PRACE ORYGINALNE. Katedra Genoterapii, Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz. II Katedra Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum UJ, Kraków

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Piotr KOPIŃSKI 1 Andrzej DYCZEK 2 Joanna CHOROSTOWSKA-WYNIMKO 3 Andrzej MARSZAŁEK 4,5 Barbara BALICKA-ŚLUSARCZYK 6 Izabela KUBISZEWSKA 7 Karina SZABŁOWSKA 1 Ewelina PÓŁGĘSEK 1 Adam SZPECHCIŃSKI 3 1 Katedra Genoterapii, Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz 2 II Katedra Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum UJ, Kraków 3 Samodzielna Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Immunologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa 4 Katedra Patomorfologii Klinicznej, Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz 5 Katedra Patomorfologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny, Poznań 6 Katedra Toksykologii i Chorób Środowiskowych, Collegium Medicum UJ, Kraków 7 Katedra Immunologii, Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz Dodatkowe słowa kluczowe: apoptoza choroby śródmiąższowe płuc limfocyty pęcherzykowe palenie papierosów płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe receptory śmierci Additional key words: alveolar lymphocytes apoptosis cigarette smoking death receptors interstitial lung diseases Adres do korespondencji: Piotr Kopiński ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, Bydgoszcz Katedra Genoterapii CM UMK mpkopins@hotmail.com; Tel ; Fax: Częstsza apoptoza limfocytów pęcherzykowych (alveolar lymphocytes, AL) u palaczy papierosów zależy od ekspresji BCL-2 i swoistej odpowiedzi na czynnik martwicy nowotworów α (tumor necrosis factor α, TNFα). Analiza materiału z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (bronchoalveolar lavage, BAL) chorych z wybranymi chorobami śródmiąższowymi płuc i osób zdrowych Higher incidence of alveolar lymphocytes (AL) apoptosis in smokers depends on BCL-2 expression and specific response to tumor necrosis factor α (TNFα). Bronchoalveolar lavage (BAL) material analysis from selected interstitial lung diseases (ILD) and healthy controls Wprowadzenie: Uprzednio opisaliśmy wzrost częstości apoptozy limfocytów pęcherzykowych (alveolar lymphocytes, AL) u palaczy papierosów. Wzrost ten nie zależał od aktywacji układu FASL/FAS. Należy zatem rozważyć udział wewnątrzpochodnego szlaku apoptozy lub innych par ligand/ receptor śmierci, jak TNFα/TNFR1 i TRAIL/DR4. Cel: Zbadanie wpływu palenia papierosów na ekspresję wybranych czynników rodziny BCL-2 i par ligand/ receptor w materiale z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (bronchoalveolar lavage, BAL), pobranego w sarkoidozie płuc, idiopatycznym włóknieniu płuc (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) i od osób zdrowych. Wyniki odniesiono do częstości apoptozy AL. Metody: Apoptozę AL zbadano odczynem TUNEL u 36 chorych z sarkoidozą (w tym 14 palaczy papierosów), 13 z IPF (6 palaczy) i w grupie kontrolnej (n=17, w tym 9 palaczy). AL barwiono na obecność BCL-2, BCLxL, BAK, TNFR1 (CD120A), TNFR2 (CD120B) i DR4. W nadsączu BAL testem ELISA zbadano stężenie TNFα i TRAIL, cytokin uczestniczących w regulacji apoptozy. Wyniki: Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, apoptoza AL była znamiennie częstsza w podgrupach palaczy, w odniesieniu do odpowiednich podgrup osób niepalących. Spadek odsetka AL BCL-2+ stwierdzono u palących chorych z PS (80,5±6.2 wobec 91±9,8 u niepalących) i w grupie Background: We have previously described the increased apoptosis rate in smokers alveolar lymphocytes (AL) that was independent from the FASL/ FAS system activation. Consequently, the role of intrinsic apoptosis pathway and other ligand/death receptor pairs as TNFα/TNFR1 and TRAIL/DR4 important for apoptosis regulation should be considered in this phenomenon. The purpose of the study was to evaluate the impact of tobacco consumption on expression of selected BCL-2 family members and ligand/receptors pairs in bronchoalveolar lavage (BAL) harvested from patients with pulmonary sarcoidosis (PS), idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) and healthy volunteers. The results were analyzed in the context of AL apoptosis rate. Methods: AL apoptosis from PS (n=36, incl. 22 smokers), IPF (11, incl. 5 smokers) and controls (n=17, incl. 9 smokers) was evaluated by flow cytometry (sub-g1 of cell cycle). AL were stained for BCL-2, BCL-xL, BAK, TNFR1 (CD120A) TNFR2 (CD120B) and DR4. ELISA assay was used to evaluate the BAL supernatant levels of TNFα and TRAIL. Results: According to previous observations, AL apoptosis rate was significantly higher in smoker subgroups as compared to nonsmoking counterparts. Decreased AL BCl-2+ relative number was observed in smoking PS (80.5±6.2 vs 91±9.8 in nonsmokers) and controls (59±14.1 vs 75±16.1, p<0.05). TNFα concentration Przegląd Lekarski 2012 / 69 /

