Spis treści. Wstęp. Termodynamika szuka odpowiedzi na pytania: Jaka równowaga została osiągnięta? Jak system doszedł do równowagi?

Transkrypt

1 Spis treści 1 Wstęp 2 Podstawowe pojęcia termodynamiczne 21 Entalpia 211 Właściwości entalpii 212 Prawo Hessa 22 Entropia 23 Energia swobodna 24 Entalpia 25 Entropia 3 Podstawowe wiadomości o równowagach 31 Teoria kolizji 4 Historia 5 Dwa typy eksperymentów kalorymetrycznych 51 Kalorymetr ITC 511 VP-ITC 512 ITC Techniki inicjalizacji reakcji 513 Etapy eksperymentu ITC 514 Plan eksperymentu na podstawie wykonanych symulacji 515 Parametr sigmoidalności 516 Co zrobić jeśli nie można wyznaczyć bezpośrednio parametrów termodynamicznych? 517 Zebranie danych pomiarowych 518 Przepływ protonów 519 Analiza danych kalorymetrycznych 5110 Przykłady 52 ITC enzymatyczne eksperymenty kinetyczne 521 Pojedyncze wstrzyknięcie 522 Wielokrotne wstrzyknięcia 523 Projektowanie enzymatycznego eksperymentu kinetycznego 53 DSC różnicowa kalorymetria skaningowa (Differential Scanning Calorimetry) 531 Eksperyment DSC 532 Zastosowania DSC 533 Schemat denaturacji białka Wstęp Termodynamika matematyczny opis ciepła i jego związku z energia mechaniczną i pracą Umożliwia przewidywanie czy reakcja chemiczna (biochemiczna) będzie zachodziła, w jakim kierunku i kiedy osiągnie stan równowagirozważa zależności między układem a otoczeniem Termodynamika szuka odpowiedzi na pytania: Jaka równowaga została osiągnięta? Jak system doszedł do równowagi?

2 Jak system zachowa się w odpowiedzi na jego zaburzenie? Metody badania : wprowadzenie zaburzenia układu, obserwacja zmian, dopasowanie modelu Czynniki zaburzające układ: denaturanty, ciepło, sól, rozpuszczalniki, ligandy Termodynamiczne metody pomiaru: kalorymetria: DSC : kalorymetria skaningowa (Differential Scanning Callorimetry) ITC : kalorymetria miareczkująca (Isothermal Titration Callorimetry) Osmometria Podstawowe pojęcia termodynamiczne Stan termodynamiczny to wartość wszystkich funkcji stanu (np ciśnienie, objętość, temperatura, masa, entropia, energia wewnętrzna) układu termodynamicznego w określonej chwili Przejście z jednego stanu termodynamicznego do drugiego nazywane jest przemianą termodynamiczną Klasyfikacja podstawowych przemian termodynamicznych przemiana izobaryczna (stałe ciśnienie ), przemiana izotermiczna (stała temperatura ), przemiana izochoryczna (stała objętość ), przemiana adiabatyczna (brak wymiany ciepła z otoczeniem ) W zależności od relacji pomiędzy układem i otoczeniem możemy mówić o układach: otwartych wymieniających z otoczeniem energię i materię, zamkniętych wymieniających tylko energię, materia pozostaje stała, izolowanych nie wymieniają z otoczeniem energii i materii, izotermicznych układy pozostające w stałej temperaturze, adiabatycznych izolowanych termicznie od otoczenia (energia może być wymieniana jako praca, a nie jako ciepło) Zerowa zasada termodynamiki = prawo równocenności stanów układów termodynamicznych: Jeśli układy A i B mogące ze sobą wymieniać ciepło są ze sobą w równowadze termicznej, i to samo jest prawdą dla układów B i C, to układy A i C również są ze sobą w równowadze termicznej Sposoby przekazywania energii:

3 ciepło transfer energii w wyniku bezładnego ruchu, wynikający z różnicy temperatur układu i otoczenia, praca transfer energii w wyniku ruchu uporządkowanego (wydatek energii przeciwko działającej sile): Całkowita ilość energii w układzie to energia wewnętrzna, możemy mierzyć tylko jej zmiany Wielkości termodynamiczne możemy podzielić na: funkcje stanu wartość zależy od stanu układu w danym momencie, np objętość, ciśnienie, energia wewnętrzna, entropia, funkcje zależne od drogi wartość zależy od drogi, na której układ zmienia się od jednego stanu do drugiego (praca, ciepło) Pierwsza zasada termodynamiki: Całkowita energia układu izolowanego jest stała Układ może zmieniać swój stan energetyczny na drodze wykonania pracy lub oddania/pobrania ciepła Praca i ciepło są funkcjami zależnymi od drogi Przy zmianie energii wewnętrznej układu ilość utraconej na skutek wykonania pracy lub poboru ciepła zależy od tego jak wydajnie wydobywana jest energia (samochód) Praca objętościowa (najczęściej spotykana) Gdy wydziela się gaz w reakcji pod stałym ciśnieniem praca polega na rozszerzaniu otoczenia (balon): Zmiana energii wewnętrznej: Pojemność cieplna jeśli do układu dostarczamy energię w postaci ciepła to wzrost temperatury jest proporcjonalny do ilości dostarczonego ciepła, a współczynnikiem proporcjonalności jest pojemność cieplna Pojemność cieplna w stałej objętości Pojemność cieplna przy stałym ciśnieniu Dla stałej objętości ciepło dostarczone jest równe zmianie energii wewn:

4 Molowa pojemność cieplna temperatury, im większa tym więcej ciepła potrzeba do osiągnięcia wzrostu Entalpia Reakcje biochemiczne zachodzą w warunkach stałego ciśnienia przy małych zmianach objętości Gdy ciśnienie jest stale, a wykonywana pracą jest jedynie praca objętościowa mamy: Entalpię definiujemy jako Dla zmiany skończonej pod stałym ciśnieniem mamy Jeśli jedyną wykonaną pracą jest praca objętościowa to zmiana entalpii w procesie równa jest ciepłu wymienionemu w układzie pod stałym ciśnieniem: W przypadku reakcji gazu doskonałego, w której wydziela się lub zużywa ciepło zmiana entalpii wynosi: gdzie zmiana liczby moli cząsteczek składnika gazowego, stała gazowa, temperatura Właściwości entalpii Funkcja stanu, Nie można podać bezwzględnej wartości entalpii, można mierzyć jej zmiany \Delta H związane z utratą lub dostarczeniem ciepła Proces endotermiczny, wzrost temperatury Proces egzotermiczny, spadek temperatury Zmiana entalpii wynikająca ze zmiany temperatury przy stałym ciśnieniu: W reakcji chemicznej zmiana entalpii równa jest różnicy entalpii produktów i substratów: (bo funkcja stanu)

5 Prawo Kirchhoffa: ponieważ entalpia każdego ze składników zmienia się wraz z temperaturą zależy również od temperatury: Gdy zmianę wraz z temperaturą można zaniedbać: Zmiany entalpii zależą od temperatury, ciśnienia, ilości i stanu skupienia substratów i produktów Prawo Hessa Całkowita zmiana entalpii w reakcji jest równa sumie zmian entalpii w oddzielnych etapach reakcji, mierzonych w tej samej temperaturze Często spotykane zmiany entalpii: jonizacji, przyłączenia, parowania, sublimacji, reakcji, spalania, tworzenia, rozpuszczania Entropia Proces odwracalny kierunek przepływu energii może zostać zmieniony w każdym momencie przez zmianę warunków W czasie trwania procesu układ jest w równowadze, wymiana energii następuje nieskończenie powoli Proces nieodwracalny kierunek przepływu energii nie może zostać zmieniony W praktyce cześć energii jest rozpraszana jako ciepło, którego nie można odzyskać i w celu odtworzenia warunków wyjściowych należy wykonać pracę Zmiana entropii procesu w warunkach izotermicznych określona jest następująco: proces odwracalny, proces nieodwracalny (funkcja stanu) Druga zasada termodynamiki: Całkowita zmiana entropii wynosi zero w przypadku procesu odwracalnego i jest większa od zera w przypadku procesu nieodwracalnego

