Wykorzystanie reagentów biologicznych do asymetrycznej redukcji ketonów aromatyczno-alifatycznych

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia 5(1-2) 2006, ENANCJOSPECYFICZNA REDUKCJA KETONÓW AROMATYCZNYCH W KULTURZE GREMMENIELLA ABIETINA 1 Ewa Brzezowska 1, Jadwiga Dmochowska-Gładysz 1, Bogdan Jarosz 1, Tadeusz Kowalski 2 1 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 2 Akademia Rolnicza w Krakowie Streszczenie. Badany był przebieg reakcji redukcji pięciu prochiralnych ketonów aromatyczno-alifatycznych, acetofenonu i jego pochodnych w kulturze pasoŝytniczego grzyba Gremmeniella abietina wyizolowanego z zaraŝonych pędów sosny. We wszystkich przypadkach zanotowano enancjospecyficzny przebieg procesu, przy czym specyficzność ta, mierzona jako nadmiar enancjomeryczny enancjomeru będącego w przewadze, tak jak i wydajność tworzącego się alkoholu drugorzędowego, zaleŝała zarówno od czasu reakcji, jak i struktury substratu. Słowa kluczowe: Gremmeniella abietina, biotransformacja, enancjospecyficzność, redukcja ketonów WSTĘP Wykorzystanie reagentów biologicznych do asymetrycznej redukcji ketonów aromatyczno-alifatycznych jest skuteczną metodą otrzymywania optycznie czynnych produktów alkoholi drugorzędowych o duŝej czystości optycznej [Nakamura i in. 2003]. Alkohole te są uŝytecznymi syntonami w asymetrycznej syntezie chemicznej prowadzącej do uzyskania substancji posiadających określoną aktywność biologiczną, w tym leków [Brzezińska-Rodak i in. 2006]. Najczęściej wykorzystuje się do tego celu droŝdŝe piekarskie, ale znaleźć teŝ moŝna liczne przykłady uŝycia zarówno bakterii, jak i grzybów [Maconi i Aragozzini 1989, Yamazaki i Kobayashi 1993, Molinari i in. 1999]. Reakcje redukcji ketonów prowadzić moŝna przy udziale izolowanych enzymów bądź całych komórek; oba sposoby mają swoje wady i zalety. UŜycie czystych enzymów na ogół daje powtarzalne rezultaty, jednak do wad tej metody zaliczyć naleŝy ograniczoną moŝliwość wielokrotnego zastosowania danego preparatu, jako Ŝe z cza- Adres do korespondencji Corresponding author: Ewa Brzezowska, Katedra Chemii, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25, Wrocław, brzez@ozi.ar.wroc.pl

2 106 E. Brzezowska i in. sem enzymy ulegają dezaktywacji, jak i konieczność uŝycia i regeneracji drogich kofaktorów. W przeciwieństwie do tego, przygotowanie całych komórek na ogół nie nastręcza większych problemów ze względu na niski koszt prowadzenia hodowli oraz nieskomplikowaną aparaturę potrzebną do jej utrzymania. UŜycie kofaktorów enzymów nie jest konieczne (NADH, NADPH), gdyŝ ich obecność jest spowodowana metabolizowaniem substancji odŝywczych. śywe komórki, wśród nich oczywiście i komórki mikroorganizmów zawierają cały zestaw enzymów zdolnych do przeprowadzenia reakcji redukcji związków karbonylowych, wśród nich jedną lub kilka dehydrogenaz alkoholowych, zdolnych do wzajemnych przekształceń funkcji hydroksylowej i karbonylowej szeregu związków organicznych. MoŜe to stanowić wadę metody, gdyŝ moŝe się zdarzyć, Ŝe dwa enzymy (lub więcej) dają produkty o przeciwnej konfiguracji absolutnej i otrzymuje się produkt częściowo racemiczny. Z drugiej strony moŝe to stanowić równieŝ zaletę, gdyŝ w takim przypadku zmiana struktury (modyfikacja) substratu lub warunków prowadzenia procesu moŝe dać sposobność otrzymania produktu o określonej (lub przeciwnej do niej) konfiguracji. Tak więc wiele mikroorganizmów posiada zdolność stereospecyficznej redukcji grupy karbonylowej. NaleŜy więc zaznaczyć, Ŝe struktura otrzymanego produktu zaleŝy od chiralności