Siedlce University of Natural Sciences and Humanities Polish Separation Science Society. Camera Separatoria. Volume 5, Number 1 / June 2013

Transkrypt

1 Siedlce University of Natural Sciences and Humanities Polish Separation Science Society Camera Separatoria Volume 5, Number 1 / June 2013 Siedlce 2013

2 Honorary Editor: Edward Soczewiński (Lublin) Editors-in-Chief: Bronisław K. Głód (Siedlce) Marian A. Kamiński (Gdańsk) Editors: Tadeusz Dzido (Lublin) Bronisław K. Głód (Siedlce) Marian Kamiński (Gdańsk) Piotr M. Słomkiewicz (Kielce) Piotr Stepnowski (Gdańsk) Andrzej Stołyhwo (Warszawa) Monika E. Waksmundzka-Hajnos (Lublin) Mieczysław Sajewicz (Katowice) Language Editor: John Podgórski (Manchester) Technical Editors: Paweł Piszcz Paweł M. Wantusiak Reviewers: Monika Asztemborska Bronisław K. Głód Marian Kamiński Iwona Kiersztyn Monika E. Waksmundzka-Hajnos Paweł Zarzycki Editorial office s address: Department of Analytical Chemistry, Institute of Chemistry Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach Siedlce University of Natural Sciences and Humanities ul. 3 Maja 54, Siedlce tel. : (25) psc1@onet.eu URL:

3 SPIS TREŚCI (CONTENTS) PRACE ORYGINALNE / ORIGINAL PAPERS Grzegorz Boczkaj, Marian Kamiński Ocena przydatności i optymalizacja warunków rozdzielania w chromatografii gazowej bez oddziaływań sorpcyjnych (EC-GC)... 5 Magdalena Bytniewska, Bronisław K. Głód Właściwości antyoksydacyjne miodów wyznaczone za pomocą HPLC-ED PRACE PRZEGLĄDOWE / REVIEW PAPERS Joanna Głazowska, Marian Kamiński Techniki chromatografii w rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów w Rhaponticum carthamoides artykuł przeglądowy Henryk Lamparczyk, Aleksandra Chmielewska, Paweł K. Zarzycki Krótki przegląd zastosowań cyklodekstryn dotyczący analiz farmaceutycznych, biomedycznych oraz środowiskowych Paweł K. Zarzycki Wspomnienie o profesorze Henryku Lamparczyku Instrukcje dla autorów Zapory ghostwriting i guest-autorship Instructions for Authors and Editorial Policy... 46

4 Camera Separatoria PRACE ORYGINALNE (ORIGINAL PAPERS)

5 CAMERA SEPARATORIA Volume 5, Number 1 / January 2013, 5-10 Grzegorz BOCZKAJ*, Marian KAMIŃSKI** Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej ul. G. Narutowicza 11/12, Gdańsk * grzegorz.boczkaj@gmail.com, ** mknkj@chem.pg.gda.pl Ocena przydatności i optymalizacja warunków rozdzielania w chromatografii gazowej bez oddziaływań sorpcyjnych (EC-GC) Streszczenie: Dotychczasowe badania wykazały, że możliwe jest rozdzielanie wysokowrzących mieszanin techniką chromatografii gazowej z zastosowaniem pustej rurki kapilarnej z topionej krzemionki, zamiast kolumn zawierających fazę stacjonarną. Operacja rozdzielania chromatograficznego ma miejsce jedynie na zasadzie różnicy temperatur wrzenia rozdzielanych substancji. Wysoki stopień podobieństwa warunków rozdzielania, osiąganych w ten sposób, z klasyczną destylacją okazuje się być korzystny, w przypadku zastosowania chromatografii gazowej do destylacji symulowanej. W pracy przedstawiono wyniki badań nad charakterystyką rozdzielczą pustej rurki z topionej krzemionki. Zbadano sprawność układu chromatograficznego w warunkach braku oddziaływań sorpcyjnych, a także przydatność takich warunków rozdzielania do destylacji symulowanej tj. do wyznaczania temperatury wrzenia wybranych substancji chemicznych na podstawie ich retencji względem substancji wzorcowych. W pracy porównano rezultaty uzyskane z zastosowaniem badanej metodyki z rezultatami otrzymanymi dla klasycznych kolumn do destylacji symulowanej. Badania wykazały większą zgodność wyznaczanych wartości temperatury wrzenia z wartościami rzeczywistymi w porównaniu z metodyką normowaną destylacji symulowanej. Słowa kluczowe: rozdzielanie chromatograficzne, chromatografia gazowa, GC, destylacja symulowana, SIMDIS, EC-GC. Evaluation of the usefulness and optimization of the separation conditions in Empty Column Gas Chromatography (EC-GC) Abstract: Previous studies revealed that it is possible to separate a high-boiling mixtures by gas chromatography using an empty fused silica capillary tubing instead of column containing stationary phase. Chromatographic separation takes place only on the basis of differences in boiling point values of separated substances. The high degree of similarity in terms of separation achieved in this way, with a classic distillation, appears to be advantageous when gas chromatography is used for simulated distillation. The paper presents results of research on the separation properties of the empty fused silica tubing. The efficiency of such chromatographic system has been examined as well as usefulness of such conditions for simulated distillation i.e. to determine the boiling point of the selected chemicals based on their retention in respect to the reference substances. The results obtained using the empty column gas chromatography (EC- GC) conditions and with the use of classical simulated distillation columns are compared in the paper. Studies have shown more accurate determination of the boiling point values comparing with simulated distillation standard method. Keywords: Chromatographic separation, gas chromatography, GC, simulated distillation, SIMDIS, EC-GC.

6 6 G. Boczkaj, M. Kamiński 1. Wstęp (Introduction) Postęp w technikach rozdzielania, szczególnie w chromatografii, doprowadził do znacznego skrócenia czasu potrzebnego na osiągnięcie zadowalającego rozdzielenia składników mieszaniny. W przypadku chromatografii gazowej, efekt rozdzielczy jest uzyskiwany z zastosowaniem kolumn o coraz mniejszej średnicy wewnętrznej i coraz cieńszym filmie fazy stacjonarnej, co zapewnia ultra wysoką sprawność układu chromatograficznego [1-2]. W przypadku zastosowania wodoru, jako gazu nośnego, sprawność rozdzielania tylko nieznacznie spada wraz z dużym wzrostem liniowej prędkości przepływu gazu. Na drugim biegunie oczekiwań użytkowników aparatury chromatograficznej znajdują się aplikacje, w których dużo większe znaczenie ma pojemność na próbkę i odporność temperaturowa fazy stacjonarnej, a oczekiwania co do rozdzielczości układu chromatograficznego są zredukowane do absolutnego minimum. Jedną z takich aplikacji jest destylacja symulowana [3, 4], gdzie efekt rozdzielczy ma zapewnić jedynie rozdzielenie wybranych n-alkanów, które są stosowane do kalibracji metody, tj. do wyznaczenia zależności wartości czasu retencji od temperatury wrzenia. W tym przypadku, blisko liniowa zależność, którą zapewniają nisko-polarne kolumny kapilarne z fazą stacjonarną w postaci polidimetylosiloksanu (PDMS), pozwala na kalibrację z zastosowaniem tylko kilku lub kilkunastu substancji wzorcowych obejmujących zakresem wrzenia zakres analizowanych próbek. Tak w przypadku metod badań dedykowanych wysokowrzącym produktom naftowym, wzorcowe n-alkany powyżej n-c 40, występują w mieszaninach kalibracyjnych co dziesięć atomów węgla (tj. n-c 50, C- 60 etc.) [5, 6]. Uzyskanie rozdzielenia mieszaniny wzorców, których temperatury wrzenia różnią się o kilkadziesiąt stopni Celsjusza, z zastosowaniem kapilarnej chromatografii gazowej nie sprawia żadnego problemu. Dużo większe znaczenie ma natomiast liniowość zależności retencja-temperatura wrzenia, dla innych grup substancji chemicznych obecnych w próbce w odniesieniu do n-alkanów. Najważniejszym zastosowaniem destylacji symulowanej, jest wyznaczanie charakterystyk destylacyjnych frakcji i produktów naftowych [7-10]. Mieszanina węglowodorów wchodzących w skład analizowanych próbek benzyn, olejów napędowych czy destylatów próżniowych, jest bardzo bogata, a ogólna charakterystyka podawana jako tzw. skład grupowy wskazuje, że oprócz węglowodorów nasyconych parafin i naftenów występują także związki aromatyczne, w tym poliaromatyczne, a w przypadku pozostałości podestylacyjnych czy asfaltów również składniki żywiczne i asfalteny [11]. W celu poprawnego wyznaczenia krzywej destylacji metodą destylacji symulowanej, substancje inne niż n-alkany, muszą w warunkach rozdzielania wykazywać zbliżoną do n-alkanów, a korzystnie, identyczną zależność temperatury wrzenia od wartości czasu retencji. W przypadku występowania znacznych odchyleń od oczekiwanej retencji składników próbki, ma miejsce zafałszowanie krzywej destylacji, wyznaczanej na podstawie pola powierzchni poszczególnych części piku chromatograficznego [12, 13]. Bardziej szczegółową analizę problemów występujących w destylacji symulowanej przedstawiono w [14]. Dotychczasowe badania prowadzone nad optymalizacją warunków analizy wykazały, że możliwym do zastosowania, rozwiązaniem jest zastąpienie kolumn kapilarnych z filmem fazy stacjonarnej, pustą kolumną kapilarną z topionej krzemionki o dezaktywowanej powierzchni wewnętrznej [15]. Takie warunki rozdzielania określono skrótem EC-GC (ang. Empty Column Gas Chromatography). Ze względu na wyeliminowanie oddziaływań sorpcyjnych takie rozwianie wydaje się w lepszy sposób "symulować" proces destylacji, a stąd zapewniać bardziej zbieżne wyniki. Dla kilku związków z grupy WWA, dla których odnotowano duże odchylenia obliczonej względem rzeczywistej (TBP) temperatury wrzenia, badania w warunkach EC-GC wykazały, że uzyskuje się bardziej dokładne wartości TBP. W pracy przedstawiono wyniki dalszych badań nad warunkami EC-GC. Przedstawiono wyznaczone krzywe Van Deemtera opisujące zależność sprawności od liniowej prędkości przepływu gazu nośnego, a także porównano wyznaczane w warunkach SIMDIS oraz EC-GC wartości TBP dla wybranych związków chemicznych. 2. Część eksperymentalna (Materials and Methods) 2.1. Materiały (Materials) - Mieszanina wzorcowa SIMDIS 2887 Extended - n-parafiny w zakresie n-c 5 - n-c 60 (AC Analytical Controls); - Substancje wzorcowe: α-metylo-naftalen, p-nitro-anilina, 2,4-dinitro-anilina, benzydyna, dibenzotiofen, sulfon dietylowy, piren, chryzen, antracen, fenantren, mentol, skwalan, 4,6-dinitro-o-krezol, α-naftylo-amina, 9-hydroxyfluoren, 1,10-fenantrolina (Sigma Aldrich, USA); - mieszanina wzorcowa metanu w powietrzu (100 ppm, Linde Gas); - dwusiarczek węgla (>99% (GC), Fluka Analytical), metanol (czystość do HPLC, Merck); - azot, hel, powietrze czystości 5,0 N (Linde Gas). Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

7 Ocena przydatności i optymalizacja warunków rozdzielania w chromatografii Aparatura (Instruments) Generator wodoru (Packard) SIMDIS - Chromatograf gazowy Autosystem (Perkin Elmer), - Oprogramowanie TotalChrom ver. 6.3 (Perkin Elmer), EC-GC - Chromatograf gazowy Autosystem XL (Perkin Elmer), - Oprogramowanie TotalChrom ver. 6.3 (Perkin Elmer), 2.3. Metody postępowania (Methods) Przygotowanie roztworów Preparation of the solutions Roztwór wzorcowych n-parafin sporządzono poprzez rozpuszczenie naważki w dwusiarczku węgla w stosunku masowym ok. 1:100. Roztwór skwalanu o stężeniu ok. 100 ppm przygotowano w dwusiarczku węgla. Roztwory innych substancji wzorcowych o stężeniu ok. 100 ppm przygotowano, o ile to było możliwe, w dwusiarczku węgla. Roztwory substancji wzorcowych nierozpuszczalnych w CS2 przygotowano o stężeniu ok. 100 ppm w metanolu. Warunki analizy Chromatographic conditions Próbki dozowano ręcznie w objętości 1 ul za pomocą mikrostrzykawki. Dla każdej z próbek wykonano trzy analizy. SIMDIS: - Gaz nośny: Azot, 10 ml/min; - Kolumna: Zebron ZB-1XT SIMDIS (Phenomenex) 10m x 0.53 mm x 0.15 μm; - Program temperatury: 40ºC przez 1 min., narost 5ºC/min do 380ºC, utrzymywana 20 min; - Dozownik typu split/splitless w trybie splitless, temperatura: 380ºC; - Temperatura detektora FID: 385ºC. EC-GC: - Kolumna: pusta rurka z topionej krzemionki o dezaktywowanej powierzchni wewnętrznej (methyl deactivated) 30 m x 0.53 mm (BGB Analytic); pozostałe warunki jak dla SIMDIS. Wyznaczanie krzywych Van Deemtera Determination of the Van Deemter plots Krzywe sprawności wyznaczono dla skwalanu. Analizy prowadzono w warunkach stałego ciśnienia gazu nośnego w dozowniku (constant pressure mode) dla trzech gazów nośnych - azotu, helu i wodoru. Dla każdych warunków rozdzielania wykonano trzy analizy. Badania charakterystyk retencyjnych Retention behavior research Wartość temperatury wrzenia wyznaczoną w warunkach SIMDIS i EC-GC obliczano na podstawie wartości czasu retencji substancji w oparciu o kalibrację wykonaną z zastosowaniem n-alkanów. Wartość temperatury wrzenia obliczano na podstawie interpolacji względem dwóch sąsiadujących n-alkanów. Wartości rzeczywistej temperatury wrzenia przyjęto na podstawie danych literaturowych. 3. Wyniki i dyskusja (Results and discussion) Zastosowanie warunków EC-GC, tj. brak fazy stacjonarnej w kolumnie, pozwala na maksymalne wyeliminowanie oddziaływań sorpcyjnych. Pozwala to na uzyskanie większego podobieństwa warunków rozdzielania chromatograficznego do klasycznej destylacji. Ten efekt zbadano w niniejszej pracy poprzez porównanie temperatury wrzenia wybranych substancji chemicznych wyznaczonej w warunkach SIMDIS oraz EC-GC z rzeczywistą temperaturą wrzenia. Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

8 8 G. Boczkaj, M. Kamiński 3.1. Sprawność rozdzielania w warunkach EC-GC (Efficiency of the chromatographic system in EC-GC conditions) Brak fazy stacjonarnej w kolumnie skutkuje jednak, znacznym obniżeniem rozdzielczości układu chromatograficznego. Głównie, ma to miejsce z powodu znacznie niższej sprawności kolumny bez fazy stacjonarnej. Na rysunku 1 przedstawiono krzywe Van Deemtera wyznaczone dla trzech typowych gazów nośnych stosowanych w chromatografii gazowej helu, wodoru i azotu. Rys. 1. Nałożenie krzywych Van Deemtera dla trzech gazów nośnych dla kolumny o średnicy wewnętrznej 0,53 mm Fig.1. A comparison of Van Deemter plots for three carrier gases for a 0,53 mm ID capillary column Efekt rozdzielczy oraz przydatność warunków EC-GC do destylacji symulowanej wysokowrzących mieszanin opisano w poprzedniej pracy [15]. Krzywe Van Deemtera zostały wyznaczone dla 2,6,10,15,19,23-heksametylotetrakozanu (C 30 H 62, temperatura wrzenia 470 C, skwalan), który dotychczas jest używany jako niepolarna, ciekła faza stacjonarna do gazowej chromatografii. Wybrany związek chemiczny odpowiada właściwościami fizykochemicznymi analizowanym metodom SIMDIS frakcjom i produktom naftowym, stąd dobrze charakteryzuje sprawność układu rozdzielczego. Wyniki badań wykazały, że charakterystyka zmian sprawności rozdzielczej wyrażanej jako wysokość równoważna półce teoretycznej (ang. Height Equivalent to Theoretical Plate, HETP) w funkcji średniej liniowej prędkości przepływu fazy ruchomej (u) jest zbliżona do zmian odnotowywanych dla kolumn zawierających fazę stacjonarną. Wartości liniowej prędkości przepływu zapewniające najwyższą sprawność rozdzielczą wyniosły odpowiednio: 11,1 cm/s dla azotu, 13,7 cm/s helu, 25 cm/s dla wodoru. W tych warunkach kolumna o długości 30,0 m ma sprawność wynoszącą: od 3890 (hel) do 4130 (wodór i azot) półek teoretycznych. Jest to wystarczająca sprawność do wykonywania destylacji symulowanej. Klasyczna kolumna do destylacji symulowanej stosowana w pracy charakteryzowała się sprawnością na poziomie ok półek teoretycznych (ok półek na jeden metr) Porównanie poprawności wyznaczania temperatury destylacji w warunkach EC-GC i SIMDIS (Comparison of the accuracy of determined boiling point values in EC-GC and SIMDIS conditions) Największą zaletą zastosowania pustej kolumny kapilarnej bez fazy stacjonarnej wydaje się być zapewnienie większego podobieństwa zjawisk zachodzących podczas rozdzielania chromatograficznego do tych mających miejsce podczas klasycznej destylacji. Badania prowadzone dla związków chemicznych o różnej polarności, mogących występować we frakcjach naftowych, wykazały że występują znaczne odchylenia od wyznaczanych metodą SIMDIS wartości temperatury wrzenia [5, 13]. W tabeli 1 porównano rezultaty badań metodą SIMDIS oraz w warunkach EC-GC wyznaczania temperatury wrzenia wybranych substancji o różnej polarności. Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

9 Ocena przydatności i optymalizacja warunków rozdzielania w chromatografii 9 Tabela 1. Porównanie różnic obliczonych na podstawie wartości czasu retencji temperatur wrzenia w warunkach SIMDIS i EC-GC z wartościami rzeczywistymi. Table 1. Comparison of the results of determination of the boiling point obtained with SIMDIS and EC-GC conditions Związek chemiczny (chemical compounds) Vol. 5, No 1/2013 Rzeczywista temperatura wrzenia (True Boiling Point) (P=760 mm Hg) (TBP) Obliczona temperatura wrzenia (calculated boiling point) Simdis Różnica (difference) EC-GC Obliczona temperatura wrzenia (calculated boiling point) Różnica (difference) [ C] [ C] [ C] [ C] [ C] mentol α-metylo-naftalen sulfon dietylowy α-naftylo-amina dibenzotiofen fenantren p-nitro-anilina ,6-dinitro-okrezol antracen ,10-fenantrolina hydroksyfluoren piren ,4-dinitro-anilina benzydyna chryzen Uzyskane rezultaty pokazują, że dla każdej zbadanych substancji chemicznych, temperatura wrzenia wyznaczona w warunkach EC-GC jest bliższa rzeczywistej, niż ma to miejsce w przypadku zastosowania klasycznych kolumn do destylacji symulowanej. Najwyższą zgodność rezultatów uzyskano dla w przypadku EC-GC dla mentolu oraz 2,4-dinitro-aniliny. Odchylenia od wartości rzeczywistej wyniosły odpowiednio jeden i dwa stopnie Celsjusza. W warunkach SIMDIS najwyższą zgodność uzyskano również dla tych samych dwóch związków chemicznych. Odchylenia w przypadku mentolu wyniosły 6 stopni, a dla 2,4-dinitroaniliny 3 stopnie. Metodyka polegająca na zastosowaniu pustej rurki z topionej krzemionki o dezaktywowanej powierzchni wewnętrznej, powinna znaleźć zastosowanie przede wszystkim do wyznaczania rozkładu temperatury destylacji średnio i niskolotnych mieszanin, w których mogą występować polarne substancje chemiczne, a także produktów uzyskiwanych podczas nowo opracowanych procesów technologicznych, w których skład i polarność składników mieszaniny nie została jeszcze zbadana. Z powodu lepszego odwzorowania charakterystyki destylacyjnej każdej z badanych grup składników, w tym węglowodorów aromatycznych oraz polarnych substancji chemicznych, wydaje się to być dobra metoda do badań rozkładu temperatury destylacji produktów procesów rozkładu termicznego i katalitycznego tj. piroliza. Obecne uwarunkowania i trendy badawcze w kierunku termicznego odzysku ciekłych frakcji energetycznych i paliwowych z odpadów stałych powodują, że na znaczeniu zyskuje metodyka pozwalająca na poprawne wyznaczania charakterystyki destylacyjnej mieszanin zawierających znaczący udział składników polarnych. 4. Podsumowanie (Summary) W pracy zbadano sprawność układu rozdzielczego w warunkach EC-GC. Dla 30-to metrowej kolumny o średnicy 0,53 mm uzyskano sprawność na poziomie półek teoretycznych na metr. Wcześniejsze Camera Separatoria

10 10 G. Boczkaj, M. Kamiński badania [15] wykazały, że uzyskiwana sprawność rozdzielania w warunkach EC-GC spełnia wymagania dla kolumn do destylacji symulowanej (SIMDIS). W badaniach niniejszej pracy wykazano również, że warunki EC-GC zapewniają lepsze odwzorowanie charakterystyki destylacyjnej dla każdej z badanych grup substancji chemicznych. Największą zaletą warunków EC-GC jest zapewnienie znacznie lepszego odwzorowania charakterystyk destylacyjnych dla polarnych substancji. Jest to szczególnie istotne w przypadku złożonych mieszanin dla których wykonuje się rozkład temperatury destylacji. Obecnie coraz częściej SIMDIS jest stosowany w badaniach nad procesami pirolizy/upłynniania materiałów stałych i półstałych o charakterze odpadowym. Produkty z tych procesów zawierają duże ilości węglowodorów aromatycznych, stąd poprawne wyznaczanie zakresu temperatury destylacji tej grupy substancji jest kluczowe dla uzyskiwania poprawnych rezultatów techniką destylacji symulowanej. Zastosowanie do tego celu warunków EC-GC wydaje się optymalnym rozwiązaniem. Podziękowania (Acknowledgements) Autorzy pragną podziękować za wsparcie niniejszych badań Narodowemu Centrum Nauki (projekt grantowy nr UMO-2011/01/N/ST8/07757). Literatura (Literature) 1. K. Mastovská, S.J. Lehotay, Practical approaches to fast gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr A., 1000(2003) P.Q. Tranchida, L. Mondello, Current-day employment of the micro-bore open-tubular capillary column in the gas chromatography field, J. Chromatogr. A, 1261(2012) L.E. Green, L.J. Schumauch, J.C. Worman, Simulated distillation by gas chromatography, Anal. Chem., 36(1964) L.E. Green, J.C. Worman, Simulated distillation of high boiling petroleum fractions, Anal. Chem., 37(1965) ASTM D2887: Standard test method for boiling range distribution of petroleum fractions by gas chromatography. 6. ASTM D3710: Test method for boiling range distribution of gasoline and gasoline fractions by gas chromatography. 7. ASTM D5307: Standard test method for determination of boiling range distribution of crude petroleum by gas chromatography. 8. ASTM D6352: Standard test method for boiling range distribution of petroleum distillates in boiling range from 174 to 700 C by gas chromatography. 9. ASTM D7169: Standard test method for boiling point distribution of samples with residues such as crude oils and atmospheric and vacuum residues by high temperature gas chromatography. 10. ASTM D7213: Standard test method for boiling range distribution of petroleum distillates in the boiling range from 100 to 615 C by gas chromatography. 11. W.A. Darka, Crude oil hydrocarbon group separation quantitation. J. Liq. Chromatogr., 5(1982) S.G. Roussis, W.P. Fitzgerald, Gas chromatographic simulated distillation-mass spectrometry for the determination of the boiling point distributions of crude oils, Anal. Chem., 72(2000) J.P. Durand, A. Bré, J.J. Béboulène, A. Ducrozet, S. Carbonneaux, Improvement of simulated distillation methods by gas chromatography in routine analysis, Oil Gas Sci. Technol. Rev. IFP, 54(1999) G. Boczkaj, M. Kamiński, Wykorzystanie chromatografii gazowej do destylacji symulowanej (SIMDIS). Aktualny stan wiedzy i nowe perspektywy, Cam. Sep., 2(2010) G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, New procedure for the determination of distillation temperature distribution of high-boiling petroleum products and fractions, Anal. Bioanal. Chem., 399(2011)3253. Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

11 CAMERA SEPARATORIA Volume 5, Number 1 / January 2013, Magdalena BYTNIEWSKA, Bronisław K. GŁÓD Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Wydział Nauk Ścisłych, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, ul. 3 Maja 54, Siedlce bkg@onet.eu Właściwości antyoksydacyjne miodów wyznaczone za pomocą HPLC-ED Streszczenie: Celem pracy było wstępne zbadanie możliwości oznaczenia właściwości przeciwutleniających miodów oraz miodów pitnych. Oznaczenie całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) miodów, wykonano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną. Miarą CPA było sumaryczne pole powierzchni wszystkich pików zarejestrowanych podczas ich anodowego utleniania. Słowa kluczowe: wolne rodniki, antyoksydanty, całkowity potencjał antyoksydacyjny, miód Antioxidative properties of honeys determined using HPLC-ED assay Abstract: The aim of the study was to investigate the possibility of determination of antioxidative properties of honeys and meads. The total antioxidant potential (TAP), was performed using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. TAP measure was the total area of all peaks recorded during their anodic oxidation. Key words: free radicals, antioxidants, total antioxidant potential, honey

12 12 M. Bytniewska, B.K. Głód 1. Wstęp (Introduction) Natura wolnych rodników i antyoksydantów oraz ich wpływ na organizm ludzki, od polowy XX wieku, stały się częstym tematem badań. Potwierdzeniem tego zainteresowania była nagroda Nobla przyznana w 1956 roku C. Hinshelwoodowi i N.N. Siemionowem za studia nad mechanizmem powstawania wolnych rodników. Obecnie uważa się, że wolne rodniki pełnią dwojaką rolę w organizmie, szczególnie te tlenowe, mogą być przyczyną wielu chorób a nawet obarcza się je odpowiedzialnością za starzenie się organizmu. Z drugiej strony jednak biorą one udział w wielu mechanizmach wewnątrzkomórkowych, np. pełnią funkcje przekaźników sygnałów [1]. Metabolizm tlenowy wykształcony w toku ewolucji pozwolił na dużo bardziej wydajne wykorzystanie energii wiązań chemicznych, umożliwiając w ten sposób powstanie nowych, bardziej skomplikowanych pod względem budowy organizmów. W trakcie oddychania tlenowego tlen cząsteczkowy powinien ulec całkowitej redukcji do 2 cząsteczek wody, przyłączając 4 protony i 4 elektrony. Jednakże nie zawsze tak się dzieje, a skutkiem niepełnej redukcji tlenu są RFT, powstające w kolejnych etapach redukcji tlenu [2]. W procesie tym ważną rolę pełnią enzymy antyoksydacyjne (katalizatory tych przemian) takie jak dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) czy peroksydaza glutationowa (GS-Px) [1]. WR i RFT mogą być generowane wewnątrz komórek, najważniejszym miejscem ich powstawania są mitochondria (organelle komórkowe, w których zachodzi proces oddychania komórkowego) bądź powstawać pod wpływem czynników zewnętrznych. Żywe organizmy w toku ewolucji wykształciły mechanizmy broniące przed szkodliwymi zmianami wolnorodnikowymi. Żywność pochodzenia roślinnego jest bogatym źródłem zarówno substancji odżywczych jak i związków o właściwościach przeciwutleniających. Również popularne napoje takie jak: herbata, wino czy kakao są bardzo bogate w fenolowe fito-związki [3]. Najważniejsze znaczenie, jeżeli chodzi o antyoksydanty pochodzenia roślinnego, mają związki polifenolowe (kwasy fenolowe i pokaźna grupa flawonoidów wraz z antocyjanami), witaminy: A, C, tokoferole, karotenoidy, kwasy organiczne oraz biopierwiastki (np. wapń i selen) [4,5]. W literaturze opisane są metody pozwalające na oznaczenie stężenia zarówno wolnych rodników jak i antyoksydantów [1,2,6-8]. Nie we wszystkich próbkach skład antyoksydantów jest znanych. Niektóre z nich wykazują efekty synergiczne i/lub mogą między sobą reagować. W miodzie charakterystyczne na przykład jest współdziałanie flawanoidów z α-tokoferolem, powodujące wzrost mocy antyoksydacyjnej układu. Dlatego czasami korzystne jest oznaczenia sumarycznego stężenia wszystkich antyoksydantów czy wszystkich wolnych rodników, która pozwala ocenić moc układu antyoksydacyjnego oraz rozmiar stresu oksydacyjnego [1,9,10]. Miód od zamierzchłych czasów był uważany za źródło zdrowia. Już uczestnicy starożytnych olimpiad przed zawodami wzmacniali się porcją miodu, a przez długie wieki był on niezastąpionym środkiem wspomagającym gojenie ran. Również w Polsce był często stosowany. Jest naturalnym produktem pszczelim. Podstawowymi jego surowcami są nektary roślinne występujące w miodnikach, czyli gruczołach cukrowych ukrytych wewnątrz kwiatu oraz spadź. Spadź jest to substancja wydzielana przez mszyce i czerwy, zawierająca głównie niestrawione cukry [11]. W miodach wykryto ponad 300 różnych substancji [12]. Głównymi ich składnikami są monosacharydy, glukoza i fruktoza. Wszystkie węglowodany stanowią średnio 77% całego składu miodu. Wosk pszczeli jest naturalnym tłuszczowcem wydzielanym przez gruczoły woskowe młodych pszczół robotnic. Postać płynna zastyga na powierzchni płytek chitynowych odwłoka. Początkowo jest to przezroczysta łuseczka woskowa, która wykorzystywana jest jako materiał do budowy plastrów. Barwa plastrów z czasem ulega zmianie i uzależniona jest to od jakości surowca i sposobu jego przetworzenia. Początkowo jest biały, zmienia się na żółty lub nawet ciemnobrązowy ze wzrostem stężenia pyłku kwiatowego i propolisu (kitu pszczelego). W ulu wosk pszczeli nabiera szczególnej woni miodu (wyczuwalny jest również zapach kitu pszczelego). Składa się on z węglowodorów, alkoholi, wolnych kwasów (palmitynowy, mirycylowy, cerylowy, melisowy), estrów, polifenoli (małe stężenia) [13], itp. Wosk pszczeli stosowany był już w starożytności do otrzymywania odlewów. Stosowany też był do ochrony przed szkodliwym działaniem wody. W czasach średniowiecznych wykorzystywany był na przykład do produkcji łuków. Obecnie 60% produkcji wosku pszczelego wykorzystuje przemysł kosmetyczny i farmaceutyczny. 2. Część eksperymentalna (Experimental) 2.1. Aparatura (Instrumentation) W pracy użyto zestaw wysokosprawnego chromatografu cieczowego (Knauer, Niemcy): butlae na eluent, moduł Smartline Manager 5000 zawierający degazer, pompa dwutłokowa Smartline 1000 (zakres Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

