Peptydy sygnałowe roślin Małe peptydy modyfikowane potranslacyjnie

Transkrypt

1 Peptydy sygnałowe roślin Małe peptydy modyfikowane potranslacyjnie STRESZCZENIE Wyniki analiz genetycznych, bioinformatycznych i biochemicznych wykazały, że jedną z kluczowych ról w sygnalizacji międzykomórkowej odgrywają sekrecyjne peptydy sygnałowe. Odkryte do tej pory w roślinach peptydy sygnałowe dzielone są na dwie duże grupy. Peptydy z pierwszej grupy nazywane są małymi peptydami modyfikowanymi potranslacyjnie, ponieważ zawierają hydroksylowane reszty proliny, arabinozylowane reszty hydroksyproliny lub siarczanowane reszty tyrozyny. Peptydy z drugiej grupy, określane jako peptydy bogate w cysteinę, są większe i zawierają od 4 do 16 reszt cysteiny. Równolegle do badań poświęconych identyfikowaniu i poznawaniu nowych peptydów, prowadzone są poszukiwania białek receptorowych pośredniczących w percepcji odkrywanych peptydów. Poznane dotychczas białka receptorowe są serynowo/treoninowymi kinazami białkowymi z rodziny RLK oraz białkami receptorowymi z rodziny RLP. Większość poznanych białek receptorowych w części zewnątrzkomórkowej wiążącej peptyd ma domenę utworzoną z powtórzeń bogatych w leucynę (LRR). Niniejsza praca przeglądowa podsumowuje najważniejsze wyniki badań poświęconych peptydom z grupy małych peptydów modyfikowanych potranslacyjnie. Dotychczasowe wyniki pokazują, że peptydy z tej grupy biorą udział w regulacji procesów wzrostu i rozwoju roślin, w tym m. in. w organizacji merystemów wierzchołkowych, w regulacji wzrostu korzeni i inicjowaniu zawiązków korzeni bocznych, różnicowaniu wiązek naczyniowych, odcinaniu organów czy w autoregulacji brodawkowania. WPROWADZENIE Prawidłowy i niezakłócony wzrost i rozwój organizmów wielokomórkowych staje się możliwy dzięki ciągłej wymianie informacji pomiędzy komórkami. W przypadku roślin pośredniczą w niej znane i badane od dziesięcioleci fitohormony, a także cząsteczki mniej poznane, takie jak niekodujące RNA (mirna i sirna), reaktywne formy tlenu, sygnały elektryczne, mobilne czynniki transkrypcyjne i inne białka regulatorowe oraz dopiero co odkrywane i poznawane peptydy sygnałowe. Jeszcze niedawno udział tych ostatnich cząsteczek w sygnalizacji międzykomórkowej był niemal całkowicie nieznany. Wystarczy wspomnieć pracę przeglądową opublikowaną w 2002 roku w Postępach Biologii Komórki poświęconą pięciu znanym wówczas peptydom sygnałowym roślin [1]. W ciągu ostatniego dziesięciolecia sytuacja zmieniła się radykalnie, bowiem w pracy przeglądowej opublikowanej przed czterema laty autorzy wyliczają już 126 genów rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) kodujących małe białka sekrecyjne, z których są wycinane proteolitycznie małe funkcjonalne peptydy [2]. Dzisiaj już wiadomo, że liczba takich peptydów w roślinach jest wielokrotnie większa, o czym świadczą m. in. wyniki analiz genetycznych sugerujące, że genom rzodkiewnika zawiera od około tysiąca do nawet kilku tysięcy genów, których białkowe produkty mogą być źródłem peptydów sygnałowych [3,4]. Do podobnych sugestii prowadzą także wyniki analiz opublikowane w ubiegłym roku, w których wykazano, że genom rzodkiewnika zawiera około otwartych ramek odczytu (ORF) kodujących białka zbudowane z mniej niż 100 reszt aminokwasowych, spośród których co najmniej 2099 ORF ulega ekspresji, a niemal 600 wyselekcjonowanych sekwencji jest zachowane w ewolucji [5]. Zarówno wyniki analiz genetycznych, jak również wyniki dotychczasowych badań eksperymentalnych budzą coraz większe zainteresowanie roślinnymi peptydami sygnałowymi, czego efektem jest niemal lawinowy wzrost w ostatnich latach liczby prac eksperymentalnych poświęconych tym zagadnieniom. Na podstawie wyników dotychczasowych badań można wnioskować, iż odkrywane peptydy zajmują w sygnalizacji międzykomórkowej roślin jedno z kluczowych miejsc, a biorąc pod uwagę poznane mechanizmy działania niektórych peptydów, szereg poznanych cząsteczek tego typu można już dzisiaj zaliczyć do rodziny roślinnych hormonów peptydowych. Aneta Gorzelańczyk * Stanisław Kowalczyk Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń * Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, ul. Gagarina 7, Toruń; tel.: (56) , a_gorzelan@wp.pl Artykuł otrzymano 12 maja 2014 r. Artykuł zaakceptowano 27 czerwca 2014 r. Słowa kluczowe: peptydy sygnałowe, sygnalizacja międzykomórkowa, receptorowe kinazy białkowe, rzodkiewnik pospolity Wykaz skrótów: CEP (ang. C-terminally Encoded Peptide) peptydy zawierające hydroksyprolinę; CLE (ang. Clavata3/Endosperm Surrounding Region) rodzina peptydów zawierających hydroksylowaną prolinę i arabinozylowaną hydroksyprolinę; IDA i IDA-like (ang. Inflorescence Deficient in Abscission) peptydy funkcjonujące w odcinaniu organów; PSK (ang. Phytosulfokine) pentapeptyd zawierający dwie siarczanowane reszty tyrozyny; PSY (ang. Plant Peptide Containing Sulfated Tyrisine) peptydy zawierające siarczanowaną tyrozynę i dwie reszty hydroksyproliny; RGF/ CLEL/GOLVEN (ang. Root Meristem Growth Factor/CLE-like/GOLVEN) rodzina peptydów zawierających siarczanowaną resztę tyrozyny Dotychczas poznane peptydy sygnałowe roślin dzielone są przez niektórych autorów na dwie grupy. Pierwszą grupę tworzą peptydy nazywane ogólnie małymi peptydami modyfikowanymi potranslacyjnie [4,6]. Peptydy należące Postępy Biochemii 60 (3)

2 Rycina 1. Modyfikacje potranslacyjne i wycinanie z probiałka aktywnego peptydu sygnałowego. Peptydy z grupy małych peptydów modyfikowanych potranslacyjnie są wycinane proteolitycznie z probiałek, które w aparacie Golgiego i w siateczce śródplazmatycznej ulegają odpowiednim modyfikacjom. W wyniku takich modyfikacji peptydy z poszczególnych rodzin mogą mieć jedną lub dwie reszty hydroksylowanej proliny, w tym, co najmniej jedna reszta hydroksyproliny może być podstawiona liniowym łańcuchem pentozowym zawierającym zwykle trzy reszty arabinozy. Peptydy z innych rodzin mają jedną lub dwie reszty siarczanowanej tyrozyny, a niektóre zawierają jeszcze reszty hydroksylowanej proliny. do tej grupy mają jedną lub dwie hydroksylowane reszty proliny, a u wielu z nich, co najmniej jedna reszta hydroksyproliny jest podstawiona liniowym łańcuchem pentozowym utworzonym przez trzy reszty arabinozy (Ryc. 1). Do tej samej grupy zaliczane są również peptydy zawierające co najmniej jedną siarczanowaną resztę tyrozyny. Niektóre z tych peptydów oprócz zmodyfikowanej reszty tyrozyny mają także hydroksylowane i arabinozylowane reszty proliny. Drugą grupę stanowią nieco większe peptydy/polipeptydy zawierające od kilku do kilkunastu reszt cysteiny. Peptydy należące do tej grupy są nazywane peptydami bogatymi w cysteinę CRP (ang. Cysteine-Rich Peptides) [4,6]. Oprócz peptydów współtworzących powyższe dwie grupy, w różnych roślinach zidentyfikowano jeszcze szereg innych peptydów, których nie można zaklasyfikować do żadnej z tych grup [6,7]. Jako przykłady można tu wymienić peptydy odgrywające rolę endogennych elicytorów, czy peptydy podobne do zwierzęcych peptydów natriuretycznych. W rozpoznawaniu dotąd zbadanych peptydów sygnałowych roślin pośredniczą błonowe białka receptorowe obejmujące serynowo/treoninowe kinazy białkowe typu RLK (ang. Receptor-Like Kinases) oraz białka receptorowe typu RLP (ang. Receptor-Like Proteins). W tym miejscu warto przypomnieć, że genom rzodkiewnika zawiera 443, a ryżu 786 genów kodujących błonowe kinazy białkowe typu RLK [8]. Prawie połowa, bo aż 216 kinaz typu RLK rzodkiewnika w części zewnątrzkomórkowej wiążącej ligand ma domenę utworzoną z kilku do kilkudziesięciu powtórzeń bogatych w reszty leucyny typu LRR (ang. Leucine-Rich Repeat) [9]. Dzisiaj już wiadomo, że do tej grupy kinaz RLK, określanej skrótowo jako kinazy typu LRR-RLK, należy większość kinaz białkowych funkcjonujących w percepcji peptydów sygnałowych. Co jednak ciekawe, w wielu przypadkach kompleksy receptorowe współtworzą jeszcze białka z rodziny RLP, w rzodkiewniku kodowane przez 57, a w ryżu przez 90 genów [10]. Również te białka w domenie zewnątrzkomórkowej mają od 2 do 49 powtórzeń LRR, jednakże za helisą transbłonową zamiast domeny kinazowej mają skierowane do cytoplazmy krótkie przedłużenie C-końcowe. W tej części niektóre białka typu RLP mają motyw skierowujący do internalizacji na drodze endocytozy, zaś u innych występuje motyw pośredniczący w wiązaniu białka z kotwicą glikozylofosfatydyloinozytolową (GPI). Celem niniejszego artykułu było podsumowanie wyników dotychczasowych badań poświęconych peptydom sygnałowym z pierwszej grupy, nazywanym umownie małymi peptydami modyfikowanymi potranslacyjnie. Obecnie grupa ta obejmuje cztery rodziny peptydów (CLE, IDA/IDL, CEP, HypSys) zawierających hydroksylowane reszty proliny i arabinozylowane reszty hydroksyproliny, a ponadto jedną rodzinę peptydów (PSK) zawierających dwie siarczanowane reszty tyrozyny oraz dwie rodziny peptydów (PSY, RGF/CLEL/GLV), które oprócz siarczanowanej reszty tyrozyny mają jeszcze hydroksylowane reszty proliny i arabinozylowane reszty hydroksyproliny. Wszystkie małe peptydy modyfikowane potranslacyjnie są wycinane proteolitycznie w apoplaście z probiałek sekrecyjnych, gdzie następnie funkcjonują jako aktywne cząsteczki sygnałowe działające na ogół parakrynnie w niewielkich odległościach od miejsca syntezy ich preprobiałek. Poznano także nieliczne przykłady działania autokrynnego, a także przykłady peptydów funkcjonujących systemowo, tak jak to jest w przypadku peptydów CLE roślin bobowatych (motylkowatych) pośredniczących w regulacji liczby formujących się na korzeniach brodawek. Czytelnikowi zainteresowanemu peptydami sygnałowymi roślin polecamy prace przeglądowe opublikowane w czasopismach o zasięgu ogólnoświatowym [2,6,11-13], szczególnie zaś prace opublikowane w ostatnim czasie [4,7,14-16]. RODZINA PEPTYDÓW CLE Nazwa tej najliczniejszej rodziny peptydów sygnałowych pochodzi od genu CLAVATA3 (CLV3) rzodkiewnika i genów ESR (ang. Endosperm Surrounding Region) kukurydzy. Gen CLV3 zidentyfikowano w latach 90-tych ubiegłego wieku w badaniach merystemu wierzchołkowego pędu, zaś trzy geny ESR poznano w doświadczeniach prowadzonych na nasionach kukurydzy. Wszystkie cztery geny CLE (ang. Clavata3/ESR) kodują małe białka sekrecyjne, które w części C-końcowej mają charakterystyczny 14-aminokwasowy motyw, nazwany motywem CLE [13,17]. Z czasem okazało się, że genom rzodkiewnika zawiera 32 geny AtCLE kodujące aminokwasowe białka sekrecyjne zawierające co najmniej jeden motyw CLE (Ryc. 2). Po dokładniejszej analizie sekwencji aminokwasowej motywu CLE w poszczególnych 342

3 Rycina 2. Porównanie sekwencji aminokwasowej motywu CLE w 32 białkach AtCLE rzodkiewnika (na podstawie prac [11,17,21]). białkach okazało się, że 32 probiałka dają w sumie tylko 26 różnych peptydów sygnałowych, gdyż w kilku probiałkach sekwencja aminokwasowa motywu CLE jest identyczna. Tak jest w przypadku par probiałek CLE5 i CLE6, CLE9 i CLE10 oraz CLE41 i CLE44. Peptydy o identycznej sekwencji dają również probiałka CLE1, 3 i 4 (Ryc. 2) [17]. W innych roślinach rodzina genów CLE jest jeszcze liczniejsza i np. genom ryżu zawiera 47, a u soi jest 67 genów CLE [16,18]. Ponadto okazało się, że w genomie ryżu, pszenicy i lucernie występują geny CLE kodujące białka z dwoma, czterema, a nawet sześcioma motywami CLE [16,19]. Wszystkie preprobiałka AtCLE rzodkiewnika mają na N-końcu peptyd sygnałowy kierujący probiałko do światła siateczki śródplazmatycznej, gdzie reszty proliny w pozycji czwartej i siódmej motywu CLE są hydroksylowane. W genomie rzodkiewnika zidentyfikowano co najmniej sześć genów kodujących 4-hydroksylazę proliny, enzym podobny do zwierzęcej hydroksylazy modyfikującej m. in. kolagen [20]. W reakcji hydroksylacji proliny kosubstratami są tlen i 2-ketoglutaran, a produktami, oprócz hydroksylowanego probiałka, są bursztynian i CO 2, zaś sama reakcja hydroksylacji zachodzi z udziałem jonu Fe 2+ w obecności askorbinianu utrzymującego jon żelaza w formie zredukowanej. Arabinozylacja probiałka w aparacie Golgiego przebiega przypuszczalnie z udziałem dwóch różnych arabinozylotransferaz [6]. Pierwsza z nich miałaby przyłączać resztę arabinozy do grupy hydroksylowej w hydroksyprolinie, natomiast druga miałaby dodawać kolejne dwie reszty arabinozy połączone wiązaniem β-1,2. Tak zmodyfikowane probiałko w transporcie pęcherzykowym jest wydzielane do apoplastu, gdzie zostaje z niego wycięty proteolitycznie aktywny peptyd. W doświadczeniach wykorzystujących ekstrakty białkowe z kwiatostanu kalafiora wykazano, że w probiałku CLV3 niezidentyfikowana proteaza hydrolizuje wiązanie peptydowe poprzedzające resztę argininy-70, pierwszy aminokwas w motywie CLE (Ryc. 2) [14]. Miejsce cięcia wyznaczają reszty aminokwasów kwaśnych poprzedzające o dwa- lub trzy miejsca kluczową resztę argininy. Wycięty w ten sposób oligopeptyd CLE ma jeszcze w części C-końcowej kilka do kilkunastu reszt aminokwasowych, które, jak się przypuszcza, są usuwane przez karboksypeptydazę SOL1 [14]. Poznane w roślinach geny CLE w liczbie 179 podzielono w oparciu o analizy genetyczne na 13 grup [19], natomiast biorąc pod uwagę zakładaną funkcję, peptydy AtCLE rzodkiewnika podzielono na 4 grupy (A-D) (Ryc. 2) [17,21]. Peptydy z pierwszej grupy miałyby funkcjonować w regulacji merystemu wierzchołkowego pędu i korzenia, a także miałyby uczestniczyć w regulacji różnicowania protoksylemu. Peptydy tworzące drugą grupę miałyby hamować aktywność merystemów, natomiast peptydy trzeciej grupy miałyby brać udział w regulacji różnicowania komórek przewodzących. Rola peptydów z czwartej grupy na razie nie jest znana [11,16,22,23]. W tym miejscu warto jednakże podkreślić, że na obecnym etapie badań udało się poznać rolę zaledwie pięciu peptydów AtCLE rzodkiewnika (CLV3, CLE40, CLE40/44, CLE8, CLE45). Poszukiwania funkcji poszczególnych peptydów napotykają na szereg zasadniczych trudności. Wynikają one m. in. ze stosunkowo niskiego poziomu ekspresji poszczególnych genów. Również analizy zmian fenotypowych, jakie towarzyszą nadekspresji, czy śledzenie zmian wynikających z obniżenia poziomu poszczególnych transkryptów lub zmian związanych z różnymi mutacjami na ogół nie prowadzą do ostatecznych i jednoznacznych konkluzji. Wydaje się, że źródłem większości problemów jest powszechna redundancja funkcjonalna genów CLE. UDZIAŁ CLV3 W REGULACJI MERYSTEMU WIERZCHOŁKOWEGO PĘDU Merystem wierzchołkowy pędu (SAM, ang. Shoot Apical Meristem) jest strukturą dynamiczną, w której zachodzą dwa przeciwstawne procesy, proces inicjacji organów (liści, kwiatów, pędów bocznych czy międzywęźli) oraz proces samoodnawiania populacji komórek macierzystych w centrum organizacyjnym utrzymujący liczbę komórek na stałym poziomie. Dzisiaj już wiadomo, że aktywność merystemu wierzchołkowego pędu jest regulowana przez produkty wielu genów, których ekspresja jest ograniczona do niewielkich regionów merystemu, określanych jako nisze komórkowe SAM. Tak jest również w przypadku genu kodującego peptyd sygnałowy CLAVATA3 (CLV3) oraz genów, których produkty białkowe pośredniczą w jego percepcji, a także genu WUSCHEL (WUS) kodującego czynnik transkrypcyjny z domeną homeotyczną, końcowy element szlaku/szlaków sygnałowego [11,15,23,24]. Gen AtCLV3 koduje preprobiałko zbudowane z 96 reszt aminokwasowych z składającym się z 18 reszt aminokwasowych peptydem sygnałowym i motywem CLE położonym w części C-końcowej (Ryc. 2). Ekspresja AtCLV3 zachodzi w komórkach apikalnych strefy centralnej merystemu i w zasadzie ogranicza się do komórek warstwy L1 i L2 (Ryc. 3A). Probiałko CLV3 bądź wycięty z niego, składający się z 12- lub 13 reszt aminokwasowych, arabinozylowany peptyd CLV3 migruje w apoplaście w kierunku bocznym merystemu wierzchołkowego oraz w dół w kierunku centrum organizacyjnego [25-27]. Tutaj CLV3 oddziałuje z domeną LRR receptorowej kinazy białkowej CLAVATA1 (CLV1) [28], a przypuszczalnie także z innymi białkami receptorowymi pośredniczącymi w jego percepcji. W tym miejscu warto zauważyć, iż w obrębie merystemu wierzchołkowego pędu ekspresji ulegają jeszcze inne geny CLE, które również w jakiś sposób uczestniczą w regulacji SAM [15,22,23]. Postępy Biochemii 60 (2)

4 Rycina 3. Pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego CLV3/WUS (A) i pętla dodatniego sprzężenia zwrotnego cytokinina/wus (B) w regulacji merystemu wierzchołkowego pędu. Szczegóły opisano w tekście (na podstawie prac [16,23,24]). Kinaza białkowa CLV1 jest typową receptorową, serynowo/treoninową kinazą białkową typu LRR-RLK, w której domenę zewnątrzkomórkową wiążącą ligand tworzy 21 powtórzeń bogatych w leucynę (LRR) [8,9]. Jednakże już od początku badań zaczęto przypuszczać, że właściwym receptorem wiążącym peptyd CLV3 jest heteromer CLV1/ CLV2 ponieważ mutanty clv3, clv1 i clv2 fenotypowo są bardzo podobne (silnie rozbudowany region centralny merystemu) [1]. CLV2 jest białkiem typu RLP (ang. Receptor-Like Protein) z domeną zewnątrzkomórkową LRR utworzoną przez 21 powtórzeń bogatych w reszty leucyny, w którym za helisą transbłonową, zamiast domeny kinazowej, występuje zbudowane z 27 reszt aminokwasowych przedłużenie cytoplazmatyczne [1]. Pierwotne sugestie dotyczące udziału CLV2 w percepcji CLV3 są obecnie poddawane w wątpliwość, zwłaszcza po tym jak się okazało, że kinaza CLV1 po związaniu peptydu CLV3 ulega endocytozie, podczas gdy poziom CLV2 w błonie nie ulega istotnym zmianom [29]. Poszukiwania właściwego receptora/receptorów CLV3 okazały się jeszcze bardziej skomplikowane po wyselekcjonowaniu mutanta sol2 fenotypowo podobnego do mutanta clv2 [30]. Sklonowany gen SOL2 (ang. Suppressor of Overexpression of LLP1-2) okazał się tożsamy z poznanym wcześniej genem CORYNE (CRN) [31]. Białko CRN/SOL2 jest cytoplazmatyczną kinazą białkową zakotwiczoną w błonie plazmatycznej za pośrednictwem pojedynczej helisy transbłonowej, w którym zwrócone na zewnątrz komórki krótkie przedłużenie N-końcowe odgrywa ważną rolę w wewnątrzkomórkowej relokacji białka [31]. Białko CRN/ SOL2 występuje w błonach siateczki sródplazmatycznej samodzielnie bądź tworzy heterokompleksy z białkiem CLV2. W tworzeniu heterokompleksów CRN/CLV2 migrujących z siateczki do błony plazmatycznej pośredniczą odcinki transbłonowe oraz zewnątrzkomórkowy odcinek N-końcowy CRN/SOL2 [32,33]. Można zatem przypuszczać, że właściwym receptorem CLV3 jest heterokompleks CLV1/ CRN/CLV2 (Ryc. 3A), w którym CNR/SOL2 jako nieaktywna pseudokinaza pełni przypuszczalnie funkcję białka rusztowaniowego [33-35]. Wątpliwości dotyczące budowy kompleksów receptorowych wiążących CLV3 pogłębiły się jeszcze bardziej po wyselekcjonowaniu mutanta cli1 (ang. clv3 peptide insensitive1) rzodkiewnika niewrażliwego na syntetyzowany chemicznie peptyd CLV3 (mclv3). Fenotyp tego mutanta jest addytywny z fenotypami clv1 i clv2, a zmutowany gen koduje kinazę receptorową typu LRR-RLK tożsamą z poznaną wcześniej kinazą RPK2/TOAD2 [36]. Ponieważ RPK2 nie oddziałuje z kinazą CLV1 i białkiem CLV2, natomiast tworzy w błonie plazmatycznej formy homooligomeryczne, dlatego przypuszcza się, że kinaza RPK2 współtworzy samodzielne kompleksy receptorowe. Ponadto, w rozpoznawaniu CLV3 miałyby jeszcze pośredniczyć kinazy receptorowe BAM1/2 typu LRR-RLK poznane u mutantów bam1 i bam2 (ang. barely any meristem1), które wg autorów miałyby wiązać peptyd w regionach bocznych merystemu, współtworząc w ten sposób strefę buforową białek receptorowych sprzyjającą właściwej organizacji merystemu [35,37]. Wprawdzie niemal od początku badań było wiadome, że końcowym elementem szlaku/szlaków sygnałowego aktywowanego przez CLV3 jest gen WUSCHEL (WUS), to nadal niewiele wiadomo na temat białkowych elementów współtworzących szlak/szlaki sygnałowe [24]. W latach 90. poznano fosfatazę białkową KAPP i małe białko G typu Rop, jako składniki kompleksu receptorowego współtworzonego z kinazą CLV1 [1], zaś w ostatnich latach zidentyfikowano fosfatazę białkową POLTERGEIST (POL) oraz podobną do niej fosfatazę POL-like, enzymy zakotwiczone w błonie plazmatycznej aktywowane przez fosfatydyloinozytolo-4 fosforan (Ryc. 3A) [38]. W najnowszych doświadczeniach zidentyfikowano jeszcze białko Ga heterotrimerycznych białek G, które miałoby współdziałać z kinazami typu RLK [39]. Potwierdzono również udział w szlaku sygnałowym kinaz białkowych MAKK4 i MPK6 tworzących kaskadę kinaz MAP [40]. WUSCHEL jest niewielkim, składającym się z 291 reszt aminokwasowych białkiem zawierającym w części N-końcowej nieco zmienioną homeodomenę [41]. Ekspresja WUS ogranicza się do niewielu komórek w regionie centralnym merystemu obejmującym przede wszystkim komórki tworzące tzw. centrum organizacyjne merystemu (Ryc. 3A). Mutant wus charakteryzuje się niemal całkowitym zanikiem komórek rdzenia położonych w regionie centralnym merystemu, podczas gdy u mutantów clv3, clv1, clv2 ten sam region jest bardzo silnie powiększony. Wyniki tych obserwacji dowodzą, że wiązanie CLV3 do kompleksu receptorowego aktywuje 344

5 szlak sygnałowy hamujący ekspresję genu WUS [24]. W ostatnich latach dowiedziono, że czynnik transkrypcyjny WUS odgrywa podwójną rolę, gdyż w stosunku do wielu genów pełni funkcję represyjną, np. względem CLV1, natomiast w stosunku do innych genów, w tym m. in. do genu CLV3 jest aktywatorem [41,42]. Przez wiele lat nie było jasne jak czynnik transkrypcyjny WUS, syntetyzowany w komórkach centrum organizacyjnego, może aktywować ekspresję genu CLV3 w komórkach apikalnych merystemu. Dopiero niedawno odkryto, że białko WUS przenika poprzez plazmodesmy z komórki do komórki, migrując w ten sposób symplastem aż do komórek apikalnych merystemu, gdzie aktywuje ekspresję CLV3 [43]. Syntetyzowane probiałko CLV3 ulega modyfikacji potranslacyjnej, a następnie w transporcie pęcherzykowym zostaje wydzielone do apoplastu, gdzie staje się źródłem aktywnego peptydu. Peptyd CLV3 przemieszcza się w głąb i w kierunkach bocznych merystemu, a po dotarciu do komórek położonych w warstwach korowych merystemu aktywuje zlokalizowane w błonach plazmatycznych receptory. Aktywacja szlaku sygnałowego prowadzi do zahamowania ekspresji genu WUS i ograniczenia podziałów komórek w regionie centralnym merystemu. Tworząca się w ten sposób pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego CLV3/WUS stanowi istotę mechanizmu regulacyjnego, który utrzymuje równowagę pomiędzy zachodzącym nieprzerwalnie odtwarzaniem komórek centrum organizacyjnego a przebiegającym równolegle w tym samym regionie procesem różnicowania komórek [24,44]. Pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego CLV3/WUS jest elementem szerszego mechanizmu regulacyjnego, w którym uczestniczą również cytokininy i auksyny [24]. Mimo że rola tych fitohormonów w regulacji SAM jest dopiero poznawana, to już wyniki dotychczasowych doświadczeń pokazują, że na pętlę regulacyjną CLV3/WUS nakłada się pętla pozytywnego sprzężenia cytokininy/wus (Ryc. 3B). Okazało się bowiem, że cytokinina aplikowana na merystem wierzchołkowy aktywuje ekspresję WUS i hamuje ekspresję CLV1. Ponadto wykazano, że w komórkach epidermy, w apikalnej części merystemu, ekspresji ulega gen LOG4 kodujący jeden z enzymów szlaku biosyntezy cytokinin, a spływająca w głąb merystemu fala cytokininowa aktywuje ekspresję WUS, działając w ten sposób przeciwstawnie do CLV3 [24]. Miejsce ekspresji WUS pokrywa się z miejscem ekspresji genu AHK4 kodującego receptorową histydynowo/asparaginianową kinazę białkową, jedno z czterech białek receptorowych cytokinin. Ponadto czynnik transkrypcyjny WUS aktywuje ekspresję genów kodujących białka nazywane ogólnie regulatorami odpowiedzi klasy A, które w cytokininowych szlakach sygnałowych funkcjonują jako białka represorowe, zaś ekspresję tych samych genów hamują auksyny w szlaku zależnym od czynnika transkrypcyjnego ARF5/MONOPTEROS [24]. ROLA CLE40 W ORGANIZACJI MERYSTEMU WIERZCHOŁKOWEGO KORZENIA Analizy ekspresji genów AtCLE rzodkiewnika pokazały, że spośród 32 genów aż 20 ulega ekspresji w korzeniu, z tego 9 genów AtCLE ulega aktywacji w merystemie wierzchołkowym korzenia (RAM) (ang. Root Apical Meristem) (Ryc. 4) [11,22,23]. Nadekspresja niektórych genów, podobnie jak aplikacja na korzeń odpowiednich peptydów syntetyzowanych chemicznie, prowadzi na ogół do zahamowania wzrostu korzenia oraz powoduje wystąpienie wyraźnych zmian w merystemie wierzchołkowym. Jednakże podwyższona ekspresja niektórych genów CLE u mutantów clv2, crn/sol i rpk2 bądź aplikacja odpowiednich peptydów syntetyzowanych chemicznie nie powoduje podobnych zmian fenotypowych, co sugeruje, że białka receptorowe, poznane wcześniej w merystemie wierzchołkowym pędu, biorą również udział w percepcji peptydów CLE w korzeniu [45,46]. Wyniki szczegółowych analiz pokazują, że badane peptydy CLE wpływają na różnicowanie komórek merystemu, natomiast nie wpływają na podziały komórek o niskiej aktywności mitotycznej tworzących tzw. centrum spoczynkowe QC (ang. Quiescent Centre) i nie wpływają na różnicowanie komórek kolumelli [11,23,46]. Inaczej jest w przypadku peptydu AtCLE40, który pośredniczy w procesie odnawiania komórek macierzystych kolumelli. Ekspresja AtCLE40 zachodzi w różnicujących się komórkach potomnych kolumelli, w regionie poniżej centrum spoczynkowego, a jego nadekspresja lub aplikacja peptydu syntetyzowanego chemicznie promuje różnicowanie komórek kolumelli [47]. Mutant cle40 charakteryzuje się skróconym i poskręcanym korzeniem oraz ma zwiększoną liczbę komórek macierzystych kolumelli. Pojawienie się dodatkowych komórek macierzystych ma ścisły związek z rozszerzoną u tego mutanta ekspresją genu WOX5 (ang. WUSCHEL-related HOMEOBOX5) [47]. W roślinach linii dzikiej gen WOX5 ulega ekspresji w komórkach QC, natomiast u mutanta cle40 jego transkrypty pojawiają się również w sąsiednich komórkach. Mutacje w genie WOX5 prowadzą do różnicowania komórek macierzystych kolumelli do komórek kolumelli, Rycina 4. Udział peptydów CLE w regulacji merystemu wierzchołkowego korzenia. Białka receptorowe RPK2, CLV2, CRN przypuszczalnie pośredniczą w percepcji dziewięciu peptydów AtCLE funkcjonujących w regulacji merystemu wierzchołkowego korzenia. Peptyd AtCLE40 produkowany w komórkach kolumelli jest wiązany przez kinazy białkowe ACR4 i CLV1 zlokalizowane w błonach komórek centrum spoczynkowego (QC), gdzie aktywują szlak sygnałowy hamujący ekspresję genu WOX5 (na podstawie prac [7,11,22,23,46,55]). Postępy Biochemii 60 (3)

6 natomiast u osobników z podwyższoną ekspresją WOX5 obserwuje się zahamowanie różnicowania [47]. Wyniki wstępnych doświadczeń sugerowały, że receptorem peptydu CLE40 jest receptorowa kinaza białkowa ACR4 (ang. ARABIDOPSIS CRINKLY4) kodowana przez jeden z pięciu genów AtCRR rzodkiewnika, którego ekspresja zachodzi w komórkach macierzystych kolumelli [47]. Jednakże wyniki ostatnim badań pokazują, że w komórkach macierzystych kolumelli ekspresji ulega także gen AtCLV1, a produkty genów ACR4 i AtCLV1 oddziałują pomiędzy sobą [48]. W tym miejscu warto zwrócić uwagę, iż kinazy AtCRR nie należą do podrodziny LRR-RLK, bowiem domenę zewnątrzkomórkową tworzą u nich dwa motywy, a mianowicie: motyw podobny do motywu wiążącego TNF w receptorach ssaków oraz motyw utworzony z siedmiu 39-aminokwasowych powtórzeń (powtórzenia crinkly) tworzących strukturę wiatraczka. Ponadto ujawniono, że wiązanie AtCLE40 do kompleksu receptorowego kieruje obie kinazy do wakuoli litycznych. Co równie ciekawe, kinaza ACR4, a w mniejszym stopniu także AtCLV1, występują w formie homo- lub heterooligomerów w błonach plazmodesm [48]. W konkluzji dotychczasowych badań można zatem stwierdzić, że wiązanie peptydu AtCLE40 do heterokompleksu ACR4/AtCLV1 aktywuje szlak sygnałowy, który hamuje ekspresję WOX5, wpływając w ten sposób na różnicowanie komórek macierzystych położonych poniżej QC. Jednakże ekspresja WOX5 w merystemie wierzchołkowym korzenia, podobnie jak ekspresja WUS w merystemie wierzchołkowym pędu, jest regulowana także przez cytokininy i auksyny [49]. W tym wypadku regulatory odpowiedzi cytokininowych typu B (ARR1 i ARR12), funkcjonujące jako elementy pozytywne szlaków cytokininowych, hamują ekspresję genu LAX2 kodującego białko importujące auksyny do komórki, co w efekcie prowadzi do hamowania ekspresji WOX5 [49]. PEPTYDY CLE41/44/TDIF W REGULACJI RÓŻNICOWANIA WIĄZEK PRZEWODZĄCYCH W badaniach prowadzonych na kulturach komórkowych cynii poświęconych różnicowaniu komórek mezofilowych w wiązki przewodzące, z płynu hodowlanego wyizolowano peptyd TDIF (ang. Tracheary Element Differentiation Inhibitory Factor), który hamuje różnicowanie komórek prokambialnych [50]. Sklonowany gen TDIF koduje zbudowane ze 132 reszt aminokwasowych białko sekrecyjne, z którego wycinany jest składający się z 12 reszt aminokwasowych aktywny peptyd o sekwencji identycznej z sekwencją peptydów AtCLE41/CLE44 i podobnej do sekwencji peptydów AtCLE42 i AtCLE46 rzodkiewnika (Ryc. 2) [17]. W badaniach prowadzonych na rzodkiewniku wykazano, że białko AtCLE41 jest syntetyzowane w komórkach floemu, a wycinany w apoplaście peptyd AtCLE41 migruje do prokambium (kambium), gdzie aktywuje podziały komórek prokambialnych (kambialnych), natomiast hamuje różnicowanie kambium do komórek ksylemu (Ryc. 5) [51]. W kolejnych doświadczeniach wykorzystujących technikę mutacji T-DNA udało się wyselekcjonować trzy mutanty niewrażliwe na peptyd AtCLE41/TDIF. Okazało się, że wszystkie trzy mutacje dotyczą tego samego genu TDR (ang. TDIF Receptor) kodującego receptorową kinazę białkową typu LRR- -RLK [51]. Kinaza TDR okazała się tożsama z kinazą PXY (ang. Phloem Intercalated with Xylem) poznaną wcześniej u mutanta z zaburzoną polarnością podziałów komórek kambium. Ekspresja genu TDR/PXY zachodzi tylko w komórkach prokambium (kambium), a zlokalizowana w błonach plazmatycznych kinaza białkowa pośredniczy w percepcji przemieszczającego się w apoplaście peptydu AtCLE41/ TDIF (Ryc. 5). Aktywacja szlaku/szlaków sygnałowego stymuluje podziały komórek prokambium (kambium) i hamuje różnicowanie ksylemu, przy czym kierunek migracji peptydu AtCLE41/TDIF w apoplaście ma istotne znaczenie dla właściwej orientacji podziałów komórek kambium [52]. Na razie nie znamy szlaku sygnałowego aktywowanego przez TDR/PXY, natomiast wiadomo, że końcowym jego elementem jest gen WOX4 (ang. WUSCHEL-related HOMEOBOX4) [21,52]. W genomie rzodkiewnika zidentyfikowano piętnaście genów WOX, ale w komórkach kambium peptyd AtC- LE41/TDIF aktywuje ekspresję tylko WOX4 i WOX14 [53]. Warto w tym miejscu zauważyć, że w przeciwieństwie do merystemów wierzchołkowych pędu i korzenia, w których peptydy AtCLV3 i AtCLE40 hamują ekspresję WUS i WOX5, w komórkach kambium AtCLE41/TDIF aktywuje ekspresję WOX4. Aktywacja genu WOX4 prowadzi do wzrostu częstotliwości podziałów komórek kambium, natomiast hamowanie różnicowania kambium do ksylemu jest niezależne od WOX4 i WOX14, chociaż zależne od aktywacji kinazy TDR/PXY przez AtCLE41/TDIF [53]. Wyniki innych doświadczeń sugerują, że w hamowaniu różnicowania ksylemu może być zaangażowany peptyd AtCLE10 [54,55]. W tym wypadku peptyd AtCLE10 blokuje ekspresję genów ARR5 i ARR6 kodujących regulatory odpowiedzi klasy A funkcjonujące jako represory szlaków cytokininowych. Ponadto wiadomo, że formowanie prokambium/kambium aktywują auksyny [56], a wyniki prowadzonych obecnie doświadczeń wykazały, że ekspresja Rycina 5. Szlak sygnałowy AtCLE41/TDIF TDR/PXY WOX4 w regulacji proliferacji komórek kambium. Peptyd AtCLE41, produkowany w komórkach floemu, wiązany jest przez kinazę białkową TDR/PXY zlokalizowaną w błonach komórek prokambium (kambium). Aktywacja szlaku sygnałowego stymuluje proliferację komórek kambium poprzez aktywację genu WOX4. Kinaza receptorowa TDR/PXY aktywuje również inny szlak sygnałowy, który hamuje różnicowanie komórek ksylemu (na podstawie prac [11,15,21,54,57])