2 kontrolnej (59±14,1 wobec 75±16,1, p<0,05). Stężenia TNFα w nadsączu BAL były wyższe znamiennie tylko u zdrowych palaczy papierosów (2,32±0,77 wobec 0,42±0,27 pg/ml, p<0,05), podczas gdy stężenie TRAIL było podwyższone tylko u palaczy z IPF (44,8±12,8 vs 13,5±5,0 pg/ml, p<0,05). Jednak stężenie TNFα było dodatnio skorelowane z apoptozą AL u palaczy papierosów (p<0,05), a wszystkie podgrupy z podwyższoną apoptozą AL charakteryzowała względnie niska wartość stosunku ekspresji CD120B:C- D120A na limfocytach pęcherzykowych. Paradoksalnie, stężenie TNFα było pozytywnie skorelowane z ekspresją BCL-2 w AL osób niepalących (Rs +0.58, p<0,01), ale nie palaczy. Nie było różnic między AL badanych podgrup w zakresie ekspresji DR4, BCL-xL i BAK. Wnioski: 1. AL nie są dostatecznie chronione przed apoptozą u palaczy papierosów. 2. Prawdopodobne mechanizmy objęły zmniejszoną ekspresję BCL-2 i zmienioną podatność AL na TNFα, w czym pośredniczy zaburzona równowaga między powierzchniową ekspresją receptora dla TNF typu 1 (receptora śmierci) i typu 2 (mediatora przeżycia). 3. Mechanizmy wzmożonej apoptozy AL u palaczy papierosów wydaje się być odmienne w każdej z badanych podgrup. in BAL supernatant was significantly higher only in healthy smokers (2.32±0.77 vs 0.42±0.27 pg/ml, p<0.05), whereas TRAIL levels were remarkably enhanced in IPF smokers (44.8±12.8 vs 13.5±5.0 pg/ml, p<0.05) only. However, TUNELdetected AL apoptosis positively correlated with TNFα in smokers (p<0.05) and negatively with AL CD120B:CD120A expression ratio. Paradoxically, TNFα levels were positively correlated with AL BCL-2 expression in nonsmokers (Rs +0.58, p<0.01), but not in smokers. No differences were observed in all subgroups in respect to AL expression of DR4, BCL-xL or BAK. Conclusions: 1. AL were not sufficiently protected against apoptosis in smokers. 2. The most likely mechanisms involve down-regulation of BCL-2 expression and altered AL susceptibility to TNFα, mediated by imbalance between AL membrane expression of TNF receptor type 1 (death receptor) and type 2 (survival mediator). 3. Mechanisms regulating the increased AL apoptosis in smokers seem to be different in each tested group. Wstęp Choroby śródmiąższowe płuc na podstawie autorytarnie przyjętej definicji są grupą nieinfekcyjnych i nienowotworowych chorób zapalnych drobnych dróg oddechowych. Toczą się w ścianach i świetle pęcherzyków płucnych oraz w otaczającej je tkance śródmiąższowej [22]. Do badania zmian cytoimmunologicznych w przebiegu tych chorób służy m.in. płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) [25]. Wyniki cytoimmunologiczne materiału BAL wspomagają proces diagnostyczny, niekiedy umożliwiając postawienie właściwego rozpoznania. W każdym przypadku konieczne jest jednak wzięcie pod uwagę modyfikującego wpływu dodatkowych czynników środowiskowych, wśród których szczególne znaczenie ma palenie papierosów. Obraz BAL jest zasadniczo odmienny u palaczy, niż w odpowiadającej im grupie osób niepalących papierosów (zarówno chorych, jak i zdrowych) [16,17,23]. Typową zmianą wywołaną przez palenie jest wybitny wzrost liczby makrofagów pęcherzykowych, a w konsekwencji wzrost całkowitej liczby komórek BAL. Makrofagi są pobudzone i zawierają w cytoplazmie charakterystyczne, organiczne pyły palacza papierosów. Znamiennie spada odsetek (ale nie liczba) innych kluczowych komórek odczynu dolnych dróg oddechowych, limfocytów. Komórki te w materiale BAL, prawie wyłącznie uczulone antygenowo limfocyty T (alternatywnie komórki pomocnicze, T helper, CD4+ i cytotoksyczne, T cytotoxic, CD8+), są bowiem wykładnikiem swoistej, wymierzonej precyzyjnie w patogeny, odpowiedzi obronnej płuc. Wartość indeksu CD4/ CD8 w BAL niepalących osób zdrowych wynosi około 2,0, u palaczy papierosów spada, nieraz poniżej 1,0 [18,22]. Niższe wartości indeksu obserwuje się także u palaczy z chorobami śródmiąższowymi płuc, w porównaniu z chorymi niepalącymi [17]. Liczba limfocytów (zwanych tu limfocytami pęcherzykowymi, alveolar lymphocytes, AL) jest regulowana przez ich migrację do światła pęcherzyków, proliferację i przeciwieństwo tej ostatniej, czyli przez zaprogramowaną śmierć (apoptozę). Jednak wg obserwacji własnych i danych pismiennictwa, AL prawie nie proliferują. Ważnym mechanizmem miejscowej regulacji ich liczby (i zapewne aktywności) pozostaje za to apoptoza. Poprzednio wykazaliśmy, że u zdrowych osób grupy kontrolnej jej częstość, mierzona badaniem cyklu komórkowego (komórki apoptotyczne umiejscawiają się w tzw. fazie sub-g1cyklu) wynosi około 1 [27]. W chorobach śródmiąższowych z przewagą polaryzacji immunologicznej Th1 i limfocytowym zapaleniem pęcherzyków, jak sarkoidoza i alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych, częstość apoptozy AL spada, natomiast w chorobach przebiegających z włóknieniem śródmiąższowym płuc, jak idiopatyczne włóknienie płuc (IPF) wybitnie rośnie. Zjawisko to uczestniczy w patogenezie IPF, gdyż limfocyty wydają się chronić tkankę płucną przed włóknieniem, zatem ich nasilona apoptoza jest niekorzystna. Wykazalismy uprzednio, zarówno w śródmiąższowych chorobach płuc, jak i u osób zdrowych, że palenie papierosów powoduje z reguły wybitny wzrost częstości apoptozy AL [13]. W kontekście ochronnej, przeciwzwłóknieniowej roli tych komórek, wypada odnotować, że idiopatyczne włóknienie u