Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk. Mariusz Czyżniejewski

Transkrypt

1 Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk Mariusz Czyżniejewski Zmiany profili metabolitów wybranych traw z kompleksu Lolium-Festuca w odpowiedzi na stresy abiotyczne AUTOREFERAT Praca doktorska wykonana pod kierunkiem prof. dra hab. Piotra Kachlickiego w Instytucie Genetyki Roślin, Polskiej Akademii Nauk Poznań,

2 1. Streszczenie Trawy pastewne stanowią ważną agronomicznie i zróżnicowaną grupę roślin. Są wykorzystywane jako pasze dla bydła, które stanowi dla nas cenne źródło białka (mięso, mleko) i wapnia (mleko). Zmieniające się warunki klimatyczne, w tym coraz częstsze okresy suszy i bezśnieżne zimy, oraz rosnąca populacja ludzka sprawiają, że rolnictwo staje przed wyzwaniem pozyskania nowych gatunków traw pastewnych o wysokiej tolerancji na zmieniające się warunki klimatyczne oraz wysokiej wartości paszowej. Do uzyskania roślin o pożądanych cechach świetnie nadają się obcopylne trawy z kompleksu Lolium-Festuca, które stosunkowo łatwo tworzą mieszańce międzyrodzajowe, łączące wysoką tolerancję na różne czynniki stresowe, charakterystyczną dla roślin z rodzaju Festuca, z dobrymi parametrami paszowymi, charakterystycznymi dla traw z rodzaju Lolium. Pomimo coraz liczniejszych doniesień literaturowych na temat przebiegu odpowiedzi roślin na różne czynniki stresowe, wciąż nasza wiedza na ten temat jest ograniczona i dotyczy badania poszczególnych czynników stresowych osobno. W niniejszej pracy doktorskiej zaprezentowano wyniki pionierskich prac, z zakresu badania wpływu trzech abiotycznych czynników stresowych (chłód, zasolenie, susza) na te same genotypy losowo wybranych populacji traw z kompleksu Lolium-Festuca. Finalnie scharakteryzowano odpowiedź na działanie różnych abiotycznych czynników stresowych dwóch gatunków traw (kostrzewa trzcinowa, życica trwała) różniących się poziomem tolerancji na abiotyczne czynniki stresowe. Kostrzewa trzcinowa (Festuca arundinacea Schreb.) odmiana Kord wyróżniała się lepszą tolerancją na działanie wszystkich trzech abiotycznych czynników stresowych w stosunku do życicy trwałej (Lolium perenne L.) odmiana Solen. Analizy chemiczne z wykorzystaniem różnych technik chromatograficznych połączonych z spektrometrią mas pozwoliły na uzyskanie dużego zestawu danych, które następnie zostały poddane przetworzeniu z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych. Na przetworzonych danych przeprowadzono analizy statystyczne, które wykazały znaczące różnice w odpowiedzi na działanie bodźca stresowego pomiędzy badanymi gatunkami traw oraz pomiędzy różnymi rodzajami działających czynników stresowych. Co ciekawe, na ogół w kostrzewie trzcinowej mniejsza liczba metabolitów zmieniała swój poziom istotnie, co sugeruje, że zaobserwowane zmiany dotyczyły związków kluczowych dla tolerancji na działanie bodźca stresowego. Jednocześnie podjęto prace mające na celu scharakteryzowanie szeregu struktur związków fenolowych występujących u traw z kompleksu Lolium-Festuca, co do których 2

3 istnieją nieliczne doniesienia literaturowe. Wiedza ta jest niezbędna, do uzyskania pełnego obrazu zmian zachodzących w roślinie w odpowiedzi na działanie bodźca stresowego. Zastosowanie dwuetapowej chromatografii cieczowej z dwoma różnymi rodzajami faz stacjonarnych oraz zastosowaniem spektrometru mas z pułapką jonową i wysokorozdzielczego spektrometru mas z detektorem typu orbitrap, pozwoliło na częściowe rozwiązanie 62 struktur metabolitów fenolowych występujących u analizowanych dwóch gatunków traw z kompleksu Lolium-Festuca, przy czym 16 zidentyfikowano wyłącznie dla kostrzewy, natomiast 15 dla życicy trwałej. Uzyskane wyniki mogą zostać wykorzystane do określenie metabolomicznych markerów tolerancji na działanie abiotycznych czynników stresowych. Markery takie mogą wydatnie przyspieszyć prace hodowców nad uzyskiwaniem mieszańców międzyrodzajowych traw pastewnych o pożądanych cechach. 2. Wstęp Trawy pastewne są ważnymi roślinami uprawnymi, a łąki i pastwiska w Polsce zajmują powierzchnię ponad 4 milionów ha, co daje ponad 20% udział w ogólnej powierzchni gruntów rolnych. Ważnymi użytkowo gatunkami traw pastewnych są życice (życica trwała, Lolium perenne; życica wielokwiatowa, Lolium multiflorum) oraz kostrzewy (kostrzewa łąkowa, Festuca pratensis; kostrzewa trzcinowa, Festuca arundinacea). Gatunki te różnią się poziomem i jakością plonu, którymi to cechami wyróżniają się życice, a także zimotrwałością i odpornością na suszę oraz zasolenie, które są znacznie wyższe u kostrzew. Wprowadzane do użytkowania odmiany mieszańcowe Festulolium łączą korzystne cechy obydwu genomów rodzicielskich (Kosmala i in., 2006, 2007; Thomas i inni 2003; Turner i inni, 2012). W ostatnich latach obserwujemy postępujące zmiany klimatu, w związku z czym w polskim rolnictwie problem strat w plonach z powodu suszy i przymrozków nabiera coraz większego znaczenia. Obserwuje się wzrost częstości występowania susz, w latach , lat posuchy było 6 (co około 5 lat), natomiast w okresie odnotowano ich 13, czyli przeciętnie co 2 lata miała miejsce susza. Zwrócono też uwagę na wyjątkową katastrofalność niektórych susz, w tym w roku 2006 (Staniak i Kocoń, 2015). Jak wskazują Rapacz i inni (2014) w polskich warunkach klimatycznych zimowa pokrywa śnieżna o grubości cm zapewnia roślinom dostateczną ochronę przed spadkami temperatury, utrzymując temperatury przy podłożu w granicach około 0 C. Od 1922 roku powierzchnia zimowej pokrywy śnieżnej na półkuli 3