7 WOX4 jest również aktywowana przez auksyny w szlaku zależnym od kinazy TDR/PXY [54,57]. ROLA PEPTYDU CLE8 W REGULACJI ROZWOJU ZARODKA I ENDOSPERMU Mechanizmy molekularne koordynujące program genetyczny regulujący rozwój poszczególnych elementów nasiona takich jak zarodek, bielmo oraz łupina nasienna są jeszcze bardzo słabo poznane. Jednakże wyniki doświadczeń prowadzonych na rzodkiewniku opublikowane w ostatnim czasie pokazują, że w regulacji rozwoju poszczególnych części nasiona uczestniczy peptyd AtCLE8 [58]. Ekspresja genu AtCLE8 zachodzi wyłącznie w młodym zarodku oraz w bielmie, a peptyd AtCLE8 wpływa na proliferację i wzrost elongacyjny komórek. AtCLE8 pośredniczy w ten sposób w regulacji podstawowego wzorca podziałów komórkowych, co zapewnia synchronizowane w czasie różnicowanie poszczególnych części nasiona. Przypuszcza się, że w percepcji AtCLE8 bierze udział receptorowa kinaza białkowa HAIKU2 (IKU2) typu LRR- -RLK. Ekspresja AtIKU2 zachodzi w bielmie rozwijających się nasion, a mutacje iku2 prowadzą do powstawania mniejszych zarodków i mniejszych nasion. Wydaje się, że końcowym elementem szlaku sygnałowego jest gen WOX8 (ang. WUSCHEL-related HOMEOBOX8), którego ekspresja w kilku komórkach bielma (mikropyle) jest aktywowana przez AtCLE8. Zarodki mutanta wox8 mają nieregularne płaszczyzny podziału komórek, a ich komórki są powiększone i zniekształcone. Tak więc, wyniki wstępnych badań sugerują, że peptyd AtCLE8 aktywujący układ IKU2 WOX8 wpływa pozytywnie na wzrost oraz ogólny rozwój nasion [58]. PEPTYD CLE45 W ODDZIAŁYWANIU ŁAGIEWKI PYŁKOWEJ ZE ZNAMIENIEM W doświadczeniach prowadzonych na kulturach łagiewek pyłkowych rzodkiewnika wykazano, że syntetyzowany chemicznie peptyd AtCLE45 promuje wzrost łagiewek [59]. W poszukiwaniach białka receptorowego zidentyfikowano dwa geny SKM1 i 2 (ang. Sterility Regulating Kinase Member 1/2) kodujące kinazy receptorowe typu LRR-RLK. W temperaturze 22 o C ekspresja genu SKM1 zachodzi w znamieniu, natomiast w temperaturze 30 o C obejmuje również tkankę transmisyjną. Zakłócenie szlaku sygnałowego AtCLE45 SKM1/SKM2 prowadzi do zmniejszenia liczby nasion w temperaturze 30 o C, natomiast nie wpływają na ich liczbę w temperaturze 22 o C. Ponadto wykazano, że AtC- LE45 powoduje zwolnienie tempa rozpadu mitochondriów w łagiewkach, co sugeruje, że szlak sygnałowy aktywowany przez badany peptyd promuje proces zapłodnienia w wyższej temperaturze [59]. PEPTYDY CLE ROŚLIN BOBOWATYCH W AUTOREGULACJI BRODAWKOWANIA W pracy przeglądowej opublikowanej w Postępach Biologii Komórki w 2012 roku podsumowano wyniki poszukiwań receptorów wiążących czynniki nodulacji, które aktywują szlaki sygnałowe regulujące symbiozę brodawkową [60]. Wyniki tych badań pokazują, że zarówno infekowanie roślin bobowatych (motylkowatych) przez bakterie glebowe z grupy ryzobiów, jak również sam proces organogenezy brodawek korzeniowych są regulowane przez szlaki sygnałowe aktywowane przez receptory cząsteczek lipochitooligosacharydowych syntetyzowanych przez bakterie. Wnikające do formujących się brodawek korzeniowych bakterie są otaczane błoną peribakteroidalną, a po przekształceniu w bakteroidy rozpoczynają w symbiosomach redukcję N 2 do amoniaku. Katalizowana przez kompleks nitrogenazy redukcja azotu do dwóch cząsteczek amoniaku (N 2 2NH 3 ) jest reakcją niezwykle energochłonną zużywającą 8 cząsteczek zredukowanej ferredoksyny i 16 cząsteczek ATP. Ponieważ cały wydatek energetyczny związany z redukcją N 2 ponosi roślina, dlatego już niemal od początku badań stawiano pytania o bilansowanie energetyczne roślin wchodzących w symbiozę brodawkową. Z czasem zaczęto zakładać, że u roślin wchodzących w symbiozę musi funkcjonować mechanizm regulacyjny pozwalający ograniczać liczbę brodawek do możliwie najmniejszego poziomu, ale optymalnego dla rozwoju i wzrostu rośliny. Wiadomo, że w regulacji liczby brodawek kluczowe znaczenie ma zawartość w glebie związków azotowych, a regulacja brodawkowania na poziomie lokalnym jest ściśle zależna od zmian stężenia niektórych fitohormonów, głównie zaś etylenu, kwasu abscysynowego i jasmonianu [61]. Jednakże już w latach 80. ubiegłego wieku dowiedziono eksperymentalnie, że oprócz regulacji lokalnej, liczba formujących się brodawek jest kontrolowana również systemowo w mechanizmie nazywanym autoregulacją, AON (ang. Autoregulation of Nodulation) [61,62]. Badania poświęcone regulacji systemowej brodawkowania rozpoczęły się od doświadczeń, w których korzenie rośliny bobowatej, rozdzielone na dwie części, umieszczano w oddzielnych pojemnikach, a następnie w różnym czasie infekowano ryzobiami [62]. Okazało się, że zainfekowanie bakteriami jednej części korzeni hamuje po pewnym czasie formowanie brodawek w drugiej części, mimo że obie części są połączone ze sobą jedynie za pośrednictwem nienaruszonego pędu. W podobnych doświadczeniach prowadzonych na komonicy (Lotus japonicus) wykazano, że warunkiem wystąpienia pełnego hamowania brodawkowania w jednej części korzenia jest co najmniej pięciodniowe opóźnienie w jej infekowaniu w stosunku do infekowania drugiej części [63]. Wyniki tych doświadczeń sugerowały, że sygnał pochodzący z zainfekowanej części korzeni dociera do pędu, a następnie powraca do drugiej części korzeni, gdzie hamuje organogenezę brodawek. Badania molekularne autoregulacji rozpoczęły się od selekcjonowania mutantów, w tym m. in. mutanta har1/sym78 (ang. hypernodulation abberrant root1) komonicy, u którego powstaje niemal czterokrotnie więcej brodawek korzeniowych. Wyniki doświadczeń polegających na szczepieniu pędu pochodzącego od mutanta Ljhar1 na korzeń rośliny dzikiej i odwrotnie pokazały, że nadmierna liczba brodawek powstaje wówczas, gdy zmutowany genotyp występuje w pędzie [64]. Podobne mutanty o zwiększonej liczbie brodawek wyselekcjonowano również u pozostałych trzech roślin modelowych, a mianowicie u lucerny (Medicago truncatula), soi (Glycine max) i grochu (Pisum sativum), powszechnie wykorzystywanych w badaniach molekularnych poświęconych symbiozie brodawkowej [61,62]. Po sklono- Postępy Biochemii 60 (3)