palaczy ma szczególnie niekorzystny przebieg [7,21]. Apoptoza może początkowo zachodzić w dwóch szlakach, zewnątrzpochodnym (receptorowym) i wewnątrzpochodnym (mitochondrialnym), które schodzą się w fazie wykonawczej zaprogramowanej śmierci, wskutek czynności katalitycznej enzymów z grupy tzw. kaspaz [13]. Pierwszy ze szlaków stanowi następstwo aktywacji specyficznych receptorów błony komórkowej, czyli receptorów śmierci, przez swoiste ligandy. Do typowych par ligand/receptor należą: ligand FAS (FASL)/FAS, TNFα/ TNFR1, TRAIL/ DR4, TRAIL/DR5 i VEGI/DR3. Drugi szlak rozpoczyna się dezintegracją mitochondriów. Szczelność błon mitochondrialnych kontrolują wewnątrzkomórkowe białka rodziny BCL-2. Te z nich, które uszczelniają błonę organelli, jak np. właściwy czynnik BCL-2 i BCL-xL, pełnią czynność antyapoptotyczną. Inne, zwiększające przepuszczalność błon mitochondrialnych, jak Bax i Bak, są czynnikami proapoptotycznymi [8]. Początkowo sądziliśmy, że palenie papierosów prowadzi do apoptozy AL, wskutek aktywacji pary cząsteczek Ligand Fas/receptor śmierci Fas. Wiadomo, że ekspresja receptora Fas na limfocytach BAL jest powszechna [27]. Z kolei odsetek AL FasL+ rośnie u palaczy papierosów, np. w sarkoidozie i w grupie kontrolnej, w porównaniu z podgrupami osób niepalących [16]. Obecnie jednak wydaje się, że obserwacje te wiążą się z cytotoksycznością limfocytów w odniesieniu do otaczających tkanek, ale nie korelują ze wzrostem częstości apoptozy samych AL [14]. Tym samym wypada rozważyć czynność innych par ligand/receptor śmierci, jako inicjatorów apoptozy. TNFα, ważna plejotropowa cytokina prozapalna, niewątpliwie uczestnicząca w patogenezie śródmiąższowych chorób płuc, jest wydzielana głównie przez układ makrofagów, a także m.in. przez limfocyty T i NK. W sarkoidozie cytokina bierze udział w formowaniu typowej ziarniny; w innych chorobach grupy ILD podtrzymuje przewlekły odczyn zapalny [6]. Ekspozycja na TNFα prowadzi do uszkodzenia nabłonka dróg oddechowych [11]. Ważnym źródłem cytokiny w aktywnej postaci sarkoidozy są makrofagi pęcherzykowe, uwalniające zwiększone ilości TNFα spontanicznie i po stymulacji [3]. TNFα działa na komórki docelowe przez dwa typy powierzchniowych receptorów: TNFR typu 1 (TNFR1, CD120A) i typu 2 (TNFR2, CD120B). Pierwszy z receptorów obecny jest przede wszystkim na komórkach nabłonkowych, np. na nabłonkach dróg oddechowych, w tym pneumocytach. Ekspresja drugiego typowa jest dla krwinek białych, wliczając w to limfocyty [5]. Przyjmuje się, że ligacja prowadzi do przeciwstawnych reakcji: apoptozy (receptor 732 Przegląd Lekarski 2012 / 69 / 10 P. Kopiński i wsp.

3 śmierci TNFR1) lub przeżycia i proliferacji komórki docelowej (TNFR2) [3]. Podwyższony poziom TNFα i jego receptorów w dolnych drogach oddechowych chorych z ILD wskazuje na zagrożenie włóknieniem płuc [29]. Możliwe, że to niekorzystne zejście choroby stanowi pośrednią konsekwencję przewlekania się procesu zapalnego, czego mediatorem jest TNFα [8]. Nie można też wykluczyć, że stymulowana przez tę cytokinę apoptoza AL znosi ochronę miąższu płucnego przed włóknieniem [21]. Apoptozę AL u palaczy papierosów może także indukować ligand śmierci TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) [8]. Należy podkreślić, że jak dotąd tylko fragmentarycznie badano rolę TRAIL i jego receptorów śmierci (DR4 i DR5) w indukcji apoptozy komórek zapalenia w dolnych dróg oddechowych i/lub uszkodzenia tkanek płuc. Według wiedzy autora, zamieszczone niżej wyniki, dotyczące sarkoidozy i IPF, są oryginalne. TRAIL występuje zarówno w postaci rozpuszczalnej, jak związanej z błoną. Stężenie TRAIL w materiale BAL badano u chorych z astmą oskrzelową: po ekspozycji alergenem, stężenie TRAIL znamiennie wzrastało, ale nie przekładało się to na śmierć leukocytów w drogach oddechowych, gdyż m.in. spadała ekspresja receptorów DR4 i DR5 na tych komórkach [24] W zespole ARDS stężenie TRAIL we krwi znamiennie rośnie, co jest prognostycznie niekorzystne [19]. Do niedawna w piśmiennictwie przeważał pogląd, że obwodowe efektorowe komórki T (a z takich właśnie składa się pula limfocytów pęcherzykowych), giną głównie w mechanizmie receptorowym, co jest następstwem napotkania swoistego antygenu przez uczulone komórki (jako zjawisko AICD, activation-induced cell death). Paradoksalnie śmierć limfocytów powodowana jest więc przez ich aktywację. Jednak szereg danych doświadczalnych, w tym właśnie badania nad limfocytami BAL, wskazują, że ważniejszy może być mechanizm mitochondrialny [9,26]. Uważa się powszechnie, że istotnym czynnikiem antyapoptotycznym, hamującym zaprogramowaną śmierć AL, jest białko BCL-2. Uprzednio wykazano, że ekspresja BCL-2 może hamować apoptozę AL w śródmiąższowych chorobach płuc [20]. Jednak, jak dotąd, nie badano obecności BCL-2 w limfocytach pęcherzykowych palaczy papierosów. Tym bardziej nie prowadzono badań nad innymi białkami tej rodziny, potencjalnie regulującymi apoptozę komórek zapalnych dolnych dróg oddechowych. Cel pracy Zbadanie wpływu palenia papierosów na ekspresję wybranych czynników rodziny BCL-2 i par ligand/receptor w materiale