w³óknieniem p³uc (IPF)

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Piotr KOPIÑSKI 1 Grzegorz PRZYBYLSKI 2 Barbara BALICKA-ŒLUSARCZYK 3 Joanna CHOROSTOWSKA-WYNIMKO 4 Gra yna PINIS 5 Marta PLATO 1 Adriana RO Y 4 Jerzy SZCZEKLIK 3 Palenie papierosów zwiêksza liczbê limfocytów cytotoksycznych CD8+Fas Ligand+ w p³ynie z p³ukania oskrzelowopêcherzykowego (BAL) chorych z samoistnym w³óknieniem p³uc (IPF) Cigarette smoking results in the number of CD8+Fas Ligand+ T cytotoxic lymphocytes in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) 1 Katedra Terapii Genowej, Collegium Medicum Uniwersytetu Miko³aja Kopernika w Bydgoszczy p.o. kierownika: Dr med. Piotr Kopiñski 2 Klinika Chorób P³uc, Nowotworów i GruŸlicy, Collegium Medicum Uniwersytetu Miko³aja Kopernika, Bydgoszcz p.o. kierownika: Dr med. Grzegorz Przybylski 3 Klinika Chorób Wewnêtrznych i Œrodowiskowych Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego, Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. Jerzy Szczeklik 4 Instytut GruŸlicy i Chorób P³uc, Warszawa Kierownik: Prof. dr hab. med. Kazimierz Roszkowski-Œli 5 NZOZ Atopia, Kraków Kierownik: Lek. med. Gra yna Pinis Dodatkowe s³owa kluczowe: limfocyty pêcherzykowe p³ukanie oskrzelowo-pêcherzykowe palenie papierosów samoistne w³óknienie p³uc ligand Fas Additional key words: alveolar lymphocytes bronchoalveolar lavage cigarette smoking idiopathic pulmonary fibrosis Fas ligand Praca finansowana z projektu Ministrem Nauki i Szkolnictwa Wy szego nr N /3591 Adres do korespondencji: Dr med. Piotr Kopiñski Katedra i Zak³ad Genoterapii Collegium Medicum Uniwersytet Miko³aja Kopernika ul. Marii Sk³odowskiej-Curie Bydgoszcz Tel.: (+52) Fax: (+52) kizgenoter@cm.umk.pl mpkopins@consoft.com.pl Samoistne w³óknienie p³uc (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) jest œródmi¹ szow¹ chorob¹ p³uc o niekorzystnym zejœciu. Palenie papierosów zaostrza przebieg choroby i skraca czas prze ycia chorych. Zmiany cytoimmunologiczne powodowane paleniem u chorych z IPF wymagaj¹ dok³adnego zbadania. P³ukanie oskrzelowo-pêcherzykowe (BAL) wykonano u 21 chorych z IPF, podzielonych w zale noœci od palenia/niepalenia papierosów (n=7 dla palaczy). Rutynowe badanie cytologiczne BAL uzupe³niono; immunotypowaniem, w tym barwieniem podstawowych subpopulacji limfocytów (CD4, CD8) na obecnoœæ Fas, ligandu Fas (FasL) i TNFR-1, analiz¹ cyklu komórkowego i póÿnej apoptozy (komórki BAL permeabilizowano i znakowano jodkiem propydyny) oraz testem TUNEL. Cytologia materia³u BAL chorych, w porównaniu z grup¹ kontroln¹, charakteryzowa³a siê znamiennym wzrostem ca³kowitej liczby komórek BAL i makrofagów, zwiêkszeniem odsetka limfocytów, neutrofilów i eozynofilów oraz wzglêdnie nisk¹ wartoœci¹ CD4/CD8. Palaczy papierosów w IPF cechowa³ wy szy odsetek i liczba limfocytów CD8 w porównaniu z grup¹ niepal¹cych oraz dalszy spadek wartoœci CD4/CD8 (0,41±0,15 vs 1,23±0,29 u niepal¹cych, mediana ± SEM, p<0,05). Odsetek komórek CD8, ale nie CD4, wykazuj¹cych ekspresjê ligandu Fas znamiennie wzrasta³ u palaczy z IPF (12,0±3,1% vs 3,7±0,9% u niepal¹cych, p<0,05). Apoptoza makrofagów i limfocytów BAL by³a wzmo- ona w IPF w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (potwierdzono obu technikami), ale bez znamiennych ró nic miêdzy obu podgrupami chorych z IPF. Liczba i odsetek komórek CD8+FasL+ by³y ujemnie skorelowane z wartoœci¹ pojemnoœci yciowej (VC) chorych z IPF, Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is an interstitial lung disease with unfavourable outcome. Tobacco consumption in IPF exacerbates the clinical manifestations and limits the time of patient survival. The cyto-immunological alterations caused by smoking in IPF patients need particular explanation. BAL was carried out in 21 nontreated patients with IPF, subdivided according to the smoking status (n=7 for smokers). BAL routine cytology was completed by; immunotyping, including T cell major subsets (CD4 and CD8) stained for Fas, Fas ligand (FasL) and TNFR-1, late apoptosis/cell cycle analyses (BAL cells were permeabilized and stained with PI) and TUNEL assay. BAL cytology in IPF, as compared with control group, was characterized by significantly higher total cell and macrophage number, increased lymphocyte, neutrophile and eosinophile percentage and relatively low CD4/CD8 ratio. Cigarette smoking in IPF resulted in enhanced BAL lymphocyte CD8 cell percentage and number, as compared with nonsmoking subgroup and further decline in CD4/CD8 ratio (0.41±0.15 vs 1.23±0.29 in nonsmokers, median ± SEM, p<0.05). The percentage of CD8, but not CD4 cells carrying Fas Ligand was significantly increased in IPF smokers (12.0±3.1% vs 3.7±0.9% in nonsmokers, median ± SEM, p<0.05). Apoptosis rate of BAL macrophages and lymphocytes was enhanced in IPF, as compared with controls (confirmed by both techniques), but without remarkable changes, if compared one IPF subgroup to another. The number and percentage of CD8+FasL+ was negatively correlated with vital capacity (VC) values in IPF patients, but not with BAL inflammatory cell apoptosis rate. Cigarette smoking enhanced a percentage Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 /