13 Właściwości antyoksydacyjne miodów wyznaczone 13 przepływu 0, ml/min), mieszadło magnetyczne, autosampler, lub dozownik o objętości pętli 20 μl, kolumna COSMOSIL 5 μm, 4,6x150 mm, 5C18-MS-II, detektor elektrochemiczny EC3000 (elektroda pracująca elektroda z węgla szklistego, elektroda odniesienia - Ag/AgCl, elektroda pomocnicza - Pt), detektor UV/VIS z matrycą diodową (DAD) Smartline 2600, oprogramowanie do przetwarzania i obróbki danych Clarity Chrom V oraz Eurochrom 2000, odbieralnik fazy ruchomej. Pomiary fotometryczne wykonano na fotometrze Helios Epsilon (Thermo Spectronic, USA). ph mierzono na ph-metrze OP-208/1 (RADELKIS, Budapeszt, Węgry) Odczynniki (Reagents) W badaniach stosowano kwas 4-hydroksybenzoesowy (p-hba) i 3,4-dihydroksybenzoesowy (3,4- DHBA), metanol czysty do HPLC, 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (DPPH) i siarczan(vi) żelaza(ii) (Sigma-Aldr ich, St. Louis,USA), diwodoroortofosforan sodu, wodoroortofosforan potasu, brom, wolframian sodowy, molibdenian sodowy, węglan sodowy bezw., 85% kwas orto-fosforowy, siarczan litu i 3% nadtlenek wodoru (POCh, Gliwice, Polska) oraz wodorotlenek sodu (Chempur, Piekary Śląskie, Polska) Materiał badawczy (Samples) Miody (lipowy, akacjowy, wielokwiatowy, gryczany oraz spadziowy) pochodziły z pasieki Pod wiązami (Siedlce, Polska). Do badań były rozcieńczane w stosunku 1:10 (10 mg/ml) i przesączane przez nylonowy sączek. Roztwory otrzymywano z wody trójkrotnie destylowanej z kwarcu. Roztwory miodów (0,1g/ml) były przesączane przez sączek nylonowy o grubości 0,45 μm Warunki pomiarowe (Procedures) Pomiary chromatograficzne przeprowadzono w układzie faz odwróconych (RP C18) stosując bufor fosforanowy (ph 6,6) jako fazę ruchomą. W pomiarach zastosowano detektor elektrochemiczny w zakresie potencjału, E = 0 1,2 V. Czas trwania analizy wynosił 30 min. Miarą CPA jest sumaryczna powierzchnia pików chromatograficznych obserwowanych w zakresie anodowym elektrody pracującej. Pomiar wykonywano w układzie faz odwróconych przy dodatnich potencjałach elektrody w zakresie od 0V do 0,8V, a czas analizy wynosił 30 min. Jako fazę ruchomą zastosowano bufor fosforanowy o ph 6,6; nastrzyk próbki miodu (1mg/ml) - 20 μl. Oznaczania wykonane były z wykorzystaniem detektora elektrochemicznego z elektrodą pracującą z węgla szklistego, elektrodą odniesienia - Ag/AgCl i elektrodą pomocniczą - Pt. 3. Wyniki i dyskusja (Results and discussion) Antyoksydanty utleniane są na powierzchni elektrody. Zmieniając napięcie można uzyskać informacje tylko o mocnych bądź sumie mocnych i słabych antyoksydantach zawartych w próbce. Przy niskich potencjałach reakcji ulegają związki o silnych właściwościach redukujących, a przy wyższych potencjałach obserwujemy działanie zarówno tych słabszych jak i silnych przeciwutleniaczy. Charakterystyczna dla miodów jest duże sumaryczne pole powierzchni pików przy wysokim potencjale. Świadczy to o obecności znacznych ilości słabych przeciwutleniaczy, nie dających sygnałów przy niskich potencjałach. CPA miodów przy E= 0,8 V ilustruje Rys. 1. Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

14 CPA [na s] 14 M. Bytniewska, B.K. Głód Rys. 1. CPA 1 mg/ml miodów wyznaczone dla potencjału elektrody pracującej 0,8 V. Warunki chromatograficzne: kolumna - COSMOSIL 5 μm, 4,6x150 mm, 5C18-MS-II, faza ruchoma - bufor fosforanowy ph 6,6, szybkość przepływu - 1 ml/min, detektor elektrochemiczny (elektroda odniesienia Ag/AgCl). Fig. 1. TAP values of 1 mg/ml honeys obtained at 0.8V. Experimental conditions: column - COSMOSIL 5 μm, 4,6x150 mm, 5C18-MS-II, mobile phase phosphate buffer ph 6.6, flow rate - 1 ml/min, amperometric detection (reference electrode Ag/AgCl). Największe CPA otrzymano dla miodów, gryczanego i spadziowego. Oba te miody mają charakterystyczną ciemną barwę, co sugeruje wysokie stężenie polifenoli, np. flawonoidów z których większość zalicza się do antyoksydantów. Wartości CPA uzyskane przy potencjale 0,2 V sugerują, że największe stężenia silnych antyoksydantów występuje w miodzie gryczanym, najniższe w akacjowym (Rys. 2). Ze zmianą potencjału proporcjr te niewiele się zmieniają (Rys. 2). Można więc stwierdzić, że miód gryczany zawierają największe stężenia zarówno silnych jak i słabych antyoksydantów. Rys. 2. CPA miodów o stężeniu 1 mg/ml z pasieki Pod wiązami w funkcji potencjału elektrody pracującej. Warunki chromatograficzne jak na Rys. 1. Fig. 2. Dependence of TAP values of 1 mg/ml honeys from apiary Pod wiązami on the working electrode potential. Experimental conditions as on Fig. 1. Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

15 Właściwości antyoksydacyjne miodów wyznaczone 15 Literatura (References) 1. B.K. Głód, P. Piszcz, I. Kiersztyn, A. Lamert, P. Zarzycki, Zastosowanie HPLC do oznaczania wolnych rodników, antyoksydantów oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego, Cam. Sep., 1(2009) Q. Chen, E.J. Vazquez, S. Moghaddas, C.L. Hoppel, E.J. Lesnefsky, Production ofreactive oxygen species by mitochondria, J. Biol. Chem., 278(2003) M.S. Fernandez-Pachon, D, Villano, M.C. Garcia-Parrilla, A.M. Troncoso, Antioxidant activity of wines and relation with their polyphenolic composition, Anal. Chim. Acta, 513(2004) B. Maniak, Z. Targowski, Przeciwutleniacze naturalne wystupujące w żywności. Przem. Ferm., 4(1996) A. Szajek, J. Borowska, Właściwości przeciwutleniające żywności pochodzenia roślinnego, Żywność. Nauka Techn. Jakość, 4(2004) B.K. Głód, E. Olszewska, P. Piszcz, Wolne rodniki a stres oksydacyjny, Tłuszcze Jadalne, 41(2006) A. Łuszczewski, E. Matyska-Piekarska, J. Trefler, I. Wawer, J. Łącki, P. Śliwińska-Stańczyk, Reaktywne formy tlenu: Znaczenie w fizjologii i stanach patologii organizmu, Reumatologia, 45(2007) T. Laskowska-Kmita, Wolne rodniki tlenowe i obrona przeciwutleniająca, Med. Wieku Rozw., 1(1997) C. Buhmann, S. Arlt, A. Kontush, T. Moller-Bertram, S. Sperber, M. Oechsner, M Stuerenburg, U. Beisiegel, Plasma and CSF markers of oxidative stress are increased in Parkinson's disease and influenced by antiparkinsonian medication, Neurobiol. Diseas., 15(2004) A. Rehman, M. Whiteman, B. Halliwell, Scavenging of hydroxyl radicals but not of peroxynitrite by inhibitors and substrates of nitric oxide synthases, British J. Pharmacol., 122(1997) L. Bornus, Miód pszczeli od producenta do konsumenta, PWRiL, Poznań J.W. White, Composition of hone, w E. Crane, red., Honey: A comprehensive survey, str , Heinemann, London R.J. Weston, The contribution of catalase and other natural products to the antibacterial activity of honey: a review. Food Chem., 71(2000) B.K. Głód, J. Strosznajder, Wolne rodniki w starzeniu się mózgu i innych procesach biologicznych, w M.J. Kossakowski, J. Strosznajder, red., Mózg a starzenie, Oświata UN-O, Warszawa Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

16 Camera Separatoria PRACE PRZEGLĄDOWE (REVIEW PAPERS)

17 CAMERA SEPARATORIA Volume 5, Number 1 / January 2013, Joanna GŁAZOWSKA, Marian KAMIŃSKI* Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska ul. Gabriela Narutowicza 11/ Gdańsk *markamin@pg.gda.pl Techniki chromatografii w rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów w Rhaponticum carthamoides artykuł przeglądowy Streszczenie: Rhaponticum carthamoides (syn. Leuzea carthamoides, pol. szczodrak krokoszowaty) to syberyjska, endemiczna, wieloletnia bylina, od wieków wykorzystywana w medycynie ludowej, w postaci wyciągów alkoholowych, jako preparat wzmacniający organizm. Szczególnie ważną grupą związków chemicznych, występujących w roślinie, wzbudzających szczególne zainteresowanie, ze względu na wykazywaną aktywność, są ekdysteroidy. Poznanie dokładnego składu metabolicznego oraz stężeń ekdysteroidów, a także innych metabolitów w tkankach roślinnych staje się istotnym elementem poznawczym. Ich znajomość może przyczynić się do wytwarzania preparatów leczniczych i wspomagających na bazie Leuzei. W rozdzielaniu ekdysteroidów zastosowanie znajduje przede wszystkim wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnych (NP) i odwróconych (RP) układach faz, a ostatnio, także, w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC) - z reguły, w warunkach elucji gradientowej, a także chromatografia cienkowarstwowa (TLC) w jednym, a szczególnie w dwóch wymiarach. W dalszym ciągu poszukuje się możliwie nieskomplikowanych metodyk pozwalających na rozdzielenie i oznaczenie ekdysteroidów i innych metabolitów wtórnych obecnych w surowym ekstrakcie. Ważne, szczególnie w przypadku tej rośliny, byłoby opanowanie metodyki rozdzielania i wydzielania wszystkich metabolitów, ponieważ, niektóre badania wykazują, że działanie ekdysteroidów w organizmach ssaczych jest wzmacniane w sposób synergiczny przez nieznane dotychczas składniki rośliny. Prace nad rozdzielaniem mają duże znaczenie dla dalszych badań nad tą, ciągle jeszcze niewystarczająco zbadaną rośliną, w tym także, dla opracowania procedury standaryzacji "materiału roślinnego", obecnego na rynku w postaci różnego rodzaju wyciągów i preparatów. Przedmiotem niniejszej pracy jest zestawienie oraz porównanie technik i warunków chromatograficznych wykorzystywanych dotychczas w rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów w wyciągach roślinnych z Rhaponticum carthamoides. W związku z ogromnym bogactwem metabolicznym Rhaponticum carthamoides, szczególnie obiecujące wydaje się zastosowanie w dalszych badaniach dwuwymiarowej wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej z elucją gradientową w obu "wymiarach" rozdzielania (2D-Grad/Grad-HPLC), albo ortogonalnego rozdzielania wielokolumnowego, z przepływem zwrotnym eluentu w dowolnej kolumnie rozdzielczej ((MC-HPLC-EBF), a w przypadku techniki chromatografii cienkowarstwowej - elucji kilkustopniowej (NS-TLC), lub rozdzielania dwuwymiarowego (2D-TLC), być może także z elucją kilkustopniową w drugim "wymiarze" rozdzielania (2D-NS-TLC). Słowa kluczowe: Rhaponticum carthamoides, Leuzea carthamoides, Fitoekdysteroidy, Wysokosprawna elucyjna chromatografia cieczowa kolumnowa - HPLC, Chromatografia cienkowarstwowa - TLC, Odwrócone układy faz - RP, Normalne układy faz - NP, Warunki oddziaływań hydrofilowych - HILIC Chromatographic techniques in separation and determination of ecdysteroids in Rhaponticum carthamoides A review Abstract: Rhaponticum carthamoides (Leuzea carthamoides) is a Siberian endemic perennial used for centuries in folk medicine as a body-strengthening specimen based on alcohol extracts. The main group of substances which is in particular interest, due to exhibiting high activity, are ecdysteroids. The determination of the exact composition and comcentration of metabolites in the plant tissues is an important element of cognitive. The knowledge can contribute to the development of new medicinal preparations based on Leuzea. The separation of ecdysteroids is carried out using the normal and reverse phase high performance liquid chromatography, as well as the hydrophilic interactions liquid chromatography, in a gradient elution, and thin layer chromatography in one- and two-dimension. However there is still a need to look for an uncomplicated method for the separation and identification of ecdysteroids and other plant secondary metabolites, present in the crude extract of Rhaponticum. Separation and isolation off all metabolites showing synergic interactions with ecdysteroids in mammalian organisms is important to investigate their mode of action. Further studies, on this still not well known plant, and also on the development of procedures of standardization of plant material, present on the market in form of different extracts and preparation are needed. The object of this work is to collate and compare the most popular chromatographic techniques used in separation and determination of ecdysteroids in plant material of Rhaponticum carthamoides. Due to its enormous wealth of secondary metabolite it is important to apply two dimmensional high performance liquid chromatography with gradient elution in both directions (2D-Grad/Grad-HPLC), or