6 Pomiar pojemności cieplnej w funkcji temperatury umożliwia wyznaczenie entropii Jeśli do układu dopływa ciepło w sposób odwracalny to: oraz, a zmiana entropii: W przypadku przemiany fazowej zachodzącej pod stałym ciśnieniem W procesie parowania dla większości cieczy (wyjątek woda, amoniak wykazują pewny stopień uporządkowania w stanie ciekłym i przy przejściu w stan gazowy jest większe) Entropia jako miara nieuporządkowania układu (statystyczna definicja entropii) równanie Boltzmanna:, gdzie: liczba możliwych konfiguracji układu, stała Boltzmanna Doskonale uporządkowany układ o najmniejszej entropii jest najmniej prawdopodobny Trzecia zasada termodynamiki: Entropia doskonałego kryształu w temperaturze zera bezwzględnego wynosi zero (kryształ doskonały jedno ułożenie składników, temperatura zera bezwzględnego brak zmian dynamicznych) Zmiany entropii można wyznaczać na podstawie pomiarów pojemności cieplnych, entropia ma mierzalną wartość bezwzględną Procesy samorzutne zachodzą bez konieczności wykonania pracy na układzie Procesy niesamorzutne nie wykazują tendencji do zachodzenia Aby zachodziły do układu należy dostarczyć energię na sposób pracy Entropia układów izolowanych wzrasta, jeżeli zachodzą w nich procesy nieodwracalne, lub pozostaje stała, jeżeli zachodzą procesy odwracalne (druga zasada termodynamiki) Entropia układu izolowanego nigdy nie maleje:

7 Idealnym układem izolowanym jest Wszechświat Układy doświadczalne nie są układami izolowanymi Całkowita zmiana entropii sumą zmian entropii układu i otoczenia (związek entropii z entalpią pod stałym ciśnieniem) Standardowa entropia reakcji różnica między standardowymi entropiami produktów i substratów: Całkowita zmiana entropii sumą zmian entropii układu i otoczenia Entalpia swobodna (energia swobodna Gibbsa, funkcja Gibbsa) zmiany skończone pod stałym ciśnieniem i w stałej temperaturze entalpia swobodna jest miarą całkowitej zmiany entropii dla procesu samorzutnego pod stałym ciśnieniem Energia swobodna Inaczej energia Helmholtza, funkcja Helmholtza Stosowana jest do opisu pracy w stałej objętości i temperaturze w stałej objętości dla procesu samorzutnego w stałej objętości Pojęcie energii swobodnej jest użyteczne w układach zamkniętych, w których zmiany następują w stałej objętości (ciała stałe) Większość układów biochemicznych działa pod stałym ciśnieniem częściej stosuje się pojęcie entalpii swobodnej Entalpia swobodna i energia swobodna: Funkcje stanu

8 Niemierzalne wartości bezwzględne Są wskaźnikiem samorzutności procesu Reprezentują maksymalną pracę, którą można uzyskać z procesu ( poza pracą zmiany objętości) Przewidywanie warunków, w których reakcja jest samorzutna: Ujemne Samorzutna? Samorzutności sprzyjają Dodatnie W każdych warunkach Każde warunki Ujemne Ujemne Jeśli Niskie temperatury Dodatnie Dodatnie Jeśli Wysokie temperatury Dodatnie Ujemne Nigdy Nie sprzyjają żadne warunki Biokalorymetria pomiary kalorymetryczne procesów biochemicznych Entalpia Entalpia zależy od temperatury, ciśnienia i stanu molekuł Standardowa entalpia reakcji (solwatacji, itp): zmiana entalpii odpowiadająca zmianie entalpii w trakcie reakcji 1 mola cząsteczek w temp 25 C, pod ciśnieniem 1 atm jest miara zmian pojemności cieplnej się też pojemność cieplna, określenie powierzchni białka podczas reakcji Gdy zmienia się kontakt powierzchni hydrofobowej z woda zmienia dostarcza informacji o zmianie stopnia ekspozycji Zmiany entalpii wynikają z reorganizacji oddziaływań międzycząsteczkowych, tworzenia nowych oddziaływań, zmianie hydratacji grup polarnych i niepolarnych Entropia Idealny kryształ bez drgań Wzrost temperatury, przejście ciało stałe ciecz gaz wzrost entropii Absorpcja ciepła powoduje wzrost entropii Dla reakcji samorzutnej: Czyli: Aby reakcja była samorzutna entropia musi być wystarczająco wysoka Ma to miejsce w