4 północnej zmniejszyła się o 7% i według różnych modeli zmian klimatycznych szacuje się że ulegnie dalszej redukcji o 7% do 25% do końca 21-wieku (Rapacz i inni, 2014). Odporność roślin na różne abiotyczne czynniki stresowe jest złożonym procesem obejmującym szereg zmian na poziomie genetycznym, biochemicznym, fizjologicznym i morfologicznym (Thomashow, 1999; Guy i inni, 2008; Sandve i inni, 2011; Huiying i inni, 2012; Kosmala i inni, 2012). Jednym z istotnych agronomicznie parametrów opisujących odpowiedź roślin na działanie abiotycznych czynników stresowych jest zdolność roślin do regeneracji i odrostu po okresie działania czynnika stresowego. O odpowiedzi roślin na działanie czynników stresowych decyduje zdolność gromadzenia różnorodnych związków chemicznych mających właściwości ochronne i umożliwiające regenerację oraz naprawienie powstałych uszkodzeń. 3. Cel pracy Rozpoczynając doświadczenia postawiono hipotezę mówiącą, że odpowiedź roślin na różne abiotyczne czynniki stresowe jest zróżnicowana. Celem pracy była weryfikacja hipotezy badawczej poprzez badanie metabolomicznej odpowiedzi wybranych genotypów traw z kompleksu Lolium Festuca poddanych działaniu trzech różnych abiotycznych czynników stresowych, tj. suszy, chłodu i zasolenia. Dla realizacji tak postawionego celu pracy doktorskiej postanowiono w pierwszym etapie prac dokonać identyfikacji metabolitów wtórnych obecnych w liściach traw, w tym zwłaszcza glikozydowych pochodnych związków fenolowych. Ponieważ, jak stwierdzono, większość identyfikowanych związków charakteryzowała się bardzo podobnymi właściwościami chromatograficznymi i strukturalnymi, jako narzędzie analityczne wybrano spektrometry mas, a instrumenty wysoko- i niskorozdzielczy zastosowano w połączeniu z ultrasprawnym i wysokosprawnym chromatografem cieczowym. Zmiany zawartości metabolitów pierwotnych i wtórnych postanowiono określić przy użyciu odpowiednio chromatografu cieczowego połączonego ze spektrometrem mas oraz ultrasprawnygo chromatografu cieczowego. Ostatnim etapem prac stała się matematyczna transformacja uzyskanych wyników analiz chromatograficznych oraz analiza statystyczna wyników ilościowych. Na podstawie uzyskanych wyników podjęto próbę określenia roli związków niskocząsteczkowych w odpowiedzi roślin na stresy abiotyczne. 4

5 4. Materiały i metody Materiał badawczy Materiał do badań stanowiły wybrane trawy z kompleksu Lolium Festuca, którymi były: kostrzewa trzcinowa Festuca arundinacea, odmiana Kord oraz życica trwała Lolium perenne, odmiana Solen, podczas testu chłodu w 2013 i 2014 roku oraz zasolenia i suszy w 2014 roku, a także mieszaniec międzyrodzajowy (F. pratensis i L. multiflorum) Festulolium odm. Felopa podczas testu chłodu w 2013 roku. Eksperymenty traktowania roślin poszczególnymi czynnikami stresowymi przeprowadzono w niezależnych eksperymentach na klonach tych samych genotypów każdego z badanych gatunków i mieszańca w 10 powtórzeniach biologicznych i 3 (2013)/4 (2014) powtórzeniach technicznych. W eksperymencie chłodu powtórzenia techniczne zduplikowano ze względu na dwa warianty temperaturowe (-9 C i -12 C (2013)/-13 C(2014)) traktowania mrozem. Eksperymenty traktowania czynnikami stresowymi Ocenę mrozoodporności roślin L. perenne odmiany Solen (2013, 2014) i F. arundinacea odmiany Kord (2013, 2014), Festulolium odmiana Felopa (2013) wykonano według dwuetapowej procedury stosowanej we wcześniejszych badaniach prowadzonych w Pracowni Cytogenetyki i Biologii Molekularnej IGR PAN (Kosmala i in. 2006, 2009). Próbki z roślin traktowanych zbierano w 3, 9 i 15 dniu aklimatyzacji oraz w 21 dniu odrostu. Eksperyment stresu zasolenia przeprowadzono podlewając co drugi dzień 37 ml (2014) lub 35 ml (2015) 0,25M roztworu NaCl przez 11 dni każdą z roślin traktowanych, a następnie przez 10 dni podlewając co drugi dzień wodą, podobnie jak przez cały eksperyment rośliny kontrolne. Próbki do analiz fizjologicznych (analiza względnej zawartości wody) oraz metabolomicznych zbierano w 3, 7 i 11 dniu traktowania oraz 10 dniu ponownego nawadniania z roślin traktowanych i kontrolnych. Eksperyment stresu suszy przeprowadzono obniżając wilgotność gleby do wartości potencjału wodnego gleby w zakresie 3,2 3,8 pf i utrzymywano ten poziom przez 11 dni. Następnie przywrócono nawadnianie roślin traktowanych do poziomu wilgotności gleby na zakresie potencjału wodnego gleby w zakresie 2,2 3,0 pf na 10 dni. W drugiej serii roślin, stanowiącą kontrolę, przez 21 utrzymywano wilgotność gleby na zakresie potencjału wodnego gleby w zakresie 2,2 3,0 pf. Próbki do analiz fizjologicznych (analiza względnej zawartości wody) oraz metabolomicznych zbierano w 3, 7 i 11 dniu traktowania oraz 10 dniu nawadniania po traktowania z roślin traktowanych i kontrolnych. 5