2 ale nie z czêstoœci¹ apoptozy komórek zapalnych BAL. Palenie papierosów w IPF powodowa³o znamienny wzrost odsetka i ca³kowitej liczby zarówno komórek BAL CD8, jak i CD8+FasL+. Komórki cytotoksyczne BAL (limfocyty CD8+FasL+) wydaj¹ siê wp³ywaæ na pogorszenie czynnoœci p³uc u chorych z IPF. as well as a total number of both BAL CD8 and BAL CD8+FasL+ cells in IPF patients. BAL cytotoxic cells (CD8+FasL+ lymphocytes) seem to have impact on impaired lung function in smoking IPF patients. Wstêp Samoistne w³óknienie p³uc (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) to œródmi¹ szowa choroba p³uc (interstitial lung disease, ILD) o niejasnej etiologii i patogenezie. Charakteryzuje siê zapaleniem pêcherzyków p³ucnych, uszkodzeniem ich œcian i postêpuj¹cym w³óknieniem mi¹ szu [4]. U chorych z IPF stwierdza siê typowy obraz histopatologiczny decyduj¹cy o rozpoznaniu tzw. zwyczajnego œródmi¹ szowego zapalenia p³uc (usual interstitial pneumonia, UIP): w pocz¹tkach choroby dominuje zapalenie czêœci pêcherzyków z bogatokomórkowym wysiêkiem w ich œwietle i niewielkim w³óknieniem podœcieliska. Charakterystyczna jest heterogennoœæ obrazu i ogniskowe wystêpowanie zmian [26]. Z czasem dochodzi do ich ewolucji, zajêcia wiêkszoœci pêcherzyków i pojawienia siê charakterystycznego obrazu plastra miodu w rozleg³ych obszarach p³uc. Kluczowym elementem patofizjologii IPF jest rozplem komórek uk³adu fibroblastów (z wytworzeniem tzw. ognisk miofibroblastycznych) w tkance œródmi¹ szowej p³uc. Komórki te, zgodnie ze sw¹ rol¹ biologiczn¹, produkuj¹ znaczne iloœci tkanki ³¹cznej w³óknistej (kolagenu) [6]. Nale y zaznaczyæ, e w myœl obecnych pogl¹dów IPF i UIP to synonimy: pierwszy z pary terminów ma sens kliniczny, drugi jest rozpoznaniem stawianym przez patologa [19]. Czêstoœæ wystêpowania IPF wynosi ok. 5/ ludnoœci, liczba zachorowañ roœnie. Chorzy niezadowalaj¹co odpowiadaj¹ na konwencjonalne leczenie, które obejmuje steroidy przeciwzapalne i œrodki immunosupresyjne (cyklofosfamid, kolchicyna). IPF w mechanizmie nieodwracalnego w³óknienia p³uc i niewydolnoœci oddechowej, prowadzi do œmierci w ci¹gu oko³o 3 lat [30]. Rozpoznanie stawia siê w oparciu o typowy obraz kliniczny, ewentualnie weryfikuje siê badaniem histopatologicznym [4], tak post¹piono u wszystkich chorych w³¹czonych do niniejszej pracy. P³ukanie oskrzelowo-pêcherzykowe (bronchoalveolar lavage, BAL) stosuje siê jako pomocnicz¹ metodê badawczo-diagostyczn¹, w IPF maj¹c¹ znaczenie zw³aszcza w prognozowaniu przebiegu choroby: ni szy odsetek limfocytów, ni sza wartoœæ CD4/CD8 oraz wy sza proporcja neutrofilów i/lub eozynofilów zapowiadaj¹ krótszy czas prze ycia i brak odpowiedzi na leczenie [7, 25]. W patogenezie IPF zwraca siê uwagê w dolnych drogach oddechowych na znaczenie zmienionej czynnoœci makrofagów i limfocytów pêcherzykowych. Pierwsze z tych komórek dzia³aj¹ zwykle jak fagocyty, natomiast wzglêdnie s³abo pe³ni¹ czynnoœæ komórek prezentuj¹cych antygen [3]. W IPF odpowiadaj¹ prawdopodobnie za syntetyzê licznych czynników wzrostu dla fibroblastów i mediatorów profilu sekrecyjnego Th2 [4,9]. Limfocyty pêcherzykowe (LP), dostêpne badaniem BAL, s¹ kluczowymi komórkami w miejscowym odczynie zapalnym, poniewa ich receptory swoiœcie rozpoznaj¹ antygeny powoduj¹ce choroby z grupy ILD (czêsto, jak w IPF, niepoznane). LP s¹ zdominowane przez populacjê komórek T i posiadaj¹ fenotyp uczulonych komórek pamiêci i/lub komórek efektorowych. Ich akumulacja na powierzchni pêcherzyków p³uc ma charakter aktywny [15,24]. Miêdzy inymi dzia³aj¹ cytotoksycznie w stosunku do komórek, na powierzchni których pojawiaj¹ siê antygeny swoiste dla limfocytów. Efekt ten dotyczy np. nab³onka dróg oddechowych lub zaka onych makrofagów i ma miejsce zarówno w przypadku antygenów znanych (w azbestozie, gruÿlicy, berylozie lub zewnatrzpochodnym alergicznym zapaleniu pêcherzyków p³ucnych), jak i nieznanych (typowe przyk³ady to sakoidoza i w³aœnie IPF). Jednym z mechanizmów zabijania komórek docelowych przez limfocyty cytotoksyczne jest uruchomienie uk³adu Fas/Ligand Fas. Pierwsza z pary cz¹steczek, Fas, jest obecna na powierzchni komórki atakowanej i nale y do tzw. receptorów œmierci. Gdy do- ³¹czy siê do niej cz¹steczka ligandu Fas (FasL), dochodzi do uruchomienia œmierci w mechanizmie apoptotycznym [17]. Do indukcji apoptozy poprzez opisywany uk³ad Fas/FasL dochodzi albo wskutek dzia³ania komórek o czynnoœci cytotoksycznej, maj¹cej ligand Fas na swej powierzchni (w dolnych drogach oddechowych dotyczy to limfocytów CD8, CD4, komórek NK i makrofagów), albo te ligand Fas jest przez te komórki z³uszczany do otoczenia i dzia³a wówczas jako rozpuszczalny mediator apoptozy (soluble FasL, sfasl) [12]. Apoptoza, definiowana jako œmieræ kontrolowana przez program genetyczny komórek, s³u y utrzymaniu homeostazy tkanek i eliminowaniu komórek zbêdnych, starych lub uszkodzonych tak, by nie wzbudzaæ miejscowego odczynu zapalnego [23]. W dolnych drogach oddechowych mo e ona z jednej strony dotykaæ nab³onków oddechowych i komórek œródmi¹ sza (prowadzi