Ocena rozprawy doktorskiej Pana mgr Kamila Jastrzębskiego pt. "Role of the Rho GTPases in trafficking and signaling of platelet-derived growth factor"

Transkrypt

1 Dr hab. Jarosław Czyż Zakład Biologii Komórki Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński ul. Gronostajowa Kraków jarek.czyz@uj.edu.pl Kraków, 2 grudnia 2015 Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii. dr hab. Jarosław Czyż Ocena rozprawy doktorskiej Pana mgr Kamila Jastrzębskiego pt. "Role of the Rho GTPases in trafficking and signaling of platelet-derived growth factor" UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI W ul. Gronostajowa KRAKOWIE Kraków t tel. +48(12) f fax +48(12) Podstawowe procesy fizjologiczne decydujące o funkcjach komórek w tkankach jarek.czyz@uj.edu.pl i organach, w tym proliferacja i różnicowanie komórek i ich apoptoza, regulowane są przez złożone systemy komunikacji między komórkami a ich mikrośrodowiskiem. Systemy te oparte są o działanie różnorodnych mediatorów. Wśród nich wymienić można zarówno czynniki humoralne, takie jak czynniki wzrostowe, cytokiny i hormony; jak i receptory adhezji międzykomórkowej (bezpośredniej lub/i za pośrednictwem macierzy zewnątrzkomórkowej) oraz bezpośrednią międzykomórkową wymianę metabolitów (np. za pośrednictwem złączy szczelinowych i struktur nanotubularnych). Ponadto komórki wymieniają informacje ze swoim otoczeniem za pośrednictwem pęcherzyków błonowych, w tym wydzielanych do mikrośrodowiska komórek w procesach egzocytozy, jak i generowanych w wyniku endocytozy. W kontekście tematyki recenzowanej pracy, na szczególną uwagę zasługują powiązania między procesami internalizacji kompleksów ligand-receptor na drodze endocytozy a szlakami sygnałowymi regulowanymi przez czynniki wzrostowe. Badania nad tymi zależnościami, prowadzone m. in. przez grupę Pani prof. Marty Miączyńskiej, wykazały zaangażowanie internalizacji kompleksów ligand-receptor (w tym receptora płytkopochodnego czynnika wzrostowego; platelet-derived growth factor; PDGF) za pośrednictwem endocytozy klatryno-zależnej w regulacji degradacji kompleksów ligand-receptor i w aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków

2 sygnałowych. Z drugiej strony wciąż niewiele wiadomo nt. roli klatrynoniezależnych szlaków endocytozy w tym procesie, przełożenia ich mobilizacji na wzór aktywacji komórek i zaangażowania małych białek G w tych relacjach. Podstawowym celem ocenianej pracy było określenie roli internalizacji receptora PDGF β (PDGFRβ) za pośrednictwem endocytozy klatrynoniezależnej (CIE) w regulacji szlaków sygnałowych zależnych od PDGF i identyfikacja regulatorów tego procesu. Wielość szlaków regulujących wydajność endocytozy klatryno-niezależnej powoduje, że zadania badawcze podjęte przez Autora z jednej strony są dość złożone pod względem metodycznym, z drugiej zaś trudne w interpretacji. Jednak ze względu na ewidentne luki w naszej wiedzy na ten temat, podjęcie tej tematyki badawczej uważam za w pełni uzasadnione, co przełożyło się na jednoznacznie pozytywną ocenę całej rozprawy, niezależnie od kilku pytań, które postawiłem w dalszej części recenzji. Przedłożona do oceny praca ma rozkład i objętość typowe dla tego typu opracowań; liczy ona 129 stron, zawiera 41 rycin, w tym 34 ryciny ilustrujące uzyskane wyniki, oraz 13 tabel (które przede wszystkim wyszczególniają wykorzystane w pracy odczynniki i plazmidy). Rozpoczynają ją przejrzyście skomponowane streszczenia rozprawy w języku polskim i angielskim oraz kompletna lista skrótów używanych w rozprawie, która bez wątpienia podnosi komfort lektury pracy. Komfort