PRACE ORYGINALNE. w kierunku ekspresji receptorów: TGFß (CD105), IFN? (CD119) and

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Barbara BALICKA-ŒLUSARCZYK 1 Andrzej DYCZEK 2 Andrzej MARSZA EK 4,5 Grzegorz PRZYBYLSKI 6 Teresa IWANIEC 2 Karina SZAB OWSKA 3 Ewelina PÓ GÊSEK 3 Tomasz WANDTKE 3 Piotr KOPIÑSKI 3 Wybrane cytokiny i ich receptory w dolnych drogach oddechowych palaczy papierosów. Czy dym tytoniowy wp³ywa na stan polaryzacji immunologicznej Th1/Th2 w œródmi¹ szowych chorobach p³uc? Selected cytokines and their receptors in lower airways of cigarette smokers. Does tobacco smoke have an impact on Th1/Th2 immune polarization in interstitial lung diseases? 1 Katedra Toksykologii i Chorób Œrodowiskowych, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloñski, Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. Krystyna Obtu³owicz 2 II Katedra Chorób Wewnêtrznych, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloñski, Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. Jacek Musia³ 3 Katedra Genoterapii, Collegium Medicum, Uniwersytet im. Miko³aja Kopernika, Bydgoszcz Kierownik: Dr med. Piotr Kopiñski (p.o.) 4 Katedra Patomorfologii Klinicznej, Collegium Medicum, Uniwersytet im. Miko³aja Kopernika, Bydgoszcz Kierownik: Dr. hab. med. Andrzej Marsza³ek prof. UMK 5 Katedra Patomorfologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ Kierownik: Prof. dr hab. Przemys³aw Majewski 6 Klinika Chorób P³uc, Nowotworów i GruŸlicy, Collegium Medicum, Uniwersytet im. Miko³aja Kopernika, Bydgoszcz Kierownik: Dr med. Grzegorz Przybylski (p.o.) Dodatkowe s³owa kluczowe: choroby œródmi¹ szowe p³uc cytokiny limfocyty pêcherzykowe palenie papierosów p³ukanie oskrzelowo-pêcherzykowe Additional key words: alveolar lymphocytes bronchoalveolar lavage (BAL) cigarette smoking cytokines interstitial lung diseases Pracê sfinansowano ze œrodków Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wy szego (grant nr N /3591) Adres do korespondencji: Dr med. Piotr Kopiñski Katedra Genoterapii CM UMK ul. M. Sk³odowskiej-Curie Bydgoszcz mpkopins@hotmail.com Tel. / Faks: / 87 Konsumpcja tytoniu jest uznan¹ przyczyn¹ raka p³uca, wskutek indukcji miejscowej mutagenezy. Uprzednio opisaliœmy wzrost czêstoœci apoptozy limfocytów pêcherzykowych (alveolar lymphocytes, AL) u palaczy. Mniej wiadomo o innych miejscowych mechanizmach promocji karcynogenezy, jak upoœledzony nadzór immunologiczny i zaburzenia polaryzacji Th1/Th2. Cel: Zbadanie wp³ywu palenia papierosów na ekspresjê wybranych cytokin i ich receptorów w materiale z p³ukania oskrzelowo-pêcherzykowego (bronchoalveolar lavage, BAL) u osób zdrowych i w chorobach œródmi¹ szowych p³uc; próba oceny zaburzeñ polaryzacji immunologicznej Th1/Th2 u palaczy. Metody: BAL pobrano od chorych z sarkoidoz¹ p³uc (PS, n=35), samoistnym œródmi¹ szowym zapaleniem p³uc (idiopathic interstitial pneumonias, IIP, n=30) i w grupie kontrolnej (n=17); wyodrêbniono podgrupy osób niepal¹cych () i palaczy papierosów. W nads¹czu BAL testem ELISA badano stê enie TGFß, IFNg i TNFa, cytokin potencjalnie uczestnicz¹cych w regulacji odpowiedzi przeciwnowotworowej. Komórki Th (CD4) i Tc (CD8) typowano w kierunku ekspresji receptorów: TGFß (CD105), IFNg (CD119) i TNFa (receptor œmierci TNFR1, CD120A i TNFR2, CD120B). WYNIKI. U chorych pal¹cych, w porównaniu z odpowiadaj¹cymi im, stwierdzono znamiennie ni sze stê enia IFNg (4,3±2,7 vs 7,9±1,6 pg/ml w PS, 2,5±2,2 vs 6,1±1,4 pg/ml w IIP, p<0,05) i TNFa (1,1±0,5 vs 4,3±0,4 pg/ml w PS, p<0,01). Wzrost stê enia TGFß w IIP w porównaniu z PS i grup¹ kontroln¹ by³ nieznamienny. Odsetek AL dodatnich z receptorami dla TGFß i TNFa typu 1 (CD120A) by³ wy szy w podgrupach palaczy; znamiennoœæ statystyczn¹ (p<0,05) wykazano dla ekspresji CD105 Tobacco consumption is established as a cause of lung tumors, due to induction of local mutagenesis. We previously described increased apoptosis rate of alveolar lymphocytes (AL) in cigarette smokers. Less is known about other local mechanisms of carcinogenesis promotion, as impaired local immune surveillance and alterations in immune polarization Th1/ Th2. Aim: Evaluation of smoking impact on expression of selected cytokines and their receptors in material obtained by broncho-alveolar lavage (BAL) in healthy persons and in interstitial lung diseases; an attempt to assess the alterations of Th1/Th2 immune polarization in smokers. METHODS. BAL was harvested from patients with pulmonary sarcoidosis (PS, n=35), idiopathic interstitial pneumonias (IIP, n=30) and control subjects (n=17); subgroups of nonsmokers () and smokers were defined. The BAL supernatant levels of IFN?, TGFß and TNFa, the cytokines potentially regulating the local antitumor immunity, were tested with ELISA. Th (CD4) and Tc (CD8) cells were phenotyped for receptors expression: TGFß (CD105), IFN? (CD119) and TNFa (death receptor TNFR1, CD120A and TNFR2, CD120B). RESULTS. In smoking patients, as compared to respective subgroups, significantly lower IFNg (4.3±2.7 vs 7.9±1.6 pg/ml for PS, 2.5±2.2 vs 6.1±1.4 pg/ml for IIP, p<0.05) and TNFa (1.1±0.5 vs 4.3±0.4 pg/ml for PS, p<0.01) levels were found. Increase of TGFß level in IIP, as compared to PS and controls, was insignificant. Percentage of AL positive with TGFß and TNF type I (CD120A) receptors was higher in smokers; statistical significance (p<0.05) for expression of CD105 in IIP (10.6±2.3 vs 6.1±1.4 for Th, 11.7±3.4 and 4.0±0.8% 684 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 P. Kopiñski i wsp.