wówczas do propagacji odczynu zapalnego i uszkodzeñ dróg oddechowych w przebiegu ILD). Tê mo liwoœæ zbadano w niniejszej pracy tylko poœrednio, analizuj¹c wyniki badañ czynnoœciowych uk³adu oddechowego badanych chorych. Z drugiej strony, zjawisko apoptozy mo e regulowaæ liczbê samych komórek odczynu zapalnego, jak np. makrofagów i limfocytów pêcherzykowych i o ile jest nasilone sprzyjaæ remisji zapalenia. Apoptozê tych komórek zbadano w niniejszej pracy bezpoœrednio, dwoma ró nymi technikami. Ostatnio pojawi³y siê doniesienia œwiadcz¹ce o udziale zaburzeñ programowanej œmierci komórek dolnych dróg oddechowych w patogenezie IPF. Wiele przemawia za tym, e ³añcuch fatalnych zdarzeñ rozpoczyna siê zale n¹ od uk³adu Fas/FasL apoptoz¹ nab³onka dróg oddechowych [29]. Natomiast inna kluczowa dla IPF populacja komórek, fibroblasty, jest w tej chorobie bardziej odporna na apoptozê zale n¹ od ligandu Fas, ni fibroblasty osób zdrowych [19]. Mniej wiadomo o ekspresji FasL na powierzchni komórek BAL w IPF. W szczególnoœci, nie próbowano dot¹d, wg wiedzy autorów, powi¹zaæ zmian w miejscowej ekspresji uk³adu Fas/Ligand Fas w IPF z paleniem papierosów. Tymczasem w³aœnie u palaczy przebieg kliniczny choroby jest zaostrzony, a rokowanie gorsze [26]. Niektórzy zwolennicy hipotezy o œrodowiskowym pod³o u choroby uwa aj¹ palenie wrêcz za jeden z czynników etiologicznych [28]. Toksyczny wp³yw wywierany przez dym papierosowy na drogi oddechowe palaczy i komórki odczynowe dolnych dróg oddechowych dotyczy zarówno zdrowych palaczy, jak i chorych z grupy ILD. Typowe zmiany w dolnych drogach oddechowych powodowanych paleniem wyra aj¹ siê w materiale BAL grupy kontrolnej wzrostem ca³kowitek liczby komórek i makrofagów pêchrzykowych (alveolar macrophages, AM), wzrostem odsetka makrofagów i neutrofilów, spadkiem odsetka (ale nie ca³kowitej liczby) limfocytów oraz odwróceniem wartoœci stosunku CD4/CD8 [15]. W przybli ony sposób palenie papierosów modyfikuje obraz w chorobach grupy ILD, jak sarkoidoza [3]. Co wiêcej, apoptoza makrofagów i limfocytów wystêpuje u tych osób czêœciej, ni w równoleg³ych grupach chorych niepal¹cych [12]. Makrofagi palaczy ulegaj¹ uszkodzeniu i apoptotycznej œmierci poprzez wolne rodniki tlenowe, dochodzi do spadku potencja³u przezb³onowego mitochondriów, przesuniêcia równowagi w grupie bia³ek Bcl na rzecz proapoptotycznego czynnika Bax oraz wyp³ywu cytochromu c do cytoplazmy [1]. Wœród innych mo liwych mechanizmów programowanej œmierci makrofagów, wymienia siê wy sz¹ ekspresjê Ligandu Fas na ich powierzchni, spadek ekspresji antyapoptotycznego bia³ka Bcl-2 oraz aktywacjê czynnika transkrypcyjnego NFkB, (aktywuje go czynnik martwicy nowotworu TNFa, który mo e jednak t¹ drog¹ dostarczyæ makrofagom sygna³u prze ycia) [12]. Zasadniczo nie wiadomo, w jaki sposób dym papierosowy wzbudza apoptozê limfocytów pêcherzykowych. W œwietle naszych wczeœniejszych badañ znaczenie mo e mieæ zmniejszona sekrecja insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (IGF-1) lub/i spadek ekspresji Bcl-2 w tych komórkach [15]. W sumie zmiany powodowane paleniem papierosów w grupie chorych z IPF nie s¹ dobrze poznane, chocia akcentuje siê wzrost ca³kowitej liczby komórek i obni enie wartoœci CD4/CD8 w materiale BAL 690 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 P. Kopiñski i wsp.

3 [7,27]. W szczególnoœci zgodnie z wiedz¹ autorów niniejszej pracy, nie badano dot¹d apoptozy komórek zapalnych BAL w IPF u palaczy papierosów. Celem pracy by³o okreœlenie wystêpowania i czêstoœci miejscowej apoptozy limfocytów i makrofagów pêcherzykowych oraz ekspresji cz¹steczek uk³adu Fas/Ligand Fas u palaczy papierosów chorych na samoistne w³óknienie p³uc, w zwi¹zku z pogl¹dem, e palenie jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym w tej chorobie. Zestawienie otrzymanych wyników z danymi klinicznymi mo e wnieœæ nowe dane do patogenezy samoistnego w³óknienia p³uc, zw³aszcza u osób pal¹cych. Tabela I Badane grupy osób podstawowe dane kliniczne. Studied groups basic clinical data. Materia³ i metody Grupy badane P³ukanie oskrzelowo-pêcherzykowe (BAL) wykonano u 21 osób diagnozowanych w zwi¹zku z podejrzeniem choroby œródmi¹ szowej p³uc, u których postawiono ostateczne rozpoznanie samoistnego w³óknienia p³uc. W sk³ad tej grupy IPF wchodzi³o 14 osób niepal¹cych i 7 palaczy papierosów. Do dnia wykonania BAL pozostawali bez leczenia. Rozpoznanie postawiono w oparciu o obraz histopatologiczny w biopsji p³uca (typu zwyczajnego œródmi¹ szowego zapalenia pêcherzyków p³ucnych, usual interstitial pneumonia, UIP) [26] u chorych z charakterystycznym obrazem klinicznym (w tym z odpowiednimi zmianami w tomografii komputerowej wysokiej rozdzielczoœci). Inne przyczyny w³óknienia p³uc wykluczono. Podstawowe dane o badanych osobach zestawiono w tabeli I. Grupê kontroln¹ stanowi³o 17 osób (w tym 7 palaczy), diagnozowanych w kierunku choroby œródmi¹ szowej p³uc, u których koñcowa ocena kliniczna (uwzglêdniaj¹ca badanie przedmiotowe i badania dodatkowe, w tym radiogramy klatki piersiowej i testy czynnoœciowe p³uc) wykluczy³a odchylenie od normy w zakresie uk³adu