteczki odniesienia (np. niepegylowanej formy peptydu lub peptydu natywnego), wyznaczonej w porównywalnych warunkach. Korzystnie PEGylowany związek GLP-1 według niniejszego wynalazku ma okres półtrwania w fazie eliminacji wynoszący co najmniej jedną godzinę, korzystniej co najmniej 3, 5, 7, 10, 15, 20 godzin i najkorzystniej co najmniej 24 godzin. Okres półtrwania podany w niniejszym dokumencie w przykładzie 5 stanowi okres półtrwania w fazie eliminacji; wartość ta odpowiada końcowej logarytmiczno-liniowej szybkości eliminacji. Specjaliści w dziedzinie będą wiedzieć, że okres półtrwania jest parametrem pochodnym, który zmienia się w funkcji zarówno klirensu, jak i objętości dystrybucji. [0028] Klirens jest miarą zdolności organizmu do wydalenia leku. W miarę zmniejszania się klirensu (na przykład wskutek modyfikacji leku) należy oczekiwać zwiększenia okresu półtrwania. Taka zależność odwrotna jest dokładnie spełniona tylko wtedy, jednak, kiedy objętość dystrybucji się nie zmienia. Przydatna przybliżona zależność między końcowym logarytmiczno-liniowym okresem półtrwania (t 1/2 ), klirensem (C) a objętością dystrybucji (V) jest dana równaniem. t 1/2 ~ 0,693 (V/C). Klirens nie wskazuje na to, ile leku zostało usunięte, ale raczej jaka objętość płynu biologicznego, na przykład krwi lub osocza, musiałaby być całkowicie pozbawiona leku, aby odpowiadało to wydalaniu. Klirens wyraża się w jednostkach objętości na jednostkę czasu. PEGylowane związki GLP-1 według niniejszego wynalazku mają korzystnie wartość klirensu wynoszącą 200 ml/h/kg lub mniej, korzystniej 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg lub mniej i najkorzystniej mniej niż 50, 40 lub 20 ml/h/kg (patrz przykład 5). [0029] Po otrzymaniu i oczyszczeniu peptydu do stosowania w wynalazku jest on modyfikowany przez kowalencyjne połączenie co najmniej jednej cząsteczki PEG z resztami Cys. Trudno jest

14 nadać delikatnym cząsteczkom peptydów lub białek odpowiednie nowe właściwości przez przyłączenie polimerów i jednocześnie nie doprowadzić do utraty ich funkcji. W stanie techniki opisano bardzo wiele sposobów otrzymywania cząsteczek połączonych kowalencyjnie z PEG, przy czym nie ogranicza się konkretnych sposobów wykorzystywanych w niniejszym wynalazku (artykuł przeglądowy, por. Roberts, M. i wsp. Advanced Drug Delivery Reviews, 54: , 2002). PEGylacja białek może pozwolić na przezwyciężenie wielu problemów farmakologicznych oraz toksykologicznych i immunologicznych związanych z wykorzystaniem peptydów lub białek jako środków terapeutycznych. W przypadku jednak pojedynczego peptydu nie jest pewne, czy w jego formie PEGylowanej nastąpi znaczna utrata aktywności biologicznej w porównaniu do niepegylowanej formy tego peptydu. [0030] Na aktywność biologiczną białek PEGylowanych wpływają czynniki, takie jak: i) wielkość cząsteczki PEG; ii) określone miejsca przyłączenia; iii) stopień modyfikacji; iv) niekorzystne warunki przyłączania; v) to, czy do przyłączania wykorzystuje się łącznik lub czy polimer jest przyłączany bezpośrednio; vi) wytwarzanie szkodliwych produktów ubocznych; vii) uszkodzenia wywoływane przez aktywowany polimer lub viii) zatrzymywanie ładunku. W zależności od zastosowanej reakcji przyłączania, w szczególności w przypadku modyfikacji cytokin polimerami, stwierdzono gwałtowne zmniejszenie aktywności biologicznej [Francis, G.E., i wsp., (1998) PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the importance of biological optimization of coupling techniques, Intl. J. Hem. 68:1-18]. [0031] PEGylowane związki GLP-1 według niniejszego wynalazku mają aktywność biologiczną in vitro stanowiącą co najmniej 0,5% wartości dla GLP-1 lub korzystniej dla Val 8 -GLP-1 (7-37)OH. Korzystniej PEGylowany związek GLP-1 według niniejszego wynalazku ma aktywność biologiczną in vitro stanowiącą co najmniej 1% lub 3% wartości dla GLP-1 lub korzystniej dla