18 18 J. Głazowska, M. Kamiński orthogonal column separations with eluent backflush on each column (MC-HPLC-EBF), and in TLC: stepand multi-dimensional elution (2D-TLC and 2D-NS-TLC). Key words: Phytoecdysteroids, Rhaponticum carthamoides, Leuzea catrhamoides, Liquid Chromatography, Thin Layer Chromatography - TLC, Reversed Phase High Performance Chromatography - RP-HPLC, Normal Phase High Performance Chromatography - NP-HPLC, Hydrophilic Interaction Chromatography - HILIC. Użyte skróty: NP-HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnych układach faz, RP-HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconych układach faz, TLC chromatografia cienkowarstwowa, HILIC chromatografia oddziaływań hydrofilowych, OPTLC chromatografia cienkowarstwowa z wykorzystaniem nadciśnienia (z wymuszonym przepływem eluentu, HPTLC wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa, FFPC chromatografia planarna z wymuszonym przepływem fazy ruchomej, UV promieniowanie nadfioletowe 1. Wstęp (Introduction) Rhaponticum carthamoides (synonim Leuzea carthamoides) (Rysunek 1), po polsku szczodrak krokoszowaty jest endemiczną rośliną, porastającą duże obszary południowej Syberii, w szczególności łąki gór Ałtaj i Sajan, gdzie spotykana jest na wysokości powyżej 1200 m n.p.m. L. carthamoides to wieloletnia bylina dożywająca nawet 150 lat. Od ponad 5000 lat znana jest jako roślina lecznicza, stosowana szeroko w medycynie ludowej ludności syberyjskiej, mongolskiej, tybetańskiej oraz chińskiej w wyniku czego obecnie zagrożona jest wyginięciem ze względu na wzrost zainteresowania tą rośliną szczególnie, niestety, jej korzeniami [1-4]. Szczęśliwie, obecnie istnieje coraz więcej upraw tej rośliny, szczególnie w krajach Europy Środkowej i Zachodniej, a także na terenie Chin i Rosji (rys. 1). Szczodrak krokoszowaty bogaty jest w związki chemiczne należące do różnych klas, takich jak steroidy, sterole, flawonoidy i antocyjany, kwasy fenolowe, garbniki, a także triterpeny i tiofeny. Uważa się, że bogate w ekdysteroidy ekstrakty i preparaty na bazie tej rośliny mają działanie wzmacniające organizm po wysiłku, zwiększające odporność na długotrwały stres, działają przeciwbakteryjnie, przeciwutleniająco oraz wykazują właściwości adaptogenów [2, 3, 5-11]. Rys.1. Uprawa Rhaponticum carthamoides. (Źródło: Fig. 1. Cultivation of Rhaponticum carthamoides (source: W Rhaponticum carthamoides, jak do tej pory, zidentyfikowano około 50 różnych ekdysteroidów [3]. Są one obecne w częściach podziemnych rośliny (korzenie i kłącza) oraz nadziemnych, zarówno wegetatywnych (łodygach, liściach), jak i generatywnych (kwiaty i nasiona). W zależności od pory roku oraz stadium rozwoju rośliny stężenia poszczególnych ekdysteroidów zmieniają się [12, 13]. Dotychczasowe badania dowiodły obecności ekdysteroidów w różnych partiach rośliny: korzeniach, liściach i nasionach na poziomie, odpowiednio: 0,04-0,81 %, 0,03-1,22 % i 0,27-1,51 % [3]. Do najważniejszych ekdysteroidów występujących w Rhaponticum carthamoides, zalicza się 20- hydroksyekdyson (Rysunek 2, 20E, spotykany również pod nazwą β-ekdyson, ekdysteron, polipodyna A), α- ekdyson oraz inokosteron [3]. Szczegółową budowę wszystkich jak dotąd odkrytych ekdysteroidów, w tym tych występujących w Rhaponticum cartamoides można znaleźć w literaturze [3, 14] oraz bazie The Ecdysone Handbook. Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

19 Techniki chromatografii w rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów 19 Rys. 2. Struktura chemiczna 20-hydroksyekdysonu z numeracją atomów węgla. Fig.2. Chemical structure of 20-hydroxyecdysone with the numeration of carbon atoms. 2. Struktura ekdysteroidów i jej wpływ na retencję (The chemical structure of ecdysteroids and its influence on retention) Ekdysteroidy należą do rodziny związków o bardzo zbliżonej budowie. Są to czteropierścieniowe steroidy, posiadające od 27 do 29 atomów węgla w cząsteczce. Wyjątki, powstałe w wyniku usunięcia łańcucha bocznego, to rubrosteron 19 atomów węgla oraz posteron 21 atomów węgla [3]. Cechą charakterystyczną ekdysteroidów jest grupa 7 -keto-6-enowa w pierścieniu B, będąca silnym chromoforem absorbującym fale o długości 242 nm [15], pierścienie A i B w pozycji cis, a także grupa hydroksylowa w pozycji 14 [16]. Numerację węgli w cząsteczce ekdysteroidów przedstawiono na rysunku 2. Są to związki o zróżnicowanej polarności, zawierające od 2 do 10 grup OH w swej strukturze. Posiadają łańcuch boczny, przyłączony w pozycji 17, który łatwo ulega modyfikacjom i reakcjom podczas syntezy i metabolizmu ekdysteroidów. Główne reakcje, jakim ulegają ekdysteroidy to reakcje hydroksylacji (najczęściej w pozycjach 5, 11, 25 lub 26), utleniania (np. w pozycji 26), reakcje tworzenia γ- i δ-laktonów (łańcuch boczny), alkilowania (rozgałęzienie łańcucha bocznego, w pozycji 24) oraz reakcje koniugacji, mające miejsce na sąsiadujących grupach hydroksylowych w pozycjach 2, 3 oraz 20, 22. Grupy hydroksylowe w tych pozycjach mają szczególne znaczenie w przypadku tworzenia się trwałych pochodnych powodując zmiany w polarności tych ekdysteroidów. Związki te spotykane są często w postaci pochodnych oraz konjugatów polarnych: glikozydów, siarczanów, fosforanów oraz niepolarnych: eterów, estrów, octanów i benzoesanów. Skutkuje to obecnością w roślinie związków o bardzo zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych, również często występujących w ilościach śladowych [3, 14, 16-18]. 3. Metodyki ekstrakcji lub ługowania ecdysteroidów z surowego bądź suszonego materiału roślinnego (Methods of ecdysteroids extraction from a dry of fresh plant material) Na podstawie badań przeprowadzonych do tej pory, wpływ na retencję ekdysteroidów w układzie NP jak i RP, ma nie tylko ilość grup OH w cząsteczce, ale przede wszystkim ich położenie. Dlatego też dodatkowa grupa -OH w rejonie o charakterze hydrofilowym (np. pozycje 1 lub 24) nie wpłynie znacząco na retencję w warunkach RP w przeciwieństwie do dodatkowej grupy OH obecnej w bardziej hydrofobowym rejonie cząsteczki (pozycje 11, 25 lub 26). Odwrotnie sytuacja przedstawia się dla warunków w normalnym układzie faz. Wyjątkiem jest grupa 5β-OH w polipodynie B, gdzie tworzy ona silne wiązanie wodorowe z grupą ketonową w pozycji 6 [19, 20] i retencja cząsteczki jest inna w badanych układach i warunkach rozdzielania, niż mogłoby się to wydawać z teoretycznych założeń. Reakcje utleniania, szczególnie w pozycji 3 oraz 22 wpływają na spadek polarności a co za tym idzie na spadek retencji ekdsteroidów w normalnym układzie faz. Może to powodować trudności w uzyskaniu pełnego rozdzielenia związków o takiej budowie. Na spadek retencji wzrost hydrofobowości ekdysteroidów w układach NP mają także wpływ podstawienia grupy alkilowej w pozycji 24, a także reakcje estryfikacji (acetylacji) w pozycjach 2 i 3 oraz 20, 22, co powoduje, że związki te jak np. 20-hydroksyekdyson 2, 3- monoacetonid lub 20-hydroksyekdyson 2, 3;20,22-diacetonid są trudne do rozdzielenia [19]. W odwróconych układach faz sytuacja w większości przypadków przedstawia się odmiennie niż w układach NP. W przypadku układów RP spadek polarności w wyniku np. utleniania grup OH do grup ketonowych w pozycji 3, przy zastosowaniu eluentów na bazie rozpuszczalnika o większej polarności (np. metanol) może powodować trudności w rozdzieleniu. Zmienia się to przy zastosowaniu mniej polarnych rozpuszczalników organicznych jak np. acetonitryl. Duży wpływ na retencję mają wszelkie rozgałęzienia łańcucha bocznego, szczególnie w pozycji 24. Skutkuje to wzrostem hydrofobowości ekdysteroidów i zwiększeniem ich retencji. Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku związków z grupami estrowymi oraz Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

20 20 J. Głazowska, M. Kamiński acetylowymi w pozycjach 2, 3, 20, 22. Związki wykazują znaczną retencję w odwróconych układach faz i ulegają lepszemu rozdzieleniu niż w przypadku normalnego układu faz [20]. 4. Modyfikacje strukturalne ekdysteroidów (The structural modifications of ecdysteroids) Píš i współpracownicy [17] zaproponowali szybką i skuteczną metodę oczyszczania ekstraktów alkoholowych ekdysteroidów za pomocą ekstrakcji do fazy stałej pochodnych kwasu fenyloboronowego. Reakcji z kwasem fenyloboronowym ulegają jedynie ekdysteroidy posiadające układ diolowy w łańcuchu bocznym, w pozycji 20, 22. Przykład takiej pochodnej przedstawia rysunek 3. Pierwotne formy ekdysteroidów można uzyskać w reakcji pochodnych z roztworem nadtlenku wodoru. Fenyloboroniany ekdysteroidów mogą być przygotowane w różnych rozpuszczalnikach, również zawierających wodę, co jest ważne w przypadku rozdzielania ich w odwróconych układach faz. Jest to szczególnie korzystne w przypadku badania próbek biologicznych. Dzięki modyfikacji, ekdysteroidy zmieniają swoje właściwości na bardziej hydrofobowe, dzięki czemu w układach typu RP wykazują większą retencję. Wzrost wydajności oczyszczania fenyloboronianów ecdysteroidów, można osiągnąć w wyniku zastosowania faz ruchomych bardziej polarnych i o niższej sile elucyjnej, w pierwszej kolejności, do wymycia ze złoża polarnych zanieczyszczeń obecnych w ekstraktach roślinnych, a następnie stosowania eluentów o większej sile elucyjnej do elucji ekdysteroidów ze złoża. Pozwala to na bardziej selektywne oczyszczenie natywnych ekdysteroidów. Dodatkową zaletą jest fakt, że wstępnie oczyszczone ekdysteroidy można w tej samej formie poddać rozdzielaniu w warunkach wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Istotną wadą procedury jest to, że reakcji ulegają jedynie ekdysteroidy posiadające układ diolowy w pozycji 20, 22. Wiele składników ekstraktów o inaczej zbudowanym łańcuchu bocznym nie może w ten sposób zostać selektywnie izolowanych. Rys.3. Struktura chemiczna 20,22-fenylo-20-hydroksyekdyson Fig. 3. Chemical structure of a 20,22-phenyl-20-hydroxyecdysone. 5. Metody chromatografii w rozdzielaniu i analityce ekdysteroidów (The chromatographic methods for separation and analysis of ecdysteroids) 5.1. Chromatografia cienkowarstwowa jedno- i dwuwymiarowa (Thin-layer chromatography in one-and two dimension) Chromatografia cienkowarstwowa jest efektywną techniką do rozdzielania ekdysteroidów. Rozdział odbywa się na płytkach aluminiowych lub szklanych, pokrytych żelem krzemionkowym w układach NP albo HILIC lub na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi (tzw. C18, układ RP) [21]. TLC należy do grupy nieskomplikowanych w wykonaniu, tanich i szybkich technik separacyjnych, a wykorzystywana jest przede wszystkim do określania odcisku palca, a także do kontroli procesu ekstrakcji. Opracowanych zostało wiele faz ruchomych zarówno dla normalnego jak i odwróconego układu faz [15], zapewniających rozdzielanie zarówno polarnych, średnio polarnych, a także niepolarnych ekdysteroidów. W analizie ekdysteroidów roślinnych, a w szczególności tych obecnych w Rhaponticum carthamoides, wykorzystuje się popularne mieszaniny rozpuszczalników organicznych (Tabela 1). W normalnych układach faz stosuje się eluenty na bazie organicznych rozpuszczalników takich jak: octanu etylu, dichlorometan, chloroform w połączeniu z alkoholami takimi jak metanol, etanol i izopropanol [15, 19, 22, 23]. W przypadku stosowania dodatku wody do fazy ruchomej, w ilości od 0,1-0,2 % mówimy już o chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC). W odwróconych układach faz, jako fazę ruchomą, stosuje się głównie mieszaninę metanolu i wody w różnych stosunkach objętościowych [15, 19, 22]. Obecnie możliwe jest wykorzystanie technik z użyciem nadciśnienia (OPTLC, HPTLC, FFPC), co znacznie skraca czas trwania rozdzielania na płytkach TLC [21], a Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

21 Techniki chromatografii w rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów 21 przede wszystkim umożliwia użycie płytek typu HPTLC, co zapewnia znacznie wyższą wartość tzw. pojemności względnej pików (węższe strefy rozdzielanych substancji). Technika ta charakteryzuje się krótkim czasem analizy, lepszą rozdzielczością niż w przypadku tradycyjnego TLC [22]. Rozdzielenie trudnych do separacji ekdysteroidów, takich jak np. ponasteron A i 2-deoksyekdyson, możliwe jest dzięki zastosowaniu modyfikacji kwasem boronowym ekdysteroidów zawierających układ 20, 22-diolowy w swojej cząsteczce, zarówno w układach TLC jak i HPLC. Możliwe jest to dzięki zmniejszeniu polarności cząsteczek poprzez modyfikację resztą kwasu boronowego [15, 17]. Do wykrywania ekdysteroidów na płytkach TLC wykorzystuje się techniki niespecyficzne dla danego związku, np.: absorpcję światła UV dla 254 i 366 nm [15, 22, 23], wygaszanie fluorescencji za pomocą płytek TLC typu F zawierających czynnik luminescencyjny (np. ZnSe), a także wywoływanie w oparach jodu [15, 21]. Do bardziej specyficznych metod, pozwalających na kolorystyczne rozróżnienie poszczególnych plamek, zaliczyć można rozpylanie mieszaniny waniliny lub kwasu siarkowego w 95 % etanolu, dające charakterystyczne zabarwienie plamkom ekdysteroidów, a także kwas siarkowy i amoniak w formie aerozolu [15, 19]. Ekdysteroidy z Rhaponticum carthamoides barwią się pod wpływem wyżej wymienionych czynników na kolor: od niebieskiego przez turkusowy, zielony, oliwkowy, szary, fioletowy do brązowego, pomarańczowego i żółtego. Lopenna i współpracownicy [23] poddali analizie estry etylowe ecdysteroidów, m. in. techniką TLC, uzyskując dobre rozdzielenie analogów 20E. W swoich badaniach zastosowali fazę ruchomą składającą się z chloroformu i metanolu w stosunku 7:1 (v/v) oraz fazy o niższym stężeniu metanolu bardziej odpowiednią dla rozdzielania 2,3- i/lub 20,22- dioli chronionych grupą acetylową. Tabela 1. Table 1. Zestawienie opisów literaturowych stosowanych warunków rozdzielania ekdysteroidów techniką TLC. A list of the TLC separation conditions of ecdysteroids. Tryb (Mode) Faza stała (The stationary phase) Faza ruchoma (v/v) (The mobile phase (v/v)) Detekcja (Detection) NP Żel krzemionkowy DCM:EtOH CHCl 3:MeOH: CO(CH 3) 2 85:15 6:2:1 Światło widzialne oraz UV (254 nm) 366 nm; Zastosowanie kwasu siarkowego DCM:96 % EtOH 96:4 CHCl 3:EtOH 9:1 RP C18 MeOH:H 2O 65:35 MeOH:H 2O 6:4 NP- HPTLC, FFPC Żel krzemionkowy 60 F 254 CHCl 3:MeOH 7:1 Detekcja przy długości fali 254 nm, zanurzenie płytki w 5% (w/v) p- 10:1 anizoaldehydzie i 5% (v/v) roztworze kwasu siarkowego w etanolu, podgrzewanie do 15:1 pojawienia się fioletowego, niebieskiego, 9:1 szarego lub zielonego zabarwienia 92,5:7,5 Literatura (References) [22] [22, 23] NP NP Żel krzemionkowy F 254 Żel krzemionkowy 85:15 DCM:96 % EtOH 8:2 Detekcja przy długości fali 254 nm [24, 25] CHCl 3:MeOH:Benzen 25:5:3 CHCl 3:95% EtOH CHCl 3:Pr-1-OH DCM: CO(CH 3) 2:MeOH 7:3 9:5 2:1:1 Detekcja przy długości fali 254 nm, oprócz zastosowania faz ruchomych z dodatkiem DCM; dla wszystkich faz MS DCM: CO(CH 3) 2:EtOH 16:4:5 AcOEt:EtOH 4:1 RP Merck C 18 MeOH:H 2O 1:1 Whatman C 18 HILIC Żel AcOEt:MeOH:25% NH 3 85:10:5 Światło widzialne oraz UV (254 nm) 366 nm krzemionkowy w H 2O przy zastosowaniu kwasu siarkowego AcOEt:96 % EtOH:H 2O 8:2:1 AcOEt:MeOH:H 2O 85:10:5 AcOEt:EtOH:H 2O 80:5:2 AcOEt:96 % EtOH:H 2O 16:2:1 DCM:MeOH:H 2O 79:15:1 Detekcja przy długości fali 254 nm, oprócz DCM:MeOH: 25 % NH 3 77:20:2: zastosowania faz ruchomych z dodatkiem w H 2O:H2O 1 DCM; dla wszystkich faz MS NP/ HILIC RP Żel krzemionkowy F 254 Żel krzemionkowy mod. C 18 F 254 AcOEt:96 % EtOH:H 2O 80:10:5 Światło widzialne oraz UV (254 nm) 366 nm Toluen: 100:140: przy zastosowaniu kwasu siarkowego z CO(CH 3) 2:96%EtOH:25 32:9 waniliną % NH 3 w H 2O THF:H 2O 45:55 MeOH:H 2O 55:45 [15] [22] [15] [24] Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

