Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli izolowanych od osób z zespołem jelita nadwrażliwego

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 Volume 48 Number Praca oryginalna Original Article Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli izolowanych od osób z zespołem jelita nadwrażliwego Characteristics of invasive potential of enteroaggregative Escherichia coli strains isolated from individuals with irritable bowel syndrome Anna Krystyna Duda, Beata Sobieszczańska Katedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu Streszczenie Zespół jelita nadwrażliwego (IBS, ang. irritable bowel syndrome) jest przewlekłym, czynnościowym zaburzeniem funkcji jelit. Chociaż wśród czynników predysponujących do rozwoju IBS wymienia się m.in. przebyte, bakteryjne zakażenia przewodu pokarmowego, dokładna rola bakterii w patomechanizmie tej jednostki chorobowej jest nieznana. Opisana zdolność inwazji enteroagregacyjnych szczepów E. coli (EAEC) do komórek nabłonka jelita oraz częsta izolacja tych bakterii od osób z IBS dały podstawę niniejszym badaniom, których celem była ocena zdolności inwazyjnych EAEC izolowanych od osób z IBS oraz genów kodujących inwazyny u tych szczepów. Ponadto w pracy oceniano aktywność mucynolityczną badanych szczepów EAEC. Zdolności inwazyjne EAEC oceniono w teście inwazji in vitro do komórek nabłonka jelita cienkiego linii Int407, natomiast obecność genów kodujących inwazyny oznaczano w reakcji PCR. Większość badanych szczepów EAEC była internalizowana in vitro przez komórki nabłonka jelita oraz posiadała geny inwazji. Jedna trzecia badanych szczepów EAEC wykazała aktywność mucynolityczną. Zdolność inwazji do komórek nabłonka szczepów EAEC może odpowiadać za przewlekły charakter zakażeń wywoływanych przez te patogeny. Summary Irritable bowel syndrome is a chronic, functional intestinal disorder. Despite the fact that among the factors predisposing to the development of IBS a history of bacterial gastrointestinal infections is mentioned, the exact role of bacteria in the pathogenesis of this disease is unknown. Invasive abilities of enteroaggregative E. coli (EAEC) to the intestinal epithelial cells and frequent isolation of these strains from individuals with IBS was the basis of this research. The purpose of the study was to assess the invasion ability and the presence of invasion genes among EAEC isolated from individuals with IBS. Moreover, in the study the mucinase activity was examined. The invasive capability of EAEC was evaluated by an in vitro invasion assay into the intestinal epithelial cells Int407 whereas the genes involved in the invasiveness were determined by PCR. Most of EAEC strains showed invasion capability and invasion genes determined. About one third of these strains showed mucinolytic activity. Invasion capability of EAEC strains examined may account for the chronic nature of infections caused by these pathogens. Słowa kluczowe: enteroagregacyjne E. coli, inwazja, mucynaza, zespół jelita nadwrażliwego Key words: enteroaggregative E. coli, invasion, mucinase, irritable bowel syndrome Wstęp Enteroagregacyjne szczepy Escherichia coli (E. coli; EAEC) są grupą patogennych szczepów E. coli odpowiedzialnych za ostre i przewlekłe zakażenia jelit u dzieci i osób dorosłych na całym świecie. Charakterystyczny sposób adhezji do komórek nabłonka jelit, w postaci agregatów przypominających stosy cegieł, jest cechą swoistą EAEC, różniącą je od innych patogennych szczepów E. coli. EAEC są niezwykle zróżnicowane pod względem prezentowanych czynników wirulencji, które z łatwością nabywają na drodze horyzontalnego transferu genów od innych patogenów przewodu pokarmowego. Kilkuetapowy patomechanizm zakażenia wywoływanego przez EAEC obejmuje: a) adhezję do komórek nabłonka jelita za pośrednictwem swoistych dla tej grupy 393

2 Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli izolowanych od osób... E. coli fimbrii agregacyjnych; b) stymulację gruczołów błony śluzowej jelita do sekrecji śluzu, w którym EAEC tworzą biofilm; c) wydzielanie enterotoksyn i/lub cytotoksyn, które modulują aktywność sekrecyjną enterocytów lub powodują ich uszkodzenie [1]. Ważnym czynnikiem wirulencji niektórych szczepów EAEC, a także pałeczek Shigella spp. jest proteaza serynowa Pic (ang. protease involved in intestinal colonization) o aktywności mucynazy. Mucynaza Pic indukuje sekrecję śluzu przez komórki kubkowe błony śluzowej jelita, co odpowiada za śluzowy charakter biegunek oraz degraduje mucyny zawarte w śluzie, co z kolei ułatwia tym patogenom osiąganie powierzchni nabłonka i przewlekłą kolonizację jelit [2]. Ponadto, niektóre szczepy EAEC wykazują zdolność inwazji do komórek nabłonka jelita [1]. Przebieg zakażenia w dużej mierze zależy więc od czynników wirulencji jakimi dysponują szczepy EAEC. Zespół jelita nadwrażliwego (IBS) jest czynnościowym zaburzeniem funkcji jelit o nieznanej etiologii, które dotyczy ok. 3-10% populacji. Wśród potencjalnych czynników mogących indukować rozwój IBS wymieniane są: płeć, długotrwała antybiotykoterapia, stres, zabiegi chirurgiczne w obrębie jamy brzusznej, nadwrażliwość mięśni jelit, nadużywanie alkoholu, mocnej kawy i herbaty oraz zakażenia bakteryjne. Objawy kliniczne, towarzyszące IBS obejmują kurczowe bóle brzucha, dyskomfort, uczucie niepełnego wypróżnienia, zaburzenia rytmu wypróżnień [3, 4]. Po-zakaźna postać IBS, której dominującym objawem klinicznym jest uporczywa biegunka, najczęściej jest skutkiem przebytego zakażenia przewodu pokarmowego, choć dotychczas nie zidentyfikowano żadnego, konkretnego drobnoustroju, mogącego indukować rozwój tej postaci IBS. Po-zakaźna postać IBS łączona jest z przebytym zakażeniem wywołanym przez bakterie (np.: E. coli., Campylobacter jejuni, Shigella spp.,) lub pasożyty (np.: Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Trichinella spp.) pomimo, że nie udowodniono roli żadnego z tych patogenów w rozwoju IBS [5]. Z biegunkową postacią IBS łączone są również szczepy EAEC, które izolowano od ponad 80% osób cierpiących na IBS i tylko od ok. 32% dorosłych osób zdrowych [6]. Celem badań była charakterystyka potencjału inwazyjnego tj., ocena częstości występowania genów kodujących inwazyny rozpowszechnione wśród patogennych szczepów E. coli oraz zdolności inwazji do ludzkich komórek nabłonka jelita linii Int407 szczepów EAEC izolowanych od osób z IBS. Ponadto, w pracy oceniano zdolność badanych szczepów EAEC do degradacji mucyny. Materiały i metody Szczepy bakterii. Badania przeprowadzono na 47 archiwalnych szczepach E. coli: 36 szczepów pochodziło z próbek kału osób dorosłych (średni wiek 43 lata) z biegunkową postacią IBS (grupa EAEC-IBS), rozpoznaną na podstawie Kryteriów Rzymskich II w Klinice Gastroenterologii i Hepatologii Akademii Medycznej we Wrocławiu; 11 szczepów uzyskano od osób zdrowych (ochotników nie zgłaszających żadnych dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego w okresie uzyskania materiału), w tym samym przedziale wiekowym (grupa EAEC-zdrowi). Badane szczepy E. coli zakwalifikowano do grupy EAEC na podstawie testu adhezji in vitro do komórek nabłonka linii HEp-2 (Ryc. 1). Przyna- Rycina 1. leżność badanych szczepów do gatunku E. coli potwierdzono komercyjnymi zestawami biochemicznymi (API32GN, BioMerieux). Jako kontrole dodatnie do oznaczenia genów inwazji oraz w teście inwazji in vitro wykorzystano następujące szczepy referencyjne: enteroagregacyjny szczep E. coli 17-2 aggb dodatni; ipah dodatni szczep Shigella flexneri (ATCC TM 12022); tia dodatni enterotoksynogenny szczep E. coli (ETEC) (ATCC TM 35401); afad dodatni szczep E. coli o rozsianym typie adhezji (DAEC) izolowany od dziecka z biegunką. Jako kontrolę ujemną we wszystkich wykonanych oznaczeniach użyto niepatogennego, nieinwazyjnego szczepu E. coli K12 C600. Wszystkie badane szczepy przechowywano w bulionie Luria (LB) z 15% glicerolem w temp C. Przed wykonaniem badań szczepy wysiewano na podłoże wybiórczo-różnicujące MacConkeya. Test inwazji. Zdolność ludzkich komórek nabłonka jelita cienkiego linii Int407(ATCC CCL6) do internalizacji in vitro badanych szczepów E. coli określano powszechnie stosowanym testem z gentamycyną wg Boudeau i wsp. [7]. Gentamycyna nie penetruje do komórek, więc pałeczki E. coli, które wnikają do komórek (wewnątrzkomórkowe) przeżywają ekspozycję na wysokie stężenia gentamycyny, w przeciwieństwie do bakterii zlokalizowanych zewnątrzkomórkowo. Komórki nabłonka linii Int407 hodowano do czasu uzyskania jednowarstwowej hodowli (monolayer) w podłożu MEM (minimal essential medium; Gibco BRL) wzbogaconym 10% surowicą płodową bydlęcą (FBS; Gibco BRL) oraz roztworem antybiotyków (penicylina 100U, streptomycyna 100 μg/ml, amfoterycyna B 0,25 μg/ml; Sigma-Aldrich) w 37 0 C, w wilgotnej atmosferze wzbogaconej 5% CO 2. Przed wykonaniem testu inwazji komórki płukano, trypsynizowano 394

3 i po odwirowaniu (1000 rpm; 10 min) zawieszano w świeżym podłożu MEM. Zawiesinę komórek (o gęstości 4x10 5 komórek/ml) wsiewano (po 0,5 ml) do dołków 24-dołkowej płytki do hodowli komórek (NUNC) i inkubowano do następnego dnia. Przed zakażeniem komórki płukano dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej (0,9% roztwór NaCl) w celu odpłukania antybiotyków. Badane szczepy E. coli do zakażenia komórek przygotowywano w następujący sposób: całonocne hodowle szczepów w LB (Luria broth) odwirowywano (16400 rpm; 5 min), uzyskane osady bakterii zawieszano w podłożu MEM z 2% FBS bez antybiotyków do uzyskania gęstości optycznej OD 1,5x10 8 cfu/ml. Tak przygotowywanymi zawiesinami szczepów E. coli zakażano komórki nabłonka linii Int407 (0,5 ml zawiesiny E. coli na dołek). Płytki z zakażonymi komórkami wirowano (1200 rpm, 10 min) w celu ułatwienia kontaktu bakterii z powierzchnią komórek i inkubowano 4 godz. w temp C w atmosferze 5% CO 2. Po inkubacji komórki płukano trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć niezwiązane z komórkami bakterie i dodawano świeże podłoże MEM z 2% FBS i gentamycyną w stężeniu 100 μg/ml w celu zabicia zewnątrzkomórkowych bakterii przylegających do komórek. Płytki ponownie inkubowano w temp C w atmosferze 5% CO 2 przez 1 godz. Po inkubacji komórki płukano trzykrotnie i lizowano, dodając do każdego dołka 0,5 ml wodnego roztworu 1% Triton X-100 w celu uwolnienia wewnątrzkomórkowych bakterii. Po 10 min. Inkubacji z wytrząsaniem z każdego dołka płytki pobierano 100 µl lizatu komórek, który rozcieńczano solą fizjologiczną w postępie geometrycznym w szeregu probówek i posiewano na podłoże MacConkeya. Po całonocnej inkubacji liczono wyrosłe kolonie bakteryjne. Liczbę bakterii w 1 ml lizatu obliczano ze wzoru: gdzie: cfu/ml liczba bakterii w 1 ml lizatu n - liczba wyrosłych kolonii 10 -x rozcieńczenie lizatu posiewane na podłoże stałe 0,1 ml objętość wysiewanego lizatu Za zdolne do inwazji przyjmowano szczepy, dla których średnia liczba wewnątrzkomórkowych bakterii była większa lub równa liczbie kolonii referencyjnego, inwazyjnego szczepu Shigella flexneri (ATCC TM 12022) tj. wartości 10 4 cfu/ml. Wykrywanie genów inwazji. Geny kodujące inwazyny występujące u chorobotwórczych szczepów E. coli tj.: gen ipah, kodujący inwazynę enteroinwazyjnych E. coli (EIEC) i pałeczek Shigella, gen tia, odpowiedzialny za ekspresję inwazyny enterotoksynogennych E. coli (ETEC), gen afad, kodujący inwazynę szczepów DAEC oraz gen aggb, kodujący inwazynę swoistą dla EAEC oznaczano w reakcji PCR. Sekwencje starterów zastosowanych w reakcji PCR oraz warunki reakcji podano w Tabeli I. Do oznaczenia genów afad i aggb zastosowano startery zaprojektowane w naszym laboratorium za pomocą programu Web Primers. Sekwencję starterów dla genu afad (Forward: pozycje 7479 do 7498 i Reverse: pozycje 7853 do 7870) opracowano na podstawie sekwencji klastera afa-3 szczepu E. coli A30 izolowanego od chorego z zapaleniem pęcherza moczowego (Gen-Bank accession number: X76688). Natomiast sekwencję starterów dla genu aggb (Forward: pozycje 3460 do 3480 i Reverse: pozycje 3857 do 3880) opracowano na podstawie sekwencji klastera AAF/I referencyjnego enteroagregacyjnego szczepu E. coli 17-2 (Gen-Bank accession number: U12894). Matrycę DNA do testu PCR stanowił supernatant z lizatów bakterii gotowanych przez 10 minut w łaźni wodnej, a następnie odwirowanych (1200 rpm, 10 min, 4 0 C). Ujemne lub wątpliwe wyniki testu PCR powtarzano z oczyszczonym DNA genomowym lub plazmidowym. DNA genomowe izolowano metodą fenolowo-chloroformową wg Wilson [8] z modyfikacjami. Osad uzyskany z całonocnych hodowli bulionowych (LB) badanych szczepów zawieszano w 1ml buforu S (1 M Tris-HCl, ph=8; 0,5 M EDTA, ph=8, 5 M NaCl, 10% CTAB tj. bromek heksadecylotrimetyloamonowy), dodawano 5 µl proteinazy K (10 mg/ml), mieszano i dodawano 100 µl 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS). Mieszaninę inkubowano 1 godz. w 65 0 C, a następnie dodawano 500 µl mieszaniny fenolu i chloroformu (1:1) i po wymieszaniu wirowano (6000 rpm; 10 min). Uzyskany supernatant przenoszono do nowej probówki Eppendorf, dodawano 0,6 objętości wodnego 99% roztworu izopropanolu (Isopropanol; Sigma-Aldrich) i wirowano (3600 rpm; 5 min). Do uzyskanego osadu DNA dodawano 1 µl RNA-zy (10 mg/ml) i inkubowano 30 min w 37 0 C. Po dodaniu 25 µl roztworu fenolu w 10 mmtris-hcl, próbki mieszano i wirowano (6000 rpm; 10 min). Uzyskany supernatant przenoszono do nowej probówki Eppendorf i dodawano 1/10 objętości 3 M octanu sodu oraz 2 objętości 96% Tabela I Sekwencje starterów dla oznaczanych genów inwazji. Gen Startery 5-3 Produkt (bp) Warunki reakcji PCR Piśmiennictwo afad GTCACCTGCGGGATGTTACT GCTCCGCCAACCGAAAAC C1 min; 72 0 C 45 s 60 0 C 45 s; (34 cykle) [badania własne] tia ACCAGCGCTTCCGTCAGG GCCAGATTCATTCCAGGAGG C1 min; 72 0 C 1 min 55 0 C 1 min; (30 cykli) [19] ipah GCTGGAAAAACTCAGTGCCT CCAGTCCGTAAATTCATTCT C 1 min; 72 0 C 1 min; 56 0 C 2 min; (29 cykli) [20] aggb GCATATTACCGATGTCCTGCG CCTCTTGATATTAGACATTCA C 1 min; 62 0 C 45 s; 58 0 C 30 s; (29 cykli) [badania własne] 395

4 Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli izolowanych od osób... etanolu. Po odwirowaniu (4600 rpm; 5 min) osad zawierający DNA zawieszano w 20 µl H 2 O (miliq). DNA plazmidowe izolowano metodą lizy alkalicznej wg Birnboim [9] z modyfikacjami. Osady z całonocnych hodowli badanych szczepów EAEC zawieszano w 100 µl roztworu GTE (50 mm glukoza, 25 mm Tris-HCl; ph=8, 10 mm EDTA) z dodatkiem 10 µl lizozymu (10 mg/ml). Mieszaniny inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodawano 200 µl roztworu NaOH/SDS (0,2 M NaOH, 1% SDS) i inkubowano na lodzie przez 5 min. Po inkubacji próbki mieszano ze 150 µl 3 M roztworu octanu potasu i wirowano (16400 rpm; 5 min). Uzyskany supernatant przenoszono do nowej probówki Eppendorf, dodawano 0,8 ml 96% zimnego etanolu i wirowano (16400 rpm; 2 min). Uzyskany osad DNA płukano w 0,5 ml 70% etanolu i zawieszano w 30 µl H 2 0 (miliq). Amplifikację DNA przeprowadzono w termocyklerze MJ Research, PTC- 200 (Peltier Thermal Cycler). Oznaczanie aktywności mucynolitycznej. Aktywność mucynolityczną badanych szczepów E. coli, świadczącą o ich zdolności wytwarzania mucynazy Pic, oznaczano na podłożu Luria agar z 0,28% mucyną (LA/M) (Bovine Mucin; Sigma-Aldrich) wg Gessner [10] z modyfikacjami. Całonocne hodowle badanych szczepów EAEC wkłuwano punktowo w agar LA/M i inkubowano w temp C przez 48 godz. Wyrosłe punktowo hodowle EAEC na podłożu LA/M zalewano 2 ml 1% roztworu CaCl 2. Statystyczna analiza wyników. Do statystycznej analizy wyników zastosowano test χ2 Pearsona. Wartości p 0,05 przyjmowano za statystycznie znamienne. Wyniki Test inwazji. Wśród przebadanych 36 szczepów EAEC-IBS, 23 (63,8%) szczepy wnikały do komórek linii Int407 na poziomie równym lub większym niż referencyjny szczep Shigella flexneri, tj cfu/ml. W grupie 11 szczepów EAEC od osób zdrowych, 10 (90,9%) szczepów wykazało zdolność inwazji na poziomie porównywalnym do szczepu referencyjnego. Nie wykazano różnic statystycznych w zdolności inwazji szczepów EAEC izolowanych od osób z IBS i zdrowych (p=0,08). Jednakże istotne statystyczne różnice dotyczyły ilości szczepów obu grup, które wnikały do komórek nabłonka w ilości 10 4 cfu/ml. W grupie szczepów EAEC-IBS było to 16 (44,4%) izolatów, natomiast w grupie EAEC-zdrowi 2 (18,2%) szczepów (p=0,006). Podobnie, W grupie EAECzdrowi znacznie więcej szczepów było internalizowanych w liczbie 10 5 cfu/ml niż w grupie EAEC-IBS (p=0,005) (Tabela II). Geny inwazji. Wyniki oznaczeń genów inwazji przedstawiono w Tabeli III. Analiza statystyczna nie wykazała różnic w częstości występowania oznaczanych genów inwazji wśród badanych szczepów obu grup tj. EAEC-IBS i EAECzdrowi (p>0,05). Nie wykazano również korelacji pomiędzy poziomem inwazji badanych EAEC a obecnością oznaczanych genów inwazyn. Cztery (8,5%) spośród 47 badanych szczepów EAEC (2 szczepy od osób z IBS i 2 szczepy od osób zdrