Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk. Anna Piasecka

Transkrypt

1 Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk Anna Piasecka Zmiany profili fenolowych metabolitów wtórnych u roślin jęczmienia (Hordeum vulgare L.) poddanych stresowi niedoboru wody AUTOREFERAT Praca doktorska wykonana pod kierunkiem dra hab. Piotra Kachlickiego prof. IGR PAN w Instytucie Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk Poznań,

2 1. Streszczenie Badania w przedstawionej pracy skupiły się na analizie fenolowych metabolitów wtórnych w metanolowym ekstrakcie otrzymanym z liści 9 odmian jęczmienia jarego oraz 100 linii wsobnych mieszańców F1 powstałych ze skrzyżowania odmian Maresi CamB1. Jednym z etapów pracy było profilowanie metabolitów przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej UPLC. Wygenerowany duży zestaw danych metabolomicznych, poddano zaawansowanym transformacjom matematycznym do formy umożliwiającej dalsze analizy statystyczne. Efektem połączonych prac metabolomicznych, matematycznych i statystycznych była wizualizacja dynamiki zmian zawartości badanych metabolitów w różnych warunkach niedoboru wodny. Profilowanie fenolowych metabolitów wtórnych zostało użyte także do klasyfikacji chemotaksonomicznej 9 odmian jęczmienia pochodzących z różnych rejonów geograficznych i znalezienia markerów metabolomicznych różnicujących odmiany w czasie suszy i w warunkach pełnego uwodnienia na różnych etapach rozwoju. Równolegle prowadzono identyfikację metabolitów u 9 odmian jęczmienia. Niskorozdzielczy spektrometr mas z pułapką jonową dostarczył szczegółowych danych o 165 metabolitach jęczmienia, w tym wielu nieznanych dotąd u tego gatunku. Potwierdzeniem uzyskanych informacji strukturalnych były analizy przy użyciu wysokorozdzielczego tandemowego spektrometru mas oraz spektroskopu magnetycznego rezonansu jądrowego, dzięki któremu ustalono struktury 5 metabolitów, w tym 3 nie opisywanych dotąd u jęczmienia. W celu uzyskania prób do analiz NMR opracowano metodę chromatografii preparatywnej z wykorzystaniem dwóch rodzajów złóż, poliamidu oraz RP C18, co poprawiło znacznie wydajność rozdziału. Analiza strukturalna przy użyciu wyżej wymienionych systemów została rozszerzona o identyfikację kolejnych 109 metabolitów występujących w śladowych ilościach jak również 45 związków indukowanych pod wpływem niedoboru wody. Efektem prac było znaczne poszerzenie dotychczasowej wiedzy na temat metabolomu jęczmienia i bogactwa fenolowych metabolitów wtórnych u różnych odmian jęczmienia. 2. Wstęp Jęczmień, zwłaszcza jego forma jara, jest w Polsce uprawiany na szeroką skalę. Główny rynek zbytu dla tych upraw tworzą firmy produkujące pasze dla zwierząt. Jęczmień konsumpcyjny wykorzystywany jest do produkcji płatków i kasz. Niestety obserwuje się 2