oddechowego [14]. Komisja Bioetyczna Collegium Medicum UMK wyrazi³a zgodê na niniejsze badanie (KB nr 116/2006 z dnia 18 paÿdziernika 2006 roku). P³ukanie oskrzelowo-pêcherzykowe Procedurê BAL wykonano zgodnie z zaleceniami European Respiratory Society, the BAL Task Group [3]. W skrócie, osoby poddane badaniu premedykowano (Midazolam 2,5-5,0 mg i.v., Atropina 0,5 mg s.c.); nag³oœniê i tchawicê znieczulono miejscowo roztworem ksylokainy 2 %. Koñcówkê bronchofiberoskopu Olympus Bf 20 klinowano w oskrzelu p³ata œrodkowego (p³uca prawego). Podawano 200 ml zbuforowanej soli fizjologicznej (37 C) w czterech równych porcjach. Po podaniu ka dej czêœci materia³ odsysano, filtrowano przez steryln¹ gazê, ³¹czono, mieszano, zbierano w silikonowanych ja³owych naczyniach i transportowano do laboratoriów w temperaturze 2-8 C [13]. Badania cytologiczne materia³u BAL ywotnoœæ komórek nap³ywowych BAL oznaczano b³êkitem trypanu (0,1%). Ca³kowit¹ liczbê komórek nap³ywowych BAL obliczano w komorze Bürkera, wyra aj¹c wynik jako bezwzglêdn¹ liczbê komórek w 1 ml p³ynu. Objêtoœci zawieraj¹ce po 5-20 x 10 4 komórek nap³ywowych BAL wirowano w cytowirówce (Cytospin II, Shandon, 90 g, 10 min.). Preparaty barwiono sposobem Maya- Grünwalda-Giemsy (MGG) oraz hematoksylin¹-eozyn¹ (HE) i oceniano cytologicznie. Wzór odsetkowy komórek nap³ywowych BAL (AM, limfocytów, neutrofilów i eozynofilów) otrzymano licz¹c w mikroskopie œwietlnym, co najmniej po 500 komórek w ka dym przypadku. Obliczano wartoœæ œredni¹ z obserwacji w obu barwieniach [3]. Do analizy nie kwalifikowano materia³ów BAL z ma³ym odzyskiem (<30% wyjœciowej objêtoœci u ytej soli), zawieraj¹cych >5% nab³onków górnych dróg oddechowych lub znaczn¹ domieszkê krwi (>90% erytrocytów) [3,15]. Badania immunologiczne materia³u BAL (typowanie limfocytów pêcherzykowych, LP) Podstawowe subpopulacje LP fenotypowano metod¹ podwójnej immunofluorescencji bezpoœredniej, jak opisano poprzednio [14]. W skrócie, materia³ BAL odwirowano i p³ukano w PBS-ie (300 g, 8 min.). Iloœci 1-5 x 10 5 komórek nap³ywowych BAL inkubowano z nasycaj¹cymi iloœciami mysich przeciwcia³ monoklonalnych (DAKO Cytomation, BD Immunocytometry Systems). Aby zdefiniowaæ pole limfocytów BAL w cytometrii przep³ywowej, u yto przeciwcia³a anty-cd45 FITC (kontrola dodatnia). Ponadto kolejne próbki barwiono mysimi przeciwcia³ami monoklonalnymi (Becton-Dickinson Biosciences Pharmingen), skierowanymi przeciw nastêpuj¹cym antygenom ludzkim: CD14/CD19, CD4/CD95, CD8/ CD95, CD4/CD95L, CD8/CD95L, CD3/CD16+56 i CD3/ HLA-DR (pierwsze przeciwcia³o ka dej pary sprzê one by³o z izotiocyjanianem fluoresceiny, FITC, drugie z czerwieni¹ fikoerytryny, PE; 30 min, 2-8 C). Inkubacjê przerywano roztworem PBS z 0,1% azydkiem sodu. Komórki p³ukano i zawieszano w 0,3 ml roztworu PBS z dodatkiem 2% paraformaldehydu. Nieswoiste wi¹zanie przeciwcia³ przez komórki ludzkie wykluczono, inkubuj¹c Grupa IPF IPF Grupa kontrolna Grupa kontrolna Wiek Lata VC % FEV1/VC % MEF 75 % MEF 50 % MEF 25 % Zaburzenia t. restrykcyjnego Zaburzenia t. obturacyjnego 54 ± 3 77 ± 5,4 * 87,5 ± 4, ± 11, 1 74 ± 19, 6 65 ± 14, 3 6/14 1/14 57 ± 7,5 73 ± 7, 4 80 ± 6, 1 90 ± 17, 1 68 ± 10, 9 62 ± 9, 6 3/ 7 2/ 7 34 ± 2,5 106 ± 5, 1 86 ± 4, 7 87,5 ± 4, 5 90 ± 7, 2 69 ± 6,9 * 0/10 0/10 37 ± 2,3 96,5 ± 1, 5 82 ± 5, 7 95 ± 4, 0 87 ± 13, 7 64,5 ± 10, 5 0/ 7 1/ 7 * p<0,05 w porównaniu z grup¹ kontroln¹; Procent wartoœci nale nej Tabela II Dane cytoimmunologiczne BAL. BAL cytoimmunology data. Zmienna IPF Grupa kontrolna O dzysk p³ynu BAL % 49 ± 3,2 (30-67) 47 ± 2,4 (35-53) 57 ± 2,6 (35-75) 53 ± 3,0 (32-70) Ca³kowita liczba komórek BAL ± 96 ( ) * 499 ± 74,5 ( ) 175 ± 33 (50-325) 451 ± 71 ( ) M akrofagi % 56,3 ± 6,0 (7-92) * 71,5 ± 7,7 (63-95) *# 88,5 ± 1,5 (61-92) 93 ± 0,9 (84-97) # L imfocyty (LP) % 14 ± 5,8 (3-66) * 18 ± 6,0 (2,5-28) * 10,5 ± 1,2 (4-38) 4,7 ± 0,6 (2,4-10,1) # N eutrofile % 19 ± 3,7 (1-40) * 8,2 ± 2,9 (2-12) * 1,0 ± 0,4 (0-6) 1,3 ± 0,3 (0,3-4) E ozynofile % 2,9 ± 3,7 (0-50) * 0,5 ± 0,4 (0-9) *# 0,2 ± 0,2 (0-2) 0,2 ± 0,3 (0-4) L imfocyty T (CD3+) % 90 ± 1,1 (80-98) 89,0 ± 1,7 (86-92) 89 ± 1,1 (76-96) 89 ± 1,7 (75-99) L imf. NK (CD3-CD16lub56+) % 2,5 ± 0,7 (0-9) 3 ± 2,5 (2-10) 4 ± 0,7 (0-10) 4 ± 1,1 (1-15) L imfocyty B (CD19+) % 3,0 ± 0,4 (0-7) 2 ± 0,9 (1-4) 3 ± 0,3 (0-8) 1,8 ± 0,9 (0-10) L imfocyty Th (CD4+) % 33,5 ± 3,6 (13-74) * 26 ± 6,4 (13-42) * 55 ± 2,3 (34-78) 38 ± 2,5 (21-56) # L imfocyty Tc (CD8+) % 43 ± 3,9 (10-80) 62,5 ± 7,3 (49-84) *# 30 ± 1,7 (15-58) 47 ± 2,4 (34-60) # * p<0,05 w porównaniu z odpowiedni¹ grup¹ kontroln¹ # p<0,05 w porównaniu z odpowiedni¹ grup¹ osób niepal¹cych Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 /