2 receptory praktycznie na wszystkie komórki ustroju. TNFa wydzielany jest g³ównie przez makrofagi, a tak e m.in. przez limfocyty T i NK, granulocyty, monocyty, komórki œródb³onka i fibroblasty. Wa nym Ÿród³em cytokiny w aktywnej postaci sarkoidozy s¹ makrofagi pêcherzykowe, uwalniaj¹ce zwiêkszone iloœci TNFa spontanicznie i po stymulacji [6]. Oddzia³uje na komórki przez dwa zasadnicze powierzchniowe receptory komórkowe: TNFR typu 1 (TNFR1, CD120A) i typu 2 (TNFR2, CD120B). Ligacja prowadzi do przeciwstawnych reakcji: apoptozy (receptor œmierci TNFR1) lub prze- ycia i proliferacji komórki docelowej (TNFR2) [5]. TNF wzbudza cytotoksycznoœæ makrofagów i komórek NK, chemotaksjê i czynnoœæ neutrofilów, zwiêksza ekspresjê receptorów adhezyjnych œródb³onka i produkcjê mediatorów zapalenia, jak IL-1, IL-6 i GM-CSF [6]. Efekt cytotoksyczny wynika z bezpoœredniego uruchomienia apoptozy komórki docelowej (przez TNFR1), jak te poœrednio z indukcji syntazy tlenku azotu (inos) w fagocytach i wewn¹trzkomórkowej produkcji wolnych rodników [18]. W akw IIP (10,6±2,3 vs 6,1±1,4 dla Th i 11,7±3,4 i 4,0±0,8% dla Tc), CD120A w PS (7,0±0,5 vs 2,9±0,9% dla Th), CD120A w IIP (18,1±5,6 vs 13,8±1,2 dla wszystkich AL i 11,7±3,4 vs 5,4±0,8% dla Tc) oraz CD120A w grupie kontrolnej (AL i Tc). Wnioski: BAL palaczy papierosów z PS i IIP w porównaniu z odpowiadaj¹cymi im grupami osób niepal¹cych cechuje ni sza ekspresja IFNg i TNFga. Wy sze odsetki AL CD105+ i CD120A+ u palaczy sugeruj¹ wzrost podatnoœci na potencjalny promotor nowotworzeni, TGFß, oraz na apoptozê zewn¹trzpochodn¹. W zakresie badanych cytokin wyniki nie potwierdzaj¹ pogl¹du o przewadze odpowiedzi Th1 u palaczy i wskazuj¹ na niekorzystne, w kontekœcie karcynogenezy, przesuniêcie równowagi w stronê uk³adu Th2. for Tc). CD120A in PS (7.0±0.5 vs 2.9±0.9% for Th). CD120A in IIP (18.1±5.6 vs 13.8±1.2 for total AL and 11.7±3.4 vs 5.4±0.8% for Tc) and CD120A in controls (total AL and Tc) was shown. CONCLUSIO. BAL in PS and IIP smokers, as related to respective groups, is characterized by lower IFNg and TNFa expression. Higher percentage of CD105+ and CD120A+ AL in smokers suggests increased susceptibility for potential oncogenesis promoter, TGFß, as well as sensitivity to extrinsic apoptosis. As cytokines considered, the results do not confirm the view on Th1 response predominance in smokers and indicate unfavourable, in the context of carcinogenesis, local imbalance towards Th2 system. Wstêp Choroby œródmi¹ szowe p³uc (ang. interstitial lung diseases, ILD) stanowi¹ niejednorodn¹ grupê nieinfekcyjnych i nienowotworowych chorób zapalnych dotycz¹cych dystalnych odcinków dróg oddechowych, zw³aszcza œcian pêcherzyków p³ucnych i otaczaj¹cego je œródmi¹ szu [19]. Do badania zapalenia dróg oddechowych w przebiegu ILD s³u y miêdzy innymi materia³ z p³ukania oskrzelowo-pêcherzykowego (BAL) [21]. Wyniki odczynów cytologicznych, immunologicznych i biochemicznych BAL wykazuj¹ znaczn¹ zmiennoœæ w zale - noœci od jednostki chorobowej obecnej u chorego, a tak e od wspó³wyst¹pienia dodatkowych czynników œrodowiskowych i wdro onego leczenia [13,20,26]. Palenie papierosów stanowi wyj¹tkowo silny czynnik modyfikuj¹cy obraz cytoimmunologiczny BAL - jest on zasadniczo odmienny, ni w odpowiadaj¹cej im grupie osób niepal¹cych papierosów (chorych lub zdrowych) [11,13]. U zdrowych palaczy tytoniu w materiale BAL pojawia siê wybitny wzrost liczby i odsetka makrofagów pêcherzykowych, ich pobudzenie oraz zmiany morfologiczne (jak py³ palacza papierosów w cytoplazmie fagocytów). Wzrasta parokrotnie ca³kowita liczba komórek BAL, znamiennie spada odsetek limfocytów i wartoœæ indeksu CD4/ CD8 [14,19]. W przeciwieñstwie do cytologii BAL, wp³yw wywierany przez palenie papierosów na wyniki badañ biochemicznych otrzymanych w ILD jest wzglêdnie s³abo poznany i to pomimo szczegó³owo opisanego udzia³u cytokin i czynników wzrostu w patogenezie chorób tej grupy [20]. Cytokiny i czynniki wzrostu uczestnicz¹ w inicjacji i propagacji odczynu zapalnego oraz reguluj¹ pojawienie siê i rozwój najgroÿniejszego powik³ania ILD, jakim jest w³óknienie p³uc [8]. Jest ono nieodwracalne, prowadzi do niewydolnoœci oddechowej i œmierci, a jedynym skutecznym sposobem leczenia jest przeszczep p³ucny lub p³ucno-sercowy [10]. Pracê niniejsz¹ poœwiêcono wp³ywowi palenia papierosów na ekspresjê trzech wybranych cytokin, szczególnie wa nych w patogenezie ILD i w³óknienia p³uc - czynnikowi martwicy guza (tumor necrosis factor a, TNFa), interferonowi