9 podwyższonej temperaturze Zmiana entropii jest sumą: zmian entropii hydratacji (uporządkowanie cząsteczek wody na powierzchni białka), zmian entropii konformacyjnej i entropii dynamiki wiązań, zmian entropii związanej z translacji i rotacji cząstek po utworzeniu kompleksu Energia swobodna energia, którą można wykorzystać do wykonania pracy Dla reakcji samorzutnych maleje, czyli: Tylko część energii swobodnej może być zamieniona na pracę, reszta jest zaangażowana w zmiany entropii Podstawowe wiadomości o równowagach Biologiczny stan standardowy stan czystej substancji pod ciśnieniem 1 atmosfery w określonej temperaturze (zwyczajowo 25 C) Dla roztworów substancja rozpuszczona ma stężenie 1 M, a stężenie jonów wodorowych odpowiada ph 7,0 Jest to stan względem którego mierzone są wszelkie zmiany i z nim porównywane Rozważmy: W warunkach standardowych Dla Dla reakcja samorzutna reakcja niesamorzutna Z równania: można wyznaczyć w dowolnej temperaturze, jeśli znamy wartość Po

10 przekształceniu: Dla bardzo małych zmian temperatury,, można przyjąć, że i są niezależne od Dlatego pod stałym ciśnieniem: (równanie van t Hoffa) Stad możemy wyznaczać w dowolnej temperaturze Jeśli to Rozważmy prostszy układ: Stała dysocjacji jest definiowana następująco: Szybkość reakcji w kierunku syntezy produktu: Szybkość reakcji w kierunku rozpadu produktu: W równowadze: Stąd: W stanie równowagi: Stała asocjacji jest odwrotnością stałej dysocjacji:

11 Zerwanie wiązania wymaga mniej energii niż jego utworzenie reakcja egzotermiczna W przeciwnym przypadku reakcja endotermiczna W trakcie procesów niewymagających zerwania wiązań (folding) również następuje przepływ ciepła na skutek zmiany otoczenia fragmentów bialka Teoria kolizji Reagenty aby utworzyć lub zniszczyć wiązanie muszą się zderzyć Jeśli mają energię wyższą niż energia aktywacji zachodzi reakcja chemiczna Liczbę cząsteczek o energii wyższej niż energia aktywacji opisuje rozkład Boltzmanna: całkowita liczba cząsteczek Procesy w układach biologicznych są czułe na temperaturę i zachodzą tylko w jej wąskim zakresie zdeterminowanym przez : 1 prawo Arrheniusa 2 gdzie: stała szybkości, całkowita liczba zderzeń w jednostce czasu umożliwiających utworzenie produktu Wyznaczając możemy wyznaczyć Szybkość reakcji chemicznych wzrasta ekspotencjalnie wraz ze wzrostem temperatury Denaturację w podwyższonej temperaturze Reakcje (rozrywanie lub powstawanie wiązań chemicznych) zachodzą tylko wtedy, gdy biomolekuły mają energię wyższą niż energia aktywacji i ulegają zderzeniom Odziaływania makromolekuł z punktu widzenia termodynamiki możemy podzielić na: sterowane entropowo, typowe dla oddziaływań antygen-przeciwciało i białko-dna, sterowane entalpowo, średnie i słabe oddziaływania, sterowane entropowo-entalpowo oddziaływania bardzo silne i specyficzne (proteazainhibitor) Historia W 1760 roku Black skonstruował pierwszy kalorymetr i zmierzył pojemność cieplną wody W latach 80 XVIII wieku Lavoisier zaprojektował kalorymetr lodowy i wykorzystał go do pomiarów ciepła przemian metabolicznych produkowanego przez świnkę morską W 1840 roku Joule (piwowar i naukowiec amator) udowadnił, ze ciepło można zamienić na pracę W 1850