z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego pobranego w sarkoidozie płuc, idiopatycznym włóknieniu płuc i od osób zdrowych. Wyniki odniesiono do częstości apoptozy limfocytów pęcherzykowych. Materiał i metody Grupy badane Badaniem objęto 36 chorych z sarkoidozą (pulmonary sarcoidosis, PS, w tym 14 palących papierosy, n=22/14), 13 z idiopatycznym włóknieniem płuc (IPF, n=7/6) i u 17 osób grupy kontrolnej (n=8/9). Rozpoznanie PS postawiono w oparciu o obecność nieserowaciejących ziarniniaków w badaniu histopatologicznym. U chorych wystąpił charakterystyczny obraz kliniczny i/lub typowy obraz radiologiczny klatki piersiowej [6]. Rozpoznanie IPF postawiono w oparciu o obraz histopatologiczny (zwyczajnego śródmiąższowego zapalenia pęcherzyków płucnych, UIP) w biopsji płuca chorych z charakterystycznym obrazem klinicznym, w tym z typowymi zmianami w tomografii komputerowej wysokiej rozdzielczości klatki piersiowej. W części przypadków, pod warunkiem spełnienia kryteriów diagnostycznych IPF, odstąpiono od wykonania biopsji [1]. Inne przyczyny włóknienia płuc wykluczono. Grupę kontrolną stanowiły osoby, diagnozowane w kierunku choroby śródmiąższowej płuc, u których całościowa ocena kliniczna (w tym testy czynnościowe płuc i tomografia komputerowa wysokiej rozdzielczości) wykluczyła odchylenia od normy w zakresie układu oddechowego [18]. Badania objęła zgoda Komisji Bioetycznej UMK (116/2006) z późniejszymi uzupełnieniami. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe BAL wykonano zgodnie z zaleceniami European Respiratory Society [22]. W skrócie, użyto bronchofiberoskopu Olympus Bf 20, chorych poddano premedykacji (Midazolam 2,5-5mg i.v., Atropina 0,5mg s.c.); nagłośnię i tchawicę znieczulono miejscowo roztworem ksylokainy 2. Bronchofiberoskop klinowano w oskrzelu płata środkowego (płuca prawego). Stosowano zbuforowaną sól fizjologiczną (37 o C) w czterech równych porcjach po 50ml, po każdej frakcji materiał odsysano, filtrowano przez sterylną gazę, łączono, mieszano, zbierano w jałowych naczyniach i transportowano do laboratoriów na lodzie [27]. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA Do zbadania stężeń TNFα i TRAIL w materiale BAL posłużyły zestawy R&D Systems (nr kat. odp. DTA50 i DTRL00), zgodnie z przepisem producenta. Zamrożone (-80 o C) supernatanty z wirowania (300g, 20min.) materiału BAL, rozmrażano do temperatury 2-8 o C. Do studzienek płytek polistyrenowych opłaszczonych odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi (nr kat i ) nakładano rozpuszczalnik i próbki badane (lub standard), inkubowano przez 120min. w temp. pokojowej i płukano buforem płuczącym. Do studzienek dodawano koniugaty odpowiednich przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanową (inkubacja 60min., 2-8 o C), płytki ponownie płukano i zadawano substratem dla enzymu (inkubacja 30min. w temp. pokojowej bez dostępu światła). Reakcję przerywano 2M roztworem H 2 SO 4 (stop solution). Absorbancję (długość fali 450nm) mierzono w czytniku ELx 800 (BIO-TEK Instruments); uzyskane wartości przeliczano na jednostki stężenia badanego antygenu na podstawie krzywej kalibracyjnej wyznaczonej dzięki wynikom rozcieńczeń właściwego standardu (program KC Junior) [6]. Badania cytologiczne i immunologiczne materiału BAL Zasady analizy cytologicznej i immunologicznej materiału BAL przedstawiono uprzednio [15,27]. Żywotność komórek BAL oznaczano błękitem trypanu, ich całkowitą liczbę obliczano w komorze Bürkera; preparaty z cytowirowania (80g, 5min.) barwiono sposobem Maya-Grünwalda-Giemsy i hematoksyliną-eozyną, HE; w mikroskopie świetlnym obliczano wzór odsetkowy komórek zapalenia (napływowych) BAL. Subpopulacje AL typowano techniką immunofluorescencji bezpośredniej. W skrócie, materiał BAL wirowano i płukano w roztworze PBS (300g, 8min.), ilości 1-5 x 10 5 komórek BAL inkubowano z nasycającymi ilościami mysich przeciwciał monoklonalnych (BD Pharmingen TM ). Jako kontroli dodatniej użyto zestawu przeciwciał anty-cd45 Tabela I Zastosowane przeciwciała monoklonalne w cytometrii przepływowej. Monoclonal antibodies used in flow cytometry. Antygen swoisty dla przeciwciała Barwnik Firma / nr katalogowy Odczynowość przeciwciała/ znaczenie dla wyników pracy CD45 FITC BD Pharmingen TM Obecny na wszystkich krwinkach białych, kontrola dodatnia PE-Cy5 BD Pharmingen TM badań fenotypowych limfocytów CD4 FITC BD Pharmingen TM Marker limfocytów Th i subpopulacji komórek Treg, krzyżowy PE-Cy5 BD Pharmingen TM odczyn z AM CD8 PE-Cy5 BD Pharmingen TM Marker limfocytów Tc, krzyżowy odczyn z komórkami NK CD120A FITC AbD Serotec, MCA1340F CD120B PE BD Pharmingen TM Receptor TNF typu I, przewodzi sygnał śmierci, częsty na komórkach nabłonka Receptor TNF typu II, przewodzi sygnał przeżycia, częsty na leukocytach CD14 PE BD Pharmingen TM Koreceptor endotoksyny, marker monocytów i AM DR4 PE BioLegend Receptor śmierci, jego ligandem jest TRAIL Kontrola izotypowa FITC/PE BD Pharmingen TM PE-Cy5 BD Pharmingen TM Kontrole ujemne dla odczynów z odpowiednimi przeciwciałami BCL-2 - BD Pharmingen TM Cząsteczka antyapoptotyczna rodziny Bcl-2 BAK - BD Pharmingen TM Cząsteczka proapoptotyczna rodziny Bcl-2 BCL-xL - BD Pharmingen TM Cząsteczka antyapoptotyczna rodziny Bcl-2 Przegląd Lekarski 2012 / 69 /