8 waniu zmutowanych genów LjHAR1, MtSUNN GmNARK1 i PsSYM29 okazało się, że ich produktami białkowymi są receptorowe serynowo/treoninowe kinazy białkowe typu LRR-RLK podobne do poznanej wcześniej kinazy AtCLV1 [61,62]. Analizy ekspresji GmNARK i LjHAR1 wykazały, że oba geny są aktywne w wiązkach naczyniowych, głównie w komórkach floemu liści, pędu, ale także w korzeniu i brodawkach [65]. W selekcjonowaniu kolejnych mutantów komonicy powiązanych z autoregulacją brodawkowania udało się poznać mutanta klv, którego fenotyp jest podobny do har1. Okazało się, że zmutowany gen LjKLAVIER (LjKLV) koduje receptorową kinazę typu LRR-RLK podobną do RPK2 rzodkiewnika [66]. W grochu wyselekcjonowano mutanta sym29 o zwiększonej liczbie brodawek, który ma zmieniony gen kodujący białko typu LRR-RLP homologiczne z LjCLV2 i AtCLV2 zlokalizowane głównie w błonach siateczki śródplazmatycznej [67]. Oddziaływanie LjKLV z LjHAR1 sugeruje, że obie kinazy mogą tworzyć heteromeryczne kompleksy receptorowe [66], zaś PsCLV2 i LjCLV2 może współdziałać z białkiem CRN, odpowiednikiem pseudokinazy AtCRN/SOL2 rzodkiewnika [67]. W poszukiwaniach potencjalnych ligandów aktywujących badane białka receptorowe, uwaga badaczy od początku kierowała się na geny z rodziny CLE. Najpierw w doświadczeniach prowadzonych na komonicy analizowano zmiany w ekspresji genów LjCLE, jakie towarzyszą inokulacji bakterią Mesorhizobium loti [68]. Okazało się, że spośród 39 analizowanych genów LjCLE, ekspresja tylko trzech genów, a mianowicie LjCLE-RS1, LjCLE-RS2 i LjCLE3 rośnie bardzo wyraźnie w korzeniu w szóstym dniu po inokulacji, przy czym ekspresję LjCLE-RS2 aktywuje również NO 3-. W doświadczeniach, w których analizowano efekty nadekspresji wyselekcjonowanych genów LjCLE wykazano, że podwyższona ekspresja LjCLE-RS1, LjCLE-RS2 w komonicy linii dzikiej prowadzi do wyraźnego zmniejszenia liczby brodawek, podczas gdy nadekspresja tych samych genów u mutanta har1-4 nie wywołuje podobnych efektów [68]. W podobnych doświadczeniach prowadzonych na lucernie wykazano, że już po 4 6 godzinach od inokulacji korzenia Sinorhizobium meliloti rośnie bardzo wyraźnie ekspresja genów MtCLE12 i MtCLE13 [69]. Ekspresja genu MtCLE13 zachodzi w korzeniu w miejscu infekcji, a także w komórkach głębszych warstw kory oraz w formujących się brodawkach [69]. Podobne doświadczenia prowadzono również na soi, której genom zawiera co najmniej 67 genów GmCLE [18]. W analizach ekspresji 47 genów GmCLE wykazano, że w 14-dniowych brodawkach aktywacji ulegają tylko geny GmRIC1 i GmRIC2 (ang. Rhizobia-Induced CLE1/2) [18], a gen GmNIC1 (ang. Nitrate-Induced CLE1) jest aktywowany przez NO 3 - [70]. Nadekspresja każdego z tych genów w roślinie linii dzikiej hamuje brodawkowanie, natomiast nie wpływa na liczbę tworzących się brodawek u mutanta nod4 ze zwiększoną liczbą brodawek [70]. Rycina 6. Porównanie sekwencji aminokwasowej peptydów CLE uczestniczących w autoregulacji brodawkowania (LjCLE-RS1 i LjC- LE-RS2 w komonicy, MtCLE12 i MtCLE13 w lucernie, GmRIC1, GmRIC2 i GmNIC1 w soi) (na podstawie pracy [70]). Wyniki powyższych doświadczeń sugerują, że wycinane z probiałek peptydy CLE (Ryc. 6) są ligandami dla poznanych wcześniej kinaz LjHAR1, MtSUNN, GmNARK1 zlokalizowanych w nadziemnej części rośliny [70]. Potwierdzają to również wyniki doświadczeń, w których do ogonków liściowych aplikowano ekstrakty z liści rośliny linii dzikiej oraz mutanta Gmnark soi. Wykazano w nich, że tylko ekstrakt z rośliny linii dzikiej wpływa hamująco na liczbę brodawek [71]. Na razie nie wiadomo jaka cząsteczka/cząsteczki sygnałowa jest produkowana w pędzie w odpowiedzi na aktywację receptorów wiążących peptydy CLE, chociaż niektóre wyniki pochodzące z analiz ekspresji genów sugerują, że taką cząsteczką może być kwas jasmonowy [61]. W ostatnim czasie udało się poznać dwa geny kodujące białka zlokalizowane w szlaku sygnałowym poniżej kinaz receptorowych wiążących peptydy CLE. U mutanta tml (ang. too much love) komonicy poznano gen, który w szlaku sygnałowym leży poniżej LjHAR1 i funkcjonuje w korzeniu [61]. W lucernie sklonowano gen MtRDN1 (ang. Root Determined Nodulation1) kodujący 357-aminokwasowe białko o nieznanej jeszcze funkcji, które również funkcjonuje w korzeniu w szlaku aktywowanym przez GmNARK [61]. INNE PEPTYDY ZAWIERAJĄCE MODYFIKOWANE RESZTY PROLINY PEPTYDY IDA/IDL W REGULACJI ODCINANIA ORGANÓW I PROMOWANIU WZROSTU ZAWIĄZKÓW KORZENI BOCZNYCH Odcinanie organów jest procesem zaprogramowanym genetycznie, który ma na celu usunięcie niepotrzebnych liści, kwiatów, owoców czy nasion, tak jak to ma miejsce np. w przypadku odcinania kwiatów po zapyleniu. Zrzucanie organów może także zachodzić w warunkach stresu, związanego np. z atakiem patogenów [72,73]. Oddzielanie komórek przebiega w niewielkiej strefie anatomicznej nazywanej strefą odcinania (AZ) (ang. Abscission Zone) utworzonej przez owalne komórki z gęstszą cytoplazmą. Pierwszym symptomem procesu odcinania jest zanikanie położonej pomiędzy warstwami komórek blaszki środkowej bogatej w pektyny. Tak więc, trawienie pektyn oraz innych składników ścian komórkowych przez odpowiednie enzymy, a następnie przebudowa ścian komórkowych po odcięciu organu przez inne enzymy stanowi istotę procesu oddzielania organu [73]. Badania molekularne poświęcone odcinaniu kwiatów rzodkiewnika rozpoczęły się od poznania kinazy białkowej RLK5 typu LRR-RLK zlokalizowanej w komórkach strefy odcinania [74]. W badaniach wykorzystujących technikę antysensu wykazano, że obniżenie poziomu RLK5 o około 90% prowadzi do wyraźnego upośledzenia w odcinaniu 348

9 kwiatów. Powiązanie kinazy RLK5 z procesem odcinania zadecydowało o przemianowaniu jej nazwy na HAESA (HAE) (łac. przylegać do Rycina 7. Motywy PIP i EPIP w białkach AtIDA/IDL rzodkiewnika (na podstawie prac [75,76]). czegoś). Z czasem okazało się, że genom rzodkiewnika zawiera jeszcze dwa paralogi HAE, a mianowicie geny HSL1 i HSL2 (ang. HAESA-LIKE1/2), ale w strefie odcinania kwiatów ekspresji ulegają tylko geny HAE i HSL2 [73]. W selekcjonowaniu mutantów rzodkiewnika z defektami w odcinaniu kwiatów udało się poznać mutanta ida (ang. inflorescence deficient in abscission) z kwiatami na trwale związanymi z rośliną, mimo normalnie wykształconej strefy odcinania [75]. Po sklonowaniu genu IDA okazało się, że produktem białkowym jest małe białko sekrecyjne (77 reszt aminokwasowych). Równolegle ujawniono, że genom rzodkiewnika zawiera jeszcze pięć genów IDA-like (IDL1 do 5) kodujących białka sekrecyjne (około 100 reszt aminokwasowych każde). Wszystkie poznane białka IDA/IDL w części C-końcowej mają zachowany w ewolucji, zbudowany z 12 reszt aminokwasowych, motyw PIP (prolina-izoleucyna- -prolina), w którym reszty proliny występują w układzie podobnym do peptydu CLV3, co może wskazywać, że również tutaj reszty proliny ulegają hydroksylacji (Ryc. 7) [76]. Dalsze szczegółowe badania wykazały, że aktywnymi peptydami są oligopeptydy, które oprócz motywu PIP mają jeszcze składającą się z 8 rezt aminokwasowych, zachowaną w ewolucji sekwencję poprzedzającą motyw PIP. Ostatecznie cały oligopeptyd (20 reszt aminokwasowych) wycinany z probiałek AtIDA/IDL nazwano EPIP (ang. Extendet PIP) (Ryc. 7). Analizy ekspresji poszczególnych genów IDA/ IDL wykazały, że IDA ulega ekspresji w strefie odcinania kwiatów, natomiast geny IDL są aktywne również w innych częściach rośliny, zwłaszcza tam, gdzie dochodzi do rozdzielania komórek [75,76]. Podwyższona ekspresja genu IDA, ale także genów IDL, prowadzi do przedwczesnego zrzucania kwiatów. Analizy fenotypowe mutantów ida i hae oraz hsl2 potwierdziły, że wszystkie trzy geny są epistatyczne, bowiem nadekspresja genu IDA u podwójnego mutanta haehsl2, pozbawionego obu kinaz receptorowych, nie zmienia fenotypu mutanta ida (całkowity zanik odcinania kwiatów). Wyniki tych doświadczeń prowadzą do wniosku, że IDA jest ligandem dla obu receptorowych kinaz białkowych HAE/HSL2 [76]. W szlaku sygnałowym poniżej receptorów HAE/HSL2 funkcjonuje kaskada kinaz MAP, w której występują kinazy MKK4/MKK5 i MPK3/MPK6 [77], zaś czynnikami transkrypcyjnymi bezpośrednio regulującymi geny funkcjonujące w procesie odcinania kwiatów są białka z rodziny KNOTTED zawierające kasety homeotyczne [73]. W ostatnim czasie udało się poznać jeszcze cztery inne geny, których produkty białkowe współdziałają z układem AtIDA HAE/HSL2 kinazy MAP [72,73]. Pierwszym poznanym białkiem jest NEVERSHED, białko z rodziny ARF- -GAP regulujące małe białka G z rodziny ARF funkcjonujące w transporcie pęcherzykowym. Poznano też dwie błonowe kinazy białkowe EVERSHED (EVR) i SERK1, które modyfikują aktywność kinaz HAE/HSL2 oraz cytoplazmatyczną kinazę białkową CAST AWAY (CST) pełniącą w procesie rozdzielania komórek funkcję represyjną. Całkowicie nowy kierunek badań związany z funkcjonowaniem peptydów AtIDA/IDL zapoczątkowały doświadczenia poświęcone regulacji wzrostu zawiązków korzeni bocznych [78]. Korzenie boczne biorą swój początek z komórek założycielskich zlokalizowanych w perycyklu i dlatego przebijanie się rosnącego zawiązka poprzez warstwy endodermy, kory i epidermy korzenia głównego wymusza w tych warstwach rozdzielanie komórek [56]. Wyniki prowadzonych obecnie doświadczeń potwierdziły, że peptyd AtIDA i kinazy HAE/HSL2 biorą udział w regulacji tego procesu [78]. Okazało się, że gen IDA jest aktywowany przez auksyny, a jego ekspresja w komórkach wspomnianych warstw niejako wyprzedza rosnący zawiązek korzenia bocznego. W percepcji peptydu AtIDA pośredniczą obie kinazy receptorowe HAE i HSL2, chociaż odmienny wzorzec ekspresji kodujących je genów w poszczególnych warstwach sugeruje, że obie kinazy funkcjonują w kolejnych etapach wzrostu zawiązka korzenia [55,78]. PEPTYDY CEP Liście siewek rzodkiewnika rosnących w 1% wodnym roztworze sacharozy zmieniają swoją strukturę anatomiczną, w tym m. in. pomiędzy komórkami mezofilowymi pojawiają się duże przestrzenie międzykomórkowe. W poszukiwaniach nowych peptydów sygnałowych założono, że peptydy występujące w tych przestrzeniach będą samoistnie dyfundować do roztworu sacharozy, co powinno umożliwić ich ekstrakcję o-chlorofenolem, a w następnej kolejności powinno ułatwić rozdział i identyfikację oczyszczonych peptydów. Wykorzystując tę metodę poddano analizie peptydy uzyskane z rośliny transgenicznej z podwyższoną ekspresją jednego z genów kodujących małe białko sekrecyjne [79]. W ten sposób udało się zidentyfikować oligopeptyd AtCEP1 (15 reszt aminokwasowych; ang. C-terminally Encoded Peptide1) zawierający jedną lub dwie reszty hydroksyproliny. AtCEP1 został wycięty z 91-aminokwasowego preprobiałka kodowanego przez jeden z pięciu genów tworzących rodzinę genów AtCEP (Ryc. 8) [79]. Dzisiaj już wiadomo, że genom rzodkiewnika, oprócz pięciu poznanych genów, zawiera jeszcze dziesięć innych genów AtCEP kodujących białka sekrecyjne zbudowane z reszt aminokwasowych [80,81]. Większość z tych białek zawiera pojedynczy motyw CEP, ale białka AtCEP2 i AtCEP6 mają po dwa moty- Rycina 8. Porównanie sekwencji aminokwasowej peptydów AtCEP rzodkiewnika (na podstawie prac [79-81]). wy, AtCEP10 trzy motywy, a białko AtCEP9 aż sześć motywów CEP. Postępy Biochemii 60 (3)