15 Val 8 -GLP-1 (7-37)OH. Taką aktywność biologiczną można wyznaczyć za pomocą testu mocy działania in vitro opisywanego w dokumencie (przykład 4) lub za pomocą innych testów GLP-1 znanych w stanie techniki. Jakkolwiek niektóre PEGylowane związki GLP-1 według wynalazku mogą mieć aktywność biologiczną niższą od wartości dla natywnego GLP-1 lub dla Val 8 -GLP-1(7-37)OH zmierzonej w określonym teście, to zmniejszenie aktywności jest równoważone przez wydłużenie okresu półtrwania związku i (lub) zmniejszenie wartości klirensu oraz może nawet stanowić korzystną właściwość w przypadku związku GLP-1 o wydłużonym okresie półtrwania w fazie eliminacji. [0032] Należy ponadto zaznaczyć, że położenia w peptydzie GLP-1, co do których stwierdzono, że można do nich wprowadzić resztę cysteiny nie tracąc aktywności biologicznej, mogą być zastąpione cysteiną w przypadku analogicznych położeń w eksendynie-4 i dać analog eksendyny-4 nadal zdolny do wiązania receptora GLP-1. W analogu eksendyny-4 według wynalazku występuje nie więcej niż 2 lub 1 aminokwas Cys. [0033] W typowej formie PEG jest liniowym polimerem z końcowymi grupami hydroksylowymi o wzorze HO-CH 2 CH2-(CH2CH2O)n-CH 2 CH2-OH, w którym n wynosi od około 8 do około Końcowy atom wodoru może zostać podstawiony grupą ochronną, na przykład grupą alkilową lub alkanolową. Korzystnie PEG ma co najmniej jedną grupę hydroksylową, korzystniej jest to końcowa grupa hydroksylowa. Ta właśnie grupa hydroksylowa jest korzystnie aktywowana, aby reagować z peptydem. Wiele form PEG jest użytecznych w niniejszym wynalazku. W stanie techniki znanych jest wiele pochodnych PEG nadających się do zastosowania w wynalazku (patrz np. patenty Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5,445,090; 5,900,461; 5,932,462; 6,436,386; 6,448,369; 6,437,025; 6,448,369; 6,495,659; 6,515,100 i 6,514,491 oraz Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6: , 1995). Cząsteczka PEG przyłączona kowalencyjnie do związków GLP-1 według niniejszego wynalazku nie ma być ograniczona do konkretnego typu.

16 Ciężar cząsteczkowy PEG wynosi korzystnie od 500 do 100,000 daltonów, korzystniej od 20,000 do 60,000 daltonów i najkorzystniej od 20,000 do 40,000 daltonów. PEG mogą być liniowe lub rozgałęzione, zaś w PEGylowanych związkach GLP-1 według wynalazku mogą znajdować się 1 lub 2 cząsteczki PEG przyłączone do peptydu. Najkorzystniej, jeśli występuje jedna cząsteczka PEG na cząsteczkę PEGylowanego związku GLP-1. Przewiduje się ponadto, że oba końce cząsteczki PEG mogą być funkcjonalizowane w celu wzajemnego usieciowania dwóch lub większej liczby związków GLP-1. [0034] Niniejszy wynalazek dotyczy związków GLP-1, do których kowalencyjnie przyłączona jest jedna lub więcej cząsteczek PEG. Jednym sposobem otrzymywania PEGylowanych związków GLP-1 według niniejszego wynalazku jest zastosowanie PEG-maleimidu do bezpośredniego przyłączenia PEG do grupy tiolowej peptydu. Wprowadzenie grupy tiolowej można uzyskać poprzez addycję lub