12 roku Clausius wprowadził pojęcie entropii oraz I i II zasadę termodynamiki W II pol XIX w prace Maxwella i Gibbsa nadały termodynamice postać matematyczną W 1918 roku Nernst sformułował III zasadę termodynamiki Współczesne pomiary DSC datują się od lat 60-tych XX wieku, a ITC od końca lat 80-tych XX wieku Rozwojem tych techniki pomiarowej zajmował się Peter Privalov Kalorymetria opiera się na pomiarach ciepła pochłoniętego lub wyemitowanego z układu Jest to pomiar bezpośredni zmian stanu układu za pomocą kalorymetru Kalorymetry umożliwiają: wyznaczanie ciepła właściwego cieczy i ciał stałych, ciepła topnienia i ciepła parowania, badanie zmian w czasie wartości termodynamicznych takich jak entalpia i entropia układu Rodzaje kalorymetrów: kalorymetr wodno-lodowy, bomba kalorymetryczna, kalorymetr przepływu ciepła, kalorymetr bilansu ciepła, kalorymetr różnicowy, Metody wykonywania pomiarów kalorymetrycznych: 1 Pomiary zmiany temperatury Ciepło pobierane lub oddawane w trakcie reakcji chemicznej powoduje zmianę temperatury w celce pomiarowej, która się rejestruje Dzięki odpowiedniej kalibracji instrumentu można obliczyć ilość energii stowarzyszonej ze zmianą temperatury 2 Metoda kompensacji mocy Celka jest utrzymywana w stałej temperaturze, dzięki zastosowaniu kontrolera, który chłodzi lub grzeje celkę w trakcie zachodzącej endo- lub egzotermicznej reakcji Sygnałem pomiarowym jest moc (μcal/s, μj/s) potrzebna do utrzymania celki w stałej temperaturze, takiej samej jak temperatura celki referencyjnej 3 Pomiary przepływu cieplnego Temperatura celki pomiarowej jest utrzymywana na stałym poziomie dzięki odprowadzaniu nadmiaru ciepła przez odpowiedni czujnik Wielkością mierzoną jest niewielkie napięcie proporcjonalne do niewielkiej różnicy temperatur powstającej w trakcie zachodzenia reakcji Dwa typy eksperymentów kalorymetrycznych ITC izotermiczna kalorymetria miareczkująca (isothermal scanning callorimetry) Pomiary związanego z procesami takimi jak wiązanie ligandów, tworzenie kompleksów, pomiar równowagowych stałych asocjacji (Z eksperymentu ITC

13 otrzymujemy informacje o stałej asocjacji ), zmianie entalpii asocjacji, stechiometrii wiązania Otrzymane parametry zależą od warunków pomiaru!) Ograniczenie: niskie stężenia białek i związany z tym mała wartość emitowanego lub pochłanianego ciepła DSC różnicowa kalorymetria skaningowa (differential scanning callorimetry) Zmiany fazowe w biopolimerach inicjowane dostarczeniem ciepła Kalorymetr ITC VP-ITC Objętość celki ~14 ml Objętość strzykawki ~ 270ml Peltier C Szum 05 ncal/s ITC Techniki inicjalizacji reakcji 1 Mieszanie, poprzez obracanie całej celki, i roztworów osobno dodanych do celki pomiarowej lub rozerwaniu ampułki z jednym reagentem w roztworze drugiego reagenta lub wprowadzenie dużej objętości jednego reagenta do celki z drugim reagentem w celu zainicjowania reakcji (np enzymatycznej) 2 Miareczkowanie kilkakrotne, stopniowe, ze stałym interwałem czasowym, wprowadzanie niewielkich ilości jednego reagenta do celki z drugim reagentem, aż do zakończenia procesu 3 Metoda przepływowa pomiar ciepła wydzielanego w trakcie przepływu reagentów Ze względu na wolną odpowiedz kalorymetru metoda ta nie jest stosowana Etapy eksperymentu ITC Plan eksperymentu na podstawie wykonanych symulacji Przygotowanie roztworu ligandu i makromolekuł Zebranie danych pomiarowych Wykonanie pomiarów kontrolnych, tzw ślepa próba (np bufor-bufor) Nanoszenie poprawek związanych ze ślepą próbą Analiza poprawionych danych, wyznaczenie parametrów termodynamicznych Krytyczna interpretacja wyników Plan eksperymentu na podstawie wykonanych symulacji Jak wybrać warunki aby eksperyment wyglądał jak na Rys Figure 1?

