Spektrofotometryczne badanie procesu agregacji karotenoidów

Transkrypt

1 Spektrofotometryczne badanie procesu agregacji karotenoidów VI Wprowadzenie (praca doktorska Moniki Hereć) Efekt rozszczepienia ekscytonowego Proces agregacji cząsteczek prowadzi do rezonansowego rozszczepienia wzbudzonych poziomów energetycznych pojedynczych molekuł wchodzących w skład agregatu, które to poziomy w monomerycznych cząsteczkach nie są zdegenerowane. Efektem rozszczepienia ekscytonowego poziomów energetycznych jest przesunięcie i zmiana kształtu widma elektronowego cząsteczek (Kasha, 1963; Kasha i wsp., 1965). Obliczenia energii stanów ekscytonowych przeprowadzone zostały przy użyciu przybliżenia dipola punktowego oraz przy następujących założeniach (Somsen i wsp., 1996): I. rozważamy tylko oddziaływania pomiędzy najbliżej sąsiadującymi cząsteczkami, II. energia przejścia elektronowego oraz dipolowy moment przejścia cząsteczki w formie monomeru (brana do obliczeń przesunięć spektralnych) są niezaburzone przez oddziaływania międzycząsteczkowe w agregacie. Każda pojedyncza molekuła charakteryzuje się dipolowym momentem przejścia μ mon oraz energią przejścia ν mon. W cząsteczkach tworzących formy zagregowane poziom wzbudzony ulega rozszczepieniu na m stanów ekscytonowych. (m zależy od liczby cząsteczek wchodzących w skład agregatu). Energia przejścia m-tego stanu ekscytonowego wyraża się następującym równaniem (Parkash i wsp., 1998): ~ = ~ mπ ν m ν mon + 2β cos (1) N + 1

2 gdzie: ν m -energia przejścia stanu wzbudzonego w widmie agregatu, N -liczba cząsteczek wchodzących w skład agregatu (liczba wzbudzonych stanów ekscytonowych), β -energia oddziaływania dipol-dipol w agregacie wyrażająca się wzorem: ρ ρ ρ ρ ρ ρ μi μ j 3( μi rij )( μ j rij ) βij = oraz 2 3 4πε η R o ij ρ R ρ ij rij = ρ (2) μ i -dipolowy moment przejścia cząsteczki (i) w agregacie, ε o - przenikalność dielektryczna próżni, η- współczynnik załamania ośrodka, R ij odległość między środkami dipolowych momentów przejść sąsiadujących molekuł w agregacie. R ij α μ i μ j φ i φ j R ij Rysunek 1 Orientacja dipolowych momentów przejść μ i i μ j cząsteczek w agregacie, φ i i φ j kąty pomiędzy dipolowymi momentami przejść a osią łączącą ich środki, α -kąt pomiędzy dipolowymi momentami przejść, R i j - odległość między środkami chromoforów. Równanie 2 w przypadku jednakowych cząsteczek można przekształcić do postaci: gdzie : 2 μ mon = κ (3) 2 πε η R βij 3 4 o ij ( cosα 3cos cos ) κ = ϕ i ϕ j (4) α-kąt między wektorami dipolowych momentów przejść sąsiadujących cząsteczek, φ- kąt między dipolowym momentem przejścia cząsteczki a osią łączącą środki dipolowych momentów przejść najbliższych molekuł.

3 Szczególną, najczęściej rozważaną strukturą zagregowaną jest taka, w której sąsiadujące cząsteczki są równoległe (α=0). W zależności od wartości kąta φ możemy wyróżnić dwa rodzaje agregatów: φ = 0 wektory momentów dipolowych przejść cząsteczek wchodzących w skład agregatu, leżą na jednej linii, w takim przypadku współczynnik β przyjmuje wartość ujemną, co prowadzi do przesunięcia widma w stronę niższych energii (dłuższych fal) względem widma cząsteczki monomerycznej (przesunięcie batochromowe). φ = π/2 dipolowe momenty przejść cząsteczek ułożone są względem siebie równolegle, współczynnik β przyjmuje wartość dodatnią, co powoduje przesunięcie widma cząsteczek w stronę krótkofalową względem widma monomeru (przesunięcie hypsochromowe). Agregaty, dla których widmo ulega przesunięciu batochromowemu lub hypsochromowemu nazywamy odpowiednio agregatami typu J lub H. Najogólniejszym przypadkiem są agregaty, w których dipolowe momenty przejścia ustawione są pod pewnym kątem (0<α<π i 0<φ<π/2), efektem czego jest przesunięcie widma zarówno w stronę długo jak i krótkofalową. Do wykonywania praktycznych obliczeń (wyznaczania odległości między molekułami w agregacie, określania liczby cząsteczek wchodzących w skład agregatu) wygodniej jest korzystać ze wzoru na współczynnik β w postaci (Somsen i wsp., 1996): μi μ j β = 5.04κ (5) 2 η R Równanie 5 jest poprawne wyłącznie, gdy odległość między środkami chromoforów R ij wyrazimy w nm, dipolowy moment przejścia cząsteczki w D, energię oddziaływania β w cm -1. Elektronowe widma absorpcyjne agregatów zbudowanych z małej liczby cząsteczek (N=2,3) zachowują strukturę oscylacyjną. Wzrost liczby molekuł w agregacie (N>3) powoduje zanik struktury oscylacyjnej widma. 3 ij Struktury dimeryczne Rysunek 2a przedstawia schemat poziomów energetycznych struktury dimerycznej w której molekuły tworzą agregat typu H (nazywany również card pack ). Pierwszy stan wzbudzony ulega rozszczepieniu na dwa poziomy, przy czym poziom leżący poniżej poziomu wzbudzonego monomeru (m=2), odpowiada antyrównoległemu ustawieniu