4 FITC/CD14 PE ( leucogate, służący do definiowania pola limfocytów w cytometrii przepływowej). W celu określenia ekspresji receptorów odpowiednich cytokin na komórkach Th (CD4) i Tc (CD8) posłużono się zestawem przeciwciał, skierowanych przeciw antygenom ludzkim CD120A (TNFR1), CD120B (TNFR2), DR4, CD4 i CD8, sprzężonych z barwnikami fluorescencyjnymi FITC, PE i PE-Cy5. Komórki wykazujące ekspresję badanego antygenu emitowały światło odpowiednio w standardowych kanałach fluorescencji FL1 (światło zielone), FL2 (jasnoczerwone) i FL3 (ciemnoczerwone). Jako ujemnej kontroli użyto mysich przeciwciał zgodnych izotypowo z roboczymi przeciwciałami stosowanymi w pracy. Szczegóły, w tym rodzaj fluorochromów sprzężonych z przeciwciałami podano w tab. I. Inkubację komórek BAL z przeciwciałami (30min. bez dostępu światła) przerywano roztworem PBS z 0,1 azydkiem sodu, komórki płukano i zawieszano w 0,3ml roztworu PBS z dodatkiem 1 formaldehydu [18]. Podobnie postępowano barwiąc wewnątrzkomórkowe białka rodziny BCL-2 w AL (immunofluorescencja pośrednia antygenów wewnątrzkomórkowych), z tym, że po pierwszym płukaniu komórki inkubowano w roztworze FACS Lysing Solution (Becton-Dickinson, nr kat ; przed użyciem odczynnik rozcieńczono wodą destylowaną w proporcji 1:9, 10min.). Zawiesinę komórek wirowano (500g, 5min.) i inkubowano (10min. w temp. pokojowej) z 500μl roztworu FACS Permeabilizing Solution 2 (Becton- Dickinson, nr kat ; odczynnik rozcieńczano wodą destylowaną 1:9). Komórki przepłukiwano roztworem PBS z dodatkiem 0,5 albuminy surowiczej wołu (BSA, BD Pharmingen, nr kat ) oraz 0,1 NaN 3 i inkubowano w objętości 50μl buforu PBS z dodatkiem BSA i NaN 3 (30min. w temp. pokojowej bez dostępu światła) z nasycającą ilością (5-10µl) przeciwciała pierwotnego (tabela I). Komórki płukano i inkubowano (10min. w temp. pokojowej bez dostępu światła) z nasycającą objętością przeciwciała wtórnego (poliklonalnej surowicy mysiej sprzężonej z FITC, DAKO Cytomation F0313). Komórki przepłukiwano roztworem PBS i ponownie zawieszano w 250µl roztworu PBS z dodatkiem 1 formaldehydu. W dodatkowej próbce pomijano inkubację pierwotną, dodając do komórek 5-10µl roztworu PBS (kontrola ujemna). W cytometrze przepływowym BD FACSCalibur (laser argonowy 488nm) zbierano dane o co najmniej komórek każdej pojedynczej próbki, w tym ich wielkości (forward scatter, FSC), ziarnistości (side scatter, SSC) i intensywności świecenia w kanałach fluorescencji FL1, FL2 i FL3. Wyniki obliczono jako odsetek limfocytów BAL dodatnich w danym barwieniu. Definiowanie pola AL w układzie parametrów CD45/SSC, szczegółowe kryteria kwalifikacji materiału BAL do badania i warunki analizy cytometrycznej opisano uprzednio [18]. Badanie apoptozy AL barwieniem TUNEL (TdT Biotin-dUTP Nick End Labeling). Wykorzystano zdolność terminalnej transferazy nukleotydów (TdT) do elongacji nici DNA w miejscach jej fragmentacji (między nukleosomami). Szczegóły opisano poprzednio [27]. Użyto zestawu Roche (In Situ Cell Death Detection Kit, nr kat ) zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, preparaty BAL z cytowirowania, utrwalone w 75 alkoholu z acetonem (10 min.) i przechowane w 80 o C, odmrażano, inkubowano (10 min. w temp. pokojowej z 3 roztw. H 2 O 2 w metanolu, POCh nr kat ), płukano w roztworze PBS i umieszczano w wilgotnej komorze. Na komórki nakładano mieszaninę reakcyjną (roztwór 2,5μl enzymu w buforze i 22,5μl zawiesiny nukleotydów sprzężonych z FITC, 25μl PBS). Preparaty inkubowano (20min. bez dostępu światła, 37 o C), płukano (PBS 3x) i nakładano Converter- POD (przeciwciało anty-fitc znakowane peroksydazą), rozcieńczony 1:1 roztworem PBS. Komórki inkubowano w komorze wilgotnej (30min), ponownie płukano (PBS 3x) i osuszano, nakrapiano na nie świeżo przygotowany roztwór DAB/H 2 O 2. Inkubację prowadzono w temp. pokojowej przez 5 minut lub do uzyskania odpowiednio intensywnej reakcji barwnej. Preparaty płukano w wodzie bieżącej, barwiono hematoksyliną Harrisa, odwadniano w szeregu alkoholi, prześwietlano w ksylenie i zamykano w balsamie kanadyjskim. Dodatnie (apoptotyczne) limfocyty charakteryzowały się przewagą brązowego zabarwienia jądra [27]. Wynik przedstawiano jako odsetek dodatnich AL (liczono co najmniej 500 komórek). Metody statystyczne Test U Manna-Whitneya posłużył do porównania nierównych liczbowo grup badanych. Wyniki przedstawiono jako medianę ± błąd standardowy średniej (SEM). Do badania związku pomiędzy zmiennymi posłużyło obliczenie współczynnika korelacji rang Spearmana (Rs). Wyniki Odsetki limfocytów BAL w poszczególnych grupach, wartość indeksu CD4/CD8 oraz odsetki AL dodatnich w barwieniu TU- NEL przedstawiono w tabeli II. W odczynie TUNEL zwraca uwagę: a) znamienny spadek odsetka apoptotycznych AL w PS, natomiast wzrost w IPF, w porównaniu z grupą kontrolną; b) wzrost odsetka apoptotycznych AL (TUNEL+) w podgrupach palaczy, w porównaniu z odpowiednimi podgrupami osób niepalących (nieznamienne dla IPF). Wyniki fenotypowania AL