g (IFNg) i transformuj¹cemu czynnikowi wzrostu (transforming growth factor ß, TGFß). Cytokiny (i ich receptory) dobrano w taki sposób, by ewentualne wnioski da³y podstawê do pewnych uogólnieñ: TNFa nale y do zasadniczych inicjatorów zapalenia i zewn¹trzpochodnych mediatorów programowanej œmierci/prze ycia krwinek bia³ych; IFNg i TGFß dzia³aj¹ w p³ucach przeciwstawnie, odpowiednio - hamuj¹c i stymuluj¹c w³óknienie œródmi¹ szowe [10,15]. Poniewa wszystkie zakwalifikowane do analizy materia³y BAL (tak e grupy kontrolnej) pozyskano tylko w ramach standardowej diagnostyki pulmonologicznej, wiêc rekrutacja trwa³a d³ugo i objêto nim g³ównie osoby chore. Ujêto je jednak e w dwie przeciwstawne grupy: sarkoidozy p³uc (przebieg zwykle bez w³óknienia p³uc, polaryzacja immunologiczna w kierunku Th1) i IIP (z regu³y rozwija siê w³óknienie p³uc, zwykle przewaga uk³adu Th2) [3,20]. W IIP ograniczono siê do prezentacji wyników pochodz¹cych od chorych z dwoma postaciami tego zespo³u - zwyczajnym lub nieswoistym œródmi¹ szowym zapaleniem p³uc, ze wzglêdu na zbli ony obraz kliniczny i histopatologiczny [9]. Tak zebrany materia³ uzupe³niono przypadkami osób prospektywnie zaliczonych do grupy kontrolnej (vide ni ej). TNFa, plejotropowa cytokina prozapalna i bia³ko ostrej fazy, oddzia³uje przez swe Tabela I Przeciwcia³a monoklonalne u yte w pracy wed³ug kana³ów fluorescencji (FL). Monoclonal antibodies used in the study according to fluorescence channels (FL). Badane antygeny (fluorochrom) CD45/CD14 CD105/CD4/CD8 CD119/CD8/CD4 CD120A/CD120B/CD4 CD120A/CD120B/CD8 F L 1 (FITC) F L2 (PE) FL3 (PE-Cy5) BD MCA1557F AbD Serotec FAB673F R&D Systems MCA1340F AbD Serotec MCA1340F AbD Serotec BD BD BD BD BD BD BD BD BD Tabela II Wyniki cytoimmunologiczne materia³u BAL. Grupy palaczy papierosów (S) porównano z niepal¹cymi (). BAL cytology and immunology. Smokers (S) compared to nonsmokers (). Sarkoidoza IIP kontrolna Ca³kowita liczba 3 komórek 10 /ml Makrofagi Limfocyty Neutrofile Eozynofile Indeks CD4/CD8 [1] 270 ± ± 1, 5 38 ± 1, 5 1 ± 0, 3 0,4 ± 0, ± 0, 8 S 340 ± ± 2,4** * 19 ± 2,3** * 1 ± 0, 4 0,3 ± 0,2* 3,9 ± 1,3 * 232 ± ± 7, 8 50 ± 7, 5 5 ± 2, 4 0,7 ± 1, 3 0,9 ± 0, 3 S 378 ± 243* 79 ± 29,3* 19 ± 1,4* * 3 ± 3, 0 1,5 ± 2, 4 0,9 ± 0, ± ± 4, 5 15 ± 3, 8 9 ± 3, 1 2,7 ± 2, 1 2,1 ± 0, 5 S 205 ± 47* 73 ± 18,2* 9 ± 2,5* 18 ± 15,5* 1,5 ± 0, 3 0,9 ± 0,2 * Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 /

3 Tabela III yniki typowania cytokin na powierzchni limfocytów pêcherzykowych Th (CD4+) i Tc (CD8+), przedstawione jako odsetek wszystkich limfocytów BAL. Grupy palaczy papierosów (S) porównano z niepal¹cymi (). Results of cytokin receptor typing on Th (CD4+) and Tc (CD8+) alveolar lymphocytes, presented as percentage of all BAL lymphocytes. Smokers (S) compared to nonsmokers (). Sarkoidoza IIP CD8+ C D105+ C D119+ C D120A+ CD120B+ 4,6 ± 0,34 1,7 ± 0,24 40,2 ± 3,76 9,8 ± 2,13 2,9 ± 0,92 1,6 ± 0,31 68 ± 4,16 13 ± 2,04 S 4,4 ± 0,72 2,5 ± 0,96 30,8 ± 14,25 3,4 ± 0,40 * 6,9 ± 0,45 1,6 75 ± 4,50 5,9 ± 2,16 * 6,1 ± 1,50 4 ± 0,78 30 ± 5,88 20 ± 3,36 7,5 ± 0,94 5,4 ± 0,82 38 ± 5,15 30 ± 3,99 S 10,6 ± 3,01 * 11,7 ± 0,85 * 20 ± 3,71 19 ± 3,71 8,3 ± 4,96 10 ± 3,46 * 20 ± 14,04 37 ± 13,29 5,7 2,9 20 ± 10,00 11 ± 3,00 7,3 3,4 48,5 ± 2,50 22 ± 5,00 kontrolna S 6,6 ± 2,59 3,2 ± 1,12 18 ± 1,65 12,8 ± 3,47 8,8 ± 1,33 6,6 ± 1,25 * 37 ± 7,10 30 ± 5,22 *p <0,05 w porównaniu z odpowiedni¹ grup¹ osób niepal¹cych Tabela IV Wyniki typowania cytokin na powierzchni limfocytów pêcherzykowych Th (CD4+) I Tc (CD8+), przedstawione jako odsetek odpowiedniej subpopulacji limfocytów BAL. Grupy palaczy papierosów (S) porównano z niepal¹cymi (). Results of cytokin receptor typing on Th (CD4+) and Tc (CD8+) alveolar lymphocytes, presented as percentage of respective BAL lymphocyte subset. Smokers (S) compared to nonsmokers (). Sarkoidoza IIP kontrolna *p <0,05 w porównaniu z odpowiedni¹ grup¹ osób niepal¹cych CD8+ C D105+ C D119+ C D120A+ CD120B+ 5,9 ± 0,43 10 ± 6,77 50,5 ± 5,36 64,7 ± 5,66 4,1 ± 1,13 7,9 ± 2,00 86,2 ± 4,35 88,8 ± 24,15 S 6,2 ± 0,63 16,2 ± 2,37 * 35,5 ± 16,26 * 41,7 ± 21,66 * 8,0 ± 0,47 * 18,7 ± 8,0 * 87,4 ± 5,43 68,8 ± 21,40 16,5 ± 3,85 9,0 ± 4,56 66,7 ± 7,25 63,3 ± 8,21 14,4 ± 2,11 15,0 ± 2,00 93,7 ± 4,69 78,3 ± 6,72 S 21,6 28,5 * 44,4 ± 13,61 * 47,4 ± 13,73 37,7 ± 13,30 * 12,8 ± 9,14 90,9 ± 17,73 97,4 ± 4,14 8,3 11,6 33,8 ± 17,09 35,5 ± 6,92 12,2 12,1 81,6 ± 4,88 74,0 ± 22,45 S 10,2 ± 4,75 14,8 ± 3,82 38,7 ± 2,05 26,5 ± 14,55 20,0 ± 4,25 * 12,8 ± 4,51 87,3 ± 5,55 67,4 ± 6,46 Rycina 1 Stê enie badanych cytokin w materiale BAL [pg/ml]. BAL material levels of tested cytokines [pg/ml]. tywnej sarkoidozie cytokina bierze udzia³ w formowaniu typowej ziarniny; w chorobach grupy ILD podtrzymuje przewlek³y odczyn zapalny [7,8]. Ekspozycja na TNFa prowadzi do uszkodzenia nab³onków dróg oddechowych [15]. Podwy szony poziom TNFa i jego receptorów w dolnych drogach oddechowych chorych z ILD wskazuje na zagro- enie w³óknieniem p³uc [30]. Istniej¹ w¹tpliwoœci, czy jest to nastêpstwo bezpoœredniej indukcji fibroblastów (przez TNFa lub zale - ny od niego tlenek azotu), odk¹d wykazano, e cytokina uczula fibroblasty na apoptozê zewn¹rzpochodn¹ [6]. Mo liwe wiêc, e w³óknienie stanowi tu poœredni¹ konsekwencjê przewlekania siê zapalenia [8]. W¹tpliwoœci takich nie budzi natomiast rola TGFß, obligatoryjnego mediatora w³óknienia p³uc, produkowanego m.in. przez makrofagi, monocyty, eozynofile i fibroblasty. TGFß pocz¹tkowo dzia³a prozapalnie, wzbudzaj¹c rekrutacjê i aktywacjê komórek uk³adu immunologicznego, z czasem jednak hamuje proliferacjê leukocytów i syntezê IL- 1, IL-12 i IFNg, czynnoœæ jego jest wiêc immunosupresyjna [16]. Indukuje w³óknienie, gdy stymuluje bezpoœrednio fibroblasty do syntezy sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej, w tym kolagenu typu I i III [8]. Z punktu widzenia niniejszej pracy wa ny jest fakt, e TGFß uwa a siê za czynnik promocyjny w wielu typach nowotworów. Jednym z postulowanych mechanizmów jest zmiana polaryzacji immunologicznej w kierunku odpowiedzi Th2 [27]. TGFß dzia³a za poœrednictwem receptorów typu I i II, przy czym do zwi¹zania ligandu i aktywacji przekaÿników wewn¹trzkomórkowych rodziny Smad (niezbêdnych do ekspresji genów zale nych od dzia³ania TGF), konieczna jest obecnoœæ receptora pomocniczego, CD105, czyli endogliny [22]. Cz¹steczka CD105 jest niezbêdna do dzia³ania TGFß1, najwa niejszej z punktu widzenia w³óknienia p³uc izoformy tego czynnika. Ekspresjê CD105 wykazuj¹ m.in. komórki nab³onka pêcherzyków, œródb³onka, fibroblasty, makrofagi i limfocyty pêcherzykowe [2]. Interferon gamma (IFNg), produkowany jest przez limfocyty T i NK po ekspozycji na swoiste antygeny, w tym wirusy i inne czynnika zakaÿne, jak grzyby, pr¹tki i pierwotniaki. IFNg indukuje swoist¹ odpowiedÿ komórkow¹ (Th1), uczestniczy w reakcji nadwra liwoœci typu póÿnego, wzmaga ekspre- 686 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 P. Kopiñski i wsp.

4 sjê cz¹steczek MHC klasy II na komórkach prezentuj¹cych antygen i ekspresjê cz¹steczek adhezyjnych na leukocytach, wzbudza czynnoœæ fagocytów, w tym migracjê makrofagów do ognisk zapalenia [12]. Dodatkowym ród³em IFNg w zapaleniu pêcherzyków p³ucnych s¹ pobudzone makrofagi. Ekspresja IFNg wzrasta w drogach oddechowych w ILD z przewag¹ uk³adu Th1, jak zewn¹trzpochodne alergiczne zapalenie pêcherzyków p³ucnych i sarkoidoza oraz pe³ni kluczow¹ rolê w rozwoju ziarniniaków w tych chorobach [24]. Wa nymi czynnikami wzmagaj¹cymi sekrecjê IFNg s¹ m.in. interleukina-2, uwalniana spontanicznie przez komórki T w sarkoidozie oraz IL-12 pochodz¹ca z makrofagów pêcherzykowych [7]. IFNg dzia- ³a na komórki docelowe poprzez swój receptor, IFNgR (CD119), obecny m.in. na wszystkich typach krwinek bia³ych, a wiêc na powierzchni wszystkich populacji komórek zapalnych BAL [12]. Mimo tych silnie prozapalnych w³aœciwoœci, IFNg przeciwdzia³a w³óknieniu p³uc, gdy hamuje proliferacjê fibroblastów i produkcjê kolagenu, dzia³aj¹c przeciwstawnie do TGFß [10,24]. Z tego powodu w ostatnich latach stosowano interferon w próbach klinicznych leczenia w³óknienia p³uc, jednak bez powodzenia [10]. Miejscowa sekrecja IFNg w przestrzeni œródmi¹ szowej p³uc przez komórki T jest wyznacznikiem ich czynnoœci sekrecyjnej typu Th1, tj. wydzielania cytokin silnie stymuluj¹cych swoist¹ odpowiedÿ typu komórkowego. Podstawowe wiadomoœci o polaryzacji immunologicznej i antagonizmie miêdzy odpowiedzi¹ immunologiczn¹ Th1 (komórkow¹) oraz Th2 (humoraln¹) s¹ dobrze znane i nie bêd¹ tu powtarzane. Wypada podkreœliæ, e zejœcie zapalenia w ILD w postaci w³ókneinia jest uwa ane za przejaw przewagi odpowiedzi typu Th2 (12,24), przy czym silnie profibrogenny TGFß, choæ niezaliczany wprost do cytokin uk³adu Th2, pe³ni rolê silnego inhibitora odpowiedzi Th1 [27]. Co wa niejsze, przyjmuje siê, e nadzór immunologiczny wymierzony w proces karcynogenezy zale y g³ównie od aktywnej odpowiedzi typu komórkowego, przesuniêcie miejscowej równowagi w