14 Miareczkowanie kalorymetryczne metodą ITC przykład Problemem jest dobór stężenia makromolekuły i ligandu, tak aby mierzony efekt był wystarczająco silny Parametr sigmoidalności Parametr sigmoidalności zdefiniowany jest następująco: gdzie: całkowite stężenie makromolekuł w roztworze, szacowana stała równowagi Parametr powinien mieścić się w zakresie: Jeśli jest zbyt małe kłopoty z osiągnięciem odpowiedniego stężenia makromolekuł Jeśli jest zbyt duże, stężenie makromolekuł może być zbyt niskie Dla nie można wyznaczyć stałej wiązania poważne ograniczenie metody ITC do badania potencjalnych leków, ze względu na poszukiwania ekstremalnie silnie wiążących się inhibitorów Co zrobić jeśli nie można wyznaczyć bezpośrednio parametrów termodynamicznych? Wykorzystuje się konkurencję ligandów o miejsce wiążące w makromolekule

15 1 Miareczkowanie słabym inhibitorem i określenie parametrów termodynamicznych 2 Miareczkowanie silnym inhibitorem i określenie entalpii 3 Wypychanie słabego inhibitora przez silny inhibitor 4 Wyznaczenie stałej inhibicji dla silnego inhibitora z zależności: gdzie: stała wiązania dla słabego inhibitora, stała wiązania dla silnego inhibitora, pozorna stała wiązania (uzyskana z pomiarów wypychania), stężenie słabego inhibitora dostosowane tak, aby wyznaczyć Zebranie danych pomiarowych Należy: Wyznaczyć stężenie ligandów i makromolekuł z najwyższą możliwą dokładnością (np metodami spektrofotometrycznymi) Ze względu na możliwość istnienia efektów cieplnych związanych z mieszaniem roztworów o różnym składzie bufor w celce pomiarowej i w strzykawce powinien być identyczny (dializa roztworu makromolekuł i wykorzystanie buforu po dializie do przygotowania roztworu ligandu!) Określić metodę pomiarową: Liczba wstrzyknięć Objętość każdego wstrzyknięcia Stężenie ligandu w nastrzykach Odstęp czasowy pomiędzy kolejnymi wstrzyknięciami Zrównoważyć termicznie roztwór makromolekul i liganda i wykonać pomiar Mierzymy związane z dodawaniem kolejnych porcji liganda i wszystkimi zmianami takimi jak tworzenie wiązań, oddziaływanie z buforem, jonizacja, dlatego potrzebne są, dla tych samych warunków wstrzyknięć pomiary kontrolne, to znaczy wyznaczenie 1 Ciepła rozcieńczania ligandu miareczkowanie ligandem buforu 2 Ciepła rozcieńczania makromolekuł miareczkowanie buforem roztworu makromolekuł (zwykle do zaniedbania) 3 Miareczkowanie buforu buforem Nanosimy poprawki na wartość sygnału mierzonego w 4 reakcji: Należy usunąć gaz z roztworów (odgazowywać) Przepływ protonów Dodatkowo trzeba zwrócić na uwagę na ciepło jonizacji buforu przez protony uwalniane w reakcji (należy porównywać różne bufory):

16 ilość protonów uwalnianych po związaniu 1 mola ligandów Acetate 0,1 kcal/mol MES 3,7 kcal/mol ACES 7,5 kcal/mol Analiza danych kalorymetrycznych Założenie określonego modelu reakcji dla makromolekuły, np : Jedno miejsce wiążące (lub identycznych miejsc) Dwa niezależne miejsca wiążące Wiązanie sekwencyjne Dopasowanie matematycznego modelu do danych eksperymentalnych (ITC software) z podawanymi szacunkowymi wartościami wyjściowymi poszukiwanych parametrów Poszukiwanie najprostszego modelu, który w ramach błędu pomiarowego opisze obserwowane miareczkowanie (poda np wartości K,, n) Przykłady 1 Identyczne, nieoddziałujące miejsca wiązania ligandu: 2 gdzie: frakcja miejsc zajętych, frakcja miejsc wolnych Dwa typy niezależnych miejsc wiązania ligandu: 3 Wiązanie sekwencyjne ligandów Metody rozwiązań powyższych zależności są dostarczane jako oprogramowanie wraz z kalorymetrami Krytyczna analiza wyników czy są fizyczne, czy wybrano najprostszy model, czy kryterium zbieżności jest spełnione itp