3 spadek wykorzystania jęczmienia w tym kierunku. Miejsce to stopniowo zajmują odmiany browarne z przeznaczeniem do produkcji słodu. Następuje też wzrost zainteresowania produktami jęczmiennymi zaliczanymi do żywności witalizującej. W ostatnich latach coraz częściej pojawia się w polskim rolnictwie problem strat w plonach z powodu suszy, dlatego prace mające na celu zdobycie kompleksowej wiedzy na temat mechanizmów tolerancji na suszę u roślin są kluczowe dla stabilizacji produktywności zbóż w niekorzystnych warunkach środowiskowych. Niedobór wody u roślin pojawia się, gdy obniżona jest aktywność wody w środowisku. Dzieje się tak w przypadku utrudnionego zaopatrzenia korzeni w wodę albo przy bardzo wysokim poziomie transpiracji. Pobieranie wody może być także ograniczone przez niską temperaturę, zasolenie, niedotlenienie lub uszkodzenie systemu korzeniowego. Odporność roślin na suszę jest niezwykle złożonym zjawiskiem, które obejmuje cały szereg zmian genetycznych, fizjologicznych i morfologicznych. Jednym z przejawów suszy są zmiany w zawartości metabolitów fenolowych, które mogą w stresie pełnić funkcje fotoochronne, antyoksydacyjne, osmoprotekcyjne, sygnalizacyjne oraz regulacyjne. 3. Cel pracy Niniejsze badania stanowią część wielodyscyplinarnego projektu mającego na celu kompleksowe zbadanie mechanizmów tolerancji zbóż na niedobór wody. Analizy zaplanowano z założeniem, iż w jęczmieniu występuje duże, nieodkryte dotąd bogactwo metabolitów wtórnych oraz przynamniej niektóre z nich uczestniczą w odpowiedzi roślin na niedobór wody oraz w procesach aklimatyzacyjnych. Głównym celem tu opisanych badań jest metabolomiczne podejście do poznania molekularnego fenotypu jęczmienia oraz poszukiwania charakterystycznego wzoru zmian profili fenolowych metabolitów wtórnych w liściach roślin tego gatunku związanych z odpowiedzią na stres suszy. Obecność, brak lub zwiększona akumulacja określonych metabolitów w połączeniu z danymi genetycznymi i proteomicznymi może w przyszłości dostarczyć cennych markerów selekcji w programach hodowlanych jęczmienia odpornego na stresy środowiskowe. Realizacja wyżej wymienionych celów wymagała zaangażowania metod z zakresu biologii, chemii analitycznej, matematyki, informatyki i statystyki, co nadaje pracy charakter multidyscyplinarny. W pracy dążono do podsumowania obecnej wiedzy na temat metabolomu wtórnego u jęczmienia oraz poszerzenia jej w jak największym zakresie o nowe elementy dotyczące regulacji ich biosyntezy w warunkach stresu środowiskowego. 3

4 4. Materiały i metody Materiał roślinny Przepadano 9 odmian dwurzędowego jęczmienia jarego (Hordeum vulgare L.) uprawianych w trzech kolejnych latach w szklarni IGR PAN. Są to odmiany pochodzące z: Europy - Georgia (Anglia), Maresi (Niemcy), Lubuski, Stratus (Polska), Sebastian (Dania); Stanów Zjednoczonych - Morex; Syrii - CamB1/C1, Harmal, MaresDingo. Dodatkowo w 2011 roku analizy prowadzono na 100 liniach RIL wyprowadzonych z mieszańców Maresi CamB1. W poszczególnych latach stosowano suszę na różnych etapach rozwoju: Susza 1. (S1) - 5%-6% wilgotności gleby od stadium 3-listnej siewki przez 10 dni Susza 2. (S2) - 5%-6% wilgotności od stadium liścia flagowego przez 14 dni Susza 3. (S3) - susza łączona. 5%-6% wilgotności gleby od stadium 3-listnej siewki przez 10 dni, po czym przywrócenie uwodnienia do stanu kontrolnego i kolejne zaprzestanie podlewania w stadium liścia flagowego aż do uzyskania wilgotności gleby 5%-6% i utrzymywanie takiej wilgotności przez kolejne 14 dni Fenolowe metabolity wtórne wyizolowano również w skali preparatywnej z 1,4 kg liści odmiany Maresi, poddanej suszy według parametrów S2. Procedury przygotowywania ekstraktów roślinnych, parametry akwizycji danych chromatograficznych oraz spektrometrycznych dostępne są w artykułach: 1. Sawikowska A., Swarcewicz B., Piasecka A., Kuczyńska A., Krystkowiak K., Ogrodowicz P., Mikołajczak K., Kachlicki P., Krajewski P., Stobiecki M. (2013). A data analysis protocol for monitoring metabolomic changes in multifactorial experiments: a study of barley (Hordeum vulgare) leaves under drought stress. Analytical & Bioanalytical Chemistry. Złożone do druku 2. Wojakowska A., Piasecka A., García-López P.M., Zamora-Natera F., Krajewski P., Marczak Ł., Kachlicki P., Stobiecki M. (2013). Structural analysis and profiling of phenolic secondary metabolites of Mexican lupine species using LC-MS techniques. Phytochemistry, DOI: /j.phytochem Stobiecki M., Staszków A., Piasecka A., Garcia-Lopez P.M., Zamora-Natera F., Kachlicki P. (2010). LC-MSMS profiling of flavonoid conjugates in wild Mexican lupine Lupinus reflexus. J. Nat. Prod., 73: Analizy instrumentalne Platformą do przeprowadzania analiz strukturalnych w głównej mierze był układ wysokosprawnego chromatografu cieczowego z detektorem UV sprzężonego z niskorozdzielczym spektrometrem mas wyposażonym w pułapkę jonową HPLC-UV-ESI- 4