22 22 J. Głazowska, M. Kamiński 5.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnych układach faz (The Normal Phase High Performance Liquid Chromatography) Fazy stacjonarne W normalnych układach faz w chromatografii cieczowej ekdysteroidów wykorzystuje się jako fazy stacjonarne kolumny wypełnione żelem krzemionkowym niemodyfikowanym lub modyfikowanym polarnymi grupami, np. diol (DIOL), -poliol (n-ol), -aminopropylosilan, -aminowymi (NH 2 ) oraz nitrowymi (NO 2 ). Kolumny te stosuje się zarówno w analityce, jak i w semi-preparatywnym i preparatywnym rozdzielaniu ekdysteroidów z ekstraktów szczodraka krokoszowatego. Układ faz normalnych pozwala na rozdzielenie ekdysteroidów o zróżnicowanej polarności, od niepolarnych do polarnych [15, 26]. W przypadku kolumn z polarną fazą stacjonarną kolejność elucji ekdysteroidów nie zależy od rodzaju wypełnienia. Związane jest to z inną naturą oddziaływań jakie mają miejsce na powierzchni złoża pomiędzy grupami hydroksylowymi ekdysteroidów i żelu krzemionkowego. Istotną wadą stosowania żelu krzemionkowego jest jego powolna dezaktywacja w wyniku silnej adsorpcji na jego powierzchni śladowych ilości wody. Jednakże, jeżeli kolumna stosowana jest w tych warunkach w stałej temperaturze oraz jest zrównoważona z eluentem, problem dezaktywacji złoża nie powinien występować [15]. Szczegółowe zestawienie warunków rozdzielania chromatograficznego w normalnych układach faz oraz układach oddziaływań hydrofilowych przedstawia tabela 2. Tabela 2. Table 2. Zestawienie opisów literaturowych warunków rozdzielania ekdysteroidów w normalnych układach faz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (NP-HPLC) oraz chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC). A list of the NP-HPLC and HILIC separation conditions of ecdysteroids. Układ (Mode) HILIC Kolumna (The kolumn) Zorbax-Sil (DuPont), 250x4,6 mm Warunki Lucji (Elution conditions) Faza ruchoma (Mobile chase) DCM:2-PrOH:H 2O 125:30:2 DCM:2-PrOH:H 2O 125:40:3 lub 100:40:3 DCM:2-PrOH:H 2O 125:15:1 Program elucji (The elution program) Przepływ eluentu (The flow rate) Detekcja (Detection) Litera tura (References) Izokratyczna 1 ml/min 242 nm [15] Cykloheksan:2- PrOH:H 2O (100:40:3) NP Silasorb 600, 5 µm, 250x4 mm Apex II diol column, 5 µm, 150 4,6 mm (GRACE, Wilmington, DE, USA) n-heksan:etoh:h 2O 812:180:8 Eter dietylowy:acn:h 2O 880:102:18 DCM:2-PrOH:H 2O 84:15:1 A: MeOH B: DCM Izokratyczna Liniowy program elucji od 2 do 10% B w 20 min Liniowy program elucji od 4 do 10% B w 20 min 0,8 ml/min 1 ml/min MS [27] 242 i 300 nm [23] Fazy ruchome W normalnych układach faz preferowanymi składnikami eluentów stosowanymi w rozdzielaniu ekdysteroidów są dichlorometan i chloroform, modyfikowane alkoholami takimi jak metanol, etanol lub izopropanol. Stosuje się również inne rozpuszczalniki niepolarne do tworzenia eluentu takie jak, n-heksan czy cykloheksan lub eter dietylowy. Niestety te fazy charakteryzują się większą lepkością niż fazy na bazie wody, co powoduje powstawanie dużych oporów przepływu i w konsekwencji wysokie ciśnienie robocze, przy stosunkowo niskim przepływie eluentu. Stosowanie dichlorometanu oraz chloroformu jest niekorzystne również z innego powodu. Rozpuszczalnik te uniemożliwia detekcję ekdysteroidów za pomocą UV dla długości fali 235 i 245 nm, ponieważ absorbują UV w zakresie do 245 nm. Lapenna [23] zaproponował zastosowanie elucji gradientowej o malejącej sile elucyjnej (malejącej zawartości dichlorometanu w fazie ruchomej). Ma to szczególnie zastosowanie w rozdzielaniu związków Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

23 Techniki chromatografii w rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów 23 średnio i nisko polarnych, w tym przypadku ekdysteroidów zawierających grupy eterowe i estrowe w miejscu polarnych grup OH. Zastosowanie tego typu układu umożliwia rozdzielenie ekdysteroidów w zależności od ilości grup eterowych oraz możliwość ich rozdzielenia w przypadku bardzo niewielkich różnic w polarności. W rozdzielaniu ekdysteroidów w układzie faz normalnych stosowanie kolumn zrównoważonych z eluentami zawierającymi wodę korzystnie wpływa na ograniczenie ogonowania pików oraz poprawia symetrię pików. Jednocześnie należy mieć na uwadze, że nawet niewielkie, dodatkowe ilości wody np. w próbce, powodują powolną dezaktywację fazy stacjonarnej, co skutkuje zmianami w czasach retencji eluowanych pików. Według przeprowadzonych badań [15, 28], najbardziej odporną kolumną na zmienne zawartości wody w eluencie jest kolumna Zorbax-Sil. Zauważono, że w przypadku normalnych układów faz rodzaj wypełnienia kolumny oraz obecność wody w fazie ruchomej bądź próbce, nieznacznie wpływa na wartości czasów retencji ekdysteroidów. Obecnie technika wykorzystująca eluenty zawierające znaczne ilości wody (więcej niż 0,1 %) znana jest jako chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) Wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconych układach faz (The Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography) Fazy stacjonarne W chromatografii ekdysteroidów stosuje się typowe fazy stacjonarne o charakterze hydrofobowym, takie jak, żele krzemionkowe modyfikowane grupami C22, C18, C8, C6, a także grupami fenylowymi. Wypełnienia te charakteryzują się dużą uniwersalnością i możliwością rozdzielenia ekdysteroidów o bardzo szerokim spektrum właściwości fizykochemicznych i zróżnicowanej budowie, a także innych składników matrycy roślinnej. W przypadku ekdysteroidów różnorodność struktury wpływa na kolejność elucji poszczególnych związków. Dlatego istotne jest dobranie indywidualnie najkorzystniejszych warunków chromatograficznych w zależności od posiadanej kolumny i stosowanego układu [15, 20]. Szczegółowe przedstawienie omawianych warunków rozdzielania ecdysteroidów przedstawia tabela 3. Tabela 3. Table 3. Zestawienie opisów literaturowych warunków rozdzielania ekdysteroidów w odwróconych układach faz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC). A list of the RP-HPLC separation conditions of ecdysteroids. Kolumna (The column) Warunki elucji (The elution conditions) Faza ruchoma (The mobile phase) Program elucji (The elution program) Natężenie przepływu eluentu (The flow rate) Detekcja (Detection) Litera tura (Referenc es) Lichrospher 100 RP-18e, 250x4.6 mm, 5 μm (Merck, Niemcy) Spherisorb 5ODS2 (Biochrom), 250x4,6 mm C18 Phenomenex Sphereclone ODS2, 5µm, 150mm 4.60mm (Phenomenex, Macclesfield, UK) C6 Phenomenex Sphereclone, 5µm, 150mm 4.6mm (Phenomenex, Macclesfield, UK) Separon SGX C18, 5 µm, 250x4mm Sherisorb ODS-2 Symmetry C18, 150x3,9mm, 5 μm (Waters) Vol. 5, No 1/2013 ACN:H 2O 25:75 (+0.01% TFA) ACN:H 2O 23:77(+0.01% TFA) H 2O:MeOH 50:50 (0.01% TFA) H 2O:2-PrOH 82:18 (0.01% TFA) A: MeOH B: H 2O A: H 2O B: MeOH A: MeOH B: H 2O A:woda B:acetonitryl Izokratyczna 1 ml/min 246 nm [29] Izokratyczna 1 ml/min 242 nm [15, 21] Liniowy program elucji od 30 do 100% w 25 min Liniowy program elucji od 10 do 70% B w 50 min Liniowy program elucji od 30 do 100 % A w 30 min 100 % A 10 min 20-25% B w 0-20min 90% B w 20min 90% B w 20-30min Rekondycjonowanie kolumny 20% B przez 5min 1 ml/min 242 i 300 nm [23] 0,6 ml/min MS [27] 1 ml/min 242 nm [30] 0,7 ml/min 254 nm [31, 32] Camera Separatoria

24 24 J. Głazowska, M. Kamiński Fazy ruchome W układach faz odwróconych (RP) w rozdzielaniu ekdysteroidów najpopularniejszymi eluentami są mieszaniny metanol:woda oraz acetonitryl:woda. Te organiczne dodatki do eluentów stosowane są zarówno w elucji izokratycznej, jak i gradientowej [15, 21]. Stosowanie buforu, najczęściej mrówczanowego lub dodatku 0,01% kwasu trifluorooctowego w mieszaninie wody z acetonitrylem, pozwala na osiągnięcie pików o lepszym kształcie, a także znacznie polepsza rozdzielenie ekdysteroidów bardzo zbliżonej strukturze lub występujących w postaci zdysocjowanej lub glikozydowej. Wymienione eluenty są dość uniwersalne i nadają się do rozdzielania ekdysteroidów zarówno polarnych (jonowych i niejonowych), jak i średnio polarnych związków [15]. Retencja w odwróconych układach faz zależy przede wszystkim od ilości wolnych grup OH oraz struktury łańcucha bocznego. Obecność lub brak którejś z grupy OH również wpływa na kolejność elucji. Wraz z większą ich ilością zwiększa się polarność związku, a co za tym idzie zmniejsza się ich hydrofobowość i retencja. Szczególne znaczenie ma w tym przypadku grupy hydroksylowe w pozycji 11, 25 i 26, które znacznie wpływają na hydrofilowy charakter cząsteczki. Jednakże nie tylko to ma znaczący wpływ na stopień oddziaływań danej cząsteczki z fazą stacjonarną i ruchomą. Ważne są tu również oddziaływania steryczne oraz konformacja i układ przestrzenny cząsteczki pozycja aksjalna lub ekwatorialna grupy OH, czy grupa ta jest wolna czy oddziałuje z innymi grupami w cząsteczce. Niektóre ekdysteroidy posiadają łańcuch boczny (grupy metylowe lub etylowe w pozycji 24), który, o ile niepodstawiony, powoduje wzrost hydrofobowości cząsteczki i zwiększenie retencji, a podstawienie przynajmniej jedną grupą hydroksylową powoduje zmianę charakteru cząsteczki czyniąc ją znacznie bardziej polarną [19, 20, 28] Chromatografia gazowa (Gas Chromatography) Ekdysteroidy, jako bardzo polarne związki chemiczne są nielotne, a także termo labilne (najniższą temperaturę topnienia posiada kartamosteron: 170 C, [33]). Z tych względów nie mogą być w prosty sposób rozdzielane i oznaczane za pomocą chromatografii gazowej. Wykorzystanie tej techniki możliwe jest jedynie po przeprowadzeniu ekdysteroidów w ich lotne pochodne w wyniku derywatyzacji. Takimi pochodnymi stosowanymi w analizie GC są pochodne trimetylosililowe, zmniejszające polarność, zwiększające lotność oraz wytrzymałość pochodnych na wysoką temperaturę. Poważną wadą tej metody jest fakt, że ekdysteroidy mogą tworzyć podczas derywatyzacji pochodne o zróżnicowanej budowie, utrudniające satysfakcjonujące rozdzielenie otrzymanych pochodnych oraz jednoznaczną identyfikację [15, 28]. 6. Podsumowanie (Summary) Ekstrakty ekdysteroidów z Rhaponticum stanowią bardzo skomplikowaną mieszaninę związków chemicznych. Wiele z nich należy do grup o bardzo zbliżonej budowie i właściwościach, przez co uzyskanie pełnego rozdzielenia podczas jednej operacji chromatograficznej stanowi problem. Inne grupy związków chemicznych, obecnych w tkankach rośliny posiadające podobne właściwości tzn. polarność, hydrofobowość, mogą i w praktyce przeszkadzają w rozdzieleniu, identyfikacji i oznaczaniu ekdysteroidów, które są szczególnym przedmiotem zainteresowania. Stosowane dotychczas metodyki rozdzielania ekdysteroidów opierają sie głównie na jednowymiarowej chromatografii cieczowej z elucją izokratyczną albo gradientową. Nie eliminuje to, jednak, możliwości koelucji analogów strukturalnych ekdysteroidów oraz innych związków chemicznych o zbliżonych właściwościach. Jednym z rozwiązań tego problemu rozdzielczego jest tworzenie pochodnych ekdysteroidów, pozwalających, tak na bardziej selektywną ekstrakcję, jak i na selektywne rozdzielanie chromatograficzne. Nie wszystkie ekdysteroidy obecne w próbce można jednak w ten sposób rozdzielić i oznaczyć. Wilson ze współpracownikami [31, 32] zaproponował jednowymiarowe rozdzielenie w warunkach elucji gradientowej, z zastosowaniem odwróconych układów faz, równocześnie wykorzystując detektor UV oraz spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego do jednoczesnego określania struktury rozdzielanych ecdysteroidów. Technika chromatografii cienkowarstwowej (TLC) stanowi dobrą technikę wstępnego doboru warunków rozdzielania i kontroli efektywnej ekstrakcji/ługowania oraz wstępnej oceny składu frakcji. W przypadku techniki TLC należy zbadać rozdzielanie dwuwymiarowe oraz wielostopniowe, pozwalające na rozdzielenie wszystkich ekdysteroidów, a także innych składników obecnych w ekstrakcie podczas jednej operacji rozdzielczej. Najkorzystniejsze warunki rozdzielania ekdysteroidów, z zastosowaniem TLC zaproponowała Báthori [24] zarówno w warunkach normalnych jak i odwróconych układów faz. Zaproponowała warunki dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej pozwalające na rozdzielenie kilkunastu ekdysteroidów obecnych w badanych ekstraktach roślinnych. Optymalnym rozwiązaniem wydaje się opracowanie metodyki opartej o wielowymiarowe oraz wielostopniowe rozdzielanie ekdysteroidów, dwu- lub wyżej wymiarowe (HPLC oraz UPLC), ze względu na zwiększona wydajność i rozdzielczość tychże układów. W szczególności zastosowanie elucji gradientowej, Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