10 Wszystkie peptydy pochodzące z tych piętnastu probiałek podzielono na dwie grupy. Peptydy z pierwszej grupy (od AtCEP1 do AtCEP12) cechuje bardzo wyraźna zachowawczość sekwencji aminokwasowej, podczas gdy pozostałe trzy peptydy mają konserwatywny tylko 8-aminokwasowy odcinek C-końcowy [80,81]. Badania poświęcone roli AtCEP1 wykazały, że jego ekspresja zachodzi w miejscu powstawania zawiązków korzeni bocznych, a nadekspresja bądź aplikacja peptydu syntetyzowanego chemicznie hamuje wzrost i rozwój korzenia [79]. Jednakże już wyniki nowszych badań pokazują, że poszczególne geny AtCEP ulegają ekspresji w różnych tkankach, zarówno w podziemnej, jak również nadziemnej części rośliny. Ekspresja niektórych genów jest regulowana przez fitohormony, ale ulega również wyraźnym zmianom pod wpływem różnych czynników środowiska (zmiany stężenia NO 3-, NH 4+, NaCl, CO 2, mannitolu) [80,81]. OLIGOPEPTYDY HYPSYS W doświadczeniach, których celem było poszukiwanie w tytoniu systeminy, pierwszego roślinnego peptydu sygnałowego poznanego w pomidorze, zidentyfikowano odrębną grupę glikopeptydów nazwanych ogólnie HypSys, zbudowanych z 8 20 reszt aminokwasowych [82]. Dwa glikopeptydy bogate w hydroksyprolinę zidentyfikowano najpierw w liściach tytoniu, a następnie podobne trzy glikopeptydy poznano w liściach pomidora. Peptydy tytoniu NtHypSys I i II są wycinane z preprobiałka (165 reszt aminokwasowych), natomiast w liściach pomidora trzy peptydy o zbliżonej wielkości pochodzą ze zbudowanego z 145 reszt aminokwasowych polipeptydu. Wszystkie poznane peptydy zawierają od kilku do kilkunastu pentoz [82]. Podobnie glikopeptydy poznano także w petunii, ziemniaku, psiance czarnej i wilcu ziemniaczanym [82]. Funkcja poznanych glikopeptydów HypSys nie została poznana. Wyniki pierwszych doświadczeń sugerowały, że glikopeptydy HypSys, produkowane w miejscu zranienia, aktywują geny kodujące inhibitory proteaz i oksydazę polifenolową [82]. Jednakże w innych doświadczeniach nie potwierdzono sugerowanej roli [83], natomiast w badaniach prowadzonych na dzikorosnącym tytoniu Nicotiana attenuata wykazano, że ekspresja pojedynczego genu HypSys zachodzi w kwiatach, a badany glikopeptyd wpływa na morfologię kwiatu [84]. SIARCZANOWANE PEPTYDY PSK, PSY I RGF/CLEL/GLV FITOSULFOKINA (PSK) Fitosulfokina (PSK), wyizolowana po raz pierwszy z kultur komórkowych szparaga, jest jednym z pierwszych poznanych peptydów sygnałowych roślin [1]. Peptyd o identycznej sekwencji aminokwasowej, zawierający dwie siarczanowane reszty tyrozyny (Y(SO 3 H)-I-Y(SO 3 H)-T-Q), znaleziono następnie w płynie pobieranym z kultur komórkowych ryżu i marchwi. Z czasem w ryżu sklonowano gen PSK kodujący preprobiałko (89 reszt aminokwasowych) zawierające w części C-końcowej pentapeptyd PSK [85]. Ostatecznie w genomie ryżu zidentyfikowano pięć genów OsPSK, a w genomie rzodkiewnika sześć ortologów AtPSK1-6 kodujących preprobiałka (77 87 reszt aminokwasowych) z motywem PSK o identycznej sekwencji aminokwasowej [85]. We wszystkich poznanych probiałkach motyw YIYTQ poprzedzony jest sekwencją HTD lub HLD, a kilka pozycji wcześniej motywem zasadowym RR lub KK (dwie reszty argininy lub lizyny) wyznaczającym miejsce cięcia proteolitycznego katalizowanego przez subtylazy enzymy podobne do subtylizyny, kodowane w rzodkiewniku przez 56 genów [85,86]. W doświadczeniach prowadzonych na probiałku AtPSK4 wykazano, że subtylaza AtSBT1.1 hydrolizuje wiązanie peptydowe pomiędzy resztą leucyny a resztą histydyny (-RRSLVL*HTDYIYTQNHKP) [86]. Wynika stąd, że w usuwaniu tripeptydu -HTD- i tetrapeptydu -NHKP muszą brać udział jakieś peptydazy. W ostatnich latach poznano gen AtTPST (ang. Tyrosyl Protein Sulfotransferase) kodujący sulfotransferazę przenoszącą resztę siarczanową z 3 -fosfoadenozyno-5 -fosfosiarczanu (PAPS) na reszty tyrozyny w probiałku AtPSK i probiałku AtPSY1 (patrz następny podrozdział) [87]. Mutacja w genie AtTPST powodująca zanikanie aktywności sulfotransferazowej prowadzi do licznych defektów rozwojowych obejmujących zarówno korzeń, jak również nadziemną część rośliny. Równolegle z poznawaniem peptydu PSK podejmowano poszukiwania białka receptorowego wiążącego pentapeptyd. Ostatecznie z marchwi udało się wyselekcjonować klon cdna DcPSKR1 kodujący serynowo/treoninową kinazę białkową typu LRR-RLK, zbudowaną z 1021 reszt aminokwasowych [88], a w nowszych badaniach wykazano, że w wiązaniu PSK bierze udział 36-aminokwasowa wstawka położona pomiędzy 17 a 18 powtórzeniem LRR [89]. Poznanie białka receptorowego w marchwi ułatwiło znalezienie sekwencji AtPSKR1 rzodkiewnika kodującej kinazę białkową typu LRR-RLK (1008 reszt aminokwasowych) [90]. Z czasem okazało się, że w genomie rzodkiewnika występują jeszcze dwie inne sekwencje AtPSKR1-like kodujące białka podobne do AtPSKR1 [91]. Jedna z tych kinaz (AtPSKR2) okazała się być również receptorem peptydu AtPSK, natomiast druga funkcjonuje w percepcji peptydu AtPSY1 [91]. W tym miejscu warto zwrócić uwagę, że w domenie cytoplazmatycznej AtPSKR1 występuje 14-aminokwasowa sekwencja cyklazy guanylanowej. Co więcej, udało się potwierdzić eksperymentalnie, że AtPSKR1 posiada zarówno aktywność kinazy białkowej, jak również aktywność cyklazy guanylanowej [92]. Dotychczasowe poszukiwania roli peptydów PSK nie przyniosły na razie zadowalających odpowiedzi. W analizach ekspresji poszczególnych genów AtPSK ujawniono, że AtPSK1 ulega ekspresji tylko w korzeniu, natomiast pozostałe geny są aktywne we wszystkich badanych tkankach [6,12]. Szereg wcześniejszych wyników wskazywało na udział PSK w regulacji wielu różnych procesów, w tym m. in.: promowaniu różnicowania komórek mezofilowych cynii, aktywacji proliferacji komórek, stymulacji wzrostu łagiewki pyłkowej, aktywacji embriogenezy somatycznej, aktywacji formowania dodatkowych pąków i korzeni, stymulacji syntezy chlorofilu [4,6,12]. Plejotropowy charakter zmian potwierdzano również w doświadczeniach prowadzonych na mutantach z defektami w genach kodujących kinazy AtPSKR [90,91]. W najnowszych badaniach zwraca się uwagę na udział AtPSK w regulacji wielkości komórek 350

11 oraz na współdziałanie peptydów PSK z brasinosteroidami [93]. Badana jest również rola AtPSK w odpowiedziach roślin na różne czynniki stresowe takie jak zranienie czy atak patogenów [94]. SIARCZANOWANE PEPTYDY PSY W poszukiwaniach peptydów sygnałowych, które podobnie jak PSK zawierają siarczanowaną resztę/reszty tyrozyny, z płynu hodowlanego kultur komórkowych rzodkiewnika udało się oczyścić 18-aminokwasowy siarczanowany glikopeptyd AtPSY1 (ang. Plant Peptide Containing Sulfated Tyrisine1) [91]. Aktywny peptyd jest wycinany ze zbudowanego z 75 reszt aminokwasowych preprobiałka kodowanego w rzodkiewniku przez jeden z trzech genów AtPSY. Oligopeptyd AtPSY1 w pozycji drugiej zawiera resztę tyrozyny ulegającą siarczanowaniu, a dalej pięć reszt proliny, spośród których Pro-16 i Pro-17 są hydroksylowane, a reszta hydroksyproliny-16 jest dodatkowo arabinozylowana [91]. Również pozostałe, zbudowane z 71 reszt aminokwasowych preprobiałka AtPSY2 i 3 mają pojedyncze motywy PSY, Rycina 9. Sekwencja aminokwasowa peptydów AtP- SY1-3 rzodkiewnika (na podstawie pracy [91]). których sekwencja aminokwasowa jest bardzo podobna do AtP- SY1 (Ryc. 9). Gen AtPSY1 ulega ekspresji w różnych tkankach, a aktywny peptyd PSY1 stymuluje podziały i wzrost wydłużeniowy komórek. Receptorem AtPSY1 jest kinaza białkowa AtPSY1R (AtPSKR3), paralog kinaz AtPSKR1 i 2 wiążących fitosulfokinę [91]. RODZINA PEPTYDÓW RGF/CLEL/GLV Wyniki doświadczeń prowadzonych na mutancie tpst- 1 pozbawionym sulfotransferazy AtTPST, kodowanej w rzodkiewniku przez pojedynczy gen, wykazały, że brak tego enzymu powoduje szereg defektów morfologicznych i anatomicznych, w tym również defektów dotyczących wzrostu korzenia [87,95]. Aplikacja na korzeń fitosulfokiny i peptydu PSY1 cofa niektóre defekty, ale nie znosi zmian, jakie zaszły w merystemie wierzchołkowym korzenia. Wyniki tych doświadczeń skłoniły badaczy do szukania w genomie rzodkiewnika innych genów kodujących białka ulegające siarczanowaniu [95]. W ten sposób zidentyfikowano gen RGF1 (ang. Root Meristem Growth Factor1) kodujący Rycina 10. Porównanie sekwencji aminokwasowej peptydów AtGLV/CLEL/ RGF rzodkiewnika (na podstawie prac [96,99]). 130-aminokwasowe preprobiałko, które w części C-końcowej zawiera motyw zbudowany z 13 reszt aminokwasowych rozpoczynający się od sekwencji -DY-, która wyznacza resztę tyrozyny ulegającą siarczanowaniu (Ryc. 10). W kolejnych doświadczeniach, z roślin z podwyższoną ekspresją AtRGF1 udało się oczyścić aktywny 13-aminokwasowy peptyd AtRGF1 z siarczanowaną resztą tyrozyny [95]. Ekspresja genu AtRGF1 zachodzi w komórkach centrum spoczynkowego (QC) i komórkach kolumelli. W badaniach prowadzonych w innym zespole odkryto, że gen CLE18 rzodkiewnika koduje preprobiałko z motywem CLE położonym w części środkowej polipeptydu i motywem podobnym do RGF1 zlokalizowanym w części C- -końcowej preprobiałka [96]. Ponadto ujawniono, że genom rzodkiewnika zawiera rodzinę genów CLEL (ang. CLE-like) kodujących białka sekrecyjne zawierające w części C-końcowej pojedynczy motyw RGF1 [96]. W tym samym czasie w innym zespole poznano trzy geny GOLVEN 1, 2 i 3 (hol. golven - poskręcany), których nadekspresja powoduje wystąpienie charakterystycznych zmian w morfologii korzeni objawiających się silnie poskręcanymi korzeniami [97]. Ponadto ujawniono, że geny GLV1, 2, i 3 są tożsame z genami CLEL6/RGF6, CLEL9/RGF9 i RGF4 [96,98]. Ostatecznie, dzięki wykonanym analizom genetycznym potwierdzono, że genom rzodkiewnika zawiera rodzinę 11 genów GOLVEN/ CLEL/RGF kodujących preprobiałka ( reszt aminokwasowych) z zachowanym w ewolucji, zbudowanym z reszt aminokwasowych motywem rozpoczynającym się od sekwencji -DY- (Ryc. 10) [96,98]. Ostatecznie, obecność siarczanowanej reszty tyrozyny potwierdzono w peptydach AtGLV1, 2, 3 i 11 [95,97]. Rola peptydów AtGLV/CLEL/RGF pozostaje na razie zagadkowa. Analizy ekspresji wszystkich jedenastu genów prowadzą do wniosku, że peptydy z tej rodziny pełnią przypuszczalnie różne funkcje [95-99]. Wyniki tych analiz ujawniły, że w merystemie wierzchołkowym korzenia ekspresji ulega aż pięć genów (GLV5, 6, 7, 10 i 11), w części powyżej merystemu trzy (GLV3, 6, i 9), a w części włośnikowej dwa geny (GLV4 i 8 ). W części nadziemnej ekspresji ulegają geny GLV1 i 2 oraz kilka genów aktywowanych w korzeniu [99]. Wydaje się, że niektóre peptydy AtRGF/CLEL/GLV mogą działać parakrynnie, inne zaś autokrynnie. Ekspresję niektórych genów RGF/CLEL/GLV aktywują auksyny, a co najmniej niektóre peptydy AtRGF/CLEL/GLV wpływają na transport auksyn z udziałem białek PIN [55,97,98,100]. PIŚMIENNICTWO 1. Kowalczyk S, Maciejewska B (2002) Roślinne peptydy sygnałowe. Post Biol Kom 29: Wheeler JI, Irving HR (2010) Evolutionary advantages of secreted peptide signalling molecules in plants. Funct Plant Biol 37: Lease KA, Walker JC (2006) The Arabidopsis unannotated secreted peptide database, a resource for plant peptidomics. Plant Physiol 142: Matsubayashi Y (2012) Recent progress in research on small post- -translationally modified peptide signals in plants. Genes Cells 17: Hanada K, Higuchi-Takeuchi M, Okamoto M, Yoshizumi T, Shimizu M, Nakaminami K, Nishi R, Ohashi C, Iida K, Tanaka M, Horii Y, Kawashima M, Matsui K, Toyoda T, Shinozaki K, Seki M, Matsui M (2013) Small open reading frames associated with morphogenesis are hidden in plant genomes. Proc Natl Acad Sci USA 110: Postępy Biochemii 60 (3)