stronê odpowiedzi humoralnej Th2 sprzyja wiêc rozwojowi raka p³uca [17]. Celem pracy by³o zbadanie wp³ywu palenia papierosów na ekspresjê wybranych cytokin i ich receptorów w materiale z p³ukania oskrzelowo-pêcherzykowego u osób zdrowych i w chorobach œródmi¹ szowych p³uc; próba oceny zaburzeñ polaryzacji immunologicznej Th1/Th2 u palaczy. Materia³ i metody Grupy badane Badania biochemiczne i cytoimmunologiczne BAL wykonano u 35 chorych z sarkoidoz¹ (w tym 20 niepal¹cych i 15 pal¹cych papierosy, n=20/15), 30 z samoistnym œródmi¹ szowym zapaleniem p³uc (IIP, n=22/8) i u 17 osób grupy kontrolnej (n=8/9). Rozpoznanie sarkoidozy postawiono w oparciu o obecnoœæ nieserowaciej¹cych ziarniniaków w badaniu histopatologicznym. U chorych wyst¹pi³ charakterystyczny obraz kliniczny i/lub typowy obraz radiologiczny klatki piersiowej [7]. Rozpoznanie IIP postawiono w oparciu o obraz histopatologiczny w biopsji p³uca (typu zwyczajnego lub nieswoistego œródmi¹ szowego zapalenia pêcherzyków p³ucnych, ang. usual interstitial pneumonia, Rycina 2 Receptory TGF-b i IFN-g na limcofytach pêcherzykowych. IFNg and TGFb receptors on alveolar lymphocytes. Rycina 3 Receptory TNF na limfocytach pêcherzykowych. TNF receptors on alveolar lymphocytes UIP, oraz non-specific interstitial pneumonia, IP) u chorych z charakterystycznym obrazem klinicznym (w tym z odpowiednimi zmianami w tomografii komputerowej wysokiej rozdzielczoœci klatki piersiowej). W czêœci przypadków UIP z obrazem klinicznym spe³niaj¹cym kryteria diagnostyczne samoistnego w³óknienia p³uc odst¹piono od wykonania biopsji [1]. Inne przyczyny w³óknienia p³uc wykluczono. Grupê kontroln¹ stanowi³o 17 osób, diagnozowanych w kierunku choroby œródmi¹ szowej p³uc, u których koñcowa ocena kliniczna (w tym testy czynnoœciowe p³uc i tomografia komputerowa wysokiej rozdzielczoœci) wykluczy³a odchylenia od normy w zakresie uk³adu oddechowego [14]. Komisja Bioetyczna Uniwersytetu Miko³aja Kopernika wyrazi³a zgodê na badania (KB 116/2006). P³ukania oskrzelowo-pêcherzykowe Zabieg BAL wykonano zgodnie z zaleceniami European Respiratory Society, the BAL Task Group [19]. U yto bronchofiberoskopu Olympus Bf 20. W skrócie, chorych poddano premedykacji (Midazolam 2,5-5 mg i.v., Atropina 0,5 mg s.c.); nag³oœniê i tchawicê znieczulono miejscowo roztworem ksylokainy 2%. Bronchofiberoskop klinowano w oskrzelu p³ata œrodkowego (p³uca prawego). Stosowano zbuforowan¹ sól fizjologiczn¹ (37 o C) w czterech równych porcjach po 50 ml, po ka dej frakcji materia³ odsysano, filtrowano przez steryln¹ gazê, ³¹czono, mieszano, zbierano w ja³owych naczyniach, transportowano do laboratoriów na lodzie [26]. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA W celu okreœlenia stê eñ IFNg, TNFa i TGFß1 w materiale BAL, wykorzystano zestawy R&D Systems do oznaczeñ ELISA (odpowiednio nr kat. DIF50, DTA50 i DB100B). Odczyn wykonano zgodnie z przepisami producenta. Zamro one (-80 o C) supernatanty, uzyskane z wirowania (300 g, 20 min.) materia³u BAL, rozmra ano do temperatury 2-8 o C. Do studzienek p³ytek polistyrenowych op³aszczonych przeciwcia³ami monoklonalnymi skierowanymi przeciw wy ej wymienionym cytokinom (odpowiednio nr kat , i ) nak³adano kolejno rozpuszczalnik i próbki badane (lub standard), inkubowano 120 min. i p³ukano buforem p³ucz¹cym. Do studzienek dodawano konjugaty odpowiednich przeciwcia³ sprzê onych z enzymem (inkubacja 60 min., 2-8 o C), p³ytki ponownie p³ukano i zadawano substratem dla enzymu (inkubacja 30 min. w temp. pokojowej bez dostêpu œwiat³a). Reakcjê przerywano 2M roztworem H 2 SO 4 (stop solution). Gêstoœæ optyczn¹ badano po 30 minutach (czytnik ELx800, BIOTEK, d³ugoœci fali zgodnie z instrukcjami). Sporz¹dzano krzywe kalibracyjne; wyniki odczytano pos³uguj¹c siê programem komputerowym "Genesis" [2,6]. Badania cytoimmunologiczne materia³u BAL Zasady analizy cytologicznej i immunologicznej Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 /