4 dipolowych momentów przejść cząsteczek, natomiast poziom znajdujący się powyżej poziomu wzbudzonego monomeru (m=1) odpowiada równoległemu ustawieniu dipolowych momentów przejść cząsteczek wchodzących w skład dimeru. Ponieważ całkowity moment przejścia dimeru jest wektorową sumą poszczególnych momentów dipolowych to przejście ze stanu podstawowego do stanu o m=2 jest zabronione (μ w =0). Dozwolone jest tylko przejście do stanu o m=1, co powoduje, iż widmo dla tego typu dimerów ulega przesunięciu w stronę krótkofalową względem widma monomeru. Przerwa energetyczna pomiędzy poziomem wzbudzonym monomeru a poziomem ekscytonowym m=1 wynosi: ν m - ν mon = β. a) b) 2β m=1 m=2 β m=1 m=2 monomer dimer monomer dimer Rysunek 2 Diagramy energetyczne dla cząsteczek w formie dimerów typu: a) card pack, b) head to tail. Liniami przerywanymi oznaczono przejścia wzbronione, ciągłymi dozwolone. Diagram energetyczny cząsteczek tworzących dimery typu J (nazywane również head to tail ) przedstawia rysunek 2b. Dwie możliwe konfiguracje dipolowych momentów przejść prowadzą do powstania dwóch ekscytonowych poziomów energetycznych, przy czym przejście ze stanu podstawowego do poziomu o m=1 jest wzbronione (wypadkowy dipolowy moment przejścia wynosi 0). Efektem tego jest przesunięcie widma w stronę długofalową dla tego typu dimerów.

5 Jeżeli dipolowe momenty przejść cząsteczek w dimerze są ustawione względem siebie pod pewnym kątem, poziom wzbudzony ulega rozszczepieniu na dwa poziomy ekscytonowe, do których dozwolona jest absorpcja promieniowania. Agregaty wyższych rzędów W przypadku, gdy w skład agregatu molekularnego wchodzą więcej niż dwie cząsteczki (N>2), poziom wzbudzony ulega rozszczepieniu na N stanów ekscytonowych. Maksymalne przesunięcie spektralne (odległość pomiędzy stanem wzbudzonym monomeru a skrajnym stanem ekscytonowym) dla N-agregatu uzyskujemy w przypadku, gdy N>>2 i wynosi ono 2β, co wynika ze wzoru 1. m=1 4β m=n monomer agregat Rysunek 3 Diagram energetyczny agregatu składającego się z N molekuł. Zagadnienia do kolokwium: Zjawisko absorpcji, prawo Lamberta-Beera (wyznaczanie stężeń barwników w oparciu o widma absorpcji) Barwniki aparatu fotosyntetycznego (budowa, własności spektralne, struktura elektronowa karotenoidów) Rodzaje i charakterystyka oddziaływań molekularnych Proces agregacji karotenoidów (teoria rozszczepienia ekscytonowego, rodzaje agregatów i ich właściwości spektralne, wyznaczanie parametrów struktury agregatu)