5 MS n. Dodatkowo, dla wybranych prób przeprowadzono analizy na wysokorozdzielczym spektrometrze mas z kwadrupolową komorą kolizyjną UPLC-micrOTOF-Q znajdującym się w Instytucie Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu. Analizy te zostały przeprowadzone w celu potwierdzenia wcześniej uzyskanych wyników. Do rozdziału preparatywnego mieszaniny ekstrakcyjnej wykorzystano dwa rodzaje wypełnień chromatograficznych o odmiennym sposobie adsorpcji związków fenolowych: poliamidu oraz RP C18. Wyizolowane i oczyszczone metabolity uzyskane w największych ilościach poddano następnie analizom magnetycznego rezonansu jądrowego NMR w Środowiskowym Laboratorium Unikalnej Aparatury Chemicznej Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu oraz w Zespole Biomolekularnego NMR Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu. Ultrasprawny chromatograf cieczowy z detektorem fotodiodowym PDA-UPLC służył do otrzymania chromatogramów UV reprezentujących profile związków fenolowych w poszczególnych próbach. Profile te poddano zaawansowanym transformacjom matematycznym umożliwiającym ujęcie statystyczne zawartych w nich danych jakościowych i półilościowych. Obliczenia chemometryczne wykonała dr Aneta Sawikowska z Zakładu Biometrii i Bioinformatyki IGR PAN. Analizy statystyczne wykonane zostały przez prof. Pawła Krajewskiego z Zakładu Biometrii i Bioinformatyki IGR PAN oraz dr Anetę Sawikowską i obejmowały analizy zmian fenolowych metabolitów wtórnych pod wpływem niedoboru wody oraz grupowanie odmian na podstawie zawartości fenolowych metabolitów wtórnych w warunkach kontrolnych dla chromatogramów roślin z doświadczenia 2010 r oddzielnie dla kontroli z 1 dnia suszy w stadium siewki oraz dla kontroli z 1 dnia suszy w stadium liścia flagowego. 5

6 Poniższy schemat obrazuje szczegółowo etapy analiz strukturalnych oraz sposób badania reakcji na deficyt wody u jęczmienia Materiał roślinny Ekstrakt fenolowy Identyfikacja strukturalna Reakcje na deficyt wody Chromatografia preparatywna (złoże poliamidowe) UPLC-micrOTOF-Q (potwierdzenie danych HPLC-UV-ESI-MS n) HPLC-UV-ESI-MS n PDA-UPLC HPLC preparatywna (złoże RP C18) Metabolity w warunkach kontrolnych Metabolity indukowane pod wpływem suszy Przetwarzanie matematyczne NMR (potwierdzenie danych HPLC-UV-ESI-MS n ) Metabolity w śladowych ilościach Analiza chemotaksonomiczna Zmiany pod wpływem niedoboru wody Analizy statystyczne i wizualizacja statystyk 7

