O elektryczności neuronalnej i kanałach jonowych nieco więcej

Transkrypt

1 O elektryczności neuronalnej i kanałach jonowych nieco więcej

2 4.13 Molecular structure of the Na + /K + pump. (Part 1)

3 4.11 Ionic movements due to the Na + /K + pump. (Part 1) Np. przez dinitrofenol blokujący syntezę ATP Doświadczenia lat 50-tych z izotopem Na i blokowaniem ATP-azy ouabainą (g-strofantyna) Strophanthus gratus i Acokanthera ouabaio

4 4.12 Electrogenic transport of ions by the Na + /K + pump can influence membrane potential. Po silnym pobudzeniu neuronu/aksonu następuje stymulacja ATP-azy która w efekcie prowadzi do hyperpolaryzacji błony. Ouabaina zapobiega hyperpolaryzacji w takim eksperymencie.

5 Potencjał spoczynkowy różni się od potencjału równowagi dla potasu (jak również od pozostałych jonów!) E K = -102mV E Cl = -76mV E Na = 56mV E Ca = 125mV Różne populacje komórek w CSN mają różne wartości potencjału spoczynkowego. Mogą wartości zależeć od pory dnia, np. neurony wzgórza są hyperspolaryzowane w nocy zmniejszając w ten sposób impulsację dokorową.

6 Prąd jonowy Ruch określonych jonów poprzez błonę komórkową jest zależny od: różnicy potencjału spoczynkowego E m i potencjału równowagi dla określonego jonu np. dla potasu E k Przewodnictwa błony dla określonego jonu (odwrotność oporu elektrycznego zgodnie z prawem Ohma tj. i = V/R). Jeśli E m = E k prądu nie ma. Dla potasu: I k = g k (E m E k ) gdzie I k oznacza prąd jonowy potasu; g k oznacza przewodnictwo dla potasu (g = 1 Siemen gdy 1 volt powoduje przepływ 1 ampera)

7 Box A Voltage Clamp Method Kenneth Steward Cole Techniki opracowanej przez Kennetha S. Cole a tej używali w latach 50-tych Hodgkin i Huxley (nobel 1963)

8 3.5 Pharmacological separation of Na + and K + currents into components. Chlorek czteroetyloamoniowy doświadczenia z lat 60-tych

9 Wyniki badań Hodgkina i Huxley a nad przewodnictwem jonowym w zależności od napięcia błonowego w eksp. Voltage-clamp

10 Potencjał spoczynkowy a stężenie jonów potasu Uwaga: stężenie wewnątrzkomórkowe potasu u kałamarnicy ok. 400 mm Hodkin i Katz w 1949 r eksperymenty (na aksonie kałamarnicy) ze zmianą stężenia pozakomórkowego K Potencjał równowagi zachowuje się prawie zgodnie z równaniem Nernsta

11 Dowód, że potencjał spoczynkowy określa głównie gradient stężenia potasu Czarna linia predykcja potencjału zgodnie z równaniem Nernsta Czerwona linia rzeczywiste dane pomiarowe potencjału Wykresy najbardziej się różnią dla niższych stężeń potasu (wpływ innych jonów)

12 Błona komórkowa jest znacznie bardziej przepuszczalna dla K niż dla innych jonów Wniosek: potas najbardziej wpływa na zachowanie potencjału błonowego

13 Rola sodu w gerneracji potencjału czynnościowego Wniosek Hodgkina i Katza : w czasie Pcz następuje gwałtowny wzrost przepuszczalności dla sodu

14 O wartości maks. potencjału czynnościowego decyduje stężenie pozakomórkowe sodu (limituje potencjał równowagi dla sodu) O wartości potencjału spoczynkowego decyduje stężenie potasu (wniosek: w potencjale spoczynkowym dominuje przewodnictwo potasowe)

15 Box B Action Potential Form and Nomenclature Pcz w różnych neuronach ma różny kształt ( waveform ) ale wnioski z eksperymentów na kałamarnicy zasadniczo obowiązują wszędzie A- squid, B akson motoneuronu żaby, C ciało motoneuronu żaby, D- neuron oliwki guinea pig, E- kom.purkinjego guinea pig Różne kształty Pcz są związane z dodatkowymi prądami (kanałami) jonowymi (Ca-, Kir)