6 Analizy metabolomiczne i statystyczne Ekstrakcje prób przeprowadzono zgodnie z protokołami dostępnymi w literaturze (Stobiecki i inni 2010). Analizy zmian profili metabolitów pierwotnych i wtórnych przeprowadzono z wykorzystaniem technik chromatografii gazowej (GC) połączonej z spektrometrem mas (EI-TOF MS) oraz chromatografii cieczowej (HPLC, UPLC) połączonej z spektrometrem mas (ESI-IT MS i Q-Orbitrap MS). Analizy mające na celu identyfikację nowych struktur metabolitów fenolowych występujących w trawach pastewnych przeprowadzono z wykorzystaniem technik chromatografii cieczowej (HPLC, UPLC) połączonej z spektrometrem mas (ESI-IT MS i Q-Orbitrap MS), zgodnie z danymi literaturowymi (Stobiecki i inni 2015), z pewnymi modyfikacjami. Przetworzenie danych (skrypty własne) oraz analizy statystyczne (Genstat) wykonała dr Aneta Sawikowska. 5. Wyniki Parametry fizjologiczne Analizy statystyczne wykazały istotne różnice w poziomie ocen odrostu pomiędzy kostrzewą trzcinową, życicą trwałą i mieszańcem międzyrodajowym zarówno dla roślin poddanych wcześniej mrożeniu w -9 C (2013, 2014), jak i w przypadku -12 C dla prób z 2013 roku. Nie analizowano prób mrożonych w -13 C w 2014 roku, ze względu na zbyt małą liczbę obiektów badawczych, które przeżyły mrożenie w tej temperaturze. Wyniki analizy statystycznej dla kostrzewy trzcinowej traktowanej stresem solnym nie wykazały istotnych różnic w poziomie względnej zawartości wody (RWC) zarówno w porównaniu roślin traktowanych z kontrolnymi, jak i pomiędzy punktami czasowymi oraz w interakcji tych dwóch czynników. W odniesieniu do życicy trwałej traktowanej stresem solnym przeprowadzając analizę statystyczną stwierdzono jedynie statystycznie istotną różnicę w poziomie względnej zawartości wody pomiędzy roślinami traktowanymi i kontrolnymi. Wyniki analizy statystycznej dla kostrzewy trzcinowej traktowanej stresem suszy wykazały istotne różnice w poziomie względnej zawartości wody (RWC) w porównaniu roślin traktowanych z kontrolnymi. Nie stwierdzono natomiast istotnych zmian poziomu względnej zawartości wody w interakcji traktowania i czasu zbioru prób. W odniesieniu do życicy trwałej przeprowadzając wspomnianą analizę stwierdzono statystycznie istotną różnicę w poziomie względnej zawartości wody pomiędzy roślinami traktowanymi i kontrolnymi, oraz w interakcji efektu traktowania i czasu zbioru prób. 6

7 Analizy metabolomiczne analizy GC-MS Stres chłodu Wyniki ogólnej analizy wariancji dla prób z roślin poddanych stresowi chłodu w 2013 (próg istotności <0,01, bez poprawki Bonferroniego) wskazują, że najwięcej sygnałów 54 dla prób nierozcieńczonych i 40 dla prób rozcieńczonych wykazuje istotny efekt traktowania. 9 metabolitów wykazało istotny efekt traktowania, natomiast 45 istotny efekt traktowania zależny od czasu zbioru prób. Stres solny W wyniku analizy statystycznej stwierdzono u kostrzewy istotne zmiany poziomu dla 8 związków (kwas glicerynowy, kwas itakonowy, trójetanoloamina, ksyloza, ryboza, kwas cytrynowy, lizyna, galaktinol). Stwierdzono istotną różnicę w poziomie sygnału dla roślin traktowanych w stosunku do kontrolnych w powiązaniu z czasem traktowania dla kwasu glicerynowego, ksylozy, rybozy i galaktinolu. U życicy trwałej zaobserwowano istotne zmiany poziomu zawartości 6 metabolitów: kwasu protokatechowego, dwupeptydu alanyloalaniny, kwasu 4-aminomasłowego, kwasu bursztynowego, kwasu mlekowego oraz N,Ndwumetyloglicyny. Spośród nich tylko kwas bursztynowy wykazywał wyłącznie efekt traktowania niezależny od czasu zbioru prób. Stres suszy Na podstawie wyników analizy statystycznej stwierdzono u kostrzewy trzcinowej istotną różnicę w poziomie sygnałów pomiędzy roślinami traktowanymi i kontrolnymi dla 14 metabolitów (gencjobioza, izoleucyna, kwas lyksonowy, kwas 4-aminomasłowy, kwas asparaginowy, kwas erytronowy, lizyna, putrescyna, treonina, tryptofan, tyrozyna i walina). Dla innych 8 związków stwierdzono statystycznie istotną interakcję pomiędzy traktowaniem a punktami czasowymi zbioru prób. U życicy trwałej 14 zidentyfikowanych związków zmieniało poziom w interakcji traktowania i punktu czasowego, w którym zebrano próby. U życicy trwałej zidentyfikowano 35 związków, dla których stwierdzono istotny efekt poddania roślin stresowi suszy, przy jednoczesnym braku istotnej interakcji traktowania i czasu, w którym zbierano próby. Identyfikacja struktur metabolitów wtórnych Zarówno w próbach z liści życicy trwałej jak i kostrzewy trzcinowej zidentyfikowano izomery 3-, 4- i 5- kwasu kawowochinowego w formie trans oraz kwas 5-cis- kawowochinowy. Dla pochodnych ferulowochinonowych zidentyfikowany izomery 3, 4 i 5 u obu badanych 7