7 5. Wyniki Dwuetapowa chromatografia preparatywna i NMR Chromatografia preparatywna umożliwiła wyizolowanie 10 związków w ilościach pozwalających na analizy NMR. Uzyskane widma protonowe NMR pozwoliły określić struktury aglikonów jako apigeninę, luteolinę oraz chryzoeriol. Widma korelacyjne NMR posłużyły do określenia struktur 6-C-[2 -O-glikozylo]-glikozydów oraz 7-O-glikozylo-6-Cglikozydów flawonów. Identyfikacja metabolitów różnych odmian jęczmienia Analizy spektrometryczne metabolitów 9 odmian jęczmienia u roślin rosnących w warunkach kontrolnych w doświadczeniach z lat 2009 oraz W roku 2011 włączono odmiany Maresi i Cam B1 a także losowo wybrane linie RIL: 24, 26, 68, 86, 111, 119, 128 uzyskane z ich skrzyżowania. Łącznie zidentyfikowano 165 metabolitów należących do trzech klas związków fenolowych: kwasy hydroksycynamonowe i ich pochodne, acylowane poliaminy oraz flawonoidy. U jęczmienia zidentyfikowano pochodne kwasu p-kumarowego, ferulowego, hydroksyferulowego, kawowego oraz synapinowego, które występują głównie w połączeniach z cukrami lub kwasem chinowym (kwasy chlorogenowe). Wśród acylowanych poliamin zinterpretowano widma hordatyn A oraz B oraz ich prekursorów, p-kumaroiloagmatyny oraz feruloiloagmatyny. Wykryto także glikozydy hordatyn. Dodatkowo u wszystkich odmian, z wyjątkiem syryjskiej odmiany Harmal, zidentyfikowano trzeci rodzaj hordatyny, nieopisany wcześniej w literaturze. W niektórych liniach RIL obserwowano również jony glikozydu tejże hordatyny. Przeważającą część związków fenolowych zidentyfikowanych u jęczmienia stanowią flawonoidy. Najczęściej pojawiają się glikozydy flawonów, wśród których zidentyfikowano: apigeninę, luteolinę, chryzoeriol oraz trycynę. Dodatkowo wykryto pochodne flawonoli kwercetyny oraz izoramnetyny a także flawanonu naringeniny. Tworzą one struktury związane z cukrami: glukozą, ramnozą oraz arabinozą. Cukry przyłączają się do aglikonów w postaci mono-, dwu-, lub trójglikozydów połączonych ze sobą wiązaniem 1 6 glikozydowym. Przyłączenie do aglikonu ma dwojaki charakter: wiązania O-glikozydowego lub C-glikozydowego, przy czym w cząsteczkach obok siebie mogą występować oba typy wiązań. Zinterpretowano także widma masowe należące do 6,8-dwu-C-glikozydów apigeniny, chryzoeriolu oraz luteoliny. Glikozydy flawonoidów, podobnie jak poliaminy, u jęczmienia występują w połączeniu z kwasami hydrokosycynamonowymi: p-kumarowym, kawowym, ferulowym, 7

8 hydroksyferulowym oraz synapinowym, a połączenia te są bardzo różnorodne. U odmian syryjskich M. Dingo i Harmal, oraz polskiej Lubuski i amerykańskiej Morex znaleziono także kilka flawonoidów acylowanych alifatycznym kwasem malonowym. Identyfikacja metabolitów występujących w śladowych ilościach W poszczególnych frakcjach uzyskanych dzięki chromatografii preparatywnej zidentyfikowano 109 metabolitów nie wykrywanych w standardowych analizach HPLC-MS n. Wśród nich znajdowały się metabolity nieopisywane dotąd w literaturze. Wykryto 6 pochodnych putrescyny oraz hydroksyputrescyny acylowanych kilkoma na raz kwasami hydroksycynamonowymi. Zidentyfikowano także struktury 6-C-[6 -Oglikozylo]-glikozydy flawonoidów. Metabolity należące do tych klas nie notowano dotąd u jęczmienia. Identyfikacja metabolitów indukowanych pod wpływem suszy W roślinach poddanych suszy zaobserwowano 45 metabolitów, które nie występowały w roślinach kontrolnych. Dla próbek zebranych 5 dnia S1 większość indukowanych metabolitów stanowiły trójlub tetraglikozydy flawonoidów. Na koniec S1 pojawiły się związki acylowane kwasami ferulowym, hydroksyferulowym oraz synapinowym. W suszy S3 u odmiany Maresi pojawiły się związki podwójnie acylowane. Ocena zmian fenolowych metabolitów wtórnych jęczmienia w odpowiedzi na suszę Analizy numeryczne pozwoliły wykryć 104 statystycznie istotne sygnały we wszystkich chromatogramach z 9 odmian analizowanych w 2010 r. Analiza wariancji wszystkich sygnałów pokazała istotność trzech interakcji: zmian sygnałów zależnych od wariantu nawadniania a niezależnych od odmiany i dnia suszy W, zmian zależnych od odmiany i wariantu nawadniania OW oraz zmian zależnych od odmiany, dnia suszy oraz wariantu nawadniania OTW. Susza S1 w stadium 3-listnej siewki, wywoływała zmiany w zawartości największej liczby sygnałów Reakcje te były mało specyficzne dla odmiany. W stadium liścia flagowego reagowało dwa razy mniej metabolitów. Reakcje odmianowo- i czasowospecyficzne metabolitów w S1, różnicują odmiany na wyraźne grupy. W końcowej fazie suszy Maresi wykazywała najmniej podobną reakcje do pozostałych odmian, natomiast zmiany w metabolitach u odmiany Stratus, Cam B1 i Morex były zbliżone. Dla suszy aplikowanej w stadium liścia flagowego reakcje metabolitów różniły się od tych obserwowanych dla suszy w stadium siewki. Dla modelu OW po wstępnym wzroście 8