16 Kanały jonowe

17 Techniki patch-clamp otworzyły drogę do poznania bardzo wielu kanałów jonowych o różnych własnościach Typy kanałów jonowych: 1) napięciowo-zależne 8) kanały przeciekowe (leakage channels) 2) aktywowane ligandem 3) aktywowane fizyczną zmianą kształtu (rozciąganiem) 4) zależne od temperatury (z rodziny TRP) 5) zależne od kwasowości (ph acid sensing ion channels (ASICs) 6) kanały zależne od cyklicznych nukleotydów (cgmp,camp) 7) aktywowane światłem (channelrhodopsin 1-2 algi)

18 Technika patch-clamp (Erwin Neher, Bert Sakmann 1976 Max Planck Inst. GoettingenNobel 1991) umożliwiła badanie przepływów jonowych (prądów) dla indywidualnych kanałów. Ostatecznie udowodniła istnienie kanałów jonowoselektywnych a jednocześnie potwierdziła wcześniejsze postulaty odnośnie istnienia takich kanałów proponowane przez Hodgkina i Huxley a Box A The Patch Clamp Method (Part 1)

19 Box A The Patch Clamp Method (Part 2)

20 4.4 Types of voltage-gated ion channels.

21 Techniki patch-clamp: droga do poznania bardzo wielu kanałów jonowych o różnych własnościach W badaniach wykorzystuje się techniki genetyki molekularnej szczególnie na modelu oocytów żaby z rodzaju Xenopus Obecnie znamy ponad 100 genów (najwięcej dla K) dla kanałów jonowych Ponadto splicing oraz edycja RNA a także zmiany posttranslacyjne (fosforylacja) gwałtownie zwiększają różnorodność.

22 Równanie prądu jonowego obowiązuje dla pojedynczego kanału (np. potasowego) i s = g s (E m E k ) Przeciętny kanał jonowy posiada przewodność średnią ok. 20 ps (pikosiemensów czyli S) Dla gradientu napięcia 50mV i przewodności 20pS, prąd przechodzący przez pojedynczy kanał wynosi A (ampera) = ok. 6 mln jednowartościowych jonów/sek. (1A = ok. 6 x ładunków elektrycznych / sek)

23 4.1 Measurements of ionic currents flowing through single Na + channels. Prądy dośrodkowe Makroskopowy prąd sodowy jest sumą mikroskopowych prądów pojedynczych (napięciowozależnych) kanałów

24 4.2 Measurements of ionic currents flowing through single K + channels. Makroskopowe prądy potasowe dozewnątrz (outward) również są zsumowanymi prądami kanałów potasowych Zarówno kanał potasowy jak i sodowy muszą posiadać voltage sensor strukturę wyczuwającą napięcie

25 4.8 Structure of a simple bacterial K + channel determined by crystallography. (Part 1) Tetramer zbudowany z 4 podjednostek

26 4.8 Structure of a simple bacterial K + channel determined by crystallography. (Part 2) Ujemne ładunki helisy odwadniają jony K Przechodzą tylko nieuwodnione jony K+

27 UWAGA! Wykryto również napięciowozależne kanały Na które nie są inaktywowane depolaryzacją i prowadzące do długotrwających Pcz (blokowane przez lidokainę, benzokainę) Eksperymenty z patch-clamp wykazały podobieństwa i różnice pomiędzy różnymi kanałami jonowymi Podobieństwa kanałów K i Na: jonoselektywność, zależność prawdopodobieństwa otwarcia od napięcia, zamykanie kanałów Na i K przez hyperpolaryzację różnice kanałów K i Na: w kinetyce otwarcia (szybkość, czas otwarcia), depolaryzacja w kanale Na prowadzi oprócz otwarcia także do jego inaktywacji ale nie w przypadku kanału potasowego

28 Kanały potasowe są najbardziej zróżnicowane (różnią się np. czasem inaktywacji od milisekund do minut i innymi cechami) Kanały potasowe napięciowozależne Kanały potasowe wapniowo-zależne 1. Maxi K ps, blokowane przez charybdotoksynę (ze skorpiona) 2. Kanały o pośrednim przewodnictwie (18-80 ps) aktywowane obrzękiem komórek 3. małe kanały potasowe ps, blokowane przez toksynę pszczół apaminę Dośrodkowe prostowniki (inward rectifiers) M.in. wrażliwe na ATP blokowane przez glibenclamid i tolbutamid Kanały potasowe z podwójną domeną wewnętrznego otworu (2-pore domain=tandem pore domain, tzw. leak channels) (dimery!) M.in. kanały zależne od ph

29 4.6 Topology of principal subunits of voltage-gated, K +, 2-pore (tandem) zbudowany z 2 podj. Pozostałe z 4 podj.