8 gatunków traw. W przypadku pochodnych para-kumarowochinowych zidentyfikowano tylko izomery 3 i 5. 6-C-heksozylo-8-C-heksozyd apigeniny zidentyfikowano zarówno w liściach życicy trwałej jak i w kostrzewie trzcinowej, natomiast 6-C-heksozylo-8-C-pentozyd apigeniny. W liściach życicy trwałej zidentyfikowano 6 mono-o-glikozylowanych pochodnych następujących flawonoidów: kwercetyna (podstawiona w pozycji 3), kempferol (2 izomery), izoramnetyna, chryzoeriol i trycyna. Ze względu na obserwowany rozmiar fragmentów odpowiadających grupom cukrowym pośród dwucukrowych pochodnych flawonoidów, którymi są podstawione aglikony oraz sposobu ich połączenia w analizowanych próbach można było wyróżnić: a) dwu-o-heksozydy (162 amu+162 amu) b) O-pentozylo-O-heksozyd (132 amu+162 amu) c) O-dwuheksozydy (324 amu) d) O-ramnozyloheksozydy (308 amu) e) O-glukuroiloheksozydy (338 amu) f) O-pentozyloheksozydy (294 amu) g) O-glukuroilopentozydy (308 amu). W przypadku trój-o-glikozylowanych pochodnych flawonoidów ze względu na rodzaj grup cukrowych, którymi były podstawione aglikony oraz sposobu ich połączenia w analizowanych próbach można było wyróżnić: a) O-heksozylo-O-ramnozyloheksozydy b) O-heksozylo-O-glukuroiloheksozydy c) O-heksozylo-O-pentozyloheksozyd d) O-ramnozylo-(1"->2")-[ramnozylo-(1"->6")-heksozyd] e) O-ramnozylo-(1"->2")-[pentozylo-(1"->6")-heksozyd]. Zidentyfikowano u życicy trwałej jedną strukturę cztero-o-glikozylowaną, którą jest O-glukuroiloheksozylo-O-ramnozyloheksozyd kempferolu. W próbach z liści życicy trwałej zidentyfikowano dwie pochodne monoglikozydowe, trzy pochodne dwuglikozydowe i jedną pochodną trójglikozydową, w których jeden z podstawników cukrowych był dodatkowo acylowany kwasem malonowym. Zidentyfikowano jedną strukturę acylowaną kwasem kawowym, którą był O-heksozylo-O-kawoiloheksozyd kempferolu, zidentyfikowany w próbach z liści życicy trwałej. 8

9 W próbach z liści kostrzewy trzcinowej zidentyfikowano jedną pochodną lignanową. Związkiem tym był 4,4 -dwu-o-beta-glukopiranozyd hydroksymatairezinolu. Analizy metabolomiczne metabolity fenolowe Stres chłodu 2013 Wyniki analiz statystycznych wskazują na istotne zmiany poziomu dla 10 wierzchołków chromatograficznych z analizy kostrzewy trzcinowej. Dla życicy trwałej stwierdzono statystycznie istotna zmianę poziomu dla 22 wierzchołków chromatograficznych. W mieszańcu międzyrodzajowym zaobserwowano 11 wierzchołków chromatograficznych, których poziom zmieniał się statystycznie istotnie. Stres chłodu 2014 Stwierdzono u kostrzewy trzcinowej statystycznie istotną różnicę poziomu akumulacji dla 9 wierzchołków chromatograficznych w zależności od interakcji czasu zbioru prób i traktowania, z czego O-heksozyd kwasu dwuhydroksybenzoesowego wykazywał równocześnie istotną różnicę w zależności od traktowania. Dla 6 metabolitów u życicy trwałej, tj. kwasów 3-, 4-, 5-trans-kawowochinowego i 5- ferulowochinowego, O-heksozydu kwasu 3-kawowochinowego, O-heksozydu kwasu dwuhydroksybenzoesowego, stwierdzono statystycznie istotną interakcję czasu i traktowania. Stres solny 2014 U kostrzewy trzcinowej O-heksozyd izoramnetyny wykazywał jedynie istotnie wyższy poziom akumulacji w roślinach traktowanych w stosunku do kontrolnych (istotny efekt traktowania). Wierzchołek chromatograficzny dla koleujących O-heksozylo-Oramnozyloheksozydu izoramnetyny i dwu-o-heksozydu izoramnetyny wykazywał statystycznie istotną różnicę poziomu sygnału w interakcji czasu i traktowania. Analiza statystyczna dla prób z życicy trwałej wykazała również istotną różnicę poziomu akumulacji dla 16 metabolitów w zależności od interakcji czasu i traktowania. Stres suszy 2014 Dla kwasów 3-ferulowochinowego, 3- i 4-trans-kawowochinowych oraz O- heksozylo-o-pentozyloheksozydu izoramnetyny zidentyfikowanych w kostrzewie trzcinowej stwierdzono statystycznie istotną różnice poziomu akumulacji w zależności od traktowania. Dla wszystkich czterech metabolitów zaobserwowano wyższy akumulacji w roślinach traktowanych w stosunku do kontrolnych. O-heksozylo-O-pentozyloheksozyd izoramnetyny 9