25 Techniki chromatografii w rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów 25 również jako dwuwymiarowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej, do rozdzielania i oznaczania bogatych w ekdysteroidy ekstraktów, wydaje się być bardziej celowe ze względu na zwiększoną sprawność i selektywność tych układów w porównaniu do układów izokratycznych. Dalsze prace badawcze powinny być skoncentrowane na rozdzielaniu i oznaczaniu ekdysteroidów w ekstraktach Rhaponticum carthamoides, oraz innych roślin zawierających te metabolity. Literatura (References) 1. Lotocka B., Geszprych A., Anatomy of the vegetative organs and secretory structures of Rhaponticum carthamoides (Asteraceae). Bot. J. Linn. Soc., 144 (2004) 207., 2. Timofeev N.P., Leuzea carthamoides DC.: Application prospects as pharmpreparations and biologically active components. Functional Foods for Chronic Diseases, D&A Inc , 3. Kokoska L., Janovska D., Chemistry and pharmacology of Rhaponticum carthamoides: A review. Phytochemistry 70 (2009) 842., 4. Zhang X.-P., Zhang J., Dong M., Zhang M.-L., Hou C.-H., Shi Q.-W., Gu Y.-C., Chemical constituents of plant from the genus Rhaponticum. Chem Biodivers 7 (2010) 594., 5. Janovská D. Klouček P., Urban J., Vaněk T., Rada V., Kokoška L. Susceptibility of some clinical isolates of Staphylococcus aureus to fractions from the aerial parts of Leuzea carthamoides. Biologia 63 (2008) 607., 6. Le Bizec B., Antignac J.-P., Monteau F., Andre F. Ecdysteroids: one potential new anabolic family in breeding animals. Anal Chim Acta 473 (2002) 89., 7. Miliauskas G., Venskutonis R.P., van Beek T.A. Screening of radical scavenging activity of some medicinaland aromatic plant extracts. Food Chem 85 (2004) 231., 8. Miliauskas G., van Beek T.A., de Waard P., Venskutonis R.P., Sudhölter E.J.R. Identification of radical Scavenging Compounds in Rhaponticum carthamoides by means of LC-DAD-SPE-NMR. J Nat Prod 68 (2005)168., 9. Todorov I.N., Mitrokhin Yu.I., Efremova O.I., Sidorenko L.I. Effect of Extract from Rhaponticum carthamoides on RNA and Protein Biosynthesis in Mice. Pharm Chem J-USSR 34 (2000) 479., 10. Biskup E., Lojkowska E., Evaluation of biological activities of Rhaponticum carthamoides extracts. J Med Plants Res 3 (2009) 1092., 11. Biskup E., Szynklarz B., Golebiowski M., Borsuk K., Stepnowski P., Lojkowska E., Composition and biological activity of Rhaponticum carthamoides extracts obtained from plants collected in Poland and Russia. J Med Plants Res 11 (2013) 687., 12. Adler J.H., Grebenok R.J., Biosynthesis and distribution of Insect-molting hormones in plants A review. Lipids 30 (1995) 257., 13. Timofeev N.P., Ecological relations of agricultural populations of ecdysteroid-containing plants Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin and Serratula coronata L. with herbivorous insects Report 2.Composition variability of phytoecdysteroids in agrocenoses and their role in the vulnerability of plants to phytophagans. Contemp Probl Ecol 2 (2009) 531., 14. Baltaev U.A. Phytoecdysteroids: structure, sources, and biosynthesis in plants. Russ J Bioorg Chem 26 (2000) 799., 15. Lafont R., Blais C., Harmatha J., Wilson I.D., Ecdysteroids: Chromatography.w: Encyclopedia of Separation Science (2000) 2631., 16. Adler H., Grebenok R. J., Occurrence, Biosynthesis, and Putative Role of Ecdysteroids in Plants, Crit Rev Biochem Mol 34 (1999) 253., 17. Píš J., Hykl J., Vaisar T., Harmatha J., Rapid determination of 20-hydroxyecdysteroids in complex mixtures by solid-phase extraction and mass spectrometry. J Chromatogr A 658 (1994) 77., 18. Báthori M., Pongracz Z., Phytoecdysteroids From Isolation to Their Effects on Humans. Curr Med Chem 12 (2005) 153., 19. Lafont R., Kaouadji N., Morgan E.D., Wilson I.D., Selectivity in the high-performance liquid chromatography of ecdysteroids. J Chromatogr A 658 (1994) 55., 20. Wilson I.D., Bielby C.R., Morgan E.D., Selective effects of mobile and stationary phases in reversedphase high-performance liquid chromatography of ecdysteroids. J Chromatogr A 238 (1982) 97., 21. Dinan L., Harmatha J., Lafont R. Chromatographic procedures for the isolation of plant steroids. J Chromatogr A 935 (2001) 105., 22. Báthori M., Purification and characterization of plant ecdysteroids of Silene species. Trends Anal. Chem 17 (1998) 372., 23. Lapenna S., Dinan L., HPLC and TLC characterisation of ecdysteroid alkyl ethers. J Chromatogr B 877 (2009) Báthori M., Blunden G., Kalasz H., Two-Dimentional Thin-Layer Chromatography of Plant Ecdysteroids. Chromatographia 52 (2000) 815., Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

26 26 J. Głazowska, M. Kamiński 25. Báthori M., Mathe I., Guttman A., Determination of 20-hydroxyecdysone content by TLC and Micellar electrokinetic chromatography. Chromatographia 48 (1998) 145., 26. Meng Y., Whiting P., Zibareva L., Bertho G., Girault J.-P., Lafont R., Dinan L., Identification and quantitative analysis of the phytoecdysteroids in Silene species (Caryophyllaceae) by high-performance liguid chromatography. Novel ecdysteroids from S. pseudotites. J Chromatogr A 935 (2001) 309., 27. Buděšínský M., Vokáč K., Harmatha J., Cvačka J. Additional minor ecdysteroid components of Leuzea carthamoides. Steroids 73 (2008), 502., 28. Lafont R., Morgan E.D., Wilson I.D. Chromatographic procedures for phytoecdysteroids. J Chromatogr A 658 (1994) 31., 29. Ghosh D., Laddha K.S., Extraction and monitoring of phytoecdysteroids trought HPLC. J Chromatogr Sci 44 (2006) 22., 30. Volodin V., Chadin I., Whiting P., Dinan L. Screening plants of European North-East Russia for ecdysteroids. Biochem Syst Ecol 30 (2002) 525., 31. Wilson I.D., Morgan E.D., Lafont R., Wright B., High-performance liquid chromatography coupled to nuclear magnetic resonance spectroscopy: Application to the ecdysteroids of Silene otites. J Chromatogr A 799 (1998) 333., 32. Wilson I.D., Morgan E.D., Lafont R., Shockcor J.P., Lindon J.C., Nicholson J.K., Wright B., High Performance Liquid Chromatography Coupled to Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy and Mass Spectrometry Applied to Plant Products: Identification of Ecdysteroids from Silene otites. Chromatographia 49 (1999) 374., 33. Ramazanov N.Sh., Maksimov E.S., Saatov Z., Abdullaev N.D., Phytoecdysteroids of plants of the genus Rhaponticum II. Carthamosterone A from Rh. carthamoides. Chem Nat Compd 33 (1997) 301. Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

27 CAMERA SEPARATORIA Volume 5, Number 1 / January 2013, Henryk LAMPARCZYK 1*, Aleksandra CHMIELEWSKA 1, Paweł K. ZARZYCKI 2 1 Department of Pharmaceutical Chemistry, Medical University of Gdańsk, Faculty of Pharmacy, Hallera 107, Gdańsk, Poland addresses: chmola@gumed.edu.pl 2 Section of Toxicology and Bioanalytics, Faculty of Civil Engineering, Environmental and Geodetic Sciences, Koszalin University of Technology Sniadeckich 2, Koszalin, Poland pkzarz@wp.pl or pawel_k_z@hotmail.com *Professor Lamparczyk regrettably deceased in November 16, Krótki przegląd zastosowań cyklodekstryn dotyczący analiz farmaceutycznych, biomedycznych oraz środowiskowych Streszczenie: Przedstawiona praca jest ostatnim projektem naukowym nad jakim pracował Profesor Henryk Lamparczyk, który przedwcześnie zmarł 16 listopada 2012 roku w wieku 65 lat. Przeglądowa praca o charakterze dydaktyczno-poglądowym dotyczy zastosowania cyklodekstryn w bioanalityce i została napisana w oparciu o prace opublikowane przez Profesora i współpracowników. Niniejsza wersja bazuje na artykule pt. Natural cyclodextrins: development in theory, chromatography and pharmacy, A. Chmielewska, H. Lamparczyk; opublikowanej w materiałach Supramolecular Chemistry and Advanced Materials. Wojciech Macyk & Konrad Szaciłowski, Editors, Kraków Jagielonian University 2007, pages i jest rozszerzona o wiadomości przedstawione w najnowszych publikacjach dotyczących zastosowania cyklodekstryn w HPLC, głównie do oznaczeń sterydów i analiz przesiewowych próbek środowiskowych. Słowa kluczowe: Cyklodekstryny, chromatografia gazowa, wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia cienkowarstwowa, zależność struktura-retencja, sterydy, próbki biologiczne i środowiskowe, efekty temperaturowe, kompleksy inkluzyjne. Short review of cyclodextrins applications in separation science focusing on pharmaceutical, biomedical and environmental analisys Abstract: This is the last research project of Professor Henryk Lamparczyk that prematurely passed away at age 65. In his intention it was to prepare a demonstrative review paper concerning application of cyclodextrins in bioanalysis, based on his and co-worker contributions to the field of supramolecular chemistry. This version of paper is based on the manuscript entitled Natural cyclodextrins: development in theory, chromatography and pharmacy, A. Chmielewska, H. Lamparczyk; that was published in Supramolecular Chemistry and Advanced Materials. Wojciech Macyk & Konrad Szaciłowski, Editors, Kraków Jagielonian University 2007, pages and now is extended for the latest papers concerning HPLC application of cyclodextrins for steroids analysis and environmental samples screening. The main tools applied in described investigations were various chromatographic techniques such as gas chromatography (GC), high performance liquid chromatography (HPLC) and thin-layer chromatography (TLC). Topics such as structure-retention relationships, equilibrium constants between cyclodextrins (CDs) and guest molecules, thermodynamics and CDs separations were discussed. Additionally few examples of practical applications of CDs in pharmacy as well as biomedical and environmental analysis are given. Key words: Cyclodextrins, gas chromatography, high-performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, structure-retention relationships, steroids, biological and environmental samples, temperature effects, inclusion complexes.

28 28 H. Lamparczyk, A. Chmielewska, P.K. Zarzycki 1. Introduction Natural cyclodextrins (CDs) were discovered and described by Villiers in The natural CDs are produced from starch by the action of cyclodextrin glucosyltransferase, an enzyme present in several organisms, Bacillus macerans being the earliest source. Cyclodextrins are toroidal-sharped cyclic oligomers of -1,4-D-glucopyranose unit. The three most commonly employed natural cyclodextrins contain six seven and eight glucopyranose units and are denoted as -CD, -CD and -CD respectively. Native cyclodextrin consisting of nine units is called -CD. The dimensions of the cyclodextrin cavity increase with the number of glucose units in the ring, while the height of the cavity is the same for all three types. Internal dimensions of cavities are , and in -CD, -CD and -CD respectively. The ability of a cyclodextrin to form an inclusion complex with guest molecule is a function of two key factors. The first is steric and depends on relative size of the cyclodextrin to the size of guest molecule. If the guest is the wrong size, it will not to fit properly into the cyclodextrin cavity. The second critical factor is the thermodynamic interactions between the different components of the system CD-guest-solvent. For a complex to form, there must be a favourable net energetic driving force that pulls the guest into cyclodextrin. The aqueous solubilities of - and -CD at 25 C are and M respectively, whereas that of -CD is roughly a factor less, i.e M. The interior of CD cavities is relatively hydrophobic. It is formed by a circular configuration of hydrogen atoms and glucoside oxygen atoms, while all the hydroxyl groups are outside of the molecule. Therefore CD s and their inclusion complexes, even with nonpolar organic compounds are quite soluble in water. The CD complexation process is highly stereoselective. 2. Discussion on results included in our former works 2.1. Structure retention study In supramolecular chemistry the binding forces are determined by electrostatic interactions, molecular geometry, and hydrogen bonds. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are good model compounds to study these effects using chromatographic techniques. The electrostatic interactions (van der Waals) my be devided into three groups: the orientation interactions (Keesom), the inductive interactions (Debey) and the dispersive interations (London). When the solutes are nonpolar, like PAH, and their ionization potentials are nearly identical, the operating interactions should be inductive and dispersive. Under these circumstances the molecular polarizability ( ) of the solute appears to be the most important factor governing the retention order [1,2]. The second factor should be geometry of the solute molecules The molecular geometry was expressed by the shape parameter ( ). Mention above parameters were used to study the relationships between chromatographic retention data and structures of selected PAH [3,4] using GC technique with -CD bonded to stationary phase and cyclodextrin modified mobile phase in the case of HPLC. In both systems this idea was fully confirmed by regression equations and moreover by the elution order of solutes. Slightly different attempt was applied in structure-retention study of eight isomeric dimethylnaphtalenes [5]. On the basis of GC and HPLC retention data stability constants of the inclusion complexes with - and -CDs were calculated. All complexes under investigation were of moderate stability, except the complex of 1,8-dimethylnaphthalene with -CD. Remarkable 1,8-dimethylnaphthalene is the most compact molecule among investigated compounds Temperature effect and thermodynamics Methanol and acetonitrile are commonly used as organic components of the mobile phases for a number of prepurification and separation techniques, including liquid or solid phase extraction and capillary electrophoresis as well as planar and column chromatography. Particularly, temperature-dependent inclusion chromatography requires the presence of macrocyclic additives in mobile phases, especially those that are not retarded by the stationary-phase components [6]. As it was mentioned above, the solubility of native cyclodextrins in binary organic/water mixtures is very complex and usually non-linear. For most of the isocratic separations that involve cyclodextrin additives, the concentration of water should be as high as possible to allow good solubility of such macrocycles in the mobile phases. Therefore, a concentration of organic liquids that is close to the mole fraction of Xs = 0.16 is often used. Our experimental data confirmed that under elevated temperature conditions β-cyclodextrin is almost three-times more soluble in acetonitrile/water than a methanol/water mixture [7]. At sub-zero temperature the change in solubility between both phases is more evident. Under such conditions β-cyclodextrin is almost 5-times more soluble in acetonitrile/water than in a methanol/water mixture (1.6 and 7.9 mm, respectively). Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