ten podnosi również jakość edytorska rozprawy: została ona przygotowana bardzo starannie i napisana dojrzałą angielszczyzną. W czasie jej lektury nie natknąłem się na poważniejsze błędy stylistyczne; choć udało mi sie wyłapać parę skrótów myślowych, np. "zmniejszona fosforylacja" i "zmniejszona ekspresja genów". Z autopsji wiem jednak, że sa one trudne do uniknięcia, wpisane są w przygotowanie dużych monografii, i nie mogą mieć wpływu na ogólną ocenę rozprawy. Całość kończy dość obszerna bibliografia licząca ok. 270 pozycji (zarówno oryginalnych prac doświadczalnych, jak i artykułów przeglądowych). Dobór przedmiotu badań został gruntownie uzasadniony we Wstępie rozprawy, w którym Autor w syntetyczny sposób omówił aktualny stan wiedzy na temat funkcji i znaczenia PDGF w rozwoju organizmów, utrzymywaniu ich homeostazy, w procesach regeneracyjnych oraz w rozwoju niektórych stanów patologicznych. W rozważania te wpisany został opis wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych i genów, których ekspresja regulowana jest przez PDGF, a ten z kolei powiązany został z przeglądem mechanizmów rządzących endocytozą, jako jedną z dróg komunikacji komórek z ich mikrośrodowiskiem. W tej części wstępu, Autor w szczegółowy sposób omawia i porównuje różne drogi endocytozy, począwszy od endocytozy klatryno-zależnej a skończywszy na makropinocytozie i fagocytozie. Styl, dobór faktów i rozłożenie akcentów wskazuje, że Autor swobodnie porusza się w tematyce związanej z rozprawą. Dodatkowo, lekturę Wstępu i nadążanie za tokiem myślenia Autora ułatwiają umiejętnie dobrane i eleganckie w stylu ryciny, choć niektóre z nich opatrzone zostały zbyt lapidarnym komentarzem (np. Ryc. 1.2). Całość spięta jest syntezą właściwości małych białek G z rodziny Rho i ich powiązań ze szlakami regulowanymi przez PDGF i z procesami regulującymi procesy endocytozy. Pozwoliło to Autorowi ocenianej rozprawy w płynny sposób przejść do omówienia celów pracy. Jedyne zastrzeżenie do tej części pracy dotyczy braku nawiązania do kwestii związanych z powiązaniami między funkcjami małych białek G a adhezją komórek do podłoża. Do pewnego stopnia brak ten da się Strona2 Wydział Biochemii, Biofizyki 2i Biotechnologii UJ

3 uzasadnić profilem tematycznym rozprawy. Jednak powiązania te decydować mogą o procesach, o których traktuje rozprawa, gdyż adhezja komórkowa jest jednym z elementów uczestniczących w regulacji reaktywności komórek na czynniki wzrostowe. Do tej kwestii nawiązuję również w dalszej części recenzji. Dodatkowo wydaje się, że 6 punktów przedstawiających szczegółowe cele pracy opisuje raczej przewidywane drogi osiągnięcia podstawowego celu rozprawy. Nie są to jednak usterki, które mogłyby negatywnie wpłynąć na ocenę obu fragmentów rozprawy. Po sprecyzowaniu celów pracy, Autor przedstawił szczegółowy opis wykorzystywanych technik doświadczalnych. Zarówno metodykę przeprowadzonych doświadczeń, jak i jej opis zamieszczony w rozdziale Materiały i Metody oceniam bardzo wysoko. W pracy wykorzystano linię fibroblastów CCD-1070Sk, które wcześniej zostały dobrze scharakteryzowane pod względem mechanizmów regulacji internalizacji PDGFRβ. Część fenomenologiczna pracy oparta jest na fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, która została wsparta fluorymetrycznymi analizami intensywności procesu endocytozy za pomocą software'u Motion Tracking i technikami biologii molekularnej, w tym hybrydyzacją typu western i RT-qPCR. Do analiz funkcjonalnych Autor wykorzystał techniki wyciszania ekspresji genów w oparciu o sirna i indukcję ekspresji konstytutywnie aktywnych i