insercję reszty Cys do peptydu lub w peptydzie w położeniach opisywanych powyżej. Grupę tiolową można ponadto wprowadzić do łańcucha bocznego peptydu (np. acylowanie grupy ε-aminowej lizyny w kwasie zawierającym grupę tiolową). W sposobie PEGylacji według niniejszego wynalazku wykorzystuje się addycję Michaela z utworzeniem trwałego łącznika tioeterowego. Reakcja taka jest wysoce swoista i przebiega w łagodnych warunkach w obecności innych grup funkcyjnych. PEG-maleimid wykorzystuje się jako polimer reaktywny do otrzymywania dobrze zdefiniowanych, czynnych biologicznie koniugatów białek z PEG. Korzystne jest, aby w tej procedurze zastosować nadmiar molowy zawierającego grupę tiolową związku GLP-1 względem PEG-maleimidu, dzięki czemu reakcja przebiegnie całkowicie. Reakcje przeprowadza się korzystnie w ph od 4,0 do 9,0 w temperaturze pokojowej przez 15 do 40 godzin. Nadmiar niepegylowanego peptydu zawierającego grupę tiolową łatwo jest oddzielić od produktu PEGylowanego za pomocą konwencjonalnych metod rozdziału. Przykładowe warunki niezbędne do PEGylacji

17 związków GLP-1 podano w przykładzie 1. PEGylację cysteiny można przeprowadzić z użyciem PEG-maleimidu lub rozgałęzionego PEG-maleimidu. [0035] Związki GLP-1 mają szereg działań biologicznych. Na przykład stwierdzono, że GLP-1 stymuluje wydzielanie insuliny, dzięki czemu następuje wychwyt glukozy przez komórki i zmniejszenie poziomu glukozy w osoczu [patrz np., Mojsov, S., (1992) Int. J. Peptide Protein Research, 40:333]. GLP-1 daje duże nadzieje w leczeniu cukrzycy insulinoniezależnej (NIDDM), ponieważ nie powoduje ryzyka hipoglikemii, w przeciwieństwie do dostępnych obecnie metod leczenia NIDDM. Przewiduje się ponadto zastosowanie GLP-1 w leczeniu otyłości, zespołu jelita drażliwego i dyspepsji czynnościowej. [0036] Przewiduje się, że zastosowanie PEGylowanego związku GLP-1 według niniejszego wynalazku obejmuje zastosowanie przy wytwarzaniu leku do leczenia cukrzycy insulinoniezależnej, otyłości, udaru, zawału mięśnia sercowego, zespołu jelita drażliwego lub dyspepsji czynnościowej. PEGylację związku GLP-1 można połączyć z innymi modyfikacjami, o których w stanie techniki wiadomo, że zwiększają okres półtrwania GLP-1 (patrz np.wo03/058203, a dzięki temu jeszcze bardziej zwiększają okres półtrwania związku niż sama PEGylacja lub sama inna metoda modyfikacji. [0037] W rozumieniu niniejszego dokumentu określenie związek GLP-1 obejmuje ponadto dopuszczalne farmaceutycznie sole związków ujawnianych w dokumencie. Związek GLP-1 według niniejszego wynalazku może mieć grupę odpowiednio kwasową, odpowiednio zasadową lub obie grupy funkcyjne, a zatem może reagować z dowolną z szeregu zasad nieorganicznych oraz kwasów nieorganicznych i organicznych tworząc sól. Do kwasów stosowanych zazwyczaj w celu uzyskania soli addycyjnych z kwasami należą kwasy nieorganiczne, takie jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy i podobne, oraz kwasy organiczne, takie jak kwas