9 ilościowej zawartości metabolitów w liściach prawie wszystkich badanych odmian w trakcie upływu czasu obserwowano zmniejszanie ich ilości. W S3 wszystkie zmiany były odmianowo-specyficzne i dotyczyły 32 sygnałów. Większość reakcji związana była ze zwiększaniem zawartość metabolitów. W doświadczeniu 2011 r analizy statystyczne dotyczyły wizualizacji zmian poszczególnych metabolitów dla całej populacji MCam łącznie. Wśród badanych lini RIL najczęstszą reakcją roślin na suszę S1 była zmiana zawartości związków, w których strukturze występowały kwasy hydroksycynamonowe jako podstawniki. Charakterystyka chemotaksonomiczna badanych odmian jęczmienia Dwie odmiany syryjskie, Harmal i M. Dingo wykazywały podobieństwo zawartości metabolitów fenolowych niezależnie od stadium rozwojowego. Odmiana syryjska Cam B1, oraz Morex ze Stanów Zjednoczonych, wykazywały właściwości zbliżone do odmian europejskich. Różnice w składzie metabolitów fenolowych nie były tak widoczne na wczesnym etapie rozwoju jak w późniejszej fazie. 6. Dyskusja Najpełniejszy opis flawonoidów u jęczmienia do tej pory znaleziono u Ferreres a i in. (2008). Flawonoidy u jęczmienia cechują się dużą różnorodnością miejsc glikozylacji. Fakt ten może świadczyć o aktywności całej puli pozycyjno-specyficznych glikozylotransferaz. Wydaje się, iż aktywność glukozylotransferaz odpowiedzialnych za glikozylacje 2 -OH zwiększa się w późniejszych fazach rozwojowych. Acylacje flawonoidów kwasami hydroksycynamonowymi są szeroko rozpowszechnione u roślin, również u jęczmienia. Wartością dodaną obecnych analiz jest identyfikacja szeregu metabolitów zawierających kwas 5-hydroksyferulowy. Za obecnością takiej izoformy przemawia występowanie u jęczmienia O-metylotransferaz, dla których substratem jest kwas 5-hydroksyferulowy (Lee i in., 1997). Acylacje 6-C-glukozydów flawonoidów tworzących struktury 6-C-[2 -O-glikozylo- 6 -acylo]-glikozydów występują jedynie w mieszańcach Maresi CamB1, co może być związane z uruchomieniem dodatkowych aktywności enzymatycznej w liniach wsobnych. 23 zidentyfikowane związki posiadają acyle przyłączone bezpośrednio do aglikonu. Tego typu struktury nie zostały dotąd opisane u jęczmienia, niemniej bezpośrednie acylacje aglikonów flawonoidów spotykane są u roślin (Stobiecki i in., 2010). Jednak dla ostatecznego potwierdzenia dokładnych struktur konieczne jest przeprowadzenie analiz NMR. 9