dehydrogenazy alkoholowej, w którą wyposaŝony jest dany mikroorganizm. Ten sam enzym moŝe przekształcać keton albo w produkt o konfiguracji absolutnej R albo S, w zaleŝności od stosunku stabilności termodynamicznej ketonu do alkoholu: stabilniejsze ketony redukowane są wodorem pro S, mniej stabilne pro R. Większość tych redukcji zachodzi zgodnie z regułą Preloga, zgodnie z którą enzym prowadzący reakcję dzięki wspomnianej chiralności jest w stanie odróŝnić wielkość podstawników grupy karbonylowej w niesymetrycznym ketonie z utworzeniem enancjomeru o konfiguracji absolutnej S. Gremmeniella abietina (Lagerb.) Morelet (syn. Scleroderris lagerbergii Gremmen) naleŝy do workowców (Ascomycotina) do klasy Discomycetes, rzędu Heliotiales. Jest patogenicznym gatunkiem grzyba wywołującym choroby sosen: odwierzchołkowe zamieranie oraz okołowierzchołkowa zgorzel pędów (skleroderiozę) [Kowalski i Domański, 1983]. Obecność tego gatunku stwierdzono w kilkunastu krajach europejskich oraz USA, Kanadzie i Japonii. Obserwacje fitopatologiczne wskazują na występowanie chłodów oraz wilgoci jako czynników sprzyjających występowaniu poraŝeń wywoływanych rozwojem G. abietina [Kowalski 1987, Kowalski 1990]. Zainteresowanie zdolnością do transformacji kolejnej grupy substratów organicznych przez szczep G. abietina pochodzący z kolekcji Katedry Fitopatologii Leśnej Akademii Rolniczej w Krakowie spowodowane było naszymi wcześniejszymi obserwacjami wskazującymi na zdolność do utleniania wiązania C H w pozycji allilowej, jak teŝ selektywnych przemian oksydoredukcyjnych z udziałem grupy karbonylowej w związkach steroidowych [Brzezowska 1997]. W celu poznania zdolności do prowadzenia redukcji grupy karbonylowej przez wybrany mikroorganizm uŝyto następujących substratów: acetofenon [1], o-metyloacetofenon [2], m-metyloacetofenon [3], o-metoksyacetofenon [4], α,α,α-trifluoroacetofenon [5]. Acta Sci. Pol.

3 Enancjospecyficzna redukcja ketonów MATERIAŁY I METODY UŜyte do badań substraty: acetofenon, o-metyloacetofenon, m-metyloacetofenon, o-metoksyacetofenon oraz α,α,α-trifluoroacetofenon pochodziły z firmy Fluka; próbki wzorców odpowiadających im alkoholi uŝyte do celów analizy w chromatografii gazowej (GC) otrzymano redukując wymienione ketony borowodorkiem sodu w mieszaninie wodno-metanolowej bez izolowania preparatywnego. Transformacje prowadzono w kolbach stoŝkowych o pojemności 250 cm 3, zawierających 50 cm 3 poŝywki o składzie 3% glukozy i 1% peptonu. Do optymalnego wzrostu szczep wymagał temperatury nie wyŝszej niŝ 16 C oraz długiego czasu hodowli (do 4 tygodni). Dobry narost kultur obserwowano w temperaturze poniŝej 10 C. Substraty dodawane były do 27-dniowej kultury mikrostrzykawką w stęŝeniu nie przekraczającym 1.0 g w 1 dm 3 poŝywki. Transformacje prowadzono metodą wgłębną w róŝnym czasie: od 1 do 7 dni, w zaleŝności od szybkości redukcji substratu, która zaleŝała zarówno od budowy substratu, jak i uŝytego mikroorganizmu. Przebieg reakcji kontrolowano w czasie, pobierając strzykawką (w warunkach sterylnych), około 5 cm 3 mieszaniny reakcyjnej. Produkty transformacji ekstrahowano eterem etylowym, a ekstrakty suszono bezwodnym siarczanem magnezu. Skład mieszanin po transformacji oznaczono w chromatografii cienkowarstwowej (TLC) uŝywając następujących eluentów (v/v): heksanaceton (8:1), heksan-chloroform-izopropanol (10:9:1) przez porównanie wartości R f z wzorcami. Czystość optyczną alkoholi oznaczono za pomocą GC na podstawie czasów retencji z uŝyciem wzorców, wykorzystując kolumnę z wypełnieniem chiralnym (permetylowana