4 próbki kontrolne ze zgodnymi izotypowo przeciwcia³ami mysimi. Akwizycjê w cytometrze przep³ywowym BD FAC- SCalibur (laser argonowy 488 nm) wykonano zbieraj¹c dane, o co najmniej komórek, w tym ich wielkoœci (forward scatter, FSC), ziarnistoœci (side scatter, SSC) i intensywnoœci œwiecenia (standardowe kana³y fluorescencji FL1 i FL2, odpowiadaj¹ce pasmom œwiat³a zielonego i jasnoczerwonego). Sposób okreœlania pola limfocytów BAL w uk³adzie parametrów CD45/SSC, szczegó³owe kryteria kwalifikacji materia³u BAL i warunki analizy cytometrycznej opisano poprzednio [14]. Wyniki prezentowano jako procent dodatnich limfocytów BAL w danym barwieniu. Markery CD3, CD4, CD8, CD16+56 (NK) i CD19 charakteryzowa³y poszczególne subpopulacje LP: komórki T, Th, Tc, NK i B. Antygen CD14 definiowa³ wielkoœæ domieszki m³odych monocytoidalnych postaci makrofagów, cz¹steczki ludzkiego uk³adu zgodnoœci tkankowej MHC klasy II (HLA-DR) pos³u y³y jako znacznik aktywnoœci LP. Znaczenie antygenów CD95 (Fas) i CD178 (ligand Fas, FasL) wyjaœniono we wstêpie. Badanie apoptozy LP A. Badanie cyklu komórkowego i póÿnej apoptozy. Komórki BAL inkubowano w roztworze saponiny, celem permeabilizacji. DNA barwiono prze yciowo jodkiem propydyny (propidium iodide, PI). Umo liwia³o to analizê cyklu komórkowego, w tym hipodiploidalnej fazy (pola) sub-g 1, odpowiadaj¹cej póÿnej apoptozie. Wykorzystano zdolnoœæ PI do stechiometrycznego wi¹zania siê z DNA. Szczegó³y opisano uprzednio [14]. Akwizycjê w cytometrze przep³ywowym przeprowadzano w ci¹gu 24 godzin od barwienia, zbieraj¹c ponad limfocytów. Analizowano histogram pola powierzchni impulsów charakteryzuj¹cych pojedyncze komórki w standardowym kanale fluorescencji FL2, FL2-A (Becton-Dickinson FACSCalibur, program ModFit). Przyk³adow¹ analizê cytometryczn¹ cyklu komórkowego LP przedstawiono na rycinie 1. B. Barwienie technik¹ TUNEL (Terminal deoxinucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling). W metodzie wykorzystano zdolnoœæ terminalnej transferazy nukleotydów do wyd³u ania (elongacji) nici DNA w miejscach jego fragmentacji (zwykle miêdzy nukleosomami). Miejsca te pojawiaj¹ siê w j¹drach komórek w kilka godzin od pocz¹tku procesu apoptozy. Pos³u ono siê kitem Roche (In Situ Cell Death Detection Kit, nr kat ), stosuj¹c siê do instrukcji producenta. W skrócie, preparaty z cytowirowania materia³u BAL, utrwalone w 75% alkoholu z acetonem (10 min.) i przechowane w 20 C, odmra ano, inkubowano przez 10 min. w temperaturze pokojowej z 3% roztw. H 2 O 2 w metanolu (POCh nr kat ) i p³ukano 2x w roztworze PBS. Komórki inkubowano przez 20 minut bez dostêpu œwiat³a w temp. 37 C z 50 ul mieszaniny reakcyjnej (TUNEL reaction mixture: roztwór 2,5 ul enzymu w buforze i 22,5 ul zawiesiny nukleotydów sprzê onych z FITC w przeliczeniu na preparat, rozcieñczony w stosunku 1:1 w roztworze PBS). Sporz¹dzano preparaty stanowi¹ce kontrolê ujemn¹ (mieszanina nie zawiera³a enzymu). Nastêpnie preparaty p³ukano 3x w roztworze PBS, pole wokó³ komórek osuszano, nak³adano Converter-POD (przeciwcia³o przeciw FITC znakowane peroksydaz¹, rozcieñczone z PBS-em w stosunku 1:1), inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, ponownie p³ukano w PBS-ie (3x) i osuszano. Œwie o przygotowany roztwór DAB/H 2 O 2 (tabletka DAB, DAKO Cytomation, nr kat. S300, rozpuszczona w 10 ml TBS-u z dodatkiem 5 kropli 3% roztw. H 2 O 2 ) nakrapiano na komórki. Inkubowano w temperaturze pokojowej 5 minut lub do uzyskania odpowiednio intensywnej reakcji barwnej. Preparaty p³ukano 3x w wodzie bie ¹cej, barwiono hematoksylin¹ Harrisa (STAMAR, nr kat ), odwadniano w szeregu alkoholi, przeœwietlano 10 minut w ksylenie (POCh, nr kat ) i zamykano w balsamie kanadyjskim (LOBA FEINCHEMIE, nr kat ). Dodatnie (apoptotyczne) komórki charakteryzowa³y siê br¹zowym wybarwieniem j¹der. Liczono osobno, co najmniej po 500 limfocytów i makrofagów (wynik przedstawiano jako procent odpowiedniej populacji komórek) [12]. Metody statystyczne Zastosowano program Statistica 6.0. Testem U Manna-Whitney a porównano nierówne liczbowo grupy o nieparametrycznym rozk³adzie zmiennych, korelacja R Spearmana pos³u y³a do badania zwi¹zku pomiêdzy zmiennymi. Wyniki przedstawiono jako medianê ± b³¹d standardowy œredniej (SEM), chyba, e zaznaczono inaczej. Ró nice dla p<0,05 uznano za znamienne statystycznie. Rycina 2 CD4/CD8 w materiale BAL [1]. mediana ± SEM; NS, niepal¹cy; S, palacze papierosów * p<0,05 w porównaniu z odpowiedni¹ grup¹ kontroln¹ # p<0,005 w porównaniu z odpowiedni¹ podgrup¹ palaczy CD4/CD8 in BAL material [1]. median ± SEM NS, nonsmokers; S, smokers * p<0,05 as compared to respective controls # p<0,005 as compared to respective nonsmoker subset Wyniki Dane z badania cytologicznego materia³u BAL oraz wyniki typowania podstawowych subpopulacji LP, przedstawiono w tabeli II. W IPF wyst¹pi³ znamienny statystycznie wzrost ca³kowitej liczby komórek BAL, odsetka limfocytów, neutrofilów i eozynofilów. Po przeliczeniu wyników na ca³kowite liczby odpowiednich populacji komórek, wzros³a równie liczba makrofagów w 1 ml materia³u BAL u niepal¹cych chorych na IPF w porównaniu z odpowiedni¹ grup¹ kontroln¹. Dodatkowo u palaczy chorych na IPF, w porównaniu z chorymi niepal¹cymi, wy- szy by³ odsetek makrofagów pêcherzykowych (i ich ca³kowita liczba w przeliczeniu na 1 ml pop³uczyn). Rycina 1 Cytometria przep³ywowa. Przyk³ady barwienia cyklu komórek BAL jodkiem propydyny. Flow cytometry. Samples of BAL cell cycle staining with propidium iodide. 692 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 P. Kopiñski i wsp.