10 wykazywał również statystycznie istotną różnicę w interakcji czasu i traktowania, podobnie również 8 innych wierzchołków chromatograficznych. U życicy trwałej dla 8 wierzchołków chromatograficznych stwierdzono statystycznie istotną zmianę poziomu akumulacji w interakcji czasu i traktowania. Dla 6 spośród wspomnianych ośmiu wierzchołków stwierdzono również statystycznie istotną różnicę w poziomie akumulacji pomiędzy roślinami traktowanymi a kontrolnymi. 6. Dyskusja Stres chłodu Kostrzewa trzcinowa, jako gatunek blisko spokrewniony, powstały z połączenia diploidalnego genomu F. pratensis z dwoma genomami tetraploidalnego F. glaucescens, posiada geny warunkujące wyższy poziom tolerancji na działanie niskich temperatur. Analizy statystyczne ocen odrostu w 21 dniu wznowienia wegetacji po mrożeniu w eksperymentach stresu chłodu w 2013 i 2014 roku potwierdzają tą hipotezę, ponieważ kostrzewa uzyskała istotnie wyższe oceny odrostu w stosunku do życicy. Badaniami objęto także odmianę Felopa należącą do syntetycznego rodzaju Festulolium, a powstałą ze skrzyżowania F. pratensis oraz Lolium multiflorum (życica wielokwiatowa). Warte jest podkreślenia, że Felopa, zgodnie z postulowanym ważnym aspektem uzyskiwania mieszańców międzyrodzajowych łączenia korzystnych cech obu rodzajów, badana podczas eksperymentu stresu chłodu w 2013 roku, uzyskała oceny odrostu pośrednie, pomiędzy uzyskanymi przez kostrzewę trzcinową i życicę trwałą. Analiza zmian profili metabolitów dla danych z eksperymentu stresu chłodu z 2013 roku uzyskanych technikami GC-MS, wskazała na istotną zmianę poziomu 45 metabolitów spośród 46 analizowanych. Wspólną cechą charakterystyczną dla wszystkich sygnałów, jest odmienny przebieg zmian poziomu sygnału dla prób z kostrzewy trzcinowej w stosunku do tendencji obserwowanych w próbach z życicy trwałej i odmiany Felopa. Powyższa obserwacja, w połączeniu z wynikami analizy ocen odrostu, sugeruje kluczową rolę zmian w profilach metabolitów u kostrzewy trzcinowej w tolerancji na stres chłodu. Jest to obserwacja zbieżna z postulowaną przez Kosmalę i współautorów (2007) wyższą zimotrwałością kostrzewy trzcinowej w stosunku do traw z rodzaju Lolium, w związku z obecnością kopi genomu F. pratensis, gatunku znanego z wysokiej zimotrwałości. Zmiany poziomu metabolitów fenolowych w odpowiedzi na traktowanie chłodem oraz następujące po nim mrożenie wskazują na istotne różnice pomiędzy badanymi gatunkami traw, a w przypadku eksperymentu z 2013 roku, także mieszańcem międzyrodzajowym. W 10

11 eksperymencie z 2013 roku najmniejsza liczba metabolitów fenolowych ulegała istotnej zmianie poziomu w liściach kostrzewy trzcinowej. Uzyskany rezultat w połączeniu z wynikami oceny odrostu sugeruje, że kluczowe dla tolerancji na chłód metabolity fenolowe zmieniały zawartość u kostrzewy trzcinowej.. Najliczniejszą grupą metabolitów fenolowych, która reagowała istotnie na stres chłodu są pochodne flawonolowe, co jest zgodne z wynikami uzyskanymi przez Korn a i wsp. (2008) u A. thaliana. Wyniki eksperymentu stresu chłodu przeprowadzonego w 2014 roku wskazują, że istotne jest by równolegle przy każdym zbiorze prób z roślin traktowanych, zbierać również próby z roślin kontrolnych, ponieważ także rośliny rosnące w warunkach kontrolnych wykazują zmienność poziomu metabolitów w czasie. Stres solny Kostrzewa trzcinowa jest uznawana za gatunek charakteryzujący się wyższą tolerancją na niedobór wody w stosunku do życicy trwałej (Kosmala i inni, 2009). W związku z powyższym faktem poprzez analogię powinna ona również wykazywać wyższą tolerancję na warunki stresu solnego. Wyniki analizy statystycznej względnej zawartości wody (RWC) potwierdziły tę hipotezę, ponieważ nie wykazano istotnych różnic w poziomie RWC pomiędzy traktowanymi i kontrolnymi roślinami kostrzewy trzcinowej oraz w interakcji z czasem zbioru prób dla obu gatunków. Pomimo ograniczonego wpływu podawanego wodnego roztworu soli na traktowane rośliny, odzwierciedlonego niewielkimi zmianami względnej zawartości wody (RWC) w liściach badanych roślinach, analizy danych uzyskanych technikami GC-MS wskazują na istotne zmiany poziomu kilku metabolitów - 8 dla kostrzewy i 5 dla życicy. W liściach kostrzewy trzcinowej wzrósł poziom kwasu glicerynowego w roślinach traktowanych w stosunku do kontrolnych, podobnie jak u znanego halofita, topoli eufrackiej. Stwierdziłem też wyższy poziom kwasu cytrynowego u kostrzewy, podobnie jak to obserwowano u Lotus japonica i odwrotnie niż u dwóch odmian kukurydzy, różniących się poziomem tolerancji na stres solny, u których Richter i inni (2015) stwierdzili spadek poziomu wszystkich metabolitów szlaku kwasu cytrynowego. Zaobserwowany niższy poziom trójetanoloaminy w traktowanych roślinach kostrzewy trzcinowej w stosunku do kontroli jest zgodny z wynikami eksperymentu stresu solnego dla pszenicy (Janda i wsp., 2016), dla której stwierdzono spadek ogólnej zawartości poliamin w trakcie aklimatyzacji do stresu solnego. Poziom lizyny w liściach kostrzewy był istotnie wyższy, co sugeruje jej istotną rolę w odpowiedzi na stresy solny. Wszystkie wspomniane metabolity reagujące wzrostem poziomu są znane jako osmoprotektanty. 11