5 materia³u BAL przedstawiono uprzednio [12,26]. ywotnoœæ komórek BAL oznaczano b³êkitem trypanu, ich ca³kowit¹ liczbê obliczano w komorze Bürkera; preparaty z cytowirowania (80g, 5min.) barwiono sposobem Maya- Grünwalda-Giemsy, MGG, oraz hematoksylin¹-eozyn¹, HE; w mikroskopie œwietlnym obliczano wzór odsetkowy komórek zapalnych (nap³ywowych) BAL [13]. Subpopulacje limfocytów BAL typowano technik¹ immunofluorescencji bezpoœredniej. W skrócie, materia³ BAL wirowano i p³ukano w roztworze PBS (300 g, 8 min.), iloœci 1-5 x 105 komórek BAL inkubowano z nasycaj¹cymi iloœciami mysich przeciwcia³ monoklonalnych (BD TM, AbD Serotec). Jako kontroli dodatniej u yto zestawu przeciwcia³ anty-cd45 FITC/CD14 PE ("leucogate", s³u ¹cy do definiowania pola limfocytów w cytometrii przep³ywowej). W celu okreœlenia ekspresji receptorów odpowiednich cytokin na komórkach Th (CD4) i Tc (CD8) pos³u ono siê zestawem przeciwcia³, skierowanych przeciw antygenom ludzkim CD105 (TGFßR), CD119 (IFN?R), CD120A (TNFR typu I), CD120B (TNFR typu II), CD4 i CD8, sprzê onych z barwnikami fluorescencyjnymi FITC, PE i PE-Cy5. Komórki wykazuj¹ce ekspresjê badanego antygenu emitowa³y œwiat³o odpowiednio w standardowych kana³ach fluorescencji FL1 (œwiat³o zielone), FL2 (jasnoczerwone) i FL3 (ciemnoczerwone). Jako ujemnej kontroli u yto mysich przeciwcia³ zgodnych izotypowo z przeciwcia³ami roboczymi, stosowanymi w podanym wy ej zestawie. Szczegó³y, w tym sposób zestawienia przeciwcia³ w próbkach i rodzaj fluorochromów sprzê onych z przeciwcia³ami podano w tab.1. Inkubacjê komórek BAL z przeciwcia³ami (30min. bez dostêpu œwiat³a) przerywano roztworem PBS z 0,1% azydkiem sodu, komórki p³ukano i zawieszano w 0,3ml roztworu PBS z dodatkiem 1% paraformaldehydu. W cytometrze przep³ywowym BD FACSCalibur (laser argonowy 488 nm) zbierano dane o co najmniej komórek w ka dej pojedynczej próbce, w tym o ich wielkoœci (forward scatter), ziarnistoœci (side scatter) i intensywnoœci œwiecenia w standardowych kana³ach fluorescencji FL1, FL2 i FL3. Wyniki przedstawiono jako odsetek limfocytów BAL dodatnich w danym barwieniu (tak- e jako odsetek limfocytów wykazuj¹cych koekspresjê dwóch markerów, z których jeden jest receptorem cytokiny, drugi to CD4 lub CD8). Definiowanie pola limfocytów BAL w uk³adzie parametrów CD45/SSC, szczegó³owe kryteria kwalifikacji materia³u BAL do badania i warunki analizy cytometrycznej opisano poprzednio. W szczególnoœci nie analizowano materia³ów BAL z ma- ³ym odzyskiem p³ynu (<30% wyjœciowej objêtoœci u ytego p³ynu), zawieraj¹cych >5% nab³onków górnych dróg oddechowych lub znaczn¹ domieszkê krwi, tj. >90% erytrocytów [14]. Metody statystyczne Test U Manna-Whitneya pos³u y³ do porównania nierównych liczbowo grup o nieparametrycznym rozk³adzie zmiennych. Wyniki prezentowano jako medianê ± b³¹d standardowy œredniej (SEM). Wyniki Prezentuj¹c uzyskane wyniki zestawiano odpowiadaj¹ce sobie dane chorych niepal¹cych i pal¹cych. Wyniki z badania cytologicznego materia³u BAL uzupe³niono o wartoœci indeksu CD4/CD8 i przedstawiono w tab. II. Odpowiadaj¹ one aktualnej wiedzy na temat obrazu cytoimmunologicznego BAL w ILD i typowych modyfikacji wywo- ³anych konsumpcj¹ tytoniu [13]. Kluczowe z punktu widzenia niniejszej pracy wyniki testu ELISA przedstawia rycina 1. W nads¹czach BAL chorych palaczy papierosów, w porównaniu z odpowiadaj¹cymi im grupami niepal¹cych, stwierdzono znamiennie ni sze stê enia IFNg (4,3±2,7 vs 7,9±1,6 pg/ml w sarkoidozie oraz 2,5±2,2 vs 6,1±1,4 pg/ml w IIP, p<0,05). Natomiast stê enie IFNg w grupie kontrolnej by³o wy- sze u osób pal¹cych. Stê enie TNFa w nads¹czach BAL by³o ni sze u palaczy z ILD, zale noœæ ta by³a znamienna statystycznie w sarkoidozie (1,1±0,5 vs 4,3±0,4 pg/ml, p<0,01). Co ciekawe, chocia TGFß w IIP (a wiêc grupie chorych z w³óknieniem p³uc) by³ podwy szony, to jednak nie mia³o to cech znamiennoœci statystycznej. Palenie papierosów nie modyfikowa³o istotnie stê enia TGFß w poszczególnych grupach. Ekspresjê receptorów poszczególnych cytokin na limfocytach pêcherzykowych (alveolar lymphocytes, AL) Th (CD4) oraz Tc (CD8) scharakteryzowano na rycinach 2-3 i w tabeli III. Odsetek AL dodatnich z receptorami dla TGFß i TNFa typu 1 (CD120A) by³ zwykle wy szy w podgrupach palaczy. Znamiennoœæ statystyczn¹ (p<0,05) wykazano dla ekspresji CD105 w IIP (10,6±2,3% vs 6,1±1,4% dla Th i 11,7±3,4% i 4,0±0,8% dla Tc), CD120A w PS (7,0±0,5% vs 2,9±0,9% dla Th), CD120A w IIP (18,1±5,6% vs 13,8±1,2% dla wszystkich AL i 11,7±3,4% vs 5,4±0,8% dla Tc) oraz CD120A w grupie kontrolnej (dla wszystkich AL i Tc). Równolegle te same dane zaprezentowano w zmodyfikowany sposób w tabeli IV, ujmuj¹c wynik koekspresji odpowiednich receptorów cytokinowych na powierzchni AL jako odsetek dodatnich komórek danej subpopulacji (Th lub Tc), a nie wszystkich AL. Potwierdzi³a siê tendencja do wzrostu ekspresji CD105 (zw³aszcza na komórkach CD8) i CD120A (szczególnie na komórkach CD4), a spadku ekspresji CD119 (zw³aszcza u osób chorych) u palaczy papierosów - w porównaniu z grupami