5 W wynikach subpopulacji limfocytów zwraca³a uwagê dominacja komórek CD3+ (limfocytów T), niezale nie od badanej grupy. Odsetek limfocytów CD4 (Th) w obu podgrupach chorych z IPF, oraz by³ znamiennie ni szy, zaœ odsetek limfocytów CD8 (Tc) u palaczy z IPF znamiennie wy szy, ni równoleg³e wyniki odpowiednich podgrup kontrolnych. Dodatkowo palaczy papierosów w IPF cechowa³a wy sza liczba limfocytów CD8 (19,1±8,7 tys./ml w porównaniu 4,1±5,3 tys./ml u chorych niepal¹cych, p<0,05, mediana ± SEM). Na rycinie 2 przedstawiono spadek wartoœci stosunku CD4/CD8 w IPF, w porównaniu z grup¹ kontroln¹ oraz dalszy spadek tej wartoœci u pal¹cych chorych z IPF w porównaniu z chorymi niepal¹cymi. Cz¹steczki HLA-DR (marker aktywacji) wystêpowa³y znamiennie czêœciej na powierzchni komórek T w IPF ni w grupie kontrolnej (47±4,5% wobec 23±2,8% w podgrupach osób niepal¹cych, p<0,05 oraz 65±14% wobec 21,4±4,0% w podgrupach palaczy, p<0,05). Nie by³o znamiennych ró - nic w ekspresji receptorów dla TNF typu I na LP pomiêdzy badanymi grupami. Przewa aj¹ca wiêkszoœæ komórek BAL, zarówno makrofagów, jak i LP (nieco poni- ej 100%) wykazywa³a niezale nie od badanej grupy, ekspresjê powierzchniowej cz¹steczki Fas (wyników nie przedstawiano). Ró nice znamienne statystycznie dotyczy³y natomiast ekspresji ligandu Fas na powierzchni limfocytów pêcherzykowych, co przedstawiono na rycinie 3. Odsetek komórek CD8, ale nie CD4, wykazuj¹cych ekspresjê FasL wzrasta³ znamiennie u palaczy z IPF (12,0±3,1% vs 3,7±0,9% u niepal¹cych, p<0,05). Na rycinie 4 przedstawiono wyniki czêstoœci apoptozy LP w IPF i grupie kontrolnej. Apoptoza limfocytów pêcherzykowych (a tak e makrofagów) by³a wzmo ona w IPF w porównaniu z grup¹ kontroln¹, co potwierdzono za pomoc¹ obu stosowanych technik. Nie by³o znamiennych ró nic miêdzy obu podgrupami chorych z IPF. Odsetek limfocytów w fazie sub-g1 cyklu komórkowego (póÿna apoptoza) wyniós³ 1,6±0,6% u niepal¹cych chorych z IPF (0,7±0,2% w grupie kontrolnej) oraz 6,3±3,2% u palaczy z IPF (1,6±0,9% w odpowiedniej grupie kontrolnej). Analogiczne wartoœci dla techniki TUNEL wynios³y 8,3±2,5% u niepal¹cych chorych z IPF oraz 3,0±2,9% u palaczy z IPF (równoleg³e wartoœci dla odpowiednich podgrup kontrolnych wynios³y 1,2±0,8% oraz 2±1,1%). W przebadanym materiale odsetek i ca³kowita liczba limfocytów dodatnich z ligandem Fas, zw³aszcza liczba komórek CD8+FasL+, by³y znamiennie i ujemnie skorelowane z wartoœci¹ pojemnoœci yciowej VC (Rs= 0,51 dla odsetka CD8+FasL+ oraz Rs= 0,55 dla ca³kowitej liczby tych komórek w 1ml pop³uczyn, p<0,05 dla obu korelacji). Charakterystyczne, e ani odsetek, ani ca³kowita liczba LP dodatnich z ligandem Fas, ani odsetek komórek Th i Tc dodatnich z FasL, nie korelowa³ z apoptoz¹ limfocytów pêcherzykowych oraz nie korelowa³ z apoptoz¹ makrofagów w materiale BAL. Rycina 3 Ekspresja ligandu Fas (FasL) na limfocytach pêcherzykowych T [%]. mediana ± SEM; NS, niepal¹cy; S, palacze papierosów * p<0,05 w porównaniu z odpowiedni¹ grup¹ kontroln¹ Fas Ligand expression (FasL) on alveolar T cells [%]. median ± SEM; NS, nonsmokers; S, smokers * p<0,05 as compared to respective controls Rycina 4 Apoptoza limfocytów pêcherzykowych i makrofagów pêcherzykowych [%]. * p<0.05 w porównaniu z w³aœciw¹ grup¹ osób niepal¹cych; NS, niepal¹cy; S, palacze Apoptosis of alveolar lymphocytes and macrophages [%]. * p<0.05 as compared to respective nonsmoker group; NS, nonsmokers; S, smokers Dyskusja Kilka lat temu toczy³a siê dyskusja, jakie znaczenie ma palenie papierosów u chorych z IPF. Wg Kinga i wsp. palenie nie tylko nie zaostrza przebiegu choroby, ale nawet jest korzystnym czynnikiem prognostycznym [10]. Inaczej uwa aj¹ Selman i wsp., którzy wykazali, e w podgrupie chorych z IPF o gwa³townym, bardzo niekorzystnym przebiegu, palacze s¹ czêœciej reprezentowani, ni wœród wszystkich chorych [25]. Wg Zismana i wsp. palenie jest jednym z g³ównych czynników ryzyka zachorowania na IPF [30]. Ponadto zwraca siê uwagê na fakt du o czêstszego wystêpowania raka p³uca u chorych z IPF, co zazwyczaj jest nastêpstwem w³aœnie palenia papierosów [2]. Nasze wyniki wpisuj¹ siê w pogl¹d o szkodliwym dzia³aniu dymu papierosowego w IPF. Wyniki czynnoœciowe testów p³ucnych, zw³aszcza pojemnoœci yciowej VC, s¹ gorsze u palaczy z IPF, ani eli u osób niepal¹cych. Nie stwierdzono ró nic statystycznych, ale te i przebadana grupa by³a niezbyt liczna. Apoptoza makrofagów i limfocytów pêcherzykowych wystepuje czêœciej u pal¹cych chorych, ni w podgrupie osób niepal¹cych. W zwi¹zku z uznan¹ rol¹ obu tych populacji komórek zapalnych w patomechanizmach w³óknienia p³uc mo na by przyj¹æ, e czêstsza programowana œmieræ tych komórek bêdzie mia³a w IPF znacznie przeciwzapalne i u³atwi dzia³anie stosowanych leczenia. W przypadku makrofagów nie mo na do koñca wykluczyæ takiej mo liwoœci. Nale y pamiêtaæ, e komórki te produkuj¹ w przebiegu zapalenia zarówno czynniki hamuj¹ce, jak i aktywuj¹ce w³óknienie [3]. W œwietle obecnej wiedzy trudno przewidzieæ, czy uszkodzenie i czêstsza apoptoza tych komórek w IPF jest dla chorego korzystna, czy nie. Wypada odnotowaæ, e w chorobie tej wykazano pogorszenie czynnoœci wy- Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 /