29 Krótki przegląd zastosowań cyklodekstryn dotyczący 29 Therefore, the effective application of β-cyclodextrin as a modifier of mobile phases based on methanol/water mixtures at sub-ambient temperature may be strongly limited. It is noteworthy that the HPBCD derivative is at least two factors more soluble than native β-cd under all of the conditions investigated. In order to demonstrate experimentally the temperature effect not any sophisticated equipment is required [8]. It is well known phenolphthalein in alkaline medium is purple coloured (reference solution). The colour diminishes when phenolphthalein is incorporated into the cavity of or -CD (thermochromic solution). In iced water the thermochromic solution due to high stability constant of the inclusion complex is colourless, whereas the reference solution is purple coloured. When the temperature was raised to 40ºC the thermochromic solution became pale purple. In 70ºC water bath the colour intensity of both solutions is identical. After moving the coloured thermochromic solution to iced water the colour will disappear. This can be explained because the complexation processes occurring in solution is reversible and hysteresis phenomena is not observed. In the next work the equilibrium constants of -CD-phenolphthalein complex in wide range of temperatures (10 to 70 C) and -CD/phenolphthalein ratios (from 0.8:1 to 427:1) was studied spectroscopically [9]. Additionally, the competitive effect of tetrahydrofuran, solvent commonly used in HPLC and TLC was also examined. The stoichiometric proportion and binding constants (K 11 ) were calculated using Scott s equation. The stoichiometric ratio of investigated complex was 1:1, the K 11 values ranged from 0.26 x 10 4 M -1 (70 C) to 7.44 x 10 4 M -1 (10 C). Strong competition at the binding site between phenolphthalein and tetrahydrofuran was observed. On the basis of this observation it can be now easily explained, that relatively high concentration of CD is needed, when tetrahydrofuran-water binary system is used in chromatography. The formation of inclusion complexes between dyes and cyclodextrins has proven to be an excellent model system for studying the nature of noncovalent binding forces in water based solutions. This phenomenon was widely applied to indirect post-column detection of macrocycles in chromatographic methods as well as measurement of association constant of low molecular mass compounds. Recently, we explored the host-guest complex formation between selected bile acids (dehydrocholic, cholic, deoxycholic, taurodeoxycholic, glycodeoxycholic, glycocholic and chenodeoxycholic acid) and cyclodextrins (β-cyclodextrin and its hydroxypropyl derivative) at sub-ambient and elevated temperature, using as a probe the phenolphthalein-cyclodextrin inclusion complex detected via UV-Vis spectrophotometry [10]. In order to explore the general trends in the complexation ability of the bile acids by macrocycles investigated, the quantitative data set containing ΔAU values was analyzed by principal component analysis (PCA). It has been found that within investigated bile acids group the strongest interaction with cyclodextrins was observed for chenodeoxycholic acid at subambient temperature. Such behaviour can be explained by lack of keto or hydroxyl groups linked to C12 carbon atom in the steroid structure. The results of chemometric investigation indicate that under particular conditions an effective inclusion complex formation may improve chromatographic separation of bile acids, especially those that are difficult to separate using unmodified with macrocycles mobile phases. Generally, in classical chromatography solute retention is inversely related to temperature and is known as van t Hoff plot which is linear. Nevertheless any reversible process which alters the enthalpy or entropy of adsorption in principle give rise to nonlinear dependency. For example presence of multiple types of retention mechanisms or multiple types of binding sites leads to non-linearity of the van t Hoff plots. In the subsequent work [11] the influence of CD modified mobile phases on thermodynamic parameters and multiple separation was studied. Investigated compounds; estriol, 17 -estradiol, 17 estradiol, d-equilenin, equilin and estrone, belong to the group of female sexual hormones. However estriol, estrone and 17 -estradiol are human hormones, while d-equilenin and equilin are horse hormones both groups were applied in human medication. When unmodified mobile phase was used the van t Hoff plots are linear for all steroids and the retention times are very long. Modification of mobile phase with -CD produce deviation from the linearity, particularly in low temperature region, moreover the retention time is shorter. At subambient temperature region the selectivity of the chromatographic systems is greatly improved even for very complex multiple separations. Similar results were obtained when prednisone, cortisone, testosterone, 17 -methyltestosterone and 17 -hydroxyprogesterone were used as a model compounds [12]. The best separation in the shortest retention time of the last solute was achieved when phase modified with 16 mm - CD at 5 C was applied. We observed that in liquid chromatographic systems modified by macrocycles a decrease of retention is followed by an increase of solute complexation by inclusion modifier of the mobile phase [6,12,13]. This behaviour can be explained by assuming that the retention of cyclodextrin is considerably lower than the retention of solutes chromatographed and the predominating mechanism for retention is the formation of guest-cyclodextrin complexes in the mobile phase. Our experimental data indicated that at the wide range of temperatures investigated the retention of -cyclodextrin is significantly lower than the retention of the steroids chromatographed using an unmodified mobile phase [6]. The results seem to indicate that retention of inclusion complexes can be varied between two lines formed by the van t Hoff plot of the cyclodextrin and van t Hoff plot of the uncomplexed steroid. Additionally, in the low temperature region the inclusion modifier Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

30 30 H. Lamparczyk, A. Chmielewska, P.K. Zarzycki action is more efficient due to high values of the binding constant of the complexes created and large differences in retention of -cyclodextrin and uncomplexed solutes. In our further study we explored the capability of native α-, β- and γ-cyclodextrin as well as their hydroxypropyl derivatives for host-guest interaction in different temperatures with 7,8-dimethoxyflavone, selected steroids (estetrol, estriol, estradiol, estrone, testosterone, cortisone, hydrocortisone, progesterone and 17α-hydroxyprogesterone) and polycyclic aromatic hydrocarbons (toluene, naphthalene, 1,8- dimethylnaphthalene, 1-acenaphthenol, acenaphthylene and acenaphthene) under reversed-phase liquidchromatography conditions [14]. The study has revealed that native cyclodextrins interact more efficiently with the analytes investigated than do their hydroxypropyl counterparts. In the low-temperature region, enormously high ratios were observed for polycyclic aromatic hydrocarbons, particularly 1,8- dimethylnaphthalene, acenaphthene and acenaphthylene chromatographed on a β-cyclodextrin-modified mobile phase. In such a case, the retention times of the polycyclic aromatic hydrocarbons were strongly reduced and were close to the hold-up time of the high-performance liquid chromatography (HPLC) system. Experimental data revealed that mobile phases modified with native β-cyclodextrin and γ-cyclodextrin have ability for chiral separation of acenaphthenol optical isomers. At subambient temperature the peak of the mixture of enantiomers was broadened and split (Rs = 0.02 and 0.73 for γ-cyclodextrin and β-cyclodextrin modified eluents, respectively). Baseline separation of acenaphthenol enantiomers (Rs = 1.62; α = 1.14) under the same temperature and mobile-phase conditions was observed by applying a 15-cm column filled with Develosil ODS-UG-5 stationary phase. Circular dichroism spectra derived from the extracted fractions of pure enantiomers indicated that the (-) isomer was eluted first. Within the steroids group investigated, strong interaction was observed for estradiol and testosterone. The results of cluster analysis indicate that β- cyclodextrin as well as γ-cyclodextrin and its hydroxypropyl derivative can be most effective mobile-phase additives under reversed phase HPLC conditions for 3D-shape-recognition-driven separation, performed at subambient and elevated temperatures, respectively. It is noteworthy that irrespective of the temperature and macrocyclic modifier type, no significant interaction was observed for 7,8-dimethoxyflavone. Taking into account the 3D structures of the analytes it is clear that 7,8-dimethoxyflavone is less compact than steroids having similar molecular mass. Therefore, such compounds cannot enter the internal cavity of the macrocycles and form stable host-guest complex. The results of our study clearly show the key role of temperature in chromatographic separation, which is driven by native cyclodextrins and their hydroxypropyl derivatives used as the mobile phase additives. For a given concentration of macrocycles in the eluent, most effective host-guest complexation of analytes performed at subambient and elevated temperature was observed for β-cyclodextrin as well as γ- cyclodextrin and its hydroxypropyl derivative, respectively. Such macrocycles should be considered as the first choice mobile-phase additives for separation of low molecular mass compounds via temperaturedependent inclusion chromatography Chromatographic properties of cyclodextrins and macrocyclic antibiotics In particular cases conventional planar chromatography can actually provide more effective and robust systems than column chromatography. This is the case of retention measurements of CDs and other macrocycles. Although, HPLC technique were formerly used this technique has a number of disadvantages for such purposes. Since CDs show almost no UV absorption, universal detectors of low sensitivity such as refractive index or light scattering detector must be used. This requires overload injections which resulting enormous adsorption effect, strongly influencing the retention measurements. Furthermore, the mobile phase composition which can be investigated is strictly restricted because under extreme conditions the retention time is too long or the solute does not elute from the column. Considering these disadvantages, TLC seems to be the method of choice. It is well know that the aqueous solubilities of - and -CDs are ten time higher than -CD. The solubility behaviour in binary mixtures commonly used as mobile phases in chromatography is even more complicated. Moreover, in real chromatographic systems the influence of stationary phases cannot be neglected. Therefore, a detailed knowledge of macrocycles behaviour in chromatographic systems is of great importance because it supports the theoretical basis of chiral separations and relates to other industrial applications of CDs. In the first two works [15,16] of this cycle the retention behaviour of -, - and -CDs has been examined using RP-18W [15] and polyamide [16] plates as stationary phases. Six binnary solvent mixtures (acetonirile-water, methanol-acetonitrile, methanol-water, ethanol-water, propanol-water, and tetrahydrofuran-water) in wide rage concentrations 0-100% v/v were used as mobile phases. The retention behaviour of CDs in both systems is difficult to rationalise. Generally, the separation of CDs on polyamide phase is worse than on RP-18W [16]. On RP-18W phase [15] the most hydrophobic -CD migrates last when methanol-water and ethanol-water are used as mobile phases. In propanol-water the elution behaviour of all the cyclodextrin considered is similar, whereas in tetrahydrofuran-water mixtures the CDs again behave Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

31 Krótki przegląd zastosowań cyklodekstryn dotyczący 31 differently. At very low concentrations of tetrahydrofuran -CD migrates furthest whereas at high tetrahydrofuran concentration its migration is lowest. It is noteworthy that in contrast with reversed-phase chromatography, the order of elution of CDs on polyamide plates corresponds to the order of their molecular weights [16]. Hence, the shortest migration distance was observed for -CD and the longest for -CD. This contradicts commonly accepted idea that the retention of structurally similar compounds is determined by their solubility in mobile phase, i.e. retention decreases as the solubility increases. According to this concept the elution order should be -, - and -CD, this is not observed, therefore it can be concluded that the solubilities of CDs cannot be directly related to retention data. In the subsequent works temperature controlled chromatographic chambers were applied. Problem of chambers construction is discussed in details in work [17]. Thermostated TLC was used to study the retention behaviour of -, - and -CDs on RP-18W reversible stationary phase [18]. As mobile phases, a homologous series of n-alcohols from ethanol to butanol, and their mixtures with water were investigated. Chromatographic experiments were performed either at constant 30 C temperature and over wide range of binary mixtures (0-100%, v/v), for ethanol and propanol, as well as at fixed mobile phase composition and different temperatures from 5 C to 60 C. Using isoelution binary mobile phases, the effect of temperature on retention of CDs was examined. Thermodynamic parameters such as the change of ethalpy ( H ) and the change of entropy ( S ) were estimated. In each case the sign of the calculated parameters is negative. Nonlinear van t Hoff plots were observed when propanol or butanol was used as a component of binary mobile phase. Most recently, we demonstrated that native β-cyclodextrin and its methyl, dimethyl as well as trimethyl derivatives can be effectively separated under isocratic temperature controlled micro-tlc conditions. Fast separation was performed using simple binary mobile phase consisted of 50% (v/v) acetonitrile:water and RP18W HPTLC plates chromatographed inside horizontal micro-chamber [19]. In other work [20] the mobile phase system was restricted to methanol-water from 0 to 100% v/v binary compositions but two additional solutes were added i.e. rifamycyn and rifampicin. Both solutes belongs to the group of macrocyclic antibiotics. They are frequently used in human medicine, particularly in case of tuberculosis. It was observed that temperature changes produce significant differences in migration of the investigated compounds. Generally, the plots of the rate mobility factor (R M ) versus the reciprocal of the absolute temperature are linear. From these plots thermodynamic parameters were calculated. In each case the sign of ( H ) and the ( S ) is negative. However, the magnitudes of ( H ) and the ( S ) indicate significant thermodynamic differences between two groups of solutes, one of which includes - and -CDs and the other which includes macrocyclic antibiotics and -CD. From the practical point of view, when the macrocycles are choosing as a candidate for mobile phase additives, theirs retardation factor (R F ) should be equal unity. The most adsorbed solute is rifampicin for which the R F value never reaches unity. On the other hand, rifampicin might be the best candidate for physical immobilization on the support and therefore serve as stationary phase modifier Examples of application in pharmacy Living organisms are largely constructed from chiral compounds. Therefore, in such a highly chiral environment it should not be surprising that some drugs, which possess an asymmetric centre, exhibit a high degree of stereoselectivity in their interactions with various enzymatic systems and also with receptor. Moreover, most of the enantiomers should be considered as a separate active substances. Norgestrel [( )13 -ethyl-17-hydroxy-18,19-dinor-17 -pregn-4-en-20-yn-3-one] belongs to the group of synthetic progestagenes. It is frequently used as a component of various oral contraceptive pills. Enantiomers of this compound have different intrinsic pharmacological activity. Currently norgestrel is manufactured as separate enantiomer named levonorgestrel. Therefore, method suitable for checking optical purity is very important. In the proposed method [21] mobile phase modified with -CD and temperature controlled HPLC were used. The base line separation of two enantiomers was achieved at 0 C using acetonitrile-water (25:75 v/v) modified by the addition of 14 mm -CD. On a molecular level, enantioselectivity in this temperature can probably be interpreted as being due to slower rotation of the guest and host molecules and hence a steric fit is possible. Semi-natural mixtures of menthol, - and -pinene, borneol,, camphene, cineol and menthone have choleretic, spasmolytic, and bacteriostatic properties. Disolved in oliva oil they are used to treat cholesterol stones in the gall bladder and the bile ducts as well as in the treatment of patients with uretic stones. The enzymatic mechanism of terpene action suggest that the enantiomeric composition of the drug might be an important factor determining its therapeutic properties. Despite this fact in commercially available preparations the enantiomeric composition is not standardised and controlled. They are usually described as a mixture of six terpenes in which even the - and - pinenes are not discriminated. The enantiomeric composition of five commercially available drugs i.e. Terpichol, Terpinex, Rowachol, Rowatinex and Uroterp, were studied using a GC system with -CD [22]. It was found that, depending on the manufacturer, drugs Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

32 32 H. Lamparczyk, A. Chmielewska, P.K. Zarzycki possessing similar chemical compositions differ considerably from one to another regarding the content of enantiomers. In biomedical analysis solution of two problems is substantial. Firstly, the compounds of interest should be separated from biological matrix and secondly, the detection of usually small amount of active substance should be as high as possible. In solution of these problems CDs might be very useful. The fluorescence spectra of anethole and eugenol, compounds commonly present in essential oils, dissolved in methanol-water binary systems with the addition of - and -CD were studied [23]. In both cases, anethole and eugenol, detection limits were improved after addition of cyclodextrins. This phenomenon can be applied for improvement of both direct fluorescence and HPLC assays. Estrogens are of clinical and analytical interest for many reasons. Biochemical studies have demonstrated that there are characteristic changes in the concentration of estradiol in both plasma and urine during the menstrual cycle. Most of these studies indicated that defined changes of urinary estrogens might be used as chemical indices to locate the start and finish of fertile period. The level of estrogens should be also controlled in menopausal and postmenopausal woman specially when hormone replacement therapy is applied. During pregnancy, estrogens urinary concentration in patients with gestosis is lower than those in normal pregnant subjects. Hence, a simple procedure for simultaneous determination of 17 -estradiol, estriol and estrone in human urine was elaborated [24]. After acid hydrolysis of the sulphate and glucoronide conjugates, estrogens were extracted into diethyl ether and after concentration applied directly to an HPLC column. Using acetonitrile-water (25:75 v/v) modified by the addition -CD as mobile phase, the separation of estrogens was achieved within 20 minutes. Estrogens were detected using spectrofluorimetric detector ( exc = 280 nm, em = 312nm). In this case -CD plays double role, improving separation and detection. Described method was fully validated and applied practically for measurements of estrogens level in nonpregnant and pregnant women Application of temperature-dependent inclusion chromatography for metabolomic investigation involving biological and environmental samples Clinical and metabolomic investigations of complex human fluids require cost-effective methodologies that can rapidly assess the whole steroid hormone pattern of individual samples. We optimised the solidphase extraction protocol for the extraction of a range of steroids of varied polarity from estetrol to progesterone from human plasma [25]. In this paper, we also improved the separation methodology of our previous work using isocratic elution with a mobile phase composed of 35% acetonitrile and 12 mm of - cyclodextrin at 29ºC. Under these conditions most of the fluid components including estetrol were detected in the first 10 min with progesterone appearing at 43 minutes. We applied these pre-purification and separation analytical protocols for separation of cord blood extracts [26]. Human male and female fetal cord blood samples were purified, selectively extracted and separated to examine a fraction of steroids ranging from polar estetrol to relatively non-polar progesterone. Resulting UV diode array chromatographic patterns revealed the presence of 27 peaks. Observed chromatographic patterns of UV detected steroids were analyzed using principal components analysis, which revealed differences between male/female and labour/not-in-labour clusters. Quantitative analysis of nine identified steroids including: estetrol, 17 -estradiol, estrone, estriol, cortisol, cortisone, progesterone, 20α-hydroxyprogesterone and 17α-hydroxyprogesterone were not significantly different between males and females. Significant differences between male and female fetuses were related to as yet unidentified compounds. Four peaks were significantly different with labour which corresponded with cortisol, cortisone and two unidentified compounds. This protocol may distinguish significant differences between clinical groups that are not readily identifiable using univariate measurements of single steroids or different low-molecular mass biomarkers. Moreover, we have provided new evidence that despite the absence of testosterone there are number of steroids and low-molecular mass compounds that differ between male and female fetuses. In our last works we optimised the separation of battery of key UV non-transparent low-molecular mass compounds having possible endocrine disrupting compounds (EDCs) activity or which may be used as the endocrine effect biomarkers [27,28]. Simple optimization strategy was based on strong temperature effect in presence of cyclodextrin in HPLC mobile phase. Particularly, the effect of temperature involving native -cyclodextrin and its hydroxypropyl derivative to improve separation of number of natural (dequilenin, equilin, estetrol, estriol, estrone, 17 -estradiol, 17 -hydroxyprogesterone, 20 hydroxyprogesterone, cortisol, cortisone, progesterone, testosterone, tetrahydrocortisol and tetrahydrocortisone) and artificial steroids (ethynylestradiol, norgestrel isomers, medroxyprogesterone, mestranol, methyltestosterone, norethindrone, 17 -estradiol) as well as non-steroidal compounds (diethylstilbesterol, bisphenol A, 4-tert-butylphenol, dimethyl phthalate, dibutyl phthalate and dioctyl phthalate) was investigated. It has been found that successful isocratic separation of 27 chemicals can be achieved using acetonitrile/water eluents modified with -cyclodextrin or hydroxypropyl- -cyclodextrin at concentration of 10 mm and temperature of 47ºC. Separation protocol may be easily adapted for rapid Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

33 Krótki przegląd zastosowań cyklodekstryn dotyczący 33 separation and quantification of wide range of given steroids and related EDCs in environmental samples, particularly those that are characterised by unstable biological matrix and components of interest load. Using such analytical approach the environmental samples derived from Baltic Sea, selected lakes and rivers of the Middle Pomerania in northern part of Poland as well as untreated and treated sewage water from municipal sewage treatment plant near Koszalin were analyzed [28]. Moreover, some preliminary data concerning estriol, testosterone and equilin biodegradation involving activated sludge material were reported. Cluster and principal components analysis of the acquired data sets confirms a high separation and quantification throughput of the solid-phase extraction and isocratic HPLC protocols presented. Using this approach, two main associations consisting of untreated wastewater cluster and remaining samples cluster, which clearly split into treated wastewater and surface water samples groups, can be recognized. PCA investigation revealed that mechanical and biological units of the municipal wastewater treatment plant can reduce and, which is more important, to unify the organic pollution load of untreated sewage water. However, the EDCs fraction in the resulting treated wastewater may still have significant impact on the natural environment. Our investigations concerning of EDCs compounds level presented in Dzierżęcinka river (passing through Koszalin City) indicate low contribution of the Koszalin to organic pollutants load of this river. The method can be useful for simple and rapid classification of the environmental samples characterized by different sources of EDCs loading. The results of this work extend the utility of temperaturedependent inclusion chromatography as an inexpensive, efficient and accurate analytical tool appropriate for characterisation and quantification of complex environmental samples. Such approach may be simple and non-expensive alternative for fingerprinting protocols based on LC-MS machines. 3. Conclusion As it can be seen from this compilation, which is a tiny fraction comparing to enormous amount of worldwide published works, supramolecular chemistry or chemistry beyond the molecule is a fascinating branch of science. It offers solution to many problems connected with life sciences and technical applications. Separation protocols based on isocratic temperature-dependent inclusion chromatography provides the opportunity for steroids and related low-molecular mass compounds of differing polarities to be robustly profiled in biological and environmental samples and provides a great deal of information on a physiological situation and ecosystems without the need to perform more complex and expensive assays. References 1. H. Lamparczyk, Chromatographia 20 (1985) H. Lamparczyk, M. Atomura, K. Jinno, Chromatographia 23 (1987) H. Lamparczyk, P. Zarzycki, R.J. Ochocka, D. Sybilska, Chromatographia 30 (1990) H. Lamparczyk, P.Zarzycki, R.J. Ochocka, M. Asztemborska, D. Sybilska, Chromatographia 31 (1991) D. Sybilska M. Asztemborska, A. Bielejewska, J. Kowalczyk, H. Dodziuk, K. Duszczyk, H. Lamparczyk, P. Zarzycki, Chromatographia 35 (1993) P.K. Zarzycki, R. Smith, J. Chromatogr. A. 912 (2001) P.K. Zarzycki, E. Włodarczyk, D.W. Lou, K. Jinno, Anal. Sci. 22 (2006) P.K. Zarzycki, H. Lamparczyk, J. Chem. Educ. 73 (1996) P.K. Zarzycki, H. Lamparczyk, J. Pharm. Biomed. Anal. 18 (1998) P.K. Zarzycki, M.J. Baran, F.B. Harasimiuk, M.M. Ślączka, Pomiary Automatyka Kontrola 56 (2010) P.K. Zarzycki, M. Wierzbowska, H. Lamparczyk, J. Pharm. Biomed. Anal. 15 (1997) P.K. Zarzycki, M. Wierzbowska, H. Lamparczyk, J. Pharm. Biomed. Anal. 14 (1996) P.K. Zarzycki, H. Lamparczyk, Chromatographia 48 (1998) P.K. Zarzycki, H. Ohta, Y. Saito, K. Jinno, Anal. Bioanal. Chem. 391 (2008) P.K. Zarzycki, J. Nowakowska, A. Chmielewska, H. Lamparczyk, J. Planar Chromatogr. 8 (1995) P.K. Zarzycki, J. Nowakowska, A. Chmielewska, H. Lamparczyk, J. Planar Chromatogr. 9 (1996) P.K. Zarzycki, H. Lamparczyk, Chem. Anal. (Warsaw) 46 (2001) P.K. Zarzycki, M. Wierzbowska, J. Nowakowska, A. Chmielewska, H. Lamparczyk, J. Chromatogr. A 839 (1999) P.K. Zarzycki, J. Chromatogr. A 1187 (2008) P.K. Zarzycki, J. Nowakowska, A. Chmielewska, M. Wierzbowska, H. Lamparczyk, J. Chromatogr. A 787 (1997) H. Lamparczyk, P.K. Zarzycki, J. Nowakowska, J. Chromatogr. A 668 (1994) D. Sybilska, J. Kowalczyk, M. Asztemborska, R.J. Ochocka, H. Lamparczyk, J. Chromatogr. A 665 (1994) R.J. Ochocka, A. Marzec, H. Lamparczyk, J. Pharm. Biomed. Anal. 10 (1992) H. Lamparczyk, P.K. Zarzycki, J. Nowakowska, R.J. Ochocka, Chromatographia 38 (1994) 168. Vol. 5, No 1/2013 Camera Separatoria

34 34 H. Lamparczyk, A. Chmielewska, P.K. Zarzycki 25. P.K. Zarzycki, K.M. Kulhanek, R. Smith, V.L. Clifton, J. Chromatogr. A 1104 (2006) V. L. Clifton, A. Bisits, P.K. Zarzycki, J. Chromatogr. B 855 (2007) P.K. Zarzycki, E. Włodarczyk, M.J. Baran, J. Chromatogr. A (2009) P.K. Zarzycki, E. Włodarczyk, M.J. Baran, J. Chromatogr. A (2009) Camera Separatoria Vol. 5, No 1/2013

35 CAMERA SEPARATORIA Volume 5, Number 1 / January 2013, Paweł Konrad Zarzycki Zakład Toksykologii i Bioanalityki, Wydział Inżynierii Lądowej, Środowiska i Geodezji, Politechnika Koszalińska, Śniadeckich 2, Koszalin, pkzarz@wp.pl or pawel_k_z@hotmail.com Wspomnienie o profesorze Henryku Lamparczyku W dniu 16 listopada 2012 roku zmarł Profesor Henryk Lamparczyk ( ). Profesor całe swoje życie zawodowe poświęcił badaniom dotyczącym chromatografii, chemii fizycznej i chemometrii. Rezultaty tych badań, opublikowane w ponad 100 pracach naukowych, znalazły zastosowanie praktyczne, głównie w analizie leków, farmakokinetyce, kosmetologii, współczesnej bioanalityce oraz analizie środowiska, jak również żywności. Profesor był wieloletnim pracownikiem Studium Farmaceutycznego CMKP w Bydgoszczy oraz Akademii Medycznej w Gdańsku, sprawując funkcje Kierownika Zakładu Biofarmacji (CMKP) oraz Katedry Chemii Farmaceutycznej (AMG). Swoje pasje naukowe z sukcesem realizował podczas wieloletnich staży, uzyskanych w drodze międzynarodowych konkursów, w wiodących zagranicznych ośrodkach badawczych Anglii, Japonii oraz Hiszpanii. Należał On do pionierów wykorzystania narzędzi chemometrycznych w przetwarzaniu i interpretacji danych pozyskanych poprzez spektroskopię, chromatografię oraz termoanalizę. Obszar badań Profesora był imponujący i dotyczył między innymi: fizykochemii związków krzemoorganicznych, oddziaływań elektrostatycznych, polaryzowalności, indeksów retencji, parametru kształtu, zagadnień QSRR i QSAR, termodynamiki i optymalizacji procesów rozdzielania w chromatografii gazowej, cieczowej oraz elektroforezie kapilarnej, wykorzystania faz ciekłokrystalicznych do rozdzielania przy pomocy GC, chemii supramolekularnej - w szczególności kompleksów typu gość-gospodarz z wykorzystaniem cyklodekstryn i antybiotyków makrocyklicznych, specjacji węglowodorów i antybiotyków w próbkach żywności oraz kosmetykach, analizy n-alkanów oraz WWA w materiałach pobranych z ekosystemów wodnych, oznaczania kwasu nikotynowego, kumaryn oraz sterydów w materiałach biologicznych, profilowaniem poziomu estrogenów w cyklu miesięcznym oraz w trakcie ciąży, problemów związanych z rozdzielaniem izomerów związków organicznych (w tym enancjomerów), metabolizmu substancji rakotwórczych, składu enancjomerycznego olejków eterycznych oraz wosków, biodostępności leków z preparatów farmaceutycznych, a ostatnio wpływu płci na farmakokinetykę wybranych leków. Wiele prac Jego autorstwa włączając w to artykuł pt. The role of electric interactions in the retention index concept. Universal interaction indices for GLC, HPLC and TLC (Chromatographia 20, 1985, ; pełną listę publikacji Profesora zamieszczam poniżej) jest powszechnie uznawanych za kamienie milowe współczesnej nauki o rozdzielaniu. Był osobą otwartą na każdą dyskusję dotyczącą nauki, historii, architektury oraz muzyki, niezmiernie hojną i bezinteresowną w dzieleniu się swoją wiedzą, przemyśleniami i pomysłami naukowymi. Profesor wypromował 9 doktorów. Z perspektywy ponad 20-letniej pracy z Profesorem mogę stwierdzić, że nigdy i nigdzie nie zabiegał o popularność. Był człowiekiem prostolinijnym, bezkompromisowym i klarownym w swoich ocenach oraz poglądach, umiejącym docenić zaangażowanie w pracy wszystkich swoich wspópracowników. In memory of professor Henryk Lamparczyk Professor Henryk Lamparczyk prematurely passed away on November 16, 2012, at age of 65 years. Professor made a massive contribution to chromatography, physical chemistry and chemometrics. His passion for science performed successfully out of the Poland during long-term research visits as the international competitive grants winner in Great Britain, Japan and Spain. Since 1974 Professor Henryk Lamparczyk has published over 100 scientific papers mainly related to environmental analysis, structureretention and structure-activity relationships, chromatography, drug analysis as well as pharmacokinetics. One of his first research interest was study on intermolecular interactions involved in supramolecular chemistry and separation science, particularly chromatography and electrophoresis. He clearly demonstrated that general behavior of the solute molecules in chromatographic systems can be explained on the basis of solute-phases reversible interactions like electrostatic (van der Waals) forces and stereoselective molecular fitting to stationary and mobile phases. In this field he has studied the effect of electrostatic interactions on chromatographic retention using number of analytes, including polycyclic aromatic hydrocarbons,