12 6. Matsubayashi Y (2011) Small post-translationally modified peptide signals in Arabidopsis. The Arabidopsis Book Czyzewicz N, Yue K, Beeckman T, De Smet I (2013) Message in a bottle: small signalling peptide outputs during growth and development. J Exp Bot 64: Osakabe Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, Tran L-SP (2013) Sensing the environment: key roles of membrane-localized kinases in plant perception and response to abiotic stress. J Exp Bot 64: Zhang Z, Thomma BPHJ (2013) Structure-function aspects of extracellular leucine-rich repeat-containing cell surface receptors in plants. J Integr Plant Biol 55: Wang G, Ellendorff U, Kemp B, Mansfield JW, Forsyth A, Mitchell K, Bastas K, Liu C-M, Woods-Tör A, Zipfel C, De Wit PJGM, Jones JDG, Tör M, Thomma BPHJ (2008) A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol 147: Betsuyaku S, Sawa S, Yamada M (2011) The function of the CLE peptides in plant development and plant-microbe interactions. The Arabidopsis Book Matsubayashi Y, Sakagami Y (2006) Peptide hormones in plants. Annu Rev Plant Biol 57: Wang G, Fiers M (2010) CLE peptide signaling during plant development. Protoplasma 240: Gao X, Guo Y (2012) CLE peptides in plants: proteolytic processing, structure-activity relationship, and ligand-receptor interaction. J Integr Plant Biol 54: Murphy E, Smith S, De Smet I (2012) Small signaling peptides in Arabidopsis development: How cells communicate over a short distance. Plant Cell 24: Miyawaki K, Tabata R, Sawa S (2013) Evolutionarily conserved CLE peptide signaling in plant development, symbiosis, and parasitism. Curr Opin Plant Biol 16: Jun JH, Fiume E, Fletcher JC (2008) The CLE family of plant polypeptide signaling molecules. Cell Mol Life Sci 65: Lim CW, Lee YW, Hwang CH (2011) Soybean nodule-enhanced CLE peptides in roots act as signals in GmNARK-mediated nodulation suppression. Plant Cell Physiol 52: Oelkers K, Goffard N, Weiller GF, Gresshoff PM, Mathesius U, Frickey T (2008) Bioinformatic analysis of the CLE signaling peptide family. BMC Plant Biol 8: Tiainen P, Myllyharju J, Koivunen P (2005) Characterization of a second Arabidopsis thaliana prolyl 4-hydroxylase with distinct substrate specificity. J Biol Chem 280: Hirakawa Y, Kondo Y, Fukuda H (2011) Establishment and maintenance of vascular cell communities through local signaling. Curr Opin Plant Biol 14: Jun JH, Fiume E, Roeder AHK, Meng L, Sharma VK, Osmont KS, Baker C, Ha CM, Meyerowitz EM, Feldman LJ, Fletcher JC (2010) Comprehensive analysis of CLE polypeptide signaling gene expression and overexpression activity in Arabidopsis. Plant Physiol 154: Dodueva IE, Yurlova EV, Osipova MA, Lutova LA (2012) CLE peptides are universal regulators of meristem development. Russ J Plant Physiol 59: Perales M, Reddy GV (2012) Stem cell maintenance in shoot apical meristems. Curr Opin Plant Biol 15: Kondo T, Sawa S, Kinoshita A, Mizuno S, Kakimoto T, Fukuda H, Sakagami Y (2006) A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313: Ohyama K, Shinohara H, Ogawa-Ohnishi M, Matsubayashi Y (2009) A glycopeptide regulating stem cell fate in Arabidopsis thaliana. Nat Chem Biol 5: Shinohara H, Matsubayashi Y (2013) Chemical synthesis of Arabidopsis CLV3 glycopeptide reveals the impact of hydroxyproline arabinosylation on peptide conformation and activity. Plant Cell Physiol 54: Ogawa M, Shinohara H, Sakagami Y, Matsubayashi Y (2008) Arabidopsis CLV3 peptide directly binds CLV1 ectodomain. Science 319: Nimchuk ZL, Tarr PT, Ohno C, Qu X, Meyerowitz EM (2011) Plant stem cell signaling involves ligand-dependent trafficking of the CLA- VATA1 receptor kinase. Curr Biol 21: Miwa H, Betsuyaku S, Iwamoto K, Kinoshita A, Fukuda H, Sawa S (2008) The receptor-like kinase SOL2 mediates CLE signaling in Arabidopsis. Plant Cell Physiol 49: Müller R, Bleckmann A, Simon R (2008) The receptor kinase CORYNE of Arabidopsis transmits the stem cell-limiting signal CLAVATA3 independently of CLAVATA1. Plant Cell 20: Bleckmann A, Weidtkamp-Peters S, Seidel CAM, Simon R (2010) Stem cell signaling in Arabidopsis requires CRN to localize CLV2 to the plasma membrane. Plant Physiol 152: Zhu Y, Wang Y, Li R, Song X, Wang Q, Huang S, Jin JB, Liu C-M, Lin J (2010) Analysis of interactions among the CLAVATA3 receptors reveals a direct interaction between CLAVATA2 and CORYNE in Arabidopsis. Plant J 61: Nimchuk ZL, Tarr PT, Meyerowitz EM (2011) An evolutionarily conserved pseudokinase mediates stem cell production in plants. Plant Cell 23: Guo Y, Han L, Hymes M, Denver R, Clark SE (2010) CLAVATA2 forms a distinct CLE-binding receptor complex regulating Arabidopsis stem cell specification. Plant J 63: Kinoshita A, Betsuyaku S, Osakabe Y, Mizuno S, Nagawa S, Stahl Y, Simon R, Yamaguchi-Shinozaki K, Fukuda H, Sawa S (2010) RPK2 is an essential receptor-like kinase that transmits the CLV3 signal in Arabidopsis. Development 137: DeYoung Bj, Clark SE (2008) BAM receptors regulate stem cell specification and organ development through complex interactions with CLAVATA signaling. Genetics 180: Gagne JM, Clark SE (2010) The Arabidopsis stem cell factor POLTER- GEIST is membrane localized and phospholipid stimulated. Plant Cell 22: Bommert P, Je BII, Goldshmidt A, Jackson D (2013) The maize Ga gene COMPACT PLANT2 functions in CLAVATA signalling to control shoot meristem size. Nature 502: Betsuyaku S, Takahashi F, Kinoshita A, Miwa H, Shinozaki K, Fukuda H, Sawa S (2011) Mitogen-activated protein kinase regulated by the CLAVATA receptors contributes to shoot apical meristem homeostasis. Plant Cell Physiol 52: Ikeda M, Mitsuda N, Ohme-Takagi M (2009) Arabidopsis WUSCHEL is a bifunctional transcription factor that acts as a repressor in stem cell regulation and as an activator in floral patterning. Plant Cell 21: Busch W, Miotk A, Ariel FD, Zhao Z, Forner J, Daum G, Suzaki T, Schuster C, Schultheiss SJ, Leibfried A, Haubeiß S, Ha N, Chan RL, Lohmann JU (2010) Transcriptional control of a plant stem cell niche. Dev Cell 18: Yadav RK, Perales M, Gruel J, Girke T, Jönsson H, Reddy GV (2011) WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Gen Dev 25: Yadav RK, Tavakkoli M, Reddy GV (2010) WUSCHEL mediates stem cell homeostasis by regulating stem cell number and patterns of cell division and differentiation of stem cell progenitors. Development 137: Meng L, Feldman LJ (2010) CLE14/CLE20 peptides may interact with CLAVATA2/CORYNE receptor-like kinases to irreversibly inhibit cell division in the root meristem of Arabidopsis. Planta 232: Yamada M, Sawa S (2012) The roles of peptide hormones during plant root development. Curr Opin Plant Biol 16: Stahl Y, Wink RH, Ingram GC, Simon R (2009) A signaling module controlling the stem cell niche in Arabidopsis root meristems. Curr Biol 19: Stahl Y, Grabowski S, Bleckmann A, Kühnemuth R, Weidtkamp-Peters S, Pinto KG, Kirschner GK, Schmid JB, Wink RH, Hülsewede A, Felekyan S, Seidel CAM, Simon R (2013) Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr Biol 23:

13 49. Zhang W, Swarup R, Bennett M, Schaller GE, Kieber JJ (2013) Cytokinin induces cell division in the Quiescent Center of the Arabidopsis root apical meristem. Curr Biol 23: Ito Y, Nakanomyo I, Motose H, Iwamoto K, Sawa S, Dohmae N, Fukuda H (2006) Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313: Hirakawa Y, Shinohara H, Kondo Y, Inoue A, Nakanomyo I, Ogawa M, Sawa S, Ohashi-Ito K, Matsubayashi Y, Fukuda H (2008) Non-cell-autonomous control of vascular stem cell fate by a CLE peptide/receptor system. Proc Natl Acad Sci USA 105: Etchells JP, Turner SR (2010) The PXY-CLE41 receptor ligand pair defines a multifunctional pathway that controls the rate and orientation of vascular cell division. Development 137: Etchells JP, Provost CM, Mishra L, Turner SR (2013) WOX4 and WOX14 act downstream of the PXY receptor kinase to regulate plant vascular proliferation independently of any role in vascular organisation. Development 140: Qiang Y, Wu J, Han H, Wang G (2013) CLE peptides in vascular development. J Integr Plant Biol 55: Delay C, Imin N, Djordjevic MA (2013) Regulation of Arabidopsis root development by small signaling peptides. Front Plant Sci 4: Starzyńska E, Kowalczyk S (2012) Subkomórkowa relokacja białek PIN a regulowany przez auksyny wzrost i rozwój roślin. Post Biol Kom 39: Miyashima S, Sebastian J, Lee J-Y, Helariutta Y (2013) Stem cell function during plant vascular development. EMBO J 32: Fiume E, Fletcher JC (2012) Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell 24: Endo S, Shinohara H, Matsubayashi Y, Fukuda H (2013) A novel pollen-pistil interaction conferring high-temperature tolerance during reproduction via CLE45 signaling. Curr Biol 23: Tylman I, Kowalczyk S (2012) Receptory i szlaki sygnałowe regulujące symbiozę brodawkową i mikoryzę arbuskularną. Post Biol Kom 39: Mortier V, Holsters M, Goormachtig S (2012) Never too many? How legumes control nodule numbers. Plant Cell Environm 35: Reid DE, Ferguson BJ, Hayashi S, Lin Y-H, Gresshoff PM (2011) Molecular mechanisms controlling legume autoregulation of nodulation. Ann Bot 108: Suzuki A, Hara H, Kinoue T, Abe M, Uchiumi T, Kucho K-I, Higashi S, Hirsch AM, Arima S (2008) Split-root study of autoregulation of nodulation in the model legume Lotus japonicus. J Plant Res 121: Nishimura R, Hayashi M, Wu G-J, Kouchi H, Imaizumi-Anraku H, Murakami Y, Kawasaki S, Akao S, Ohmori M, Nagasawa M, Harada K, Kawaguchi M (2002) HAR1 mediates systemic regulation of symbiotic organ development. Nature 420: Nontachaiyapoom S, Scott PT, Men AE, Kinkema M, Schenk PM, Gresshoff PM (2007) Promoters of orthologous Glycine max and Lotus japonicus nodulation autoregulation genes interchangeably drive phloem-specific expression in transgenic plants. Mol Plant-Microbe Interact 20: Miyazawa H, Oka-Kira E, Sato N, Takahashi H, Wu G-J, Sato S, Hayashi M, Betsuyaku S, Nakazono M, Tabata S, Harada K, Sawa S, Fukuda H, Kawaguchi M (2010) The receptor-like kinase KLAVIER mediates systemic regulation of nodulation and non-symbiotic shoot development in Lotus japonicus. Development 137: Krusell L, Sato N, Fukuhara I, Koch BEV, Grossmann C, Okamoto S, Oka-Kira E, Otsubo Y, Aubert G, Nakagawa T, Sato S, Tabata S, Duc G, Parniske M, Wang TL, Kawaguchi M, Stougaard J (2011) The Clavata2 genes of pea and Lotus japonicus affect autoregulation of nodulation. Plant J 65: Okamoto S, Ohnishi E, Sato S, Takahashi H, Nakazono M, Tabata S, Kawaguchi M (2009) Nod factor/nitrate-induced CLE genes that drive HAR1-mediated systemic regulation of nodulation. Plant Cell Physiol 50: Mortier V, Den Herder G, Whitford R, Van De Velde W, Rombauts S, D haeseleer K, Holsters M, Goormachtig S (2010) CLE peptides control Medicago truncatula nodulation locally and systemically. Plant Physiol 153: Reid DE, Ferguson BJ, Gresshoff PM (2011) Inoculation- and nitrate- -induced CLE peptides of soybean control NARK-dependent nodule formation. Mol Plant-Microbe Interact 24: Lin Y-H, Ferguson BJ, Kereszt A, Gresshoff PM (2010) Suppression of hypernodulation in soybean by a leaf-extracted, NARK- and Nod factor-dependent, low molecular mass fraction. New Phytol 185: Liljegren SJ (2012) Organ abscission: exit strategies require signals and moving traffic. Curr Opin Plant Biol 15: Niederhuth CE, Cho SK, Seitz K, Walker JC (2013) Letting go is never easy: Abscission and receptor-like protein kinases. J Integrat Plant Biol 55: Jinn T-L, Stone JM, Walker JC (2000) HAESA, an Arabidopsis leucine- -rich repeat receptor kinase, controls floral organ abscission. Gen Dev 14: Butenko MA, Patterson SE, Grini PE, Stenvik G-E, Amundsen SS, Mandal A, Aalen RB (2003) INFLORESCENCE DEFICIENT IN AB- SCISSION Controls floral organ abscission in Arabidopsis and identifies a novel family of putative ligands in plants. Plant Cell 15: Stenvik G-E, Tandstad NM, Guo Y, Shi C-L, Kristiansen W, Holmgren A, Clark SE, Aalen RB, Butenko MA (2008) The EPIP Peptide of IN- FLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION is sufficient to induce abscission in Arabidopsis through the receptor-like kinases HAESA and HAESA-LIKE2. Plant Cell 20: Cho SK, Larue CT, Chevalier D, Wang H, Jinn T-L, Zhang S, Walker JC (2008) Regulation of floral organ abscission in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 105: Kumpf RP, Shi C-L, Larrieu A, Sto IM, Butenko MA, Péret B, Riiser ES, Bennett MJ, Aalen RB (2013) Floral organ abscission peptide IDA and its HAE/HSL2 receptors control cell separation during lateral root emergence. Proc Natl Acad Sci USA 110: Ohyama K, Ogawa M, Matsubayashi Y (2008) Identification of a biologically active, small, secreted peptide in Arabidopsis by in silico gene screening, followed by LC-MS-based structure analysis. Plant J 55: Roberts I, Smith S, De Rybel B, Van Den Broeke J, Smet W, De Cokere S, Mispelaere M, De Smet I, Beeckman T (2013) The CEP family in land plants: evolutionary analyses, expression studies, and role in Arabidopsis shoot development. J Exp Bot 64: Delay C, Imin N, Djordjevic MA (2013) CEP genes regulate root and shoot development in response to environmental cues and are specific to seed plants. J Exp Bot 64: Pearce G (2011) Systemin, hydroxyproline-rich systemin and the induction of protease inhibitors. Curr Prot Pept Sci 12: Berger B, Baldwin IT (2007) The hydroxyproline-rich glycopeptide systemin precursor NapreproHypSys does not play a central role in Nicotiana attenuata s anti-herbivore defense responses. Plant Cell Environ 30: Berger B, Baldwin IT (2009) Silencing the hydroxyproline-rich glycopeptide systemin precursor in two accessions of Nicotiana attenuata alters flower morphology and rates of self-pollination. Plant Physiol 149: Lorbiecke R, Sauter M (2002) Comparative analysis of PSK peptide growth factor precursor homologs. Plant Sci 163: Srivastava R, Liu J-X, Howell SH (2008) Proteolytic processing of a precursor protein for a growth-promoting peptide by a subtilisin serine protease in Arabidopsis. Plant J 56: Komori R, Amano Y, Ogawa-Ohnishi M, Matsubayashi Y (2009) Identification of tyrosylprotein sulfotransferase in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA 106: Matsubayashi Y, Ogawa M, Morita A, Sakagami Y (2002) An LRR receptor kinase involved in perception of a peptide plant hormone, phytosulfokine. Science 296: Postępy Biochemii 60 (3)

14 89. Shinohara H, Ogawa M, Sakagami Y, Matsubayashi Y (2007) Identification of ligand binding site of phytosulfokine receptor by on-column photoaffinity labeling. J Biol Chem 282: Matsubayashi Y, Ogawa M, Kihara H, Niwa M, Sakagami Y (2006) Disruption and overexpression of Arabidopsis phytosulfokine receptor gene affects cellular longevity and potential for growth. Plant Physiol 142: Amano Y, Tsubouchi H, Shinohara H, Ogawa M, Matsubayashi Y (2007) Tyrosine-sulfated glycopeptide involved in cellular proliferation and expansion in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA 104: Kwezi L, Ruzvidzo O, Wheeler JI, Govender K, Iacuone S, Thompson PE, Gehring C, Irving HR (2011) The phytosulfokine (PSK) receptor is capable of guanylate cyclase activity and enabling cyclic GMP-dependent signaling in plants. J Biol Chem 286: Hartmann J, Fischer C, Dietrich P, Sauter M (2014) Kinase activity and calmodulin binding are essential for growth signaling by the phytosulfokine receptor PSKR1. Plant J 78: Mosher S, Seybold H, Rodriguez P, Stahl M, Davies KA, Dayaratne S, Morillo SA, Wierzba M, Favery B, Keller H, Tax FE, Kemmerling B (2013) The tyrosine-sulfated peptide receptors PSKR1 and PSY1R modify the immunity of Arabidopsis to biotrophic and necrotrophic pathogens in an antagonistic manner. Plant J 73: Matsuzaki Y, Ogawa-Ohnishi M, Mori A, Matsubayashi Y (2010) Secreted peptide signals required for maintenance of root stem cell niche in Arabidopsis. Science 329: Meng L, Buchanan BB, Feldman LJ, Luan S (2012) CLE-like (CLEL) peptides control the pattern of root growth and lateral root development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA 109: Whitford R, Fernandez A, Tejos R, Pérez AC, Kleine-Vehn J, Vanneste S, Drozdzecki A, Leitner J, Abas L, Aerts M, Hoogewijs K, Baster P, De Groodt R, Lin Y-C, Storme V, Van De Peer Y, Beeckman T, Madder A, Devreese B, Luschnig C, Friml J, Hilson P (2012) GOLVEN secretory peptides regulate auxin carrier turnover during plant gravitropic responses. Dev Cell 22: Fernandez A, Drozdzecki A, Hoogewijs K, Nguyen A, Beeckman T, Madder A, Hilson P (2013) Transcriptional and functional classification of the GOLVEN/ROOT GROWTH FACTOR/CLE-like signaling peptides reveals their role in lateral root and hair formation. Plant Physiol 161: Fernandez A, Hilson P, Beeckman T (2013) GOLVEN peptides as important regulatory signalling molecules of plant development. J Exp Bot 64: Zhou W, Wei L, Xu J, Zhai Q, Jiang H, Chen R, Chen Q, Sun J, Chu J, Zhu L, Liu C-M, Li C (2010) Arabidopsis tyrosylprotein sulfotransferase acts in the auxin/plethora pathway in regulating postembryonic maintenance of the root stem cell niche. Plant Cell 22: Plant signaling peptides Small post-translationally modified peptides Anna Gorzelańczyk *, Stanisław Kowalczyk Nicolaus Copernicus University, Faculty of Biology and Environmental Protection, Department of Biochemistry, 7 Gagarina St., Toruń, Poland * a_gorzelan@wp.pl Key words: signaling peptides, intercellular signaling, receptor protein kinases, Arabidopsis thaliana ABSTRACT Recent genetic, bioinformatic and biochemical analyses have revealed that many secretory peptides are important components in intercellular signaling that coordinate and specify cellular functions in plants. The signaling peptides discovered in plants thus far can be considered to fall into two broad groups. Peptides from the first group are undergo post-translational modification, such as proline hydroxylation, hydroxyproline arabinosylation or tyrosine sulfation. Peptides from the second group are defined as cysteine-rich peptides (CRPs). The Cys-rich peptides are larger and they contain 4 to 16 cysteine residues. In parallel with the discovery of plant signal peptides, specific receptors for such peptide signals are identified. So far, the receptors for plant peptides that have been identified are members of the receptor-like kinases (RLKs) and the receptor-like proteins (RLPs) families, and most of them contain leucine-rich repeat (LRR) extracellular domain. The present review presents the recent progress in research on small post-translationally modified signal peptides. Recent findings indicate that these peptides are involved in various aspects of plant growth regulation including meristem organization, primary root development, lateral root initiation, vasculature development, organ abscission, and root nodulation