17 ITC enzymatyczne eksperymenty kinetyczne Bezpośredni pomiar szybkości reakcji Pojedyncze wstrzyknięcie Stężenie wstrzykiwanego substratu powinno umożliwić wydzielenie ciepła większe niż 10 μcal/s Wyznaczenie z pojedynczego pomiaru Wielokrotne wstrzyknięcia Stężenie wstrzykiwanego substratu w każdym kroku powinno umożliwić wydzielenie ciepła większe niż 2 μcal/s Wielokrotne wstrzyknięcia po uzyskaniu plateau umożliwiają wyznaczenie szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu i dokładniejsze wyznaczenie parametrów kinetycznych niż przy jednokrotnym wstrzyknięciu Nie ma możliwości wyznaczenia w pierwszym kroku Projektowanie enzymatycznego eksperymentu kinetycznego Podobnie jak w przypadku miareczkowania ITC wykonanie ślepych prób, dializa białka i przygotowanie ligandu w buforze po dializie, ale: większe różnice pomiędzy nastrzykami (minuty, nie sekundy) Dobranie stężeń białka i ligandu tak, aby było wyraźnie

18 Dla pojedynczego nastrzyku stężenie enzymu powinno umożliwić zakończenie reakcji w ciągu 1 godz (typowo 1 nm 10 μm) Stężenie substratu powinno być wielokrotnie większe niż enzymu ( raza) i większe niż Objętość pojedynczego nastrzyku μl Objętość dla wielokrotnych nastrzyków 2-5 μl Analiza danych za pomocą soft ware u dostarczonego z kalorymetrem DSC różnicowa kalorymetria skaningowa (Differential Scanning Calorimetry) Znajduje zastosowanie przy badaniu stabilności białek, lipidów, przejść fazowych, kwasów nukleinowych Pozwala na uzyskanie większości parametrów termodynamicznych Eksperyment DSC Próbka zawiera ok 2 ml białka o stężeniu 1-5 mg/ml Próbka referencyjna zawiera tylko bufor Próbki są jednocześnie ogrzewane lub ochładzane Pomiędzy celkami pomiarową i referencyjną znajduje się czujnik, który mierzy różnicę temperatur pojawiającą się w trakcie zachodzenia procesu i dostarcza napięcie, w celu utrzymania jednakowej temperatury obydwu celek Sygnał proporcjonalny do różnicowo dostarczonego napięcia jest zapisywany jako funkcja temperatury Eksperyment jest zwykle powtarzany kilka razy a przebiegi uśredniane, umożliwiając wyznaczenie zmiany entalpi procesu takiego jak unfolding, tworzenie kompleksów, wiązanie ligandów, itp Zakres temperatur zwykle -10 C 130 C Możliwość stosowania dla szerokiego zakresu stężeń białek DSC umożliwia pomiary w funkcji temperatury Użyteczne w określaniu parametrów, które zmieniają się wraz ze zmianą temperatury Zwykle zmiany są niewielkie, trzeba porównywać uzyskane efekty względem celki referencyjnej i powtarzać pomiary Zastosowania DSC Wszystkie procesy indukowane przez zmianę temperatury: Przejście podwójna pojedyncza helisa DNA Rozfałdowywanie białek Rozpad oligomerów na podjednostki Zmiany w funkcji ph, siły jonowej itp (warunki stabilizujące lub nie białko) Porównania mutantów Oddziaływania międzycząsteczkowe białek, wielocukrów i nie-biologicznych polimerów

19 Schemat denaturacji białka stała równowagi pomiędzy zdenaturowaną i natywną frakcją białka w temp Pamiętamy, że: zmiana pojemności cieplnej związana z określonym procesem Z wykresu możemy wyznaczyć:,, oraz: skoro: to: Krzywa zależności może pokazywać ilość stanów pośrednich w czasie zwijania/rozwijania białka