18 p-toluenosulfonowy, kwas metanosulfonowy, kwas szczawiowy, kwas p-bromofenylosulfonowy, kwas węglowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas octowy i podobne. Przykłady takich soli obejmują siarczan, pirosiarczan, wodorosiarczan, siarczyn, wodorosiarczyn, fosforan, monowodorofosforan, diwodorofosforan, metafosforan, pirofosforan, chlorek, bromek, jodek, octan, propionian, dekanian, kaprylan, akrylan, mrówczan, izomaślan, kapronian, heptanian, propiolan, szczawian, malonian, bursztynian, suberynian, sebacynian, fumaran, maleinian, butyno-1,4-dioan, heksyno-1,6-dioan, benzoesan, chlorobenzoesan, metylobenzoesan, dinitrobenzoesan, hydroksybenzoesan, metoksybenzoesan, ftalan, sulfonian, ksylenosulfonian, fenylooctan, fenylopropionian, fenylomaślan, cytrynian, mleczan, gamma-hydroksymaślan, glikolan, winian, metanosulfonian, propanosulfonian, naftaleno-1-sulfonian, naftaleno-2-sulfonian, migdalan i podobne. [0038] Do soli addycyjnych z zasadami należą sole otrzymane z zasad nieorganicznych, takie jak wodorotlenki, węglany, wodorowęglany i podobne amonu lub metali alkalicznych lub ziem alkalicznych. Do takich zasad nadających się do otrzymywania soli według niniejszego wynalazku należą zatem wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek amonu, węglan potasu i podobne. [0039] PEGylowane związki GLP-1 według niniejszego wynalazku szczególnie nadają się do podawania pozajelitowego; można je ponadto podawać doustnie, donosowo lub wziewnie. Podawanie pozajelitowe może obejmować na przykład podawanie ogólnoustrojowe, na przykład we wstrzyknięciu domięśniowym, dożylnym, podskórnym lub dootrzewnowym. PEGylowane związki GLP-1 można podawać pacjentowi w połączeniu z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub substancją pomocniczą wchodzącymi w skład kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób wymienionych powyżej. Kompozycja farmaceutyczna może stanowić roztwór lub, w przypadku podawania

19 pozajelitowego, zawiesinę związku GLP-1 lub może stanowić zawiesinę związku GLP-1 w kompleksie z kationem metalu dwuwartościowego, na przykład cynku. Odpowiednie nośniki farmaceutyczne mogą zawierać składniki obojętne, które nie oddziałują z peptydem lub pochodną peptydu. Można zastosować typowe metody otrzymywania preparatów farmaceutycznych, na przykład zamieszczone w Remington s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Do odpowiednich nośników farmaceutycznych do podawania pozajelitowego należą między innymi jałowa woda, fizjologiczny roztwór soli, bakteriostatyczny roztwór soli (roztwór soli zawierający około 0,9% mg/ml alkoholu benzylowego), roztwór soli buforowany fosforanem, płyn Hanksa, płyn Ringera z mleczanami i podobne. Do niektórych przykładów odpowiednich substancji pomocniczych należą laktoza, dekstroza, sacharoza, trehaloza, sorbitol i mannitol. [0040] Z PEGylowanych związków GLP-1 według niniejszego wynalazku można otrzymywać preparaty do podawania w taki sposób, aby poziom w osoczu krwi utrzymywał się przez dłuższy czas w zakresie skutecznym. Główną przeszkodą dla skutecznego podawania leków peptydowych drogą doustną jest niska dostępność biologiczna wskutek degradacji peptydów przez kwasy i enzymy, niskie wchłanianie przez nabłonki oraz przejście peptydów w postać nierozpuszczalną po znalezieniu się w środowisku o kwaśnym ph w przewodzie pokarmowym. Systemy do podawania doustnego peptydów, na przykład objętych zakresem niniejszego wynalazku, są znane w stanie techniki. Na przykład PEGylowane związki GLP-1 można kapsułkować za pomocą mikrosfer, a następnie podawać doustnie. Na przykład PEGylowane związki GLP-1 można kapsułkować w mikrosfery złożone z dostępnego w sprzedaży, zgodnego biologicznie, ulegającego biodegradacji polimeru, poli(laktydu-co-glikolidu)-cooh oraz oliwy z oliwek jako wypełniacza. Patrz Joseph i wsp. (2000) Diabetologia 43: Inne rodzaje technologii mikrosfer także są

20 dostępne w sprzedaży, na przykład ulegające biodegradacji polimery Medisorb i Prolease firmy Alkermes. Polimery Medisorb można wytwarzać z dowolnym z izomerów laktydu. Stosunek laktydu do glikolidu może zmieniać się od 0:100 do 100:0, dzięki czemu uzyskuje się szeroki zakres właściwości polimerów. Umożliwia to projektowanie systemów do podawania oraz wyrobów do wszczepiania, których czas resorpcji jest rzędu tygodni do miesięcy. Firma Emisphere także opublikowała szereg artykułów, w których omówiono technologię podawania peptydów i białek drogą doustną. Patrz na przykład WO autorstwa Leone-bay i wsp., w którym ujawniono konkretne nośniki złożone ze zmodyfikowanych aminokwasów zwiększających wchłanianie. [0041] PEGylowane związki GLP-1 opisywane w niniejszym dokumencie można wykorzystać w leczeniu pacjentów z różnorodnymi chorobami i stanami. PEGylowane związki GLP-1 objęte zakresem niniejszego wynalazku wywierają swoje działanie biologiczne oddziałując na receptor określany jako receptor GLP-1 (patrz Dillon i wsp. (1993) Cloning and Functional Expression of the Human Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) Receptor, Endocrinology, 133: ). Pacjentów z chorobami i (lub) stanami, w których korzystna jest stymulacja receptorów GLP-1 lub podawanie związków GLP-1, można w związku z tym leczyć przy użyciu PEGylowanych związków GLP-1 według niniejszego wynalazku. Uznaje się, że tacy pacjenci wymagają leczenia przy użyciu związków GLP-1 lub wymagają stymulacji receptorów GLP-1. [0042] Grupa ta obejmuje pacjentów z cukrzycą insulinoniezależną, cukrzycą insulinozależną, udarem (patrz WO 00/16797 dla Efendic), zawałem mięśnia sercowego (patrz WO 98/08531 dla Efendic), otyłością (patrz WO 98/19698 dla Efendic), zaburzeniami katabolizmu po zabiegu chirurgicznym (patrz patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6,006,753 dla Efendic), dyspepsją czynnościową i zespołem jelita drażliwego (patrz WO 99/64060 dla Efendic). Grupa ta obejmuje ponadto pacjentów wymagających postępowania profilaktycznego z użyciem związku GLP-1, np.

21 pacjentów z ryzykiem rozwoju cukrzycy insulinoniezależnej (patrz WO 00/16797). Dodatkowi pacjenci to osoby z zaburzeniami tolerancji glukozy lub zaburzeniami poziomu glukozy na czczo, pacjenci, których masa ciała jest około 25% większa od prawidłowej masy ciała dla wzrostu i budowy ciała pacjenta, pacjenci z częściową pankreatektomią, pacjenci, których jedno lub dwoje rodziców cierpi na cukrzycę insulinoniezależną, pacjentki, u których wcześniej wystąpiła cukrzyca ciążowa, i pacjenci, u których wcześniej wystąpiło ostre lub przewlekłe zapalenie trzustki, u których występuje zwiększone ryzyko rozwoju cukrzycy insulinoniezależnej. [0043] PEGylowane związki GLP-1 według niniejszego wynalazku można wykorzystać do normalizacji poziomu glukozy we krwi, zapobiegania degeneracji komórek β, indukcji proliferacji komórek β, stymulacji transkrypcji genu insuliny, zwiększenia ekspresji IDX-1/PDX-1 lub innych czynników wzrostu, zwiększenia czynności komórek β, aktywacji nieaktywnych komórek β, różnicowania komórek w kierunku komórek β, stymulacji replikacji komórek β, hamowania apoptozy komórek β, regulacji masy ciała i wywołania zmniejszenia masy ciała. [0044] Ilość skuteczna PEGylowanego związku GLP-1 to ilość, która powoduje pożądane działanie terapeutyczne i (lub) profilaktyczne nie powodując niedopuszczalnych działań ubocznych po podaniu pacjentowi wymagającemu stymulacji receptora GLP-1. Pożądane działanie terapeutyczne obejmuje jedno lub więcej spośród następujących: 1) łagodzenie objawu lub objawów związanych z chorobą lub stanem; 2) opóźnienie wystąpienia objawów związanych z chorobą lub stanem; 3) zwiększona długość życia w porównaniu z brakiem leczenia oraz 4) poprawa jakości życia w porównaniu z brakiem leczenia. Na przykład skuteczna ilość PEGylowanego związku GLP-1 do leczenia cukrzycy to ilość, której wynikiem byłaby większa kontrola stężenia glukozy we krwi niż w przypadku braku leczenia, dzięki czemu uzyskuje się opóźnienie wystąpienia powikłań

22 cukrzycowych, takich jak retinopatia, neuropatia lub choroba nerek. Skuteczna ilość PEGylowanego związku GLP-1 do zapobiegania cukrzycy to ilość, która prowadziłaby do opóźnienia w porównaniu z brakiem leczenia wystąpienia zwiększonego poziomu glukozy we krwi, który wymagałby podawania leków antyhipoglikemicznych, takich jak pochodne sulfonylomocznika, tiazolidynodionu, insuliny i (lub) bisguanidu. [0045] Ilość skuteczna PEGylowanego związku GLP-1 podanego pacjentowi zależy ponadto od postaci i nasilenia choroby oraz od charakterystyki pacjenta, na przykład od ogólnego stanu zdrowia, wieku, płci, masy ciała i tolerancji leków. Zazwyczaj PEGylowane związki GLP-1 według niniejszego wynalazku podaje się w taki sposób, aby poziom w osoczu pozostawał w zakresie od około 5 pikomoli/litr do około 200 pikomoli/litr. Stwierdzono, że optymalny poziom w osoczu w przypadku Val 8 -GLP-1(7-37)OH wynosi od 30 pikomoli/litr do około 200 pikomoli/litr. [0046] Typowy zakres dawek PEGylowanych związków GLP-1 według niniejszego wynalazku pozostaje w zakresie od około 0,01 mg na dobę do około 1000 mg na dobę w przypadku dorosłych. Korzystnie zakres dawkowania wynosi od około 0,1 mg na dobę do około 100 mg na dobę, korzystniej od około 1,0 mg na dobę do około 10 mg na dobę. [0047] Pacjentem jest ssak, korzystnie człowieka, jednak może to ponadto być inne zwierzę, np. zwierzęta domowe (np. psy, koty oraz podobne), zwierzęta hodowlane (np. krowy, owce, świnie, konie i podobne) oraz zwierzęta laboratoryjne (np. szczury, myszy, świnki morskie i podobne). [0048] Peptydy wykorzystywane do wytworzenia PEGylowanych związków GLP-1 według niniejszego wynalazku można otrzymać wykorzystując standardowe sposoby (metody syntezy białek w fazie roztworu lub w fazie stałej). Syntetyzatory peptydów dostępne są w sprzedaży na przykład w firmie Applied Biosystems z Foster City w stanie Kalifornia. Odczynniki do syntezy w fazie stałej są dostępne w sprzedaży, na przykład w firmie Midwest Biotech

23 (Fishers, IN). Syntetyzatory peptydów w fazie stałej można wykorzystać zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi blokowania grup przeszkadzających, ochrony aminokwasu poddawanego reakcji, sprzęgania, rozsprzęgania i zabezpieczania nieprzereagowanego aminokwasu. [0049] Zazwyczaj aminokwas zabezpieczony grupą -N-karbamoilową i aminokwas N-końcowy wydłużającego się łańcucha peptydowego na żywicy są sprzęgane w temperaturze pokojowej w rozpuszczalniku obojętnym, na przykład dimetyloformamidzie, N-metylopirolidonie lub chlorku metylenu, w obecności odczynników sprzęgających, na przykład dicykloheksylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazolu, oraz zasady, na przykład diizopropyloetyloaminy. -N-karbamoilowa grupa blokująca jest usuwana z otrzymanego peptydu na żywicy za pomocą odczynnika, na przykład kwasu trifluorooctowego lub piperydyny, zaś reakcja sprzęgania jest powtarzana z użyciem kolejnego odpowiedniego aminokwasu z zabezpieczonym końcem N, dodawanego do łańcucha peptydowego. Odpowiednie grupy blokujące dla grupy aminowej są dobrze znane w stanie techniki i omówiono je na przykład w Greene i Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Do przykładów należą grupy t-butyloksykarbonylowa (tboc) i fluorenylometoksykarbonylowa (Fmoc). [0050] Peptydy syntetyzuje się ponadto za pomocą standardowych protokołów syntezy w fazie stałej przy użyciu t-butoksykarbonylo- lub fluorenylometoksykarbonylo-alfa-aminokwasów z odpowiednim zabezpieczeniem łańcucha bocznego. Po zakończeniu syntezy peptydy są odcinane od podłoża (fazy stałej) z jednoczesnym odblokowaniem łańcucha bocznego przy użyciu standardowych metod z fluorowodorem. Następnie surowe peptydy dokładniej oczyszcza się za pomocą chromatografii w układzie faz odwróconych na kolumnach Vydac C18 z użyciem gradientu acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA). W celu usunięcia acetonitrylu

24 peptydy poddaje się liofilizacji z roztworu zawierającego 0,1% TFA, acetonitryl i wodę. Czystość można sprawdzić za pomocą chromatografii analitycznej w układzie faz odwróconych. Tożsamość peptydów można sprawdzić za pomocą spektrometrii masowej. Peptydy można solubilizować w buforach wodnych w ph obojętnym. [0051] Wynalazek zilustrowano za pomocą następujących przykładów, których w żaden sposób nie należy uważać za ograniczające. PRZYKŁADY Przykład 1 PEGylacja analogów podobnych do GLP-1: [0052] Reakcje PEGylacji przeprowadza się w warunkach umożliwiających wytworzenie wiązania tioeterowego. Konkretnie ph roztworu pozostaje w zakresie od około 4 do 9, zaś stężenie peptydu zawierającego grupę tiolową pozostaje w zakresie od 1- do 10-krotnego nadmiaru molowego względem stężenia metoksy-peg2-mal. Reakcje PEGylacji przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze pokojowej. Następnie PEGylowany peptyd GLP-1 wyodrębnia się za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych lub chromatografii wykluczenia (SEC). Charakterystykę PEGylowanych analogów GLP-1 określa się przy użyciu analitycznej RP-HPLC, HPLC-SEC, SDS-PAGE i (lub) spektrometrii masowej MALDI. [0053] Peptydy GLP-1 zawierające grupę tiolową poddaje się reakcji z poli(glikolem etylenowym) sprzężonym z maleimidem (PEG-maleimid) o masie 40 kda z utworzeniem pochodnych, w których PEG jest dołączony kowalencyjnie przez wiązanie tioeterowe. Na przykład peptyd Cex-51-C (V 8 E 22 I 33 C 45 GLP-1, długości 45 aa; 7,5 mg, 1,8 mol) rozpuszcza się w 2 ml 200 mm buforu fosforanowego zawierającego 20 mm EDTA, ph 7,4. Roztwór następnie przedmuchuje się argonem. Do roztworu dodaje się 40 mg metoksy-peg2-mal, rozgałęzionego PEG maleimidu (nr serii PT-02B-10, Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) (stosunek molowy 0,55:1 PEG do peptydu). Reakcję prowadzi się przez 2 godziny. Następnie 25 mg PEGylowanego peptydu oczyszcza się za pomocą RP-HPLC,

25 określa charakterystykę przy użyciu HPLC wykluczenia i bada aktywność in vitro. Przykład 2 reakcja 40 kda-peg-maleimidu z analogami GLP [0054] Analogi GLP-1, na przykład C 16 E 22 V 8 GLP oraz V 8 C 38 GLP, poddaje się selektywnej PEGylacji na wprowadzonej reszcie cysteiny za pomocą aktywowanego maleimidem, rozgałęzionego mpeg o masie 40 kda (Shearwater Polymers, Inc.). W reakcji PEGylacji, peptyd, który ma być poddany reakcji, rozpuszcza się w 100 mm buforu TRIS w ph 8,0 i dodaje 1,25-krotny nadmiar molowy 40 kda-mpeg w masie. Reakcję prowadzi się mieszając w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny, a następnie dializuje przez noc (błona 7 kda) wobec 10 mm cytrynianu, 10 mm fosforanu, ph 7,4 w temperaturze około 5 C. PEGylowane cząsteczki GLP oczyszcza się za pomocą chromatografii anionowymiennej na kolumnie Mono-Q (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ) z gradientem NaCl w ph obojętnym. Przykład 3 reakcja DSPE-3,4 kda-peg-maleimidu z analogami GLP-1 [0055] Analogi GLP-1, na przykład C 16 E 22 V 8 GLP-1 oraz V 8 C 38 GLP-1, poddaje się selektywnej PEGylacji na wprowadzonej reszcie cysteiny za pomocą aktywowanego maleimidem mpeg o masie 3,4 kda zakończonego lipidem distearoilofosfatydyloetanolaminą (DSPE) (Shearwater Polymers, Inc.). W reakcji PEGylacji peptyd, który ma być poddany reakcji, rozpuszcza się w 100 mm buforu TRIS w ph 8 i dodaje 1,25-krotny nadmiar molowy DSPE-3,4 kda-peg-maleimidu w masie. Dodaje się etanol absolutny do stężenia około 17%, aby ułatwić solubilizację DSPE-3,4 kda-peg-maleimidu. Reakcję prowadzi się mieszając w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny, a następnie dializuje przez noc (błona 7 kda) wobec 10 mm cytrynianu, 10 mm fosforanu, ph 7,4 w temperaturze około 5 C. PEGylowany peptyd GLP oczyszcza się za pomocą chromatografii anionowymiennej na kolumnie Mono-Q (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ) z gradientem NaCl w ph obojętnym. Przykład 4 test aktywności in vitro

26 [0056] Komórki HEK-293 wyrażające ludzki receptor GLP-1 wysiewa się wykorzystując system PanVera LLC CRE-BLAM w ilości do komórek/dołek/100 l pożywki DMEM z 10%FBS w 96-dołkowej czarnej płytce z przezroczystym dnem, pokrytej poli-d-lizyną. Dzień po wysianiu pożywkę usuwa się i dodaje 80 l pożywki DMEM bez osocza. Trzeciego dnia po wysianiu do każdego dołka dodaje się różne stężenia PEGylowanego związku GLP-1 z 20 l pożywki DMEM bez osocza z 0,5% BSA, aby uzyskać krzywą zależności odpowiedzi od dawki. Zasadniczo wykorzystuje się czternaście rozcieńczeń zawierających od 3 nm do 30 nm PEGylowanego peptydu, aby uzyskać krzywą zależności odpowiedzi od dawki, na podstawie której można wyznaczyć wartości EC 50. Po inkubacji z PEGylowanym peptydem przez 5 godzin dodaje się 20 l substratu dla -laktamazy (CCF2/AM, PanVera LLC) i inkubację prowadzi się jeszcze przez 1 godzinę; w tym czasie mierzy się fluorescencję z użyciem aparatu Cytofluor. Test opisano dokładniej w Zlokarnik i wsp. (1998), Science, 278: Następujące PEGylowane peptydy GLP-1 zbadano zgodnie z opisem i stwierdzono wartości EC 50 podane poniżej (wartość dla V 8 GLP-1 wynosi 100%): V 8 C 16-3,4kDa DPSE-PEG 4% V 8-3,4kDa PEG-FMOC 87% V 8 C 38-3,4kDa DPSE-PEG 18% V 8 C 38-40kDa PEG 3% V 8 E 22 C kda PEG 0,7% V 8 E 22 I 33 C 45-40kDa PEG (CEX-51) 9,4 +/- 1,5 % [n=5] Przykład 5 Analiza farmakokinetyczna derywatyzowanego peptydu GLP-1 [0057] PEGylowany analog GLP-1 (VgE 22 I 33 C kda PEG (PEGylowany CEX-51 zmodyfikowany C 45 )) podano drogą dożylną (IV) lub podskórną (SC) samcom szczurów SD w dawce 0,1 mg/kg. Zwierzęta (2 osobniki na punkt czasowy w przypadku podania IV, 3 osobniki na punkt czasowy w przypadku podania SC) skrwawiono w różnych punktach czasowych od 0 do 336 godzin po podaniu. Z każdej próbki