nieaktywnych mutantów małych białek G. Podejście to zostało wsparte wykorzystaniem dostępnych komercyjnie inhibitorów chemicznych. Biorąc pod uwagę mnogość dostepnych obecnie technik wizualizacji aktywności endocytarnej komórek, na uwagę zasługuje fakt, że Autor poszedł pod prąd dość powszechnej maniery polegającej na bezzasadnym mnożeniu technik opisujących jedno zjawisko, a skoncentrował się raczej na komplementarności i spójności strategii doświadczalnej. Jej opis, w części oparty na tabelach, jest jasny i dokładny, stwarzający możliwość powtórzenia opisywanych doświadczeń, oczywiście przez osobę dysponującą odpowiednim sprzętem i wiedzą. Część doświadczalna recenzowanej pracy przedstawiona została w sposób z jednej strony zwięzły, a z drugiej przystępny: łatwo było uchwycić ciągi przyczynowo-skutkowe, którymi kierował się Autor wykonując kolejne doświadczenia. W pierwszym etapie badań Autor zanalizował wpływ wyciszenia ekspresji białek zaangażowanych w CME na wydajność internalizacji PDGFRβ. Wykazał on, że wyciszenie genów kodujących białka zaangażowane w CME tylko częściowo hamuje internalizację PDGFRβ, podczas gdy całkowicie hamuje ono internalizację transferyny. W powiązaniu ze współwystępowaniem PDGFRβ i CD44 dane te jednoznacznie świadczą o zaangażowaniu mechanizmów CIE w internalizację PDGFRβ w tych przynajmniej komórkach. Dalsze doświadczenia wykazały zaangażowanie cytoszkieletu aktynowego i małych białek G (w szczególności RhoA i cdc42) w internalizację PDGFRβ. Ζostało to zilustrowane za pomocą indukowanej ekspresji mutantów obu białek w fibroblastach, wspomaganej zastosowaniem inhibitorów chemicznych RhoA i cdc42. Dodatkowo, przeprowadzone zostały analizy wpływu zahamowania aktywności ROCK1 i ROCK2 oraz miozyny II, które potwierdziły zaangażowanie tych białek w internalizację PDGFRβ. Jednoznacznie wskazały one na zaangażowanie jednej ze ścieżek CIE w regulację internalizacji PDGFRβ. Z kolei znaczenie biologiczne tych powiązań zostało zilustrowane przez analizy wzoru ekspresji genów kodujących białka związane z regulacją cyklu komórkowego. Wykazały one, Strona3 Wydział Biochemii, Biofizyki 3i Biotechnologii UJ

4 że zahamowanie zarówno CME, jak i CIE obniżyło poziom fosforylacji STAT3 oraz poziomy ekspresji genów docelowych dla tego białka, przy braku wpływu na aktywację Akt i GSK3β. Wyniki te nie budzą wątpliwości; jedyne moje zastrzeżenie dotyczy braku analiz statystycznych wpływu badanych czynników na poziom internalizacji PDGFRβ (np. Ryc ) przy czym jest to zarzut czysto formalny, gdyż uzyskane wyniki są w sumie jednoznaczne. Zastanawia mnie również, na ile w świetle wielu danych na temat wielopoziomowego zaangażowania cytoszkieletu aktynowego w regulację reaktywności fibroblastów na czynniki wzrostowe, wpływ zahamowania aktywności ROCK i cdc42 na indukcję przejścia G 1 /S (a nie proliferacji!) fibroblastów przez PDGF może być inerpretowany wyłącznie w kategoriach zaangażowania endocytozy w ten proces (Ryc. 5.34). Zastanawiający jest też stosunkowo niski procent komórek, które weszły w fazę S po potraktowaniu surowicą lub PDGF. Wyniki uzyskane w ramach rozprawy pozwoliły Autorowi na postawienie kilku podstawowych wniosków. Według Autora pokazują one jednoznacznie, że szlaki CIE dopełniają działanie CME w czasie internalizacji PDGFRβ. Opisane uprzednio zaangażowanie CME w ten proces zostało potwierdzone doświadczeniami z wykorzystaniem RNAi. Z kolei zaangażowanie RhoA w ten proces sugeruje rolę szybkiej endocytozy zależnej od endofiliny (FEME), a doświadczenia nad rolą cdc42 potwierdzają równoległe zaangażowanie ścieżki