10 Obecne badania pozwoliły na wykrycie 13 pochodnych trycyny dotąd nie znanych u jęczmienia. Obecność tych związków może wynikać z właściwości grup metoksylowych, licznie występujących w ich strukturach. Przykładowy związek 7-O-[6 -synapoilo]-glukozyd trycyny zawiera łącznie 4 grupy metoksylowe. Nowością w stosunku do danych literaturowych jest również zidentyfikowanie u jęczmienia malonylowanych pochodnych flawonoidów. Acylacja kwasem malonowym związana jest z transportem i przechowywaniem flawonoidów oraz chroni je przed enzymatyczną degradacją glikokoniugatów (Zhao i in., 2011). Choć nie ma w literaturze opisu malonylotransferazy u jęczmienia, dobrze scharakteryzowany jest enzym o takiej aktywności u ryżu (Kim i in., 2009). W literaturze brak informacji na temat bardziej złożonych acylacji poliamin u jęczmienia. Struktury takie zidentyfikowano natomiast u A. thaliana (Handrick i in., 2010). Dokładniejsze zbadanie tych intrygujących metabolitów wymaga przeprowadzenia analiz w dodatnim trybie jonowym i modyfikacji parametrów rozdziału chromatograficznego ze względu na ich dużą hydrofilowość. Nie ma w literaturze informacji na temat zmian metabolitów fenolowych u jęczmienia pod wpływem niedoboru wody. Kompleksowość badań nad ich zachowaniem w czasie suszy u jęczmienia wymagała monitoringu ich zmian ilościowych oraz nowych metabolitów pojawiających się w suszy. Indukcja nowych metabolitów ukazuje kierunek zmian w biosyntezie fenolowych metabolitów wtórnych, jakie zachodzą w komórkach pod wpływem suszy i daje możliwość dyskusji na temat pełnionych przez nie funkcji. Początek suszy jest sygnałem dla roślin jęczmienia do wzmożonej syntezy glikozydów flawonoidów. Glikozylacje są niezbędne do transportu tych związków oraz ich akumulacji w wakuolach. Z drugiej strony glikozylacje powodują zablokowanie reaktywnych grup hydroksylowych, co chroni flawonoidy przed autooksydacją (Burda i Oleszek, 2001). Być może nagromadzona pula glikozylowanych związków wykorzystywana jest do procesów acylacji pojawiających się w długotrwałej suszy. Wart podkreślenia jest fakt, iż wszystkie pojawiające się acyle zawierają grupy metoksylowe. Obecność metabolitów z grupami metoksylowymi rozszerza zakres pochłaniania najbardziej energetycznych długości fal UV-B oraz UV-A i dzięki temu mogą efektywniej zapobiegać powstawaniu wolnych rodników tworzonych pod wpływem UV. Z kolei połączenie tych acyli z flawonoidami znacznie wzmaga intensywność absorpcji (Stochmal i Oleszek, 2007). Biosynteza flawonoidów acylowanych w czasie suszy ma związek ze zwiększeniem wydajności fotoochrony zwłaszcza przeciw UV-B. Uzyskane dane potwierdzają wnioski z 10

11 pracy Schmitz-Hoerner i Weissenböck, (2003). Powyższe fakty sugerują krzyżowanie się mechanizmów tolerancji na suszę i UV-B, co zgodne jest z wnioskami innych badaczy (He i in., 2011; Kilian i in., 2007; Schmidt i in., 2000). Wnioski te stanowią wkład w wiedzę na temat fizjologii jęczmienia i roli flawonoidów w czasie suszy u roślin. Badania przeprowadzone podczas realizacji tej pracy i dokonane identyfikacje fenolowych metabolitów wtórnych znacznie wzbogacają wiedzę na temat metabolomu jęczmienia uprawnego. Dzięki przebadaniu różnorodnych genotypów zidentyfikowano cały szereg związków nieznanych dotąd u tego gatunku. Dużą rolę w identyfikacji tych metabolitów odegrało prowadzenie analiz metodą spektrometrii mas zarówno w jonizacji ujemnej jak i dodatniej, a także przy użyciu instrumentu o wysokiej rozdzielczości, dzięki czemu uzyskano komplementarne informacje o budowie związków i pozwoliło rozróżnić podstawniki acylowe od glikozydowych. Należy podkreślić, że identyfikacja metabolitów była możliwa także dzięki zastosowaniu ich oczyszczaniu w skali preparatywnej i przeprowadzeniu analiz NMR. Analizy statystyczne dały szereg informacji o zachowaniu się wtórnych metabolitów fenolowych w czasie niedoboru wody u jęczmienia. Różnorodność reakcji wśród odmian jęczmienia świadczy o dużym zróżnicowaniu mechanizmów obronnych każdej z nichoraz może być skorelowana z różną tolerancją poszczególnych odmian na deficyt wody. Zawartość kwasów hydroksycynamonowych i ich nieflawonoidowych pochodnych nie zmieniała się w czasie trwania suszy S1 i S2. Stan taki mógł być spowodowany wyrównaniem się procesów ich biosyntezy z jednoczesnym wykorzystaniem ich jako substratów do różnych procesów, w tym metylacji i acylacji flawonoidów. Wyjątek stanowiła synapoiloglukoza, dla której notowano spadek zawartości u większości odmian. Jest ona substratem dla niektórych acylotransferaz, a obserwowany spadek poziomu tego związku u większości odmian może świadczyć o korelacji z syntezą acylowanych flawonoidów mających udział w odpowiedzi roślin na suszę, a także wykorzystaniem tego związku jako składnika ścian komórkowych. Podobne zjawisko spadku zawartości glikozydu kwasu synapinowego przy jednoczesnym braku reakcji dla pozostałych kwasów hydroksycynamonowych opisywano w literaturze u innych roślin (Ceoldo i in., 2009). Spadek zawartości metabolitów obserwowany w S2 może mieć związek z intensywniejszym wykorzystywaniem innych mechanizmów odpowiedzi na niedobór wody rozwiniętych w czasie rozwoju roślin. Natomiast przez cały okres trwania S3 występowały reakcje dodatnie dla wszystkich odmian, co sugeruje udział tych metaboitów w procesach aklimatyzacji, podobny efekt obserwowano dla sosny (Watkinson i in., 2003). Za 11