12 Analiza zmian poziomu metabolitów fenolowych wykazała istotne różnice poziomu dla dwóch metabolitów zidentyfikowanych w próbach z kostrzewy trzcinowej i 16 metabolitów zidentyfikowanych u życicy trwałej. Ta dysproporcja w liczbie metabolitów o statystycznie istotnych różnicach w połączeniu z wynikami analizy zmian poziomu RWC, sugeruje istotną dla tolerancji na stres solny odpowiedź zmian metabolitów u kostrzewy. Stwierdziłem istotnie wyższy poziom zawartości O-heksozydu izoramnetyny u kostrzewy. U obu analizowanych gatunków zidentyfikowano dwu-o-heksozyd izoramnetyny, przy czym w przypadku kostrzewy trzcinowej koleuował on z O-heksozylo-O-ramnozyloheksozydem izoramnetyny. U życicy różnice poziomu dla dwu-o-heksozydu izoramnetyny były mniejsze niż to miało miejsce dla wspomnianych koelujących metabolitów u kostrzewy i odmienny przebieg. Izoramnetyna obok kwercetyny jest znana jako najwydajniejszy zmiatacz wolnych rodników, a w szczególności H2O2 (Pollestri i Tettini, 2013). W związku z powyższymi obserwacjami i wspomnianym rolą izoramnetyny, należy podejrzewać, że pochodne tego flawonolu skutecznie ograniczały powstawanie wolnych rodników w kostrzewie, w związku z czym szkodliwy efekt oddziaływania bodźca stresowego został dodatkowo ograniczony. Stres suszy Analizy statystyczne zmian poziomu względnej zawartości wody (RWC) dla prób z eksperymentu stresu suszy wskazują na istotny efekt traktowania dla kostrzewy trzcinowej, natomiast nie zaobserwowano istotnych zmian w powiązaniu z czasem zbioru prób. W odniesieniu do życicy trwałej zaobserwowano istotne zmiany poziomu względnej zawartości wody, jako efektu traktowania oraz w powiązaniu z czasem zbioru prob. Ważne jest, że poziom względnej zawartości wody jest wyższy u kostrzewy niż u życicy, co wskazuje na istnienie wydajniejszych mechanizmów ograniczających utratę wody z rośliny na drodze transpiracji, a co za tym idzie wyższy poziom tolerancji na stres suszy (Kosmala i inni, 2012). Wyniki analiz danych uzyskanych technikami GC-MS wskazują na istotne różnice w poziomie wielu metabolitów. Mniejsza liczba metabolitów reagowała istotnymi zmianami poziomu u kostrzewy w stosunku do życicy, co w połączeniu z wynikami RWC wskazuje, na reakcję istotnych dla odpowiedzi na stres suszy metabolitów u pierwszego rodzaju traw. Zaobserwowałem u kostrzewy podwyższony poziom izoleucyny, kwasu asparaginowego, lizyny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny i waliny, co jest zgodne m.in. z doniesieniami Shanker a i innych (2014) w kontekście grochu zwyczajnego, czy wynikami uzyskanymi przez Nakabayashi ego i współpracowników (2014) na A. thaliana. Istotnie w interakcji z czasem zmieniał się również poziom proliny. Podczas analiz GC-MS metabolitów pierwotnych z liści 12

13 roślin traw poddanych stresowi suszy nie stwierdzono istotnych zmian zawartości cukrów u kostrzewy poza gencjobiozą, dla której wykazano istotny efekt traktowania oraz turanozą, dla której wystąpił istotny efekt traktowania w interakcji z czasem. U obu badanych gatunków zaobserwowano istotnie wyższy poziom putrescyny w liściach roślin poddanych stresowi suszy w porównaniu z roślinami kontrolnymi. Wykazano wcześniej, że podwyższony poziom tej poliaminy podnosił poziom tolerancji ryżu (Oryza sativa L.) na stres suszy i był skorelowany z wyższym poziomem plonu ziarna (Yang i in. 2007). Jednakże w przeprowadzonych badaniach traw u życicy zaobserwowano istotny efekt traktowania o podobnym poziomie, jaki wystąpił u kostrzewy, co sugeruje że w przypadku traw pastewnych ta poliamina może nie mieć aż tak dużego znaczenia w kontekście zróżnicowanej tolerancji na stres suszy. Porównując zmiany poziomu metabolitów fenolowych, zaobserwowałem, że w przeciwieństwie do wcześniej omawianych tendencji dotyczących metabolitów pierwotnych, większa liczba metabolitów wtórnych statystycznie istotnie zareagowała u kostrzewy niż u życicy. Istotnie zmieniał się poziom kilku O-glikozylowanych flawonoidów. U kostrzewy istotnym wzrostem poziomu podczas traktowania reagowały O-heksozylo-Opentozyloheksozyd izoramnetyny i O-ramnozyloheksozyd izoramnetyny. Warty podkreślenia jest fakt, że w przeprowadzonych pracach nie zaobserwowano istotnych zmian poziomu pochodnych kwercetyny, opisanych dla innych roślin z rodziny Poaceae wyczyńca łąkowego (Alopecurus pratensis L.) i kłosówki wełnistej (Holcus lanatus L.), (Gargallo-Garriga i in., 2015). Kwercetyna i izoramnetyna są znane jako najwydajniejsze zmiatacze wolnych rodników, a w szczególności nadtlenku wodoru. Brak istotnych zmian poziom kwercetyny nie wyklucza jej roli w tym procesie w analizowanych gatunkach traw. Metoksylowane flawonoidy mają drugie maksimum absorpcji przesunięte w kierunku dłuższych fal. Obecność metabolitów posiadających w swojej strukturze grupę metoksylową, takich jak trycyna, chryzoeriol i izoramnetyna, rozszerza zakres pochłaniania szkodliwego promieniowania UV, dzięki czemu mogą one efektywniej ograniczać powstawanie wolnych rodników. Identyfikacja struktur metabolitów fenolowych W dotąd dostępnych opracowaniach skupiono się na identyfikacji aglikonów związków fenolowych występujących u traw (Klejdus i Kubáň, 2000; Ponce i inni, 2009). Podjęto również nieliczne próby identyfikacji glikozylowanych pochodnych flawonoidów, przy czym rozpoznano głównie 3-ramnozyloglukozydowe pochodne kwercetyny, kempferolu 13