6 Cel ćwiczenia W oparciu o dane literaturowe (tabela 2) określić rodzaj oraz stężenie barwnika otrzymanego od prowadzącego ćwiczenia (pomiar wykonać w roztworze etanolu) Na podstawie widm absorpcji barwnika w roztworach etanolowo-wodnych określić typ agregacji Na podstawie analizy rejestrowanych widm absorpcji oszacować odległość pomiędzy cząsteczkami tworzącymi agregat w oparciu o teorię rozszczepienia ekscytonowego (równanie 5). Wykonanie ćwiczenia Identyfikacji barwnika oraz pomiar jego stężenia dokonujemy przy pomocy spektrometru absorpcyjnego. W tym celu próbkę otrzymaną od prowadzącego ćwiczenia odparowujemy w strumieniu azotu i zalewamy odpowiednią ilością rozpuszczalnika (etanol). Pomiaru widma absorpcji dokonujemy wg instrukcji przygotowanie aparatury do pomiaru (patrz dalej). 1. Identyfikacja barwnika odbywa się w oparciu o porównanie położenia maksimów absorpcji na skali długości fal z odczytanymi z tabeli Stężenie barwnika wyznaczamy w oparciu o wzór Lamberta Beera. 3. Agregacji barwników karotenoidowych dokonujemy poprzez zwiększanie udziału wody w roztworze etanolowym (np. co 20%). Badania prowadzimy do momentu w którym dalsze dodawanie H 2 O nie powoduje zmian widma. Obszar stężeń, w obrębie którego widoczne są istotne zmiany widma należy przebadać bardziej szczegółowo (np. co 5%). Próbki należy sporządzać w taki sposób, aby stężenie barwnika było stałe. Np.: Tabela 1 Etanol [ μl ] Woda dest. [ μl ] Stężony roztwór barwnika w EtOH [ μl ] Zawartość EtOH % % % %

7 Przygotowanie aparatury do pomiaru: włączyć spektrofotometr UV 160A i odczekać aż zakończą się procedury inicjujące (brak komunikatu o błędzie error); włączyć komputer, uruchomić Windows, w grupie głównej odszukać aplikację PC 160 A z menu Configure wybrać polecenie Load i z listy plików konfiguracyjnych zbiór o nazwie pra_spec.cfg; należy sprawdzić i ewentualnie poprawić parametry pomiaru tzn.: zakres widma: nm, rodzaj pomiaru: Absorbancja prędkość skanu: Medium, Configure/Parameters ścieżki dostępu: c:\160pls\data\pracowni\ Configure/PC Configura Pomiar rozpoczynamy od umieszczenia w uchwycie pomiarowym (bliższy operatora) kuwety z czystym rozpuszczalnikiem (bez barwnika) w celu zarejestrowania linii odniesienia Baseline (widma absorpcji rozpuszczalnika, które będzie odejmowane w kolejnych pomiarach od widma całej próbki dając w efekcie spektrum absorpcji barwnika). Tło (Baseline) należy mierzyć za każdym razem po zmianie rozpuszczalnika np. etanol na metanol, czy różne proporcje EtOH : H 2 O. Pomiaru właściwego dokonujemy klikając na Start. Po skończonym pomiarze należy podać nazwę pod jaką ma zostać zapamiętane dane widmo (aby zachować widmo na dysku należy wybrać dodatkowo opcję File/Save.

8 Wybrane funkcje programu: Presentation Channel Status m.in. pozwala chwilowo podświetlać i wygaszać wybrane widma Radar [CTRL+R] dopasowuje skale osi X i Y do aktualnie wyświetlanych widm Set Limits pozwala na ręczne dopasowanie zakresów osi stosownie do potrzeb Plot drukuje aktualną zawartość okna File Save nagrywa widmo(a) na dysku w katalogu wskazanym w Configure/PC Configuration Load wczytuje widmo(a) z dysku z katalogu podanego w Configure/PC Configuration ASCII Translate nagrywa widmo jako kolumny w kodzie ASCII (możliwość dalszego opracowania w innym programie, np. Grapher) Manipulate Peak Pick odnajduje położenia maksimów i minimów widma oraz podaje wartość Abs. dla tych długości fali Dodatkowych informacji proszę szukać w instrukcji obsługi spektrometru.

9 Tabela 2 Carotenoid Anteraxanthin (231) β,β-carotene (3) Neoxanthin (234) Lutein (133) Violaxanthin (259) Zeaxanthin (119) ε mol λ Solvent λ max % III/II C EtOH H, P A C P B EtOH CHCl Cy CS Et 2 O A B C EtOH EtOH P C P EtOH B Et 2 O Et 2 O CS 2 C P EtOH B A B C A P EtOH EtOH A acetone B benzene C chloroform CS 2 carbon disulphide Cy cyclohexane Et 2 O diethyl ether EtOH ethanol H hexane P light petroleum [1] Britton, G., Liaaen-Jensen, S., Pfander, H., Carotenoids Volume 1B: Spectroscopy, 1995

10 Proponowana literatura: 1. Wanda Leyko (red.), Biofizyka dla Biologów, PWN Warszawa, Jerzy Kączkowski, Biochemia roślin, PWN Warszawa, Lubert Stryer, Biochemia, PWN Warszawa Jan Sielewiesiuk, Fotoprotekcyjna rola karotenoidów w świetle badań modelowych, Rozprawa habilitacyjna Lublin, Wiesław I. Gruszecki, Formy zagregowane wiolaksantyny i cykl wiolaksantynowy, Rozprawa habilitacyjna Lublin, Rafał Luchowski, Zastosowanie spektroskopii efektu Starka do badania oddziaływań molekularnych nukleotydów, Rozprawa doktorska, Lublin, 2000, (rozdział I.4).