niepal¹cych. Dyskusja Uprzednio, zgodnie z danymi piœmiennictwa i wynikami w³asnymi, wykazano wzrost stê eñ TNFa i IFNg w chorobach œródmi¹ szowych p³uc w porównaniu z grup¹ kontroln¹, co koresponduje ze znan¹, opisan¹ we wstêpie, rol¹ tych cytokin w patogenezie ILD [6,12]. Wp³yw palenia papierosów na stê enia obu cytokin w nads¹czach BAL jest jednak s³abo poznany. Opisano wzrost wydzielania TNFa przez makrofagi pêcherzykowe palaczy po stymulacji lipopolisacharydem, jednak obserwacje te poczyniono u osób zdrowych [29]. Natomiast potwierdzenie w piœmiennictwie znajduj¹ wyniki bie ¹cej pracy dotycz¹ce ekspresji IFNg w drogach oddechowych palaczy grupy kontrolnej. Uwa a siê wiêc, e rozwijaj¹ca siê u palaczy przewlek³a choroba obturacyjna p³uc (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) przebiega z przewag¹ uk³adu Th1; znamienny wzrost IFNg charakteryzuje podgrupê palaczy papierosów, u których rozwija siê ta choroba, natomiast w drogach oddechowych zdrowych palaczy (o ile mo - na o takich mówiæ) wzrost stê enia IFNg i innych markerów uk³adu Th1 jest s³abiej zaznaczony [4]. Nasze obserwacje dotycz¹ce spadku stê eñ TNFa i IFNg u palaczy papierosów z sarkoidoz¹ i IIP, w porównaniu z odpowiednimi grupami niepal¹cych, mog¹ stanowiæ oryginalny przyczynek do wiedzy o patofizjologii ILD. Wydaj¹ siê tym cenniejsze, e koresponduj¹ z obserwacjami klinicznymi, w myœl których u chorych pal¹cych sarkoidoza przebiega ³agodniej, a zwyczajne zapalenie œródmi¹ szowe p³uc (UIP) - ciê ej [7,23]. Zgodnie z nielicznymi pozycjami piœmiennictwa [28], nie by³o ró nic w stê eniu TGFß1 miêdzy badanymi grupami, w szczególnoœci nieznamienny by³ wzrost stê- eñ tej cytokiny w IIP. Podobnie, palenie papierosów zdaje siê nie mieæ wp³ywu na uwalnianie TGFß do dolnych dróg oddechowych tak w ILD, jak w grupie kontrolnej. Znaczenie mo e mieæ tu jednak nie tyle stê enie TGFß, co dostêpnoœæ cytokiny dla komórek docelowych. Wa ne wiêc by³o wykazanie w niniejszej pracy, e palenie papierosów znamiennie zwiêksza ekspresjê powierzchniow¹ CD105 (receptora dla TGF) na limfocytach pêcherzykowych, tak w sarkoidozie, jak w IIP. Ciekawe wnioski p³yn¹ te z badañ innych receptorów przedmiotowych cytokin, a wiêc CD119 (IFNgR), CD120A (TNFR typu I) i CD120A (TNFR typu II). W przedstawionym tu materiale, u palaczy papierosów wystêpuje sk³onnoœæ do spadku ekspresji receptora dla IFNg na limfocytach pêcherzykowych, zaœ wzrost ekspresji receptorów œmierci typu CD120A. Miejscowa dostêpnoœæ biologiczna IFNg wydaje siê wiêc byæ mniejsza u palaczy z ILD (tendencja w sarkoidozie, znamiennoœæ statystyczna w IIP). TNFa z kolei mo e ukierunkowaæ limfocyty w stronê zewn¹trzpochodnej apoptozy, a s³abiej dzia³aæ jako ich potencjalny czynnik prze ycia [6]. Uprzednio opisaliœmy wzrost odsetka apoptotycznych limfocytów pêcherzykowych w sarkoidozie i w grupie kontrolnej [12]. Obecnie wskazujemy na mo liwy mechanizm przyczynowy. Nasuwaj¹ siê wa ne komentarze. Po pierwsze pamiêtaæ nale y, e w niniejszej pracy zbadano tylko trzy cytokiny, a limfocyty pêcherzykowe nie s¹ dla nich jedynymi komórkami docelowymi [8]. Po drugie, dla oceny zagro enia w³óknieniem p³uc palaczy z ILD bardziej celowe by³oby np. typowanie fibroblastów [25], s¹ one jednak praktycznie niedostêpne badaniem BAL. Po trzecie, tylko w czêœci danych uda³o siê wykazaæ znamiennoœæ statystyczn¹ charakteryzowanych zale noœci, byæ mo e problem rozwi¹za³oby przebadanie wiêkszej liczby przypadków. Po czwarte jednak, ca³oœæ zebranych wyników przemawia za istotnym przesuniêciem polaryzacji immunologicznej u palaczy z ILD w stronê uk³adu Th2, co z jednej strony wskazuje na potencjalne zagro enie w³óknieniem mi¹ szowym, z drugiej sugeruje os³abienie miejscowego nadzoru immunologicznego skierowanego przeciw potencjalnej karcynogenezie. W ca³oœci prezentowane wyniki przemawiaj¹, w po³¹czeniu z wczeœniejszymi wynikami zespo³u [11,13,26], za zagro eniem uk³adu oddechowego przez nowotworzenie u palaczy nie tylko w drodze mutagenezy, ale tak e jako efekty: miejscowego os³abienia nadzoru immunologicznego, czêstszej apoptozy limfocytów T i przesuniêcia miejscowej polaryzacji immunologicznej w kierunku odpowiedzi Th2. Tendencje te zaznaczaj¹ siê wyraÿniej w grupie chorób œródmi¹ szowych p³uc, ni u zdrowych palaczy i s¹ zauwa alne zarówno w przebiegu procesu patologicznego z przewag¹ uk³adu Th1 (sarkoidoza), jak i Th2 (samoistne œródmi¹ szowe zapalenia p³uc). 688 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 P. Kopiñski i wsp.