30 Dwie zasadnicze podgrupy kanałów potasowych: 1. prostujące kanały odkomórkowe Rola w hyperpolaryzacji następczej występującej w przebiegu potencjału czynnościowego 2. dokomórkowe kanały prostujące (K-ir) K-ir grają istotną rolę w kontroli i regulacji potencjału spoczynkowego oraz wartości potencjału progowego.

31 Różne własności typów kanałów K +. Eksperymenty na oocytach X.laevis z ekspresją różnych typów kanałów K i pomiarami technika voltage-clamp Kir = Kanały K częściowo napięciowozależne

32 Potasowe dowewnątrz prostujące kanały jonowe (K-ir) Cechy: - osłabione przewodnictwo w warunkach depolaryzacji - podwyższone w warunkach hyperpolaryzacji - zdolność do wytwarzania większego dokomórkowego napływu jonów niż wypływu. - Blokowanie kierunku od (wypływu jonów potasowych) w warunkach depolaryzacji jest skutkiem działania wewnątrzkomórkowego magnezu (Mg2+) oraz polyamin (spermina, putrescyna, spermidyna).

33 dośrodkowe prostujące kanały potasowe pozwalają na dłuższe odpowiedzi depolaryzacyjne np. w sercu (gdzie potencjał czynnościowy trwa msec), grają rolę w tzw fertilization potential w komórkach jajowych (który trwa minuty). Zapobiegają utracie K + w czasie przedłużonej depolaryzacji i mogą pozwalać na re-entry K + T-tubul w mięśniach.

34 Ekspresja Kir w ślimaku Immunohistochemiczna lokalizacja Kir4.1 w ślimaku szczura. (p-ciało anti-kir4.1):. Kir4.1 w zwoju spiralnym ślimaka, w stria vascularis, w komórkach Deiters a i komórkach kolumnowych (pillar cells) organu Cortiego (mała strzałka).

35 4.6 Topology of principal subunits of voltage-gated Na channels. (Part 1) Kanał Na zbudowany z 1 podj α (gen SCN1A) i 1-2 podj β (regulacyjne) - gen SCN1B Jest 9 typów podj α

36 Przykłady ( channelopathies ) Nie ma wytłumaczenia dlaczego określona mutacja kanału jonowego powoduje dane objawy Różne typy mutacji danym kanale jonowym różnią się także fenotypowo (objawami). Zwykle mutacje missense łagodniejsze od trunkacji. Istotne także miejsce mutacji missense. 1. Zaburzenia napięciowo-zależnych kanałów wapniowych (Ca): 1. Familial hemiplegic migraine (FHM) = (rodzinna migrena z hemiplegią) 2. Episodic ataxia type 2 (EA2) 3. X-linked congenital stationary night blindness (CSNB) 2. Defekt genu kanału sodowego (Na): SCN1A (dla α-podj) 1. Generalized epilepsy with febrile seizures plus (GEFS+) 2. Zesp. Dravet = severe myoclonic epilepsy of infancy (SMEI) w 95% mutacje SCN1A to nowe mutacje! Początek w 1-r.ż, spowolnienie rozwoju 3. Defekt genu kanału sodowego (Na): SCN1B (dla β-podj) 1. Generalized epilepsy with febrile seizures plus (GEFS+) 4. Defekt kanałów potasowych (K) 1. Benign familial neonatal convulsions (BFNC) objawy drgawek zanikają po okresie noworodkowym

37 Przykłady chorób spowodowanych nieprawidłowością działania kanałów 1. Mukowiscydoza: zmutowany kanał chlorkowy (epithelium chloride channel Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR) 2. Zesp. Bartter a : Alkaloza, hipokaliemia, hyperaldosteronizm, hyperreninemia, bez nadciśnienia (brak odpowiedzi na aldosteron), zab. wzrastania, słabość mięśniowa, zaparcia, wielomocz.: mutacja napięciowozależnego kanału chlorkowego. 3. Myotonia congenita: Inna mutacja tego samego kanału (napięciowozależnego kanału chlorkowego). 4. Cholera: biegunka działanie toksyny bakteryjnej pobudzającej camp w nabłonku jelita co pobudza kanał CFTR i wywołuje sekrecję chloru do światła jelita. (w mukowiscydozie toksyna nie działa!). 5. Rodzinna hypoglikemia z hyperinsulinizmem; mutacja ATPzależnego kanału potasowego w komórkach beta trzustki powoduje, że kanał stymuluje wydzielanie insuliny 6. Zesp. Liddle a: wrodzone nadciśnienie: nadaktywność kanału sodowego w nabłonkach. 7. Zesp. Lamberta-Eatona (miasteniczny): przeciwciała przeciw kanałom Ca