cyklodekstryna) na aparacie Hewlett Packard 5890 Series II wyposaŝonym w detektor płomieniowo-jonizacyjny. Temperatury dozownika i detektora wynosiły 200 C, początkowa temperatura kolumny wynosiła 140 C i utrzymywana była przez 15 min, następnie narost w tempie 2 C/min do 200 C i temp. końcowa utrzymywana przez 2 minuty. Wydajność chemiczna określona była na podstawie ilości produktu wyizolowanego w drodze chromatografii kolumnowej na Ŝelu krzemionkowym G firmy Merck o wielkości ziaren odpowiadającej mesh stosując eluenty, jak w TLC. WYNIKI Transformacje prowadzono w róŝnym czasie: od 1 do 7 dni, w zaleŝności od szybkości redukcji substratu, która zaleŝała od jego budowy. Wyniki podane są w tabeli 1. Wszystkie spośród pięciu badanych substratów uległy stereospecyficznej transformacji, a w wyniku reakcji otrzymano alkohole drugorzędowe o róŝnej czystości optycznej mierzonej jako nadmiar enancjomeryczny enancjomeru będącego w przewadze. Wydajności reakcji redukcji badanych acetofenonów zaleŝały w sposób jednoznaczny od struktury substratu. Wprowadzenie do pierścienia aromatycznego acetofenonu [1] podstawnika metylowego w pozycję meta, zwiększając objętość tej części cząsteczki, daje pewne zwiększenie wydajności otrzymywanego alkoholu przy znacznym polepszeniu jego czystości optycznej. Biotechnologia 5(1-2) 2006

4 108 E. Brzezowska i in. Tabela 1. Przebieg redukcji acetofenonu i jego pochodnych w kulturze G. abietina Table 1. Reduction course of acetophenone and its derivatives in G. abietina culture Substrat Substrate [1] O Czas transformacji [dni] Transformation period [days] wydajność chemiczna [%] chemical yield Produkt Product czystość optyczna [ee, %] {konfiguracja abs.} optical purity {absolute configuration} {S} {S} [2] O {S} {S} [3] O {S} {S} [4] O {R} [5] O O F F F {R} {R} Acta Sci. Pol.

5 Enancjospecyficzna redukcja ketonów DYSKUSJA WYNIKÓW I WNIOSKI G. abietina okazał się bioreagentem zdolnym do stereospecyficznej redukcji ketonów aromatycznych przebiegającej zgodnie z poniŝszym schematem: Ar O R HO Ar H R + Ar H OH R [1] [5] [1A] [5A] [1B] [5B] gdzie Ar jest podstawnikiem o charakterze aromatycznym i duŝym objętościowo, natomiast R, podstawnik o małej objętości, jest grupą metylową w czterech przypadkach (substraty [1] [4]), lub trifluorometylową (substrat [5]). Nie we wszystkich przypadkach redukujący atom wodoru dostarczany jest przez bioreagent do cząsteczki substratu z tej samej strony grupy karbonylowej. Określenie konfiguracji absolutnej enancjomerycznych produktów redukcji okazało się moŝliwe dzięki temu, Ŝe przy rozdziale chromatograficznym na kolumnie cylkodekstrynowej enancjomery [1B] [5B] miały krótsze czasy retencji niŝ enancjomery [1A] [5A], co ustalone zostało w wyniku wcześniejszych badań z wykorzystaniem tej samej kolumny [Jarosz i Siewiński 1996]. W przypadku badanych dwóch pochodnych podstawionych w pozycji orto w pierścieniu aromatycznym wyniki mogłyby wydawać się niejednoznaczne. Wprowadzenie nawet tak małego podstawnika, jak grupa metylowa w najbliŝsze otoczenie reaktywnego ugrupowania substratu (a więc i w pobliŝe centrum aktywnego enzymu w trakcie procesu) najwyraźniej utrudnia przebieg reakcji i wydajność alkoholu spada. Z drugiej strony przejście od [2] do [4], czyli zamiana grupy metylowej na metoksylową oznacza zwiększenie objętości podstawnika w newralgicznym miejscu cząsteczki, jednak wydajność otrzymanego produktu jest istotnie większa dla [4] niŝ dla [2]. Wydaje się, Ŝe przeciwna konfiguracja absolutna orto-metoksy-1-fenyloetanolu w stosunku do orto-metylo-1-fenyloetanolu