przedstawiono w tabeli III. Zwraca uwagę tendencja do wyższych odsetków AL dodatnich z CD120A u palaczy papierosów (różnica znamienna statystycznie dla sarkoidozy i grupy kontrolnej) oraz niższych z BCL-2 (znamienne Tabela II Wyniki cytoimmunologiczne materiału BAL. Cytoimmunological results of BAL material. Badany parametr Liczba komórek BAL x 103/ml Limfocyty BAL CD4/CD8 TUNEL+ statystycznie dla grupy kontrolnej). Dodatkowo chorych z IPF charakteryzowały względnie wysokie odsetki AL CD120A+ i niskie BCL-2+ (w porównaniu z PS obie wartości znamiennie różne, p<0,05). Nie było znamiennych statystycznie różnic pomiędzy grupami osób chorych, a zdrowymi w odsetkach AL dodatnich z DR4, BCL-xL i BAK; w zakresie tych markerów nie było też różnic, pomiędzy podgrupami palaczy papierosów i niepalących. Stężenie TNFα w poszczególnych podgrupach przedstawiono na rycinie 1, stężenie TRAIL na rycinie 2 (ze znamiennym wzrostem odpowiednio, u palaczy papierosów grupy kontrolnej i w IPF). Dodatkowo, by uchwycić typ odpowiedzi AL na działanie TNF, dla każdego chorego wyliczono wartość stosunku AL CD120B+ do AL CD120A+ (rycina 3). Wyjściowo przyjęto, że limfocyty pęcherzykowe chorych z wysoką wartością stosunku charakteryzuje zwiększone przeżycie pod wpływem TNFα, zaś z niską wartością stosunku nasilona apoptoza. Podgrupy z wysoką apoptozą cechowała niższa wartość w zaproponowanego wskaźnika (stosunku). PS IPF Grupa kontrolna NS S NS S NS S 273 ± 34 ** 41 ± 1,4 6,2 ± 0,5 11,3 ± 1,8 ** 300 ± ± ± ± ± ± 2,2 4,3 ± 0,5 15 ± 4,3 6,6 ± 1,4 1,5 ± 0,6 * 17,9 ± 2,5 46,7 ± 5,6 * 12 ± 1,5 4,8 ± 0,5 0,8 ± 0,4 2,1 ± 0,2 0,9 ± 0,1 33,3 ± 7,1 27,5 ± 6,2 28,5 ± 3,8 Wyniki przedstawiono jako mediana ± SEM. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001 w porównaniu z odp. grupą kontrolną Cieniowano wyniki w podgrupach palaczy papierosów znamiennie różne (p < 0,05) w odniesieniu do odpowiadającej grupy osób niepalących; test U-Manna Whitneya. PS, sarkoidoza; IPF, idiopatyczne włóknienie płuc; NS, niepalący; S, palacze Tabela III Ekspresja białek biorących udział w regulacji apoptozy AL. Expression of proteins participating in AL apoptosis regulation. Badany parametr CD120A+ CD120B+ DR4+ BCL-2+ BCL-xL+ BAK+ PS IPF Grupa kontrolna NS S NS S NS S 6,7 ± 1,5* 9,3 ± 2,9 17,5 ± 3,5 * 13 ± 9,1 10 ± 2,1 15,5 ± 4,8 92 ± 4,2 86 ± 12,0 94 ± 1,5 71 ± ± 2,9 70 ± 5,7 7,9 ± 2,3 6,5 ± 2,7 6,0 ± 2,3 7,0 ± 2,6 8,7 ± 1,4 8,8 ± 2,7 91 ± 6,2 80,5 ± 9,8 51 ± 12,3 * 32 ± 12,8 75 ± 15,7 59 ± 14,6 2,2 ± 1,8 2,0 ± 1,8 1,3 ± 0,8 Nb 2,5 ± 0,9 2,5 ± 1,8 0 ± 2,5 1 ± 0,8 0 ± 1,5 Nb 1,3 ± 0,7 0 ± 2,1 Wyniki przedstawiono jako mediana ± SEM. * p < 0,05 w porównaniu z odp. grupą kontrolną. Cieniowano wyniki w podgrupach palaczy papierosów znamiennie różne (p < 0,05) w odniesieniu do odpowiadającej grupy osób niepalących; test U-Manna Whitneya. PS, sarkoidoza; IPF, idiopatyczne włóknienie płuc; Nb niezbadano; NS, niepalący; S, palacze 734 Przegląd Lekarski 2012 / 69 / 10 P. Kopiński i wsp.

5 Ze wszystkich analizowanych zmiennych, u palaczy papierosów tylko stężenie TNFα korelowało znamiennie dodatnio z częstością apoptozy (AL TUNEL+): Rs +0,41; p<0,05. Ponadto stężenie TNFα było pozytywnie skorelowane z ekspresją BCL-2 w AL osób niepalących (Rs +0.58, p<0,01), ale nie palaczy. Było to zaskakujące, oczekiwano raczej korelacji ujemnej. Zagadnienie to omówiono niżej. Stężenie TRAIL w nadsączu BAL i odsetek AL DR4+ nie były skorelowane z żadnymi parametrami charakteryzującymi apoptozę limfocytów pęcherzykowych. Dyskusja Opublikowano dotąd liczne prace o związku palenia papierosów z apoptozą w płucach, jednak zainteresowanie badaczy skupiało się na udziale dymu papierosowego w patogenezie rozedmy płuc, a więc na apoptozie nabłonków oddechowych. Proliferacja i apoptoza nabłonków znamiennie wzrasta u palaczy; obserwacje te nie dotyczą jednak bezpośrednio limfocytów płucnych [28]. Stąd oryginalne znaczenie niniejszej publikacji. Obok grupy kontrolnej, zebrano w niej dwie przeciwstawne grupy chorych: z sarkoidozą płuc (przebieg zwykle bez włóknienia, polaryzacja immunologiczna w kierunku Th1) i IPF (obligatoryjne włóknienie płuc, przewaga limfocytów Th2) [2,23]. Potwierdzono wpływ palenia papierosów na wzrost apoptozy AL, wykazany uprzednio w PS i u zdrowych osób badaniem cyklu komórkowego [15]. Wprawdzie znamiennych różnic nie obserwowano w IPF, ale grupa przebadana była mała, odsetek AL TUNEL+ był u niepalących chorych wyjściowo szczególnie wysoki, a w równolegle wykonanych badaniach cyklu komórkowego wykazano także w IPF znamienny wzrost apoptozy AL u palaczy, w porównaniu z chorymi niepalącymi [13]. Ciekawe wnioski płyną z badania ekspresji receptorów TNF, jak CD120A (TNFR typu 1) i CD120A (TNFR typu 2). W przedstawionym tu materiale, u palaczy papierosów wystąpiła tendencja do wzrostu ekspresji receptorów śmierci CD120A. Podgrupy chorych z wysoką częstością apoptozy AL charakteryzowała niska wartość stosunku CD120B:CD120A. TNFα może wywołać apoptozę limfocytów na szlaku zewnątrzpochodnym, ale jak już wspomniano, może też działać jako potencjalny czynnik przeżycia. Pierwszy z tych mechanizmów, obejmuje