38 Aktywowane ligandem kanały jonowe nie są zazwyczaj tak wysokoselektywne dla określonych jonów jak kanały napięciowo-zależne Oprócz błony cytoplazmatycznej obecne są w błonach organelli wewnątrzkomórkowych Kanały K aktywowane wapniem, kanały aktywowane cyklicznymi nukleotydami oraz ASICs mają wewnątrzkomórkowe domeny detekcji ligandu (Kanały aktywowane cykl. nukleotydami graja rolę m.in. w węchu i recepcji światła)!

39 Technika patch-clamp w badaniu kanałów jonowych aktywowanych ligandem A) Eksperyment typu outside-out pipeta zawiera roztwór o składzie podobnym do cytoplazmy. Na zewnątrz błony z kanałem roztwór jest podobny do zewnątrzkomórkowego. Mierzone jest natężenie prądu. Natomiast woltaż jest stabilizowany na dowolnie wybranej wartości

40 Technika patch-clamp B) Przepływ prądu płynącego przez pojedynczy kanał jonowy po podaniu od zewnątrz acetylocholiny (Ach) w sposób ciągły. Prąd PŁYNIE W POSTACI IMPULSÓW.( wszystko-albo-nic ). Zwiększenie stężenia Ach nie powoduje zmiany natężenia prądu lecz wzrost PRAWDOPODOBIEŃSTWA otwarcia kanału! Czas otwarcia jest różny ale amplituda (natężenie prądu) zawsze ta sama. Efekt postsynaptyczny jest wynikiem sumowania potencjałów z wielu kanałów jonowych.

41 Technika patch-clamp z kanałem receptorowym: podawanie N-T przy zmienianych wartościach potencjału stabilizowanego napięcia

42 Technika patch-clamp kanałem receptorowym: podawanie N-T przy zmienianych wartościach potencjału stabilizowanego napięcia oraz zmienianych stężeń jonów: wnioski: 1) Po związaniu z NT częstotliwość i średni czas otwarcia kanału są niezależne od napięcia 2) Kierunek i amplituda prądu zależy od napięcia. 3) Kierunek prądu dąży do osiągnięcia równowagi zgodnie z równaniem Goldmana-Hodgkina-Katza. 4) Testowany kanał jest tak samo przepuszczalny dla K+ i Na+ (ale różne kanały odpowiedzialne za wytwarzanie EPSP są różnie przepuszczalne dla K+ i dla Na+.) I sc = sc (V m E r ) Single channel reversal (null) potential receptora, w tym przyp.= 0 (Są one różne dla różnych receptorów) Prąd płynie na zewnątrz

43 Kablowe właściwości neuronów i ich wypustek

44 3.10 Passive current flow in an axon. (Part 1)

45 Elektrotonus, potencjały elektrotoniczne Potencjały podprogowe: rozprzestrzenianie biernie (elektrotoniczne) osłabienie: a) z odległością od miejsca ich powstania b) z upływem czasu. Własności elektrotoniczne neuronów nazywane są też właściwościami kablowymi

46 Kablowe właściwości neuronu Równanie kablowe: opis relacji (zmian) napięcia wzdłuż (modelowej) wypustki neuronu do odległości i czasu jego rozwiązanie: V x = V 0 e x/ V t = V 0 e t/ = tzw. stałą długości (length constant, space constant, characteristic length) = odległość od punktu 0, w której napięcie zmniejszy się do 37% wartości w punkcie 0.

47 Box C Passive Membrane Properties (Part 1) V x = V 0 e x/

48 Electrotoniczny zanik napięcia wzdłuż niezmielinizowanego (schemat górny) i zmielinizowanego (schemat dolny). Stała długości (Length constant - λ) jest większa w aksonie zmielinizowanym i dlatego lokalne prądy operują na dalszym dystansie wzdłuż aksonu.

49