6 dzielniczej makrofagów pêcherzykowych, czy to wskutek zaburzeñ sekrecji, jak np. interleukiny-10 i TNF-g [8], czy w zwi¹zku z ogólnym spadkiem w tych komórkach poziomu transkrypcji genów dla bia³ek [22]. Tak e i my udowodniliœmy uprzednio, e wa ny autokrynny mitogen makrofagów pêcherzykowych, jakim jest insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (IGF-1) wystêpuje w nads¹czach BAL chorych z IPF w stê eniu ni - szym, ni w grupie kontrolnej, pomimo, e stwierdza siê jego obecnoœæ w wysokim odsetku makrofagów pêcherzykowych [14]. W œwietle naszych badañ, na podstawie oceny apoptozy (i ywotnoœci) makrofagów BAL w IPF, mo na wnioskowaæ o dalszym pogorszeniu siê czynnoœci tych komórek w podgrupie chorych pal¹cych papierosy, w porównaniu z pacjentami niepal¹cymi. Trudno natomiast spekulowaæ, czy jest to zjawisko korzystne. atwiej o komentarz w odniesieniu do znacznie wzmo onej czêstoœci apoptozy LP u palaczy chorych na IPF. Wynik ten nale y interpretowaæ ³¹cznie ze znacznym spadkiem wartoœci stosunku CD4/CD8 w materiale BAL oraz ze wzrostem ca³kowitej liczby komórek cytotoksycznych CD8 u tych chorych. Od dawna wiadomo, e ma³y odsetek limfocytów w materiale BAL jest niekorzystny rokowniczo [7]. Wykazano te, e prognozê pogarsza spadek wartoœci CD4/CD8 [27]. Wykazaliœmy uprzednio, e przeciwfibrogenny czynnik prozapalny, jakim jest interferon gamma (IFNg) jest uwalniany w chorobach œródmi¹ szowych p³uc g³ównie przez komórki Th [13]. Tymczasem synteza IFNg w IPF jest upoœledzona [21]. W œwietle niektórych doniesieñ mo na s¹dziæ, e subpopulacj¹ limfocytów, której liczebnoœæ regulowana jest w dolnych drogach oddechowych przez apoptozê, s¹ komórki Th [12]. Podsumowuj¹c wydaje siê, e palenie papierosów w IPF sprzyja nasilonej apoptozie limfocytów pêcherzykowych CD4+, co znosi antyfibrotyczne, ochronne dzia³anie tych komórek i przyspiesza przebieg w³óknienia p³uc w IPF. Prezentowane tu wyniki wskazuj¹, e w dolnych drogach oddechowych chorych z IPF istnieje inny wa ny mechanizm przyspieszaj¹cy przebieg choroby u palaczy i pogarszaj¹cy rokowanie. Dotyczy on wzrostu aktywnoœci uk³adu Fas/ligand Fas w dolnych drogach oddechowych w IPF. Uprzednio wykryto w tej chorobie miêdzy innymi wysokie stê enie ligandu Fas w p³ynie BAL i powi¹zano tê obserwacjê z pogorszeniem czynnoœci p³uc, prawdopodobnie wskutek wywo³ania œmierci nab³onków dróg oddechowych [17]. W niniejszej pracy wykazano, e równie ekspresja powierzchniowych cz¹steczek Fas na komórkach zapalnych dróg oddechowych jest zwiêkszona, szczególnie u palaczy. Co wiêcej, nie by³a ona skorelowana z apoptoz¹ tych komórek. Wykazano natomiast (przynajmniej w odniesieniu do limfocytów cytotoksycznych CD8) zwi¹zek pomiêdzy wy- sz¹ ekspresj¹ ligandu Fas, a pogorszeniem czynnoœci p³uc w mechanizmie zaburzeñ restrykcyjnych. Obserwacja ta potwierdza i uzupe³nia niedawne doniesienia o niekorzystnym udziale limfocytów CD8 we w³óknieniu p³uc [5]. Wnioski 1. Palenie papierosów w IPF powodowa³o znamienny wzrost odsetka i ca³kowitej liczby zarówno komórek BAL CD8, jak i CD8+FasL+ oraz prowadzi³o do zwiêkszonej apoptozy limfocytów pêcherzykowych. 2. Komórki cytotoksyczne BAL (limfocyty CD8+FasL+) wydaj¹ siê wp³ywaæ3. na pogorszenie czynnoœci p³uc u chorych z IPF. Piœmiennictwo 1. Aoshiba K., Tamaoki J., Nagai A.: Acute cigarette smoke exposure induces apoptosis of alveolar macrophages. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2001, 281, L Aubry M.C., Myers J.L., Douglas W.W. et al.: Primary pulmonary carcinoma in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Mayo Clin. Proc. 2002, 77, Ch³ap Z., Czarnobilska E., Kopiñski P., Gil K., Jedynak U.: Cytoimmunological atlas of bronchoalveolar lavage (BAL). Ed. Medycyna Praktyczna, Kraków Crystal R.G., Bitterman P.B., Mossman B. et al.: Future research directions in idiopathic pulmonary fibrosis: summary of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002, 166, Daniil Z., Kitsanta P., Kapotsis G. et al.: CD8+ T lymphocytes in lung tissue from patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Respir. Res. 2005, 6, Fireman