w skrócie TNFR1, czynnik adaptorowy TRADD i aktywowaną postać kaspazy-8. Drugi, antagonistyczny, w szlaku uruchamianym przez TNFR2, białka adaptorowe TRAF oraz czynnik transkrypcyjny NF-κB powoduje wzrost ekspresji BCL-2. Jak wspomniano we wstępie, rola szlaku receptorowego w apoptozie AL jest poddawana w wątpliwość. Dodatkowo, nowsze badania doświadczalne dowiodły, że głównym mechanizmem apoptozy obwodowych limfocytów efektorowych (a do takich należą limfocyty pęcherzykowe) jest szlak mitochondrialny, a nie receptorowy. Bezpośrednio apoptozę w tych komórkach powoduje spadek aktywności BCL-2. Hamuje go proapoptotyczny czynnik BIM, który jak planujemy będzie celem dalszych badań nad apoptozą AL. TNFα może, poprzez czynnik NF-κB, hamować transkrypcję BIM [10, 13]. W niniejszej pracy stężenie TNFα korelowało znamiennie dodatnio z częstością apoptozy AL u palaczy papierosów, ale uprzednio opisaliśmy duże grupy osób chorych niepalących, u których zależność była dokładnie odwrotna [13]. Ponadto stężenie TNFα dodatnio korelowało z ekspresją BCL-2 w limfocytach chorych i zdrowych osób niepalących. Ekspresja tego ostatniego białka była obniżona w limfocytach pęcherzykowych w IPF w porównaniu z sarkoidozą oraz w grupie kontrolnej. Na znaczenie drogi wewnątrzpochodnej zwracają też uwagę wyniki badań doświadczalnych: ekspozycja limfocytów krwi obwodowej na karcynogeny dymu papierosowego, uruchamia szlak mitochondrialny apoptozy wskutek stresu oksydacyjnego [28]. Rycina 1 Stężenie czynnika martwicy nowotworu α, TNFα w nadsączu BAL [ng/ml]. Wyniki przedstawione jako mediana ± SEM. *p < 0,05 znamiennie różne w podgrupie palaczy (S) w odniesieniu do odpowiadającej grupy niepalących (NS); test U-Manna Whitneya. PS, sarkoidoza; IPF, idiopatyczne włóknienie płuc; GK, grupa kontrolna TRAIL level in BAL supernatant [pg/ml] Rycina 2 Stężenie czynnika TRAIL w nadsączu BAL [pg/ml]. Wyniki przedstawione jako mediana ± SEM. * p < 0,05 znamiennie różne w podgrupie palaczy (S) w odniesieniu do odpowiadającej grupy niepalących (NS); test U-Manna Whitneya. PS, sarkoidoza; IPF, idiopatyczne włóknienie płuc; GK, grupa kontrolna TNFα level in BAL supernatant [ng/ml] Rycina 3 Stosunek ekspresji receptorów TNFα typu 2 (CD120B) do ekspresji receptorów typu 1 (CD120A) na limfocytach pęcherzykowych. Wyniki przedstawione jako mediana ± SEM. p < 0,05 znamiennie różne w podgrupie palaczy (S) w odniesieniu do odpowiadającej grupy niepalących (NS); test U-Manna Whitneya PS, sarkoidoza; IPF, idiopatyczne włóknienie płuc; GK, grupa kontrolna Ratio of TNFα receptor type 2 (CD120B) expression to receptor type 1 (CD120A) expression on alveolar lymphocytes Przegląd Lekarski 2012 / 69 /

6 Tak więc wzmożona apoptoza (w IPF, a zwłaszcza u palaczy papierosów) może zależeć od zmian ekspresji obu receptorów dla TNFα na powierzchni AL. Wysoka ekspresja CD120B wraz ze względnie niską ekspresją CD120A, może uczestniczyć w aktywacji transkrypcji BCL-2 przez TNFα. To tłumaczyłoby wyniki pracy, w tym małą częstość apoptozy AL, mimo wysokich nieraz stężeń TNFα, np. u niektórych chorych z PS. U palaczy papierosów mechanizm ten przestaje działać. Wobec wyższej ekspresji CD120A w limfocytach powstaje przypuszczalnie działający alternatywnie kompleks białek (m.in. TRADD. RIP1 i kaspazy 8), prowadzący do apoptozy na przykład przez hamowanie NFκB [4]. Zaproponowany tu mechanizm wynika wprost z wyników pracy, co nie wyklucza innych przyczyn wzmożonej apoptozy AL u palaczy papierosów. Mogą to być: a) spadek aktywującego wpływu cząsteczek kostymulujących makrofagów na limfocyty, w związku z niższą ekspresją molekuły CD28 na tych ostatnich u palaczy papierosów; b) wspomniany stres oksydacyjny; c) wzajemna bratobójcza czynność AL (u palaczy papierosów wykazano podwyższoną ekspresję perforyny i granzymu B w limfocytach); d) upośledzenie zdolności makrofagów pęcherzykowych do usuwania apoptotycznych AL u palaczy papierosów [13]. Nie wiadomo też, jak palenie papierosów powoduje zmiany powierzchniowej konstelacji receptorów dla TNF na limfocytach. Podsumowując, TNFα (ale nie TRAIL) uczestniczy w regulacji apoptozy AL palących chorych w chorobach śródmiąższowych płuc, przy czym dalsze badania powinny zweryfikować przedstawiony niniejszym pogląd, że cytokina ta w istotnym zakresie modyfikuje aktywność drogi wewnątrzpochodnej. Wnioski mogą mieć znaczenie kliniczne, biorąc pod uwagę podkreślony wyżej ochronny wpływ AL u chorych zagrożonych włóknieniem płuc, oraz znane terapeutyczne możliwości oddziaływania na miejscową ekspresję TNFα w śródmiąższowych chorobach płuc [12]. Wnioski 1. AL nie są dostatecznie chronione przed apoptozą u palaczy papierosów. 2. Prawdopodobne mechanizmy objęły zmniejszoną ekspresję BCL-2 i zmienioną podatność AL na TNFα, w czym pośredniczy zaburzona równowaga między powierzchniową ekspresją receptora dla TNF typu 1 (receptora śmierci) i typu 2 (mediatora przeżycia). 