14 i izoramnetyny (De Bertoldi i inni, 2012). W niniejszej pracy przeprowadziłem identyfikację metabolitów fenolowych wyizolowanych w skali preparatywnej z życicy trwałej (Lolium perenne L.) odmiany Solen. Kilka dodatkowych struktur fenolowych zidentyfikowałem na etapie adnotacji do odpowiednich wierzchołków po wstępnym przetworzeniu danych z analiz ilościowych dla życicy oraz kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea Schreb.) odmiany Kord. Dzięki przeprowadzonym przy użyciu wysokorozdzielczego spektrometru mas dokładnym pomiarom stosunku masy do ładunku, możliwe było rozróżnienie przyłączonych podstawników, wykluczające alternatywne struktury. Możliwość znalezienia alternatywnych struktur wynikała z wykorzystania we wstępnych badaniach spektrometru mas z pułapką jonową charakteryzującego się niską dokładnością pomiaru masy. W związku z powyższym np. do obserwowanego na widmie neutralnego fragmentu 162 amu można przypisać kilka struktur różniących się kompozycją atomową: heksoza C6H10O5, kwas kawowy C9H6O3, acetal C5H6O6 (Mikołajczyk-Bator i inni, 2016; Piasecka i inni, 2015). Zidentyfikowałem szereg struktur kwasów hydroksycynamonowych, pośród których przeważały pochodne kwasu chinowego, podstawione w różnych położeniach cząsteczkami kwasów p-kumarowego, kawowego i ferulowego. Zidentyfikowałem również szereg struktur O-glikozylowanych pochodnych flawonoidów, dwie C-glikozylowane pochodne apigeniny, a także nierozpoznaną wcześniej strukturę lignanową u kostrzewy trzcinowej. Podobnie jak Johnson i współpracownicy (2002) zauważyłem znaczną pod względem ilościowym zawartość kwasu 5-kawowochinowego w stosunku do innych związków fenolowych. Co istotne, stwierdziłem obecność izomerów cis i trans tego kwasu. 7. Wnioski 1) Kostrzewa trzcinowa (Festuca arundinacea Schreb.) odmiany Kord wykazuje wyższy poziom tolerancji niż życica trwała (Lolium perenne L.) odmiany Solen na działanie nie tylko stresu suszy, o czym donoszą liczne opracowania literaturowe, ale także stresu chłodu, zasolenia. 2) W wyniku traktowania stresem chłodu istotną odpowiedź na działanie bodźca stresowego wykazała znaczna liczba metabolitów u kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea Schreb.) odmiany Kord, życicy trwałej (Lolium perenne L.) odmiany Solen i mieszańca międzyrodzajowego z rodzaju Festulolium odmiany Felopa. 3) W odpowiedzi na stres chłodu kluczową rolę u kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea Schreb.) odmiany Kord pośród metabolitów fenolowych odegrały: O-ramnozyloheksozyd 14

15 kempferolu, O-ramnozyloheksozydu izoramnetyny oraz kwas 3-ferulochinowy i kwas 3- trans-kawowochinowy. 4) W odpowiedzi na stres solny istotną rolę u kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea Schreb.) odmiany Kord pośród metabolitów odegrały: kwasy glicerynowy i cytrynowy, dwu-o-heksozyd izoramnetyny i koelujące dwu-o-heksozyd izoramnetyny z O- heksozylo-o-ramnozyloheksozydem izoramnetyny, które pełnią istotną rolę w tolerancji na działanie czynnika stresowego. 5) W odpowiedzi na stres suszy znaczącą rolę u kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea Schreb.) odmiany Kord odegrała: większość aminokwasów, gencjobioza, turanoza, putrescyny, kwasu γ-aminomasłowego oraz flawonole. 6) Odpowiedź na poziomie metabolomu na działanie różnych abiotycznych czynników stresowych (chłód, solny, susza) u analizowanych dwóch gatunków traw (Festuca arundinacea Schreb., Lolium perenne L.) z kompleksu Lolium-Festuca charakteryzuje się znacznym zróżnicowaniem powiązanym z rodzajem czynnika stresowego i badanego gatunku traw. 7) Analizowane gatunki traw z kompleksu Lolium-Festuca charakteryzują wyższą liczbą metabolitów zmieniających swój poziom w zależności od fazy wzrostu niż zmieniających swój poziom w efekcie traktowania czynnikiem stresowym. 8) Metabolity fenolowe u analizowanych dwóch gatunków traw z kompleksu Lolium-Festuca charakteryzują się różnorodnością miejsc podstawienia na cząsteczce aglikonu oraz rodzajów przyłączonych fragmentów. 8. Literatura De Bertoldi C., De Leo M., Ercoli L., Braca A. (2012). Chemical profile of Festuca arundinacea extract showing allelochemical activity. Chemoecology 22: Gargallo Garriga A., Sardans J., Pérez Trujillo M., Oravec M., Urban O., Jentsch A., Krejling J., Beierkuhnlein C., Parella T., Peñuelas J. (2015). Warming differentially influences the effects of drought on stoichiometry and metabolomics in shoots and roots. New Phytologist 207: Guy C, Kaplan F, Kopka J, Selbig J, Hincha DK (2008). Metabolomics of temperature stress. Physiol. Plant. 132: Huiying L., Tao H., Jinmin F. (2012). Identification of genes associated with adaptation to NaCl toxicity in perennial ryegrass (Lolium perenne L.). Ecotoxicology and Environm. Safety 79: Janda T., Darko É., Shehata S., Kovács V., Pál M., Szalai G. (2016). Sal acclimation processes in wheat. Plant Physiology and Biochemistry 101:

16 Johnson A.W., Snook M.E., Wiseman B.R. (2002). Green leaf chemistry of various turfgrasses: differentiation and resistance to fall armyworm. Crop Sci. 42: Klejdus B., Kubáň V. (2000). High performance liquid chromatographic determination of phenolic compounds in seed exudates of Festuca arundinacea and F. pratense. Phytochemical Analysis 11: Korn M., Peterek S., Mock H.P., Heyer A.G., Hincha D.K. (2008). Heterosis in freezing tolerance, and sugar and flavonoid contents of cross between Arabidopsis thaliana accessions of widely varying freezing tolerance. Plant Cell Environm. 31: Kosmala A., Bocian A., Rapacz M., Jurczyk B., Zwierzykowski Z. (2009). Identification of leaf proteins differentially accumulated during cold acclimation between Festuca pratensis plants with distinct levels of frost tolerance. J. of Experimental Botany 60 (12): Kosmala A., Perlikowski D., Pawłowicz I., Rapacz M. (2012). Changes in the chloroplast proteome following water deficit and subsequent watering in a high- and low-drought-tolerant genotype of Festuca arundinacea. J. of Experimental Botany 63(17): Kosmala A, Zwierzykowski Z, Gąsior D, Rapacz M, Zwierzykowska E, Humphreys M.W. (2006). GISH/FISH mapping of genes for freezing tolerance transferred from Festuca pratensis to Lolium multiflorum. Heredity 96: Kosmala A. Zwierzykowski Z, Zwierzykowska E, Łuczak M, Rapacz M, Gąsior D, Humphreys M.W. (2007). Introgression-mapping of the genes for winter hardiness and frost tolerance from Festuca arundinacea into Lolium multiflorum. J. Hered. 98: Mikołajczyk-Bator K., Błaszczyk A., Czyżniejewski M., Kachlicki P. (2016). Characterisation and identification of triterpene saponins in roots of red beets (Beta vulgaris L.) using two HPLC-MS systems. Food Chemistry 192: Nakabayashi R., Yonekura Sakakibara K., Urano K., Suzuki M., Yamada Y., Nishizawa T., Matsuda F., Kojima M., Sakakibara H., Shinozaki K., Michael A.J., Tohge T., Yamazaki M., Saito K. (2014). Enhancement of oxidative and drought tolerance in Arabidopsis by overaccumulation of antioxidant flavonoids. The Plant Journal 77: Piasecka A., Sawikowska A., Krajewski P., Kachlicki P. (2015). Combined mass spectrometric and chromatographic methods for in depth analysis of phenolic secondary metabolites in barley leaves. J. Mass Spectrom. 50: Pollastri S., Tattini M. (2011). Falvonols: old compounds for old roles. Annals of Botany 108: Ponce M.A., Bompadre M.J., Scervino J.M., Ocampo J.A., Chaneton E.J., Godeas A.M. (2009). Flavonoids, benzoic acids and cinnamic acids isolated from shoots and roots of Italia rye grass (Lolium multiflorum Lam.) with and without endophyte association and arbuscular mycorrihizal fungus. Biochem. Syst. Ecol. 37: Rapacz M., Ergon Å., Höglind M., Jørgensen M., Jurczyk B., Østrem L., Rognli O.A., Tronsmo A.M. (2014). Overwintering of herbaceous plants in a changing climate. Still more questions than answers. Plant Science 225:

17 Richter J.A., Erban A., Kopka J., Zörb C. (2015). Metabolic contribution to salt stress in two maize hybrids with contrasting resistance. Plant Science 233: Sandve R.S., Kosmala A., Rudi H., Fjellheim S., Rapacz M., Toshihiko Y., Rognli O.A. (2011). Molecular mechanisms underlying frost tolerance in perennial grasses adapted to cold climates. Plant Science 180: Shanker A.K., Maheswari M., Yadav S.K., Desai S., Bhanu D., Bajaj Attai N., Venkateswarlu B. (2014). Drought stress responses in crops. Funct. Integr. Genomics 14: Staniak M., Kocoń A. (2015). Forage grasses under drought stress in conditions of Poland. Acta Physiol. Plant 37:116, DOI: /s Stobiecki M., Kachlicki P., Wojakowska A., Marczak Ł. (2015). Application of LC/MS systems to structural characterization of flavonoids glycoconjugates. Phytochemistry letters, 11: Stobiecki M., Staszków A., Piasecka A., Garcia Lopez P.M., Zamora Natera F., Kachlicki P. (2010). LC MS/MS profiling of flavonoids conjugates In Wild Mexican lupine Lupines reflexus. J. Nat. Prod. 73: Thomas H.M., Morgan W.G., Humphreys M.W. (2003). Designing grasses with a future combining the attributes of Lolium and Festuca. Euphytica 133: Turner L.R., Holloway Phillips M.M., Rawnsley R.P., Donaghy D.J., Pembleton K.G. (2012). The morphological and physiological responses of perennial ryegrass (Lolium perenne L.), cocksfoot (Dactylis glomerata L.) and tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.; syn. Schedonorus phoenix Scop.) to variable water availability. Grass and Forage Science 67: Thomashow MF (1999). Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: Yang J., Zhang J., Liu K., Wang Z., Liu L. (2007). Involvement of polyamines in the drought resistance of rice. Journal of Experimental Botany 58(6):