Udział aneksyn w procesie endocytozy i przekazywaniu sygnałów, w których uczestniczą receptory EGF

Transkrypt

1 Udział aneksyn w procesie endocytozy i przekazywaniu sygnałów, w których uczestniczą receptory EGF STRESZCZENIE Aneksyny tworzą rodzinę białek oddziałujących z błonami biologicznymi, występującą powszechnie w organizmach kręgowców. Wyniki wielu badań prowadzonych w różnych laboratoriach na świecie wskazują, że aneksyny mogą pełnić w komórce różne funkcje, między innymi uczestniczyć w transporcie pęcherzykowym, szczególnie w endocytozie. Udział aneksyn w transporcie endosomalnym związany jest z ich zdolnością, uzależnioną od zmian stężenia jonów wapnia w komórce, do oddziaływania z błoną plazmatyczną, przede wszystkim z cząsteczkami ujemnie naładowanych fosfolipidów oraz wieloma białkami partnerskimi. Uczestnictwo aneksyn w transporcie endosomalnym ma znaczenie w regulacji różnorodnych procesów przekazywania sygnałów. Receptory cząsteczek sygnałowych na powierzchni błony komórkowej ulegają w trakcie endocytozy internalizacji, co prowadzi do aktywacji kolejnych etapów danego szlaku sygnałowego. Wiąże się to z powstaniem wyspecjalizowanych dla danego przedziału komórkowego platform sygnałowych, które stwarzają optymalne warunki do modulacji siły sygnału. W niniejszej pracy przeglądowej szczegółowo omówiono udział niektórych przedstawicieli rodziny aneksyn, aneksyny A1 (AnxA1), aneksyny A2 (AnxA2), aneksyny A6 (AnxA6) i aneksyny A8 (AnxA8) w regulacji szlaku przekazywania sygnału, w którym uczestniczy naskórkowy czynnik wzrostu (EGF). Opisano obserwacje świadczące o bezpośrednim oddziaływaniu aneksyn z receptorem EGF (EGFR) lub pośrednim, poprzez oddziaływania z białkami regulatorowymi i efektorowymi szlaku, uczestniczenie w tworzeniu i stabilizacji bogatych w cholesterol platform sygnałowych oraz udział w transporcie i degradacji EGFR. WPROWADZENIE Aneksyny są rodziną białek cytoplazmatycznych o masie cząsteczkowej od 28 do 73 kda, występującymi w organizmach wszystkich zbadanych pod tym względem organizmów eukariotycznych, w tym także we wszystkich organizmach roślin [1,2], w komórkach drożdży [3], w organizmach pasożytów [4], a także w komórkach organizmów prokariotycznych [5,6]. Zarówno komórkowe, jak i tkankowe rozmieszczenie aneksyn jest bardzo zróżnicowane [7-12]. Wszyscy przedstawiciele tej rodziny mają zdolność odwracalnego wiązania fosfolipidów błony plazmatycznej zależnie od zmian [Ca 2+ ] oraz zmian wartości wewnątrzkomórkowego ph. W strukturze aneksyn można wyróżnić, złożony głównie z α-helikalnych powtórzeń rdzeń, w którym zachowana w ewolucji powtarzająca się domena zbudowana z reszt aminokwasowych odpowiedzialna jest za zależne od stężenia [Ca 2+ ] wiązanie z cząsteczkami ujemnie naładowanych fosfolipidów w błonie. Większość przedstawicieli rodziny aneksyn posiada cztery powtórzenia reszt aminokwasowych. Jedynym wyjątkiem jest aneksyna A6 (AnxA6), w której strukturze sekwencja ta powtórzona jest ośmiokrotnie. Rdzeń, długi na około 300 reszt aminokwasowych ma kształt dysku, który w warunkach in vitro, po związaniu z błoną, może zmieniać jej przepuszczalność dla jonów. Oprócz rdzenia, ważną funkcję w cząsteczce typowej aneksyny pełni również domena N-końcowa, w której zlokalizowane są miejsca oddziaływania z białkami partnerskimi aneksyn. Domena ta jest charakterystyczna dla określonych aneksyn i prawdopodobnie odpowiada za indywidualne funkcje poszczególnych przedstawicieli rodziny in vivo [7]. Marcin Woś Joanna Bandorowicz-Pikuła Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, Warszawa Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, Warszawa; tel.: (22) , j.bandorowicz-pikula@nencki.gov.pl Artykuł otrzymano 8 lutego 2014 r. Artykuł zaakceptowano 14 lutego 2014 r. Słowa kluczowe: aneksyny, endocytoza, naskórkowy czynnik wzrostu Wykaz skrótów: AnxA aneksyna kręgowców; EGF naskórkowy czynnik wzrostu; EGFR receptor naskórkowego czynnika wzrostu; EE wczesne endosomy; LE późne endosomy; LDL lipoproteiny o niskiej gęstości; [Ca 2+ ] stężenie jonów wapnia Podziękowania: Badania prowadzone przez autorów niniejszej pracy przeglądowej są finansowane ze środków na naukę przyznanych przez Narodowe Centrum Nauki na realizację w latach projektu N N oraz przez Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. Marcelego Nenckiego. Marcin Woś otrzymuje stypendium Marszałka Województwa Mazowieckiego dla doktorantów ufundowane przez Unię Europejską w ramach Środków Europejskiego Funduszu Społecznego (Program Operacyjny Kapitał Ludzki , Priorytet 8.2.2). Szczególne właściwości aneksyn skłaniają wielu badaczy do wysunięcia hipotezy, że aneksyny uczestniczą w wielu procesach związanych z dynamiką błon, takich jak endocytoza [7-12], egzocytoza [13] oraz udział w wewnątrzkomórkowej homeostazie jonowej [7,8] przekazywaniu sygnałów [11]. Aneksyny zostały także zidentyfikowane w macierzy pozakomórkowej, gdzie są prawdopodobnie zaangażowane w procesy koagulacji, mineralizacji i apoptozę [14-16]. W niniejszej pracy przeglądowej przedstawiono poglądy dotyczące udziału aneksyn w regulacji przekazywania sygnału, w którym uczestniczy receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), poprzez zaangażowanie tych białek w wewnątrzkomórkowy transport pęcherzykowy [17-19]. Postępy Biochemii 60 (1)

2 Rycina 1. Udział aneksyn w transporcie endosomalnym. W procesie endocytozy w komórkach ssaków uczestniczą różne populacje pęcherzyków błonowych, w których cząsteczki z powierzchni błony komórkowej są wbudowywane (wczesne endosomy), sortowane (późne endosomy), ulegają degradacji (lizosomy) lub są transportowane z powrotem na powierzchnię błony (endosomy sortujące). Na schemacie zaznaczono te etapy transportu endosomalnego w których, biorą udział przedstawiciele rodziny aneksyn (AnxA1, AnxA2, AnxA6). Inne wyjaśnienie w tekście pracy. Skróty i symbole zastosowane na rycinie: CCP wgłębienie w błonie plazmatycznej opłaszczone klatryną (ang. clathrin coated pit); CCV pęcherzyki opłaszczone klatryną; RE sortujące endosomy; EE wczesne endosomy; LE późne endosomy; GA aparat Golgi ego; LY lizosomy; MVB ciała wielopęcherzykowe; NCP wgłębienie w błonie plazmatycznej nieopłaszczone klatryną (ang. non coated pit). UDZIAŁ ANEKSYN W PROCESIE ENDOCYTOZY W komórkach eukariotycznych drogi przekazywania sygnałów i transport pęcherzykowy są ze sobą ściśle powiązane. Przekazywanie sygnału rozpoczyna się od aktywacji specyficznego receptora na powierzchni błony komórkowej przez cząsteczki sygnałowe, a następnie internalizację receptora w formie aktywnej na drodze endocytozy. Receptory takie zostają skierowane do wczesnych endosomów (ang. early endosomes, EE), skąd nadal mogą wrócić na powierzchnię błony komórkowej lub pozostać w błonie EE podczas procesu dojrzewania pęcherzyków endosomalnych w późne endosomy (ang. late endosomes, LE) lub ich przekształcenia w ciała wielopęcherzykowe (ang. multivesicular bodies, MVB). Po połączeniu LE lub MVB z lizosomami (LY) receptory ulegają degradacji i przekazywanie określonego sygnału zostaje ostatecznie zatrzymana. Prawidłowe funkcjonowanie całej ścieżki endocytarnej zapewniają białka SNARE, GTPazy Rab i białka motoryczne, które kontrolują przekaz sygnału w czasie i przestrzeni. Błony endosomalne bogate są w specyficzne, charakterystyczne dla przedziału komórkowego molekularne znaczniki, takie jak Rab5 i trifosforan fosfoinozytolu dla błony EE, Rab7 i 3,5-difosforan fosfoinozytolu dla błony LE oraz białka LAMP dla lizosomów [19]. Wyniki badań prowadzonych w warunkach in vitro i in vivo wskazują na udział niektórych przedstawicieli rodziny aneksyn w transporcie endosomalnym. O związku aneksyn z endocytozą mogą świadczyć obserwacje dotyczące aneksyny A1 (AnxA1). Białko to zostało zidentyfikowane jako substrat kinazy receptora EGF. Po aktywacji receptora EGF i wbudowaniu go do endosomów, kinaza ta fosforyluje AnxA1 w przedziale ciał wielopęcherzykowych, które są odpowiedzialne za sortowanie EGFR i kierowanie go na drogę degradacji. Mechanizm, w jaki ufosforylowana na reszcie tyrozyny AnxA1 wpływa na proces sortowania pęcherzyków nie jest do końca poznany. Wykazano m.in., że w komórkach z wysokim poziomem receptora EGF, fosforylacji AnxA1 przez kinazę EGFR w przedziale ciał wielopęcherzykowych towarzyszy degradacja receptora EGF i zablokowanie jego powrotu do błony plazmatycznej [17]. AnxA1 w formie nieufosforylowanej wiąże się z tym samym powinowactwem do błony plazmatycznej, jak do błon MVB w procesie niezależnym od zmian stężenia [Ca 2+ ]; jony wapnia są niezbędne w oddziaływaniach białka z błonami, gdy AnxA1 ulegnie fosforylacji [17]. W ten sposób fosforylacja AnxA1 przez kinazę receptora EGF wydaje się być czynnikiem regulującym jej zdolność przyłączania się do błon. Dodatkowo, AnxA1 dzięki unikalnemu końcowi aminowemu jest zdolna do tworzenia heterotetrameru z jednym z białek partnerskich z rodziny S100, białkiem S100A11. Heterotetramer AnxA1 2 S100A11 2 uczestniczy w prawidłowym tworzeniu się pęcherzyków endocytarnych [20]. Innym przedstawicielem rodziny aneksyn, zaangażowanym w transport endosomalny jest aneksyna A2 (AnxA2). Jej cechą charakterystyczną jest występowanie w formie związanej z błoną wczesnych endosomów i błonami o podwyższonej zawartości cholesterolu; białko to bierze udział także w formowaniu pęcherzyków [21,22]. AnxA2 zdolna do oddziaływania z aktyną [23], zarówno w postaci monomerycznej, jak i heterotetrameru z białkiem S100A10 [25], bierze bezpośredni udział w tworzeniu szkieletu formujących się pęcherzyków. Wyniki doświadczeń z wykorzystaniem mutantów białka [26] oraz polegające na wyciszeniu ekspresji genu kodującego AnxA2 w komórkach [27] wykazały nieprawidłowości w tworzeniu się pęcherzyków opłaszczonych klatryną oraz zmiany w rozmieszczeniu EE i odpowiedzialnych za to mikrotubul. Udział aneksyny A6 (AnxA6) w transporcie endosomalnym został wykazany z wykorzystaniem niefunkcjonalnego mutanta białka. Komórki zawierające taką AnxA6 charakteryzowały się zahamowaną degradacją lipoprotein o małej gęstości (LDL), czego skutkiem była ich akumulacja w powiększonym przedziale prelizosomalnym. Dla porównania, podanie komórkom LDL wywołało silniejsze wiązanie AnxA6 z błoną LE [28]. Na podstawie opisanych powyżej informacji aneksyny zostały powiązane z wieloma etapami procesu endocytozy, od formowania pęcherzyków przy udziale klatryny, przez determinowanie wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia pęcherzyków, aż do ich degradacji. Pomimo wielu funkcji, jakie pełnią te białka przypisanie im konkretnej roli bywa często trudne. Pewne podobieństwa, ale i różnice w funkcjonowaniu poszczególnych aneksyn doskonale widać na przykładzie przejmowania funkcji przez członków rodziny o zbliżonych właściwościach. Przykładowo, u myszy z obniżoną zawartością AnxA1 wykazano wzrost poziomu AnxA2 [29], która częściowo przejęła funkcje AnxA1, jed- 56

3 nakże nie była w stanie zastąpić AnxA1 podczas procesu tworzenia się pęcherzyków, aktywowanego przez EGF [20]. Wydaje się, że białka z rodziny aneksyn, ze względu na ich właściwości, funkcjonują jako uniwersalne czynniki regulujące transport endosomalny. Nie tylko wiążą się z aktyną w trakcie powstawania pęcherzyków, ale także odgrywają rolę łączników przekazywania sygnału od receptora EGF z maszynerią biorącą udział w endocytozie. W następnej części tego artykułu zostaną omówione powiązania przekazywania sygnałów i endocytozy przez aneksyny. WPŁYW ANEKSYN NA PRZEKAZYWANIE SYGNAŁU, W KTÓRYM UCZESTNICZĄ RECEPTORY NASKÓRKOWEGO CZYNNIKA WZROSTU W komórkach ssaków związanie się ligandu z jego receptorem uruchamia kaskadę następujących po sobie zdarzeń i reguluje szeroki zakres wewnątrzkomórkowych procesów, takich jak różnicowanie, proliferacja i apoptoza. Jeszcze stosunkowo niedawno uważano, że przekazywanie sygnału przez receptory czynników wzrostu zachodzi tylko na powierzchni błony komórkowej. Z czasem, poglądy te zostały zweryfikowane i dostrzeżono funkcję transportu endosomalnego, którego aktywacja powodowała zmiany w rozmieszczeniu receptora. Dodatkowo, powszechnie akceptowanym jest fakt tworzenia się wyspecjalizowanych platform sygnałowych modulujących siłę przekazywanego sygnału. Jednym z przykładów udziału platformy w przekazywaniu sygnałów jest ścieżka receptora naskórkowego czynnika wzrostu. Ścieżka przekazywania sygnału EGF\Ras\MAPK, z uwagi na jej znaczenie i powiązanie z innymi szlakami przekazywania sygnałów, jest jedną z najważniejszych dróg sygnałowych związanych z rozwojem nowotworów. Zmiany poziomu, bądź mutacje receptora EGF są bardzo często przyczyną rozwoju chorób [30-33]. Szlak EGF\Ras\MAPK może prowadzić zarówno do apoptozy, jak i proliferacji komórek. Mutacje w innych białkach kaskady sygnałowej EGF również powodują zaburzenia prowadzące do niekontrolowanej proliferacji i wyjścia z cyklu komórkowego [34,35]. Biorąc pod uwagę udział szlaku EGF w rozwoju wielu typów nowotworów, stał się on potencjalnym celem terapii przeciwnowotworowych [36-38]. Pierwszy etap aktywacji receptora EGF został opisany przy okazji badań nad strukturą krystaliczną domeny EGFR wiążącej EGF [37-39]. Wykazano, że po przyłączeniu cząsteczki sygnałowej do receptora, zmienia on konformację z nieaktywnej monomerycznej do aktywnej homodimerycznej [40,41]. Ważną rolę na tym etapie odgrywa lokalizacja EGFR w określonym rejonie błony plazmatycznej. Zidentyfikowano bogate w cholesterol, wyspecjalizowane domeny błonowe, zwane tratwami lipidowymi, które zapewniają mikrośrodowisko zmieniające zdolność receptora do wiązania ligandów, modulując w ten sposób ścieżkę przekazywania sygnału [42,43]. Połączenie ścieżki przekazywania sygnału z właściwościami błony plazmatycznej pozwoliły na określenie mechanizmów prowadzących do propagacji sygnału i jego zakończenia. Z uwagi na charakter błon oraz możliwość ich modyfikacji poprzez elementy składowe, duże znaczenie przypisuje się białkom, uczestniczącym w organizacji błony komórkowej, takim właśnie jak aneksyny [7,25,44]. W przeciwieństwie do AnxA8, występującej w niewielkich ilościach w płucach, skórze, wątrobie i nerkach [45,46], AnxA1, Anx2 i AnxA6 występują niemal we wszystkich badanych pod tym względem tkankach ssaków i świetnie nadają się do pełnienia funkcji białek regulujących różnorodne ścieżki sygnałowe z udziałem błon lipidowych. Zmiany w ich zawartości, rozmieszczeniu w komórkach oraz zróżnicowanie funkcji w obrębie jednej rodziny białek, stanowi podstawy złożonego mechanizmu regulacji aktywności i lokalizacji EGFR, jak również kontroli kinetyki procesu endocytozy tego receptora. HETEROTETRAMER AnxA1 2 S100A11 2 Aktywność AnxA1 w dużej mierze zależy od modyfikacji potranslacyjnych białka. Zwłaszcza modyfikacje w obrębie unikatowej dla wszystkich aneksyn, domeny N-końcowej, wpływają na organizację i funkcję tego białka [17,47]. Związanie AnxA1 z błoną sprawia, że domena N-końcowa jest eksponowana do środowiska i dostępna dla białka S100A11. Białko S100A11, jeden z najlepiej poznanych partnerów AnxA1, tworzy dimer, który jest w stanie związać dwie cząsteczki AnxA1 [48-50]. Fosforylacja AnxA1 na reszcie tyrozyny 21 przez aktywny EGFR hamuje oddziaływanie AnxA1 z białkiem S100A11 i heterotetramer nie powstaje. Synteza w komórkach AnxA1 z niefunkcjonalnym N-końcem powodowała zmiany w rozmieszczeniu pęcherzyków zawierających EGF [16], podczas gdy syntezie aktywnej formy AnxA1 towarzyszyło nagromadzenie się pęcherzyków zawierających EGF w przestrzeni okołojądrowej. Na tej podstawie wyciągnięto wniosek, że AnxA1 jest bezpośrednio związana z transportem pęcherzykowym EGFR, co dodatkowo potwierdzono przez usunięcie N-końcowej domeny AnxA1. Delecja N-końca AnxA1 wywołała nieuporządkowaną lokalizację pęcherzyków na peryferiach komórki. Zwiększoną zawartość mutanta AnxA1 wykryto w przedziale LE, w odróżnieniu do białka pełnej długości, które występowało w przedziale wczesnych endosomów. Dodatkowo wykazano zahamowanie procesu degradacji EGFR, a co za tym idzie wydłużoną aktywację ścieżki sygnałowej kinazy MAP w komórkach zawierających zmutowaną AnxA1 [16]. Podobne efekty uzyskano w linii komórkowej A134 ze zwiększoną zawartością EGFR [51-53]. Co ważne, obniżeniu zawartości partnera AnxA1, białka S100A11, towarzyszyła przedłużona aktywacja kinazy ERK 1/2, wywołana zahamowaniem degradacji EGFR [16]. Wydaje się zatem, że heterotetramer AnxA1 2 S100A11 2 odgrywa kluczową rolę w procesie sortowania i degradacji EGFR, jak również wpływa na przeżywalność i proliferację komórek. Anxa2 Bardzo podobna do AnxA1, AnxA2 również występuje w komórkach w formie związanej z błoną plazmatyczną i błoną endosomów. Partnerem AnxA2 jest inne białko z rodziny S100, białko p11. Nie jest ono niezbędne do wiązania AnxA2 z błonami, tak jak w przypadku AnxA1 [23,53,54]. Postępy Biochemii 60 (1)

4 Wiązanie AnxA2 z błoną EE wynika z wysokiego powinowactwa do cholesterolu [23,55], za co odpowiada charakterystyczna dla AnxA2 domena N-końcowa [56]. Wyniki badań na komórkach pochodzących od pacjentów z chorobą Niemanna-Picka typu C (NPC1) lub liniach komórkowych, w których wywołano doświadczalnie gromadzenie się cholesterolu w przedziale LE/LY (stosując inhibitor transportu cholesterolu U18666A), wykazały przemieszczenie AnxA2 do błon przedziału magazynującego cholesterol w sposób zależny od zmian stężenia Ca 2+ [57]. AnxA2, podobnie jak AnxA1, ulega fosforylacji na reszcie tyrozyny 23 (Y23), co wydaje się mieć znaczenie dla wiązania białka z błoną endosomów [54]. Obniżenie zawartości AnxA2 spowodowało akumulację EGF w przedziale EE, podczas gdy w komórkach z wprowadzonym mutantem naśladującym fosforylację AnxA2 (Y23D) przywróciło transport endosomalny. Wykazano także, że zmiany konformacyjne wywołane przez fosforylację w końcu aminowym AnxA2 są konieczne do właściwego formowania się MVB oraz regulacji endocytozy [23,54]. Ponadto zaobserwowano, że podwyższony poziom AnxA2 jest często spotykany w przypadkach nowotworów, czemu towarzyszył podwyższony poziom EGFR [58,59]. Jak dotąd nie opisano mechanizmu regulacji EGFR przez AnxA2. Wyniki wielu badań wskazują na współzależność występowania obu białek w komórkach nowotworowych [15,23,53]. Badania przesiewowe z użyciem RNAi pozwoliły na zidentyfikowanie AnxA2 jako białka regulującego proces endocytozy EGFR, przekazywanie sygnału za pomocą tego receptora oraz rozwój raka piersi (oddziaływania z kofiliną) [60]. Zahamowanie endocytozy EGFR po zahamowaniu syntezy AnxA2 zostało powiązane z fosforylacją kofiliny poprzez wywołanie syntezy mutanta kofiliny naśladującego fosforylację (S3E), który przywracał normalny transport EGFR [61]. Dokładny mechanizm regulacji tego szlaku przez AnxA2 wydaje się być wciąż nie do końca poznany, ale istnieje wiele przesłanek świadczących o związku oddziaływania kofiliny w formie ufosforylowanej z monomerami aktyny [61-63]. AnxA6 Nietypowym przedstawicielem rodziny aneksyn jest aneksyna A6 (AnxA6); w przeciwieństwie do innych aneksyn jest zbudowana z ośmiu powtarzających się domen, tworzących rdzeń cząsteczki. Analiza bioinformatyczna pozwoliła na wysunięcie przypuszczenia, że AnxA6 mogła powstać w trakcie ewolucji z połączenia genów kodujących aneksynę A5 (AnxA5) i aneksynę A10 (AnxA10) [8,64]. Organizacja rdzenia AnxA6 pozwala białku na wiązanie się z dwoma różnymi błonami jednocześnie, np. błoną plazmatyczną i błoną pęcherzyka transportującego [64]. AnxA6 występuje w formie związenej z błoną EE, ale można ją także zaobserwować w formie związanej z błonami późnych i recyrkulujących endosomów. Poprzez swoje oddziaływanie z aktyną jest zaangażowana w przebudowę szkieletu komórki [65], jak również w transport cholesterolu z LE do aparatu Golgi ego i błony plazmatycznej [66] oraz zależne od cholesterolu wiązanie się fosfolipazy A 2 (cpla 2 ) z błonami aparatu Golgi ego [67]. W komórkach o podwyższonej zawartości LDL lub cholesterolu AnxA6 ulega przemieszczeniu do przedziału LE, gdzie jest zaangażowana w kierowanie cholesterolu do lizosomów skąd podlega on recyklingowi do błony plazmatycznej [28,68-70]. W komórkach z zaburzonym transportem cholesterolu, jego zawartość w błonach aparatu Golgi ego spada. Odpowiednie stężenie cholesterolu jest niezbędne do przyłączania cpla 2 i utrzymania prawidłowego transportu kaweoliny do błony plazmatycznej. Zaburzenia tego procesu powodują nagromadzenie się kaweoliny oraz powstawanie kaweoli z podwyższoną zawartością AnxA6. Powyższe obserwacje wskazują na udział AnxA6 w transporcie EGFR [66,67]. Zatem obok zdolności AnxA6 do oddziaływania z szkieletem aktynowym białko bierze udział w regulacji transportu endocytarnego, tworzenia mikrodomen błonowych oraz hamowaniu propagacji sygnału pochodzącego od EGFR. Zdolność AnxA6 do bezpośrednich oddziaływań z wieloma białkami regulatorowymi i efektorowymi stwarza dodatkowe możliwości regulacji ścieżki EGFR. Wykazano, że w zależności od typu badanych komórek AnxA6 może oddziaływać z PKCα, Pyk2, Raf-1 oraz z kinazami Src Lck i Fyn [71,72]. Wydaje się, że największy wpływ na ścieżkę EGFR ma zdolność AnxA6 do oddziaływania z białkiem p120gap, przedstawicielem dużej i zróżnicowanej rodziny białek GAP, wiążącym się z EGFR [73-75]. Obecnie uważa się, że pula AnxA6 w cytoplazmie występuje w formie związanej z p120gap i PKCα [76]. Aktywacja EGFR prowadzi do podwyższenia wewnątrzkomórkowego [Ca 2+ ], które stymuluje transport AnxA6 w kompleksie z p120gap i PKCα w pobliże błony plazmatycznej, gdzie oddziałują z kompleksem zawierającyym EGFR i H-Ras [71-76]. Oddziaływania pomiędzy p120gap i H-Ras wywołują zahamowanie aktywności białka Ras. Kiedy AnxA6 przyłączy się do platformy sygnałowej na błonie plazmatycznej stabilizuje kompleksy p120gap/h-ras oraz EGFR/PKCα, powodując zahamowanie sygnału pochodzącego ze ścieżki EGF i kierując EGFR do przedziału LE. Całość kompleksu zostaje skierowana do pęcherzyków opłaszczonych klatryną i na drogę endocytozy [77,78]. Ostatecznie kompleks AnxA6/ p120gap/pkcα zostaje uwolniony do cytoplazmy, a białko H-Ras skierowane z powrotem do błony plazmatycznej (poprzez recyrkulujące endosomy), gdzie oczekuje na pojawienie się kolejnego sygnału aktywacji [76]. AnxA8 Aneksyna A8 (AnxA8), w porównaniu do innych przedstawicieli rodziny aneksyn, jest słabo poznana. W niewielkich ilościach została zidentyfikowana w płucach, w skórze, w wątrobie i w nerkach [45,46], co sugeruje jej tkankowo specyficzną funkcję w transporcie endosomalnym i w przekazywaniu sygnału drogą EGF. Podobnie, jak w przypadku pozostałych przedstawicieli rodziny aneksyn, AnxA8 może oddziaływać z cząsteczkami fosfatydyloinozytolu oraz F- -aktyną, w sposób zależny od zmian [Ca 2+ ] [77,78]. Obniżeniu zawartości AnxA8 w komórce towarzyszy zmniejszenie liczby średniej wielkości endosomów LE i zmian ich oddziaływań z aktyną, czego efektem jest niewłaściwa degradacja EGFR i aktywacja kinazy MAPK [78]. Natomiast podwyż- 58

5 szeniu zawartości AnxA8 towarzyszy wzrost liczby średniej wielkości endosomów LE. Wpływ na aktywność i lokalizację EGFR nie został jeszcze zbadany [78]. Na tej podstawie wysunięto przypuszczenie, że AnxA8 moduluje ścieżkę przekazywania sygnału EGF za pośrednictwem regulacji oddziaływań endosomów LE ze szkieletem aktynowym komórki, kierując EGFR bezpośrednio na drogę degradacji do lizosomów. PODSUMOWANIE Wyniki szeregu badań przeprowadzonych w różnych laboratoriach naukowych na świecie pozwalają na wyciągnięciu wniosku na temat udziału przedstawicieli rodziny aneksyn w przekazywaniu sygnału, w którym uczestniczy receptor EGF. Dodatkowo świadczą o tym następujące przesłanki. Aneksyny charakteryzują się zdolnością uczestniczenia w regulacji transportu endosomalnego, przebudowy szkieletu aktynowego komórki oraz w różnorodnych procesach przekazywania sygnałów. Wykazują również zróżnicowany poziom i skład w różnych typach komórek oraz oddziałują z wieloma białkami partnerskimi w komórce. Wielu badaczy przypuszcza, że aneksyny odgrywają rolę w regulacji położenia EGFR na błonie komórkowej. Dodatkowo oddziaływanie aneksyn z białkami regulatorowymi i efektorowymi wchodzącymi w skład ścieżki EGF, może wpływać na kinetykę przekazywania sygnału i na zakończenie sygnału EGF (na drodze endocytozy, Ryc. 2). Wyniki dotychczas przeprowadzonych doświadczeń polegające na obniżeniu ekspresji genów kodujących określone aneksyny wskazują, że aneksyny mogą przynajmniej częściowo zastępować się wzajemnie w procesie przekazywaniu sygnału EGF. Aby poznać mechanizm regulacji szlaku sygnałowego EGF oraz zweryfikować przypuszczenia na temat aneksyn potrzebne są dodatkowe badania, polegające m.in. na obniżeniu ekspresji więcej niż jednego genu aneksyn w określonej komórce lub tkance. PIŚMIENNICTWO 1. Laohavisit A, Davies JM (2011) Annexins. New Phytol 189: Konopka-Postupolska D, Clark G, Hofmann A (2011) Structure, function and membrane interactions of plant annexins: an update. Plant Sci 181: Morgan RO, Martin-Almedina S, Iglesias JM, Gonzalez-Florez MI, Fernandez MP (2004) Evolutionary perspective on annexin calcium- -binding domains. Biochim Biophys Acta 1742: Hofmann A, Osman A, Leow CY, Driguez P, McManus DP, Jones MK (2010) Parasite annexins - new molecules with potential for drug and vaccine development. Bioessays 32: Morgan RO, Martin-Almedina S, Garcia M, Jhoncon-Kooyip J, Fernandez MP (2006) Deciphering function and mechanism of calcium-binding proteins from their evolutionary imprints. Biochim Biophys Acta 1763: Kodavali PK, Dudkiewicz M, Pikuła S, Pawłowski K (2014) Bioinformatics analysis of bacterial annexins putative ancestral relatives of eukaryotic annexins. PloS One 9: Gerke V, Moss SE (2002) Annexins: from structure to function. Physiol Rev 82: Gerke V, Creutz CE, Moss SE (2005) Annexins: linking Ca 2+ signalling to membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol 6: Bandorowicz-Pikuła J (2007) Aneksyny, białka uczestniczące w organizacji i prawidłowym funkcjonowaniu błon biologicznych - od Arabidopsis thaliana do Homo sapiens. Postepy Biochem 54: Rycina 2. Udział aneksyn w regulacji przekazywania sygnału EGF. W wyniku aktywacji receptora EGF (EGFR), po przyłączeniu cząsteczki EGF, dochodzi do jego dimeryzacji. Wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia powoduje przyłączenie kompleksu AnxA6/p120GAP/PKCα do platformy sygnałowej na błonie plazmatycznej, w której zlokalizowany jest dimer EGFR ze związanym ligandem. Po ustaniu sygnału platforma sygnałowa na błonie pęcherzyka endocytarnego zostaje skierowana na drodze endocytozy do sortujących endosomów (RE), gdzie kompleks AnxA6/p120GAP/PKCα ulega dysocjacji od błony endosomu. Na rycinie pokazano również rozmieszczenie innych aneksyn w formie związanej z błoną sortujących endosomów i późnych endosomów (AnxA2), ciał wielopęcherzykowych (AnxA8) oraz wczesnych endosomów (EE) (AnxA1). Inne wyjaśnienie w tekście pracy. Skróty i symbole zastosowane na rycinie: EE wczesne endosomy; LE późne endosomy; LY lizosomy; MVB ciała wielopęcherzykowe; NCP wgłębienie w błonie plazmatycznej nieopłaszczone klatryną; RE sortujące endosomy. 10. Bandorowicz-Pikuła J, Woś M, Pikuła S (2012) Udział aneksyn w przekazywaniu sygnałów, regulacji struktury błony komórkowej i naprawie jej uszkodzeń. Postepy Biochem 58: Bandorowicz-Pikuła J, Woś M, Pikuła S (2012) Do annexins participate in lipid messenger mediated intracellular signaling? A question revisited. Mol Membr Biol 29: Domon M, Nasir MN, Matar G, Pikuła S, Besson F, Bandorowicz-Pikuła J (2012) Annexins as organizers of cholesterol- and spingomyelin- -enriched membrane microdomains in Niemann-Pick type C disease. Cell Mol Life Sci 69: Creutz CE (1992) The annexins and exocytosis. Science. 258: Emans N, Gorvel JP, Walter C, Gerke V, Kellner R, Griffiths G, Gruenberg J (1993) Annexin II is a major component of fusogenic endosomal vesicles. J Cell Biol 120: Harder T, Gerke V (1993) The subcellular distribution of early endosomes is affected by the annexin II2p11(2) complex. J Cell Biol 123: Poeter M, Radke S, Koese M, Hessner F, Hegemann A, Musiol A, Gerke V, Grewal T, Rescher U (2013) Disruption of the annexin A1/ S100A11 complex increases the migration and clonogenic growth by dysregulating epithelial growth factor (EGF) signaling. Biochim Biophys Acta 1833: Tebar F, Gelabert-Baldrich M, Hoque M, Cairns R, Rentero C, Pol A, Grewal T, Enrich C (2014) Annexins and endosomal signaling. Methods Enzymol 535: Futter CE, Felder S, Schlessinger J, Ullrich A, Hopkins CR (1993) Annexin I is phosphorylated in the multivesicular body during the processing of the epidermal growth factor receptor. J Cell Biol 120: Sigismund S, Confalonieri S, Ciliberto A, Polo S, Scita G, Di Fiore PP (2012) Endocytosis and signaling: cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiol Rev 92: Postępy Biochemii 60 (1)

6 20. White IJ, Bailey LM, Aghakhani MR, Moss SE, Futter CE (2006) EGF stimulates annexin 1-dependent inward vesiculation in a multivesicular endosome subpopulation. EMBO J 25: Ayala-Sanmartin J, Henry JP, Pradel LA (2001) Cholesterol regulates membrane binding and aggregation by annexin 2 at submicromolar Ca 2+ concentration., Biochim Biophys Acta 1510: Drücker P, Pejic M, Galla HJ, Gerke V (2013) Lipid segregation and membrane budding induced by the peripheral membrane binding protein annexin A2. J Biol Chem 288: Hayes MJ, Rescher U, Gerke V, Moss SE (2004) Annexin-actin interactions. Traffic 5: Mayran N, Parton RG, Gruenberg J (2003) Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J 22: Hayes MJ, Merrifield CJ, Shao D, Ayala-Sanmartin J, Schorey CD, Levine TP, Proust J, Curran J, Bailly M, Moss SE (2004) Annexin 2 binding to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate on endocytic vesicles is regulated by the stress response pathway. J Biol Chem 279: Harder T, Gerke V (1993) The subcellular distribution of early endosomes is affected by the annexin II2p11(2) complex. J Cell Biol 123: Zobiack N, Rescher U, Ludwig C, Zeuschner D, Gerke V (2003) The annexin 2/S100A10 complex controls the distribution of transferrin receptor-containing recycling endosomes. Mol Biol Cell 14: de Diego I, Schwartz F, Siegfried H, Dauterstedt P, Heeren J, Beisiegel U, Enrich C, Grewal T (2002) Cholesterol modulates the membrane binding and intracellular distribution of annexin 6. J Biol Chem 277: Croxtall JD, Gilroy DW, Solito E, Choudhury Q, Ward BJ, Buckingham JC, Flower RJ (2003) Attenuation of glucocorticoid functions in an Anx-A1-/- cell line. Biochem J 371: Crosetto N, Tikkanen R, Dikic I (2005) Oncogenic breakdowns in endocytic adaptor proteins., FEBS Lett 579: Warren CM, Landgraf R (2006) Signaling through ERBB receptors: multiple layers of diversity and control. Cell Signal 18: von Zastrow M, Sorkin A (2007) Signaling on the endocytic pathway. Curr Opin Cell Biol 19: Sorkin A, Goh LK (2008) Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs. Exp Cell Res 314: Malaney S, Daly RJ (2001) The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis. J Mammary Gland Biol Neoplasia 6: Mercer KE, Pritchard CA (2003) Raf proteins and cancer: B-Raf is identified as a mutational target. Biochim Biophys Acta 1653: Downward J (2003) Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nat Rev Cancer 3: Burgess AW, Cho HS, Eigenbrot C, Ferguson KM, Garrett TP, Leahy DJ, Lemmon MA, Sliwkowski MX, Ward CW, Yokoyama S (2003) An open-and-shut case? Recent insights into the activation of EGF/ErbB receptors. Mol Cell 12: Sebolt-Leopold JS, Herrera R (2004) Targeting the mitogen-activated protein kinase cascade to treat cancer. Nat Rev Cancer 4: Ferguson KM (2008) Structure-based view of epidermal growth factor receptor regulation. Annu Rev Biophys 37: Bogdan S, Klämbt C (2001) Epidermal growth factor receptor signaling. Curr Biol 11: Garrett TP, McKern NM, Lou M, Elleman TC, Adams TE, Lovrecz GO, Zhu HJ, Walker F, Frenkel MJ, Hoyne PA, Jorissen RN, Nice EC, Burgess AW, Ward CW (2002) Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha. Cell 110: de Laurentiis A, Donovan L, Arcaro A (2007) Lipid rafts and caveolae in signaling by growth factor receptors. Open Biochem J 1: Ringerike T, Blystad FD, Levy FO, Madshus IH, Stang E (2002) Cholesterol is important in control of EGF receptor kinase activity but EGF receptors are not concentrated in caveolae. J Cell Sci 115: Futter CE, White IJ (2007) Annexins and endocytosis. Traffic 8: Reutelingsperger CP, van Heerde W, Hauptmann R, Maassen C, van Gool RG, de Leeuw P, Tiebosch A (1994) Differential tissue expression of Annexin VIII in human. FEBS Lett 349: Pepinsky RB, Hauptmann R (1992) Detection of VAC-ß (annexin-8) in human placenta. FEBS Lett 306: Haigler HT, Schlaepfer DD, Burgess WH (1987) Characterization of lipocortin I and an immunologically unrelated 33-kDa protein as epidermal growth factor receptor/kinase substrates and phospholipase A2 inhibitors. J Biol Chem 262: Mailliard WS, Haigler HT, Schlaepfer DD (1996) Calcium-dependent binding of S100C to the N-terminal domain of annexin I. J Biol Chem 271: Seemann J, Weber K, Gerke V (1996) Structural requirements for annexin I-S100C complex-formation. Biochem J 319: Réty S, Osterloh D, Arié JP, Tabaries S, Seeman J, Russo-Marie F, Gerke V, Lewit-Bentley A (2000) Structural basis of the Ca(2+)-dependent association between S100C (S100A11) and its target, the N-terminal part of annexin I. Structure 8: King IC, Sartorelli AC (1986) The relationship between epidermal growth factor receptors and the terminal differentiation of A431 carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun 140: Koese M, Rentero C, Kota BP, Hoque M, Cairns R, Wood P, Vilà de Muga S, Reverter M, Alvarez-Guaita A, Monastyrskaya K, Hughes WE, Swarbrick A, Tebar F, Daly RJ, Enrich C, Grewal T (2013) Annexin A6 is a scaffold for PKCα to promote EGFR inactivation. Oncogene 32: Jost M, Zeuschner D, Seemann J, Weber K, Gerke V (1997) Identification and characterization of a novel type of annexin-membrane interaction: Ca 2+ is not required for the association of annexin II with early endosomes. J Cell Sci 110: Morel E, Gruenberg J (2009) Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem 284: Lambert O, Cavusoglu N, Gallay J, Vincent M Rigaud JL, Henry JP, Ayala-Sanmartin J (2004) Novel organization and properties of annexin 2-membrane complexes. J Biol Chem 279: Zibouche M, Vincent M, Illien F, Gallay J, Ayala-Sanmartin J (2008) The N-terminal domain of annexin 2 serves as a secondary binding site during membrane bridging. J Biol Chem 283: Lloyd-Evans E, Morgan AJ, He X, Smith DA, Elliot-Smith E, Sillence DJ, Churchill GC, Schuchman EH, Galione A, Platt FM (2008) Niemann-Pick disease type C1 is a sphingosine storage disease that causes deregulation of lysosomal calcium. Nat Med 14: Emoto K, Yamada Y, Sawada H, Fujimoto H, Ueno M, Takayama T (2001) Annexin II overexpression correlates with stromal tenascin-c overexpression: a prognostic marker in colorectal carcinoma. Cancer 92: Zheng L, Foley K, Huang L, Leubner A, Mo G, Olino K, Edil BH, Mizuma M, Sharma R, Le DT, Anders RA, Illei PB, Van Eyk JE, Maitra A, Laheru D, Jaffee EM (2011) Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PLoS One 6: de Graauw M, Cao L, Winkel L, van Miltenburg MH, le Dévédec SE, Klop M, Yan K, Pont C, Rogkoti VM, Tijsma A, Chaudhuri A, Lalai R, Price L, Verbeek F, van de Water B (2013) Annexin A2 depletion delays EGFR endocytic trafficking via cofilin activation and enhances EGFR signaling and metastasis formation. Oncogene doi: / onc de Graauw M, Tijdens I, Smeets MB, Hensbergen PJ, Deelder AM, van de Water B (2008) Annexin A2 phosphorylation mediates cell scattering and branching morphogenesis via cofilin activation. Mol Cell Biol 28: Babbin BA, Parkos CA, Mandell KJ, Winfree LM, Laur O, Ivanov AI (2007) Annexin 2 regulates intestinal epithelial cell spreading and wound closure through Rho-related signaling. Am J Pathol 170:

7 63. Rescher U, Ludwig C, Konietzko V, Kharitonenkov A, Gerke V (2008) Tyrosine phosphorylation of annexin A2 regulates Rho-mediated actin rearrangement and cell adhesion. J Cell Sci 121: Freye-Minks C, Kretsinger RH, Creutz CE (2003) Structural and dynamic changes in human annexin VI induced by a phosphorylation- -mimicking mutation, T356D. Biochemistry 42: Monastyrskaya K, Babiychuk EB, Hostettler A, Wood P, Grewal T, Draeger A (2009) Plasma membrane-associated annexin A6 reduces Ca 2+ entry by stabilizing the cortical actin cytoskeleton. J Biol Chem 284: Cubells L, Vilà de Muga S, Tebar F, Wood P, Evans R, Ingelmo-Torres M, Calvo M, Gaus K, Pol A, Grewal T, Enrich C (2007) Annexin A6- -induced alterations in cholesterol transport and caveolin export from the Golgi complex. Traffic 8: Cubells L, Vilà de Muga S, Tebar F, Bonventre JV, Balsinde J, Pol A, Grewal T, Enrich C (2008) Annexin A6-induced inhibition of cytoplasmic phospholipase A2 is linked to caveolin-1 export from the Golgi. J Biol Chem 283: Grewal T, Heeren J, Mewawala D, Schnitgerhans T, Wendt D, Salomon G, Enrich C, Beisiegel U, Jäckle S (2000) Annexin VI stimulates endocytosis and is involved in the trafficking of low density lipoprotein to the prelysosomal compartment. J Biol Chem 275: Pons M, Grewal T, Rius E, Schnitgerhans T, Jäckle S, Enrich C (2001) Evidence for the Involvement of annexin 6 in the trafficking between the endocytic compartment and lysosomes. Exp Cell Res 269: te Vruchte D, Lloyd-Evans E, Veldman RJ, Neville DC, Dwek RA, Platt FM, van Blitterswijk WJ, Sillence DJ (2004) Accumulation of glycosphingolipids in Niemann-Pick C disease disrupts endosomal transport. J Biol Chem 279: Davis AJ, Butt JT, Walker JH, Moss SE, Gawler DJ (1996) The Ca 2+ -dependent lipid binding domain of P120GAP mediates protein-protein interactions with Ca 2+ -dependent membrane-binding proteins. Evidence for a direct interaction between annexin VI and P120GAP. J Biol Chem 271: Erratum in: J Biol Chem 271: Rentero C, Evans R, Wood P, Tebar F, Vilà de Muga S, Cubells L, de Diego I, Hayes TE, Hughes WE, Pol A, Rye KA, Enrich C, Grewal T (2006) Inhibition of H-Ras and MAPK is compensated by PKC-dependent pathways in annexin A6 expressing cells. Cell Signal 18: Chow A, Davis AJ, Gawler DJ (2000) Identification of a novel protein complex containing annexin VI, Fyn, Pyk2, and the p120(gap) C2 domain. FEBS Lett 1: Rual JF, Venkatesan K, Hao T, Hirozane-Kishikawa T, Dricot A, Li N, Berriz GF, Gibbons FD, Dreze M, Ayivi-Guedehoussou N, Klitgord N, Simon C, Boxem M, Milstein S, Rosenberg J, Goldberg DS, Zhang LV, Wong SL, Franklin G, Li S, Albala JS, Lim J, Fraughton C, Llamosas E, Cevik S, Bex C, Lamesch P, Sikorski RS, Vandenhaute J, Zoghbi HY, Smolyar A, Bosak S, Sequerra R, Doucette-Stamm L, Cusick ME, Hill DE, Roth FP, Vidal M (2005) Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature 437: Jones RB, Gordus A, Krall JA, MacBeath G (2006) A quantitative protein interaction network for the ErbB receptors using protein microarrays. Nature 439: Grewal T, Enrich C (2006) Molecular mechanisms involved in Ras inactivation: the annexin A6-p120GAP complex. Bioessays 28: Goebeler V, Ruhe D, Gerke V, Rescher U (2006) Annexin A8 displays unique phospholipid and F-actin binding properties. FEBS Lett 580: Goebeler V, Poeter M, Zeuschner D, Gerke V, Rescher U (2008) Annexin A8 regulates late endosome organization and function. Mol Biol Cell 19: Participation of annexins in endocytosis and EGFR mediated signal transduction Marcin Woś, Joanna Bandorowicz-Pikuła Nencki Institute of Experimental Biology, 3 Pasteura St., Warsaw, Poland j.bandorowicz-pikula@nencki.gov.pl Key words: annexins, endocytosis, epidermal growth factor ABSTRACT Annexins are a family of membrane interacting proteins, widely distributed in vertebrates. Their involvement in the endosomal transport is due to annexin capability of binding cellular constituents such as membrane phospholipids and intracellular protein partners in a calcium dependent manner. Furthermore, annexins, through endosomal transport of particular receptors and specific cargo, may regulate various processes involved in signal transduction. Cell surface receptors after activation by signal molecule are internalized during endocytosis and transduce signal downstream the signaling pathway. The optimal conditions to modulate the signal are provided by the compartment specific membrane platforms carrying signal transducing complexes. In this review we describe a role of some members of the annexin family, annexin A1 (AnxA1), annexin A2 (AnxA2), annexin A6 (AnxA6) and annexin A8 (AnxA8) in the epidermal growth factor (EGF) signal transduction pathway. Annexins due to their specialized structure and specific localization in the cell may modulate signal transduction either directly, by interacting with EGF receptor (EGFR) or indirectly by interacting with EGF pathway regulators and effectors, by participating in formation and stabilization of the cholesterol enriched signal transduction platforms and by participating in EGFR transport and degradation. Postępy Biochemii 60 (1)