E., Shahar I., Shoval S., Messer G., Dvash S., Grief J.: Morphological and biochemical properties of alveolar fibroblasts in interstitial lung diseases. Lung 2001, 179, Fireman E., Vardinon N., Burke M. et al.: Predictive value of response to treatment of T-lymphocyte subpopulations in idiopathic pulmonary fibrosis. Eur. Respir. J. 1998, 11, Freeburn R.W., Armstrong L., Millar A.B.: Cultured alveolar macrophages from patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) show deregulation of lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and interleukin-10 (IL-10) inductions. Eur. Cytokine Netw. 2005, 16, Furuie H., Yamasaki H., Suga M., Ando M.: Altered accessory cell function of alveolar macrophages: a possible mechanism for induction of Th2 secretory profile in idiopathic pulmonary fibrosis. Eur. Respir. J. 1997, 10, King T.E. Jr, Tooze J.A., Schwarz M.I., Brown K.R., Cherniack R.B.: Predicting survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Scoring system and survival model. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001, 164, Lohman-Matthes M.L., Steinmüller C., Franke- Ullman G.: Pulmonary macrophages. Eur. Respir. J. 1994, 7, Kopiñski P., Przybylski G., Balicka-Œlusarczyk B. i wsp.: Apoptoza limfocytów pêcherzykowych w sarkoidozie i w grupie kontrolnej wystêpuje czêœciej u palaczy papierosów ni u osób niepal¹cych. Przegl. Lek. 2006, 63, Kopiñski P., Przybylski G., Jarzemska A. i wsp.: Stê enie IFN-gamma w p³ynie z p³ukania oskrzelowo-pêcherzykowego w wybranych chorobach œródmi¹ szowych p³uc jest dodatnio skorelowane z wartoœci¹ stosunku CD4/CD8. Pol. Merk. Lek. 2007, XXIII, Kopiñski P., S³adek K., Szczeklik J. et al.: Expression of insulin-like growth factor-i (IGF-I) in the lower airways immune cells. Evaluation of its possible role as an antiapoptotic agent. Fol. Hist. Cytobiol. 2006, 44, Kopiñski P., Szczeklik J., Lackowska Bet al.: Flow cytometric characteristics of alveolar lymphocytes (AL) obtained by bronchoalveolar lavage (BAL) in the control group - proposal of normal value range of AL subsets in non smokers. Central Eur. J. Immunol. 2004, 29, Krein P., Winston B.: Roles of insulin-like growth factor-i and transforming growth factor-ß in fibrotic lung disease. Chest 2002, 122, Kuwano K., Kawasaki M, Maeyama T. et al.: Soluble form of fas and fas ligand in BAL fluid from patients with pulmonary fibrosis and bronchiolitis obliterans organizing pneumonia. Chest 2000, 118, Lohman-Matthes M.L., Steinmüller C., Franke- Ullman G.: Pulmonary macrophages. Eur. Respir. J. 1994, 7, Moodley Y.P., Caterina P., Scaffidi A.K. et al.: Comparison of the morphological and biochemical changes in normal human lung fibroblasts and fibroblasts derived from lungs of patients with idiopathic pulmonary fibrosis during FasL-induced apoptosis. J. Pathol. 2004, 202, Nicholson A.G.: Classification of idiopathic interstitial pneumonias: making sense of the alphabet soup. Histopathol. 2002, 41, Prior C., Haslam P.L.: In vivo levels and in vitro production of interferon-gamma in fibrosing interstitial lung diseases. Clin. Exp. Immunol. 1992, 88, Ren P., Rosas I.O., Macdonald S.D., Wu H.P., Billings E.M., Gochuico B.R.: Impairment of alveolar macrophage transcription in idiopathic pulmonary fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2007, 175, Revillard J.P., Adorini L., Goldman M., Kabelitz D., Waldmann H.: Apoptosis: potential for disease therapies. Immunol. Today 1998, 19, Saltini C., Kirby M., Trapnell C.: Biased accumulation of T lymphocytes with memory - type CD45 leukocyte common antigen gene expression on the epithelial surface of the human lung. J. Exp. Med. 1990, 171, Selman M., Carrillo G., Estrada A. et al.: Accelerated variant of idiopathic pulmonary fibrosis: clinical behavior and gene expression pattern. PLoS ONE 2007, 2, e Selman M., Thannicka V.J., Pardo A., Zisman D.A., Martinez F.J., Lynch J.P. 3rd.: Idiopathic pulmonary fibrosis: pathogenesis and therapeutic approaches. Drugs 2004, Tabuena R.P., Nagai S., Tsutsumi T. et al.: Cell profiles of bronchoalveolar lavage fluid as prognosticators of idiopathic pulmonary fibrosis/usual interstitial pneumonia among Japanese patients. Respiration 2005, 72, Taskar V.S., Coultas D.B.: Is idiopathic pulmonary fibrosis an environmental disease? Proc. Am. Thorax Soc. 2006, 3, Uhal B.D.: Epithelial apoptosis in the initiation of lung fibrosis. Eur. Respir. J. 2003, 22, (Suppl. 44), 7s. 30. Zisman D.A., Keane M.P., Belperio J.A., Strieter R.M., Lynch J.P. 3rd.: Pulmonary fibrosis. Methods Mol. Med. 2005, 117, Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 10 P. Kopiñski i wsp.