12 potwierdzeniem tej hipotezy przemawia specyficzność odmianowa reakcji związków fenolowych u jęczmienia w drugim etapie S3. Postulowanymi metabolitami biorącymi udział w mechanizmach aklimatyzacyjnych, wykazującymi zwiększoną zawartość po przejściu pierwszego etapu suszy są kwasy hydroksycynamonowo-chinowe, których udział w aklimatyzacji do podwyższonego poziomu promieniowania słonecznego był tematem kilku publikacji (Grace i in., 1998; Kolb i in., 2001). Ponadto niniejsza praca wskazuje na wzmożoną akumulację glukozydu hordatyny we wszystkich wariantach suszy. Wzrost zawartości poliamin obserwowano w stresach abiotycznych (Watson i Malmberg, 1996; Evans i Malmberg, 1989). Z kolei Liu i in. (2000) zasugerowali regulacyjną rolę poliamin w działaniu aparatów szparkowych. Kluczowe znaczenie w określeniu funkcji acylowanych poliamin mają ich właściwości strukturalne, o czym świadczy odmienność reakcji izomerycznych glikozydów hordatyn. Zawartość niektórych metabolitów wzrastała zarówno w roślinach poddanych suszy jak i kontrolnych. Niewykluczone, iż zmiany te związane są z regulacją hormonalną (Treutter, 2006; Ballizany i in., 2012). W obrębie linii RIL w porównaniu z poszczególnymi odmianami obserwowano zwiększeniu poziomu reakcji. Niezwykle interesujące jest zagadnienie występowania wśród reakcji na suszę w 2011 r. obu izomerów hordatyn oraz pojawienie się odpowiedzi hordatyny C, nienotowanej w poprzednich doświadczeniach. Odmienność reakcji różnych izomerów hordatyn potwierdza przypuszczenia, co do wieloaspektowego oddziaływania tych metabolitów w czasie suszy. Analizy chemotaksonomiczne są powszechnie uważane za wartościowe źródło informacji na temat zależności międzygatunkowych lub międzyodmianowych (Wojakowska i in., 2013). Zaobserwowane różnice w składzie fenolowych metabolitów wtórnych u jęczmienia nie odzwierciedlały geograficznego pochodzenia poszczególnych odmian jak stwierdzono w pracy Frost i in., (1977). 15 metabolitów różnicowało odmiany w stadium siewki a 22 w stadium liścia flagowego. Siedem z nich było istotnych dla obu stadiów rozwojowych i wydaje się, że są one kluczowymi znacznikami chemicznymi dla odmian. Związki te zawierają acylacje kwasami synapinowym oraz ferulowym. Są to pochodne glikozydowe głównie izowiteksyny, ale też metoksylowanych flawonów trycyny oraz chryzoeriolu. Obserwowano także związek 18 metabolitów różnicujących odmiany w warunkach kontrolnych z reakcjami w suszy 12