związanej ze strukturami niezależnymi od klatryny (ścieżka CLICs). Szczegółowe rozwinięcie tych kwestii znalazło się w bardzo dobrze skompilowanej Dyskusji uzyskanych wyników, którą Autor oparł na aktualnie dostępnych danych literaturowych, a w szczególności na wcześniejszych wynikach opublikowanych przez zespół prof. Miączyńskiej. Co warte odnotowania, Autor pokusił się również o zaproponowanie nowych doświadczeń, które pozwoliłyby dodatkowo zweryfikować część tez zawartych w rozprawie i doprecyzować mechanistykę opisywanych zjawisk. Moją szczególną uwagę zwróciły rozważania nt. kompartmentacji i swoistej "regionalizacji" działania opisywanych mechanizmów internalizacji PDGFRβ. Skoro znaczenie biologiczne obu procesów ilustrowane jest przez wpływ zahamowania CME i CIE na poziom fosforylacji STAT3 i proliferację fibroblastów, być może zasadne byłoby rozszerzenie analiz aktywacji STAT3 o badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji STAT3 i jego jądrowej akumulacji? Wydaje się, że badania kinetyki tego procesu (choćby z wykorzystaniem immunocytochemii) w relacji do aktywności i sub-komórkowej kompartmentacji procesów endocytozy mogłyby wzbogacić interpretację uzyskanych wyników. Ponadto, rozważania na temat konsekwencji obserwowanych zjawisk na poziomie komórki Autor oparł na dość powierzchownych jednak analizach wbudowywania BrdU, podczas gdy choćby analizy wpływu CIE na ekspresję funkcjonalnych markerów fibroblastów (np. kolageny, elastyna etc.) mogłyby pomóc zweryfikować i rozwinąć ten temat. Wreszcie w świetle uzyskanych w pracy wyników uwagę zwraca możliwość powiązania, poprzez małe białka G, wydajności i lokalizacji subkomórkowej internalizacji PDGFRβ z szeroko rozumianą architekturą cytoszkieletu aktynowego. Nota bene Autor, niejako mimochodem wspomina o tych korelacjach przy okazji rozważań nad funkcją RhoA i cdc42 w internalizacji PDGFRβ. Z drugiej jednak strony Autor nie zwrócił uwagi na potencjalne alternatywne źródła aktywacji (i aktywności) obu białek, która w przyjętym modelu doświadczalnym bez wątpienia związana jest z adhezją komórek do Strona4 Wydział Biochemii, Biofizyki 4i Biotechnologii UJ

5 podłoża i aktywacją szlaków zależnych od integryn. W związku z tym możnaby sie zastanowić, czy uzyskane wyniki nie wyjaśniają również roli adhezji komórkowej w regulacji wrażliwości komórek na czynniki wzrostowe, w tym PDGF? Wreszcie zastanawiam sie na ile różnice fenotypowe między fibroblastami pochodzącymi z różnych tkanek przekładają się na różnice w mechanizmach odpowiedzialnych za endocytozę PDGFRβ, i na ile wykorzystana w pracy linia komórkowa jest reprezentatywna dla innych komórek tego typu. Niezależnie od tych pytań, które mają charakter wyłącznie uzupełniający, bardzo wysoko oceniam wartość merytoryczną rozprawy doktorskiej Pana mgr Kamila Jastrzębskiego. W moim przekonaniu Autor uzyskał wartościowe, stanowiące nowość naukową wyniki, które otwierają szerokie perspektywy badawcze na przyszłość. Zatem stwierdzam, że przedłożona mi do oceny rozprawa spełnia warunki określone w art. 13 Ustawy z dn. 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 z późn. zm.) i wnoszę o dopuszczenie przez Wysoką Radę Instytutu Biochemii i Biofizyki w Warszawie Pana mgr Kamila Jastrzębskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Biorąc również pod uwagę dotychczasową aktywność naukową Autora, udokumentowaną czterema pracami doświadczalnymi opublikowanymi w renomowanych czasopismach naukowych, wnoszę też o wyróżnienie rozprawy stosowną nagrodą. (Jarosław Czyż) Strona5 Wydział Biochemii, Biofizyki 5i Biotechnologii UJ