świadczy o występowaniu dwóch róŝnych dehydrogenaz zdolnych do prowadzenia reakcji redukcji ketonów. PrzedłuŜenie czasu reakcji w kaŝdym przypadku zwiększało wydajność produktu przy jednoczesnym zmniejszeniu czystości optycznej. Świadczy to o odwracalności zachodzącego w środowisku Ŝywego organizmu procesu oksydoredukcyjnego, co zgodne jest z wcześniejszymi obserwacjami z naszego laboratorium [Jarosz 1997]. Otrzymane wyniki wskazują na to, iŝ nawet jedna z najprostszych pod względem chemicznym reakcji podatna jest na obecność chiralnego otoczenia, jakie zapewnia układ enzymatyczny Ŝywej komórki. Jednocześnie daje to pewne moŝliwości sterowania procesem poprzez dobór czasu reakcji, modyfikacji substratu, a zapewne teŝ i samego bioreagenta. Biotechnologia 5(1-2) 2006

6 110 E. Brzezowska i in. PIŚMIENNICTWO Brzezińska-Rodak M., śymańczyk-duda E., Klimek-Ochab M., Kafarski P., Lejczak B., A simple and green procedure for the microbial effective synthesis of 1-phenylethyl alcohol in both enantiomeric forms. Biotechnol. Lett. 28, Brzezowska E., Transformacje mikrobiologiczne wybranych substratów steroidowych w kulturze Gremmeniella abietina. Zesz. Nauk. AR Wroc., ser. Technol. śywn. 11, Jarosz B., Wstępne rozpoznanie reaktywności wybranych substratów organicznych w kulturze Nigrospora oryzae. Zesz. Nauk. AR Wroc., ser. Technol. śywn. 11, Jarosz B., Siewiński, A., Enantiospecific reduction of prochiral ketones of aromatic type to optically active alcohols in Nigrospora oryzae culture. J. Basic Microbiol. 36, Kowalski T., Domański, S., Występowanie i przyczyny odwierzchołkowego zamierania pędów Pinus nigra, P. silvestris i P. strobus w niektórych drzewostanach południowej Polski w latach Acta Agraria et Silvestria 22, Kowalski T., Fungi Infecting The Shoots And Stems of Pinus sylvestris And P. nigra In Southern Poland. [In:] Scots Pine Diseases. 7th European Colloquium of Forest Patholgists and the members of two IUFRO Working Parties, Proceedings of an international symposium, Kórnik, Poland, May 1989; Kurkela, T.; and Siwecki, R., ed.; Bulletins of the Finnish Forest Research Institute 360, Helsinki, Kowalski T., PoraŜenie sosny czarnej przez Gremmeniella abietina (= Scleroderris lagerbergii) w lasach Górnośląskiego Okręgu Przemysłowego. Sylwan 131, Maconi E., Aragozzini F., Stereoselective reduction of non-cyclic ketones with lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, Molinari, F., Gandolfi, R., Villa, R., Occhiato, E.G.,1999. Lyophilised yeasts: easy-to-handle biocatalysts for stereoselective reduction of ketones. Tetrahedron: Asymmetry 10, Nakamura, K., Yamanaka, R., Matsuda, T., Harada, T Recent developments in asymmetric reduction of ketones with biocatalysts. Tetrahedron: Asymmetry 14, Yamazaki Y., Kobayashi H., Stereoselectivity in the Microbial Reduction of (Trifluoroacetyl)ferrocene and 2-Fluoroacetophenones. Tetrahedron: Asymmetry 4, ENANTIOSPECIFIC REDUCTION OF AROMATIC KETONES IN A GREMMENIELLA ABIETINA CULTURE Abstract. A Gremmeniella abietina strain, a Scots pine pathogenic fungus, was used to investigate its ability to reduce five selected acetophenones, aromatic prochiral ketones. In all cases enantiospecificity of the process was recorded, and the enantiospecificity, calculated as the enantiomeric excess, as well as resulting secondary alcohol yield, depended on the reaction time and the structure of a given substrate. Key words: Gremmeniella abietina, biotransformation, enantiospecificity, ketone reduction Zaakceptowano do druku Accepted for print: Acta Sci. Pol.