13 6. Wnioski 1. Rośliny jęczmienia jarego (Hordeum vulgare L.) syntetyzują znaczną liczbę fenolowych metabolitów wtórnych. Wielkie zróżnicowanie międzyodmianowe ilościowej i jakościowej zawartości tych związków świadczy o istnieniu złożonych mechanizmów regulacyjnych ich biosyntezy, transportu i akumulacji. 2. Niektóre pochodne kwasów hydroksycynamonowych, hordatyn i flawonów zaangażowanie są w procesy aklimatyzacji roślin do stosowanego stresu środowiskowego. 3. Mechanizmy odpowiedzi roślin jęczmienia na deficyt wody, związane ze zmianami zawartości związków fenolowych, zależą od ich genotypu oraz fazy rozwojowej. 4. W czasie niedoboru wody zmianom ulega zawartość glikozydów flawonów i ich acylowanych pochodnych a także glikozydów hordatyn konstytutywnie istniejących w tkankach oraz następuje biosynteza nowych związków, które mogą pełnić funkcje fotoochronne i antyoksydacyjne. 5. Zwiększanie się akumulacji w liściach jęczmienia związków o właściwościach fotoochronnych takich jak metoksylowane formy kwasów fenylopropenowych, flawonów oraz ich koniugatów podczas niedoboru wody wskazuje na złożone reakcje roślin na stresy abiotyczne. 6. Zastosowanie chemicznych metod analitycznych opartych na spektrometrii mas i wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z zaawansowanymi metodami numerycznymi i bioinformatycznymi stanowi bardzo dobre narzędzie w poszukiwaniu markerów biologicznych odpowiedzi roślin na stresy. 1. Literatura Ballizany W.L., Hofmann R.W., Jahufer M., Zulfiqhar Z., Barrett B.A. (2012). Multivariate associations of flavonoid and biomass accumulation in white clover (Trifolium repens) under drought. Functional Plant Biology, 39: Ceoldo S., Toffali K., Mantovani S., Baldan G., Levi M., Guzzo F. (2009). Metabolomics of Daucus carota cultured cell lines under stressing conditions reveals interactions between phenolic compounds. Plant Science, 176: Evans P.T., Malmberg R.L. (1989). Do polyamines have roles in plant development? Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology, 40: Frost S., Harborne J.B., King L. (1977). Identification of the flavonoids in five chemical races of cultivated barley. Hereditas, 85: Grace S.C., Logan B.A., Adams W.W. (1998). Seasonal differences in foliar content of chlorogenic acids -phenylpropanoid antioxidant in Mahonia repens. Plant, Cell and Environment, 21:

14 He L, Jia X, Gao Z.L.R., Li R. (2011). Genotype-dependent responses of wheat (Triticum aestivum L.) seedlings to drought, UV-B radiation and their combined stresses. Afr. J. Biotechnol., 10: Kilian J., Whitehead D., Horak J., Wanke D., Weinl S., Batistic O. (2007). The AtGenExpress global stress expression data set: protocols, evaluation and model data analysis of UV-B light, drought and cold stress responses. Plant Journal., 50: Kolb C.A., Kaser M.A., Kopecky J., Zotz G., Riederer M., Pfundel E.E. (2001). Effects of natural intensities of visible and ultraviolet radiation on epidermal ultraviolet screening and photosynthesis in grape leaves. Plant Physiology, 127: Lee J., Vogt T., Hause B., Lobler M. (1997). Methyl jasmonate induces an O- methyltransferase in barley. Plant Cell Physiol., 38(7): Liu K., Fu H., Bei Q., Luan S. (2000). Inward potassium channel in guard cells as target for polyamine regulation of stomatal movements. Plant Physiology, 124: Schmidt A.M., Ormond D.P., Livingston N.J., Misra S. (2000). The interaction of ultraviolet-b radiation and water deficit in two Arabidopsis thaliana genotypes. Ann. Bot., 85: Schmitz-Hoerner R., Weissenböck G. (2003). Contribution of phenolic compounds to the UV-B screening capacity of developing barley primary leaves in relation to DNA damage and repair under elevated UV-B levels. Phytochemistry, 64(1): Stobiecki M., Staszków A., Piasecka A., Garcia-Lopez P.M., Zamora-Natera F., Kachlicki P. (2010). LC-MSMS profiling of flavonoid conjugates in wild Mexican lupine Lupinus reflexus. J. Nat. Prod., 73: Stochmal A., Oleszek W. (2007). Effect of acylation of flavones with hydroxycinnamic acids on their spectral characteristics. Natural Product Communications, 2(5): Treutter D. (2006). Significance of flavonoids in plant resistance: a review. Environ Chem. Lett., 4: Watkinson J.I., Sioson A.A., Vasquez-Robinet C., Shukla M., Kumar D., Ellis M., Heath L.S., Ramakrishnan N., Chevone B., Watson L.T., van Zyl L., Egertsdotter U., Sederoff R.R., Grene R. (2003). Photosynthetic acclimation is reflected in specific patterns of gene expression in drought-stressed loblolly pine. Plant Physiology, 133(4): Watson M.B., Malmberg R.L. (1996). Regulation of Arabidopsis thaliana (L.) arginine decarboxylase by potassium deficiency stress. Plant Physiology, 111: Wojakowska A., Piasecka A., García-López P.M., Zamora-Natera F., Krajewski P., Marczak Ł., Kachlicki P., Stobiecki M. (2013 C). Structural analysis and profiling of phenolic secondary metabolites of Mexican lupine species using LC-MS techniques. Phytochemistry, DOI: /j.phytochem