3. Mechanizmy wzmożonej apoptozy AL u palaczy papierosów wydaje się być odmienne w każdej z badanych podgrup. Piśmiennictwo 1. American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias. This joint statement of the American Thoracic Society (ATS), and the European Respiratory Society (ERS) was adopted by the ATS board of directors, June 2001 and by the ERS Executive Committee, June Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002, 165, Baumer I., Zissel G., Schlaak M. et al.: Th1/Th2 cell distribution in pulmonary sarcoidosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1997, 16, Dai H., Guzman J., Baomin Ch., Costabel U.: Production of soluble tumor necrosis factor receptors and tumor necrosis factor-α by alveolar macrophages in sacroidosis and extrinsic allergic alveolitis. Chest 2005, 127, Dempsey P.W., Doyle S.E., He J.Q., Cheng G.: The signaling adaptors and pathways activated by TNF superfamily. Cytokine Growth Factor Rev. 2003, 14, Drążkiewicz M., Szczeklik J., Ślusarczyk-Balicka B. i wsp.: Ekspresja czynnika martwicy guza-alfa (TNF-α) i receptora TNF typu 1 w dolnych drogach oddechowych w sarkoidozie i samoistnym włóknieniu płuc (IPF). Alergol. Immunol. 2008, 5, Drent M., Mansour K., Linssen C.: Bronchoalveolar lavage in sarcoidosis. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2007, 28, Fireman E., Vardinon N., Burke M. et al.: Predictive value of response to treatment of T-lymphocyte subpopulations in idiopathic pulmonary fibrosis. Eur. Respir. J. 1998, 11, Hengartner M.O.: The biochemistry of apoptosis. Nature 2000, 407, Herry I., Bonay M., Bouchonnet F. et al.: Extensive apoptosis of lung T-lymphocytes maintained in vitro. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1996, 15, Hildeman D.A., Zhu Y.N., Mitchell T.C. et al.: Activated T cell death in vivo mediated by proapoptotic Bcl-2 family member Bim. Immunity 2002, 16, Kelly M., Kolb M., Bonniaund P., Gauldie J.: Reevaluation of fibrogenic cytokines in lung fibrosis. Curr. Pharm. Des. 2003, 9, Kim R., Meyer K.C.: Therapies for interstitial lung disease: past, present and future. Ther. Adv. Respir. Dis. 2008, 2, Kopiński P.: Apoptoza limfocytów pęcherzykowych w wybranych chorobach śródmiązszowych płuc. Rozprawa habilitacyjna. Wydawnictwo Naukowe CM UMK. Bydgoszcz Kopiński P., Balicka-Ślusarczyk B., Dyczek A. et al.: Enhanced expression of Fas Ligand (FasL) in the lower airways of patients with fibrotic interstitial lung diseases (ILDs). Folia Histochem. Cytobiol. 2011, 49, Kopiński P., Przybylski G., Balicka-Ślusarczyk B. i wsp.: Apoptoza limfocytów pęcherzykowych w sarkoidozie i w grupie kontrolnej występuje częściej u palaczy papierosów niż u osób niepalących. Przegl. Lek. 2006, 63, Kopiński P., Przybylski G., Balicka-Ślusarczyk B. i wsp.: Palenie papierosów zwiększa liczbę limfocytów cytotoksycznych CD8+Fas Ligand+ w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) chorych z samoistnym włóknieniem płuc (IPF). Przegl. Lek. 2007, 64, Kopiński P., Szczeklik J., Balicka-Ślusarczyk B. i wsp.: Modyfikacje obrazu cytoimmunologicznego materiału z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (bronchoalveolar lavage, BAL) powodowane przez palenie papierosów w wybranych chorobach dolnych dróg oddechowych. Przegl. Lek. 2010, 67, Kopiński P., Szczeklik J., Lackowska B. et al.: Flow cytometric characteristics of alveolar lymphocytes (AL) obtained by bronchoalveolar lavage (BAL) in the control group proposal of normal value range of AL subsets in nonsmokers. Central Eur. J. Immunol. 2004, 29, Lee K.S., Choi Y.H., Kim Y.S. et al.: Evaluation of bronchoalveolar lavage fluid from ARDS patients with regard to apoptosis. Respir. Med. 2008, 102, Mermigkis C., Polychronopoulos V., Mermigkis D. et al.: Overexpression of bcl-2 protein in bronchoalveolar lavage lymphocytes and macrophages in sarcoidosis. Respiration 2006, 73, Nagai S., Handa T., Ito Y. et al.: Bronchoalveolar lavage in idiopathic interstitial lung diseases. Semin Respir. Crit. Care. Med. 2007, 28, Pirożyński M.: Bronchofiberoskopia. Alfa Medica Press, Bielsko-Biała, Reynolds H.Y., Gail D.B., Kiley J.P.: Interstitial lung diseases where we started from and are now going. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis. 2005, 22, Robertson N.M., Zangrilli J.G., Steplewski et al.: Differential expression of TRAIL and TRAIL receptors in allergic asthmatics following segmental antigen challenge: evidence for a role of TRAIL in eosinophil survival. J. Immunol. 2002, 169, Rose A.S., Knox K.S.: Bronchoalveolar lavage as a research tool. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2007, 28, Stridh H., Planck A., Gigliotti D. et al.: Apoptosis resistant bronchoalveolar lavage (BAL) fluid lymphocytes in sarcoidosis. Thorax 2002, 57, Szczeklik J., Trojan J., Kopiński P. et al.: Apoptosis in bronchoalveolar lavage lymphocytes (L-BAL) in pneumoconioses. Przegl. Lek. 2004, 61, Yokohori N., Aoshiba K., Nagai A.: Increased levels of cell death and proliferation in alveolar wall cells in patients with pulmonary emphysema. Chest 2004, 125, Ziegenhagen M.W., Fitschen J., Martinet N. et al.: Serum level of soluble tumor necrosis factor receptor II (75 kda) indicates inflammatory activity of sarcoidosis. J. Intern. Med. 2000, 248, Przegląd Lekarski 2012 / 69 / 10 P. Kopiński i wsp.