6 Wnioski 1. Materia³ BAL palaczy papierosów z sarkoidoz¹ i IIP, w odniesieniu do odpowiadaj¹cych im grup osób niepal¹cych, cechuje ni sza ekspresja IFNg i TNFa. 2. Wy sze odsetki AL CD105+ u palaczy sugeruj¹ wzrost podatnoœci na potencjalny promotor nowotworzenia, TGFß. 3. Wy sze odsetki AL CD120A+ u palaczy wskazuj¹ na zwiêkszon¹ wra liwoœci AL na apoptozê zewn¹trzpochodn¹. 4. W zakresie badanych cytokin wyniki nie potwierdzaj¹ pogl¹du o przewadze odpowiedzi Th1 u palaczy i wskazuj¹ na niekorzystne, w kontekœcie karcynogenezy, przesuniêcie równowagi w stronê uk³adu Th2. Piœmiennictwo 1. American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias. This joint statement of the American Thoracic Society (ATS), and the European Respiratory Society (ERS) was adopted by the ATS board of directors, June 2001 and by the ERS Executive Committee, June Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002, 165, Balicka-Œlusarczyk B., Czarnobilska E., Dyczek A. et al.: Ekspresja receptora transformuj¹cego czynnika wzrostu ß (transfoming growth factor ß, TGFß), CD105, w dolnych drogach oddechowych. Wstêpne wyniki w œródmi¹ szowych chorobach p³uc (interstitial lung diseases, ILD). Alergol. Immunol. 2010, in press. 3. Baumer I., Zissel G., Schlaak M. et al.: Th1/Th2 cell distribution in pulmonary sarcoidosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997, 16, Brozyna S., Ahern J., Hodge G. et al.: Chemotactic mediators of Th1 T-cell trafficking in smokers and COPD patients. COPD. 2009, 6, Dai H., Guzman J., Baomin Ch., Costabel U.: Production of soluble tumor necrosis factor receptors and tumor necrosis factor-? by alveolar macro-phages in sacroidosis and extrinsic allergic alveolitis. Chest. 2005, 127, Dr¹ kiewicz M., Szczeklik J., Œlusarczyk-Balicka B. i wsp.: Ekspresja czynnika martwicy guza-alfa (TNF-a) i receptora TNF typu 1 w dolnych drogach oddechowych w sarkoidozie i samoistnym w³óknieniu p³uc (IPF). Alergol. Immunol. 2008, 5, Drent M., Mansour K., Linssen C.: Bronchoalveolar lavage in sarcoidosis. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2007, 28, Kelly M., Kolb M., Bonniaund P., Gauldie J.: Reevaluation of fibrogenic cytokines in lung fibrosis. Curr. Pharm. Des. 2003, 9, Kim D.S., Collard H.R., King T.E.: Classification and Natural History of the Idiopathic Interstitial Pneumonias. Proc. Am. Thorac. Soc. 2006, 3, Kim R., Meyer K.C.: Therapies for interstitial lung disease: past, present and future. Ther. Adv. Respir. Dis. 2008, 2, Kopiñski P., Przybylski G., Balicka-Œlusarczyk B. i wsp.: Palenie papierosów zwiêksza liczbê limfocytów cytotoksycznych CD8+Fas Ligand+ w p³ynie z p³ukania oskrzelowo-pêcherzykowego (BAL) chorych z samoistnym w³óknieniem p³uc (IPF). Przegl. Lek. 2007, 64, 10, Kopiñski P., Przybylski G., Jarzemska A. i wsp.: Stê enie interferonu gamma (IFNg) w p³ynie z p³ukania oskrzelowo-pêcherzykowego w wybranych chorobach œródmi¹ szowych p³uc jest dodatnio skorelowane z wartoœci¹ stosunku CD4/CD8. Pol. Merkuriusz Lek. 2007, 23, Kopiñski P., Szczeklik J., Balicka-Œlusarczyk B. i wsp.: Modyfikacje obrazu cytoimmunologicznego materia³u z p³ukania oskrzelowo-pêcherzykowego (bronchoalveolar lavage, BAL) powodowane przez palenie papierosów w wybranych chorobach dolnych dróg oddechowych. Przegl Lek. 2010, 67, 10, Kopiñski P., Szczeklik J., Lackowska B. et al.: Flow cytometric characteristics of alveolar lympho-cytes (AL) obtained by bronchoalveolar lavage (BAL) in the control group - proposal of normal value range of AL subsets in nonsmokers. Central Eur. J. Immunol. 2004, 29, Krein P.M., Winston B.W.: Roles for insulin-like growth factor I and transforming growth factor-beta in fibrotic lung disease. Chest 2002, 122, 6 Suppl, 289S. 16. Letterio J., Roberts A.: Regulation of immune responses by TGF-beta. Annu. Rev. Immunol. 1998, 16, Loose D., Van de Wiele C.: The immune system and cancer Cancer Biother. Radiopharm. 2009, 24, Ordas M.C., Costa M.M., Roca F.J. et al.: Turbot TNF-alpha gene: Molecular characterization and biological activity of the recombinant protein. Mol. Immunol. 2007, 44, Piro yñski M.: Bronchofiberoskopia. Alfa Medica Press, Bielsko-Bia³a, Reynolds H.Y., Gail D.B., Kiley J.P.: Interstitial lung diseases - where we started from and are now going. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis. 2005, 22, 1, Rose A.S., Knox K.S.: Bronchoalveolar lavage as a research tool. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2007, 28, Santibanez J.F., Quintanilla M., Bernabeu C.: TGFß/TGF-ß receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin. Sci. (Lond) 2011, 121, Selman M., Thannicka V.J., Prado A. et al.: Idiopathic pulmonary fibrosis: pathogenesis and therapeutic approaches. Drugs. 2004, 64, Strieter R.M., Mehrad B.: New mechanisms of pulmonary fibrosis. Chest 2009, 136, Sumida A., Hasegawa Y., Okamoto M. et al.: TH1/ TH2 immune response in lung fibroblasts in interstitial lung disease. Arch. Med. Res. 2008, 39, Szczeklik J., Trojan J., Kopiñski P. et al.: Apoptosis in bronchoalveolar lavage lymphocytes (L-BAL) in pneumoconioses. Przegl. Lek. 2004, 61, Wahl S.M., Wen J., Moutsopoulos N.: TGF-beta: a mobile purveyor of immune privilege. Immunol. Rev. 2006, 213, Wolff H., Teppo A.M., Mutanen P. et al.: Studies of cytokine levels in bronchoalveolar fluid lavage from patients with interstitial lung diseases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2003, 63, Xu J., Xu F., Lin Y.: Cigarette smoke synergizes lipopolysaccharide-induced interleukin-1ß and tumor necrosis factor-a secretion from macrophages via substance P-mediated nuclear factor-kb activation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2011, 44, Ziegenhagen M.W., Fitschen J., Martinet N. et al.: Serum level of soluble tumor necrosis factor receptor II (75 kda) indicates inflammatory activity of sarcoidosis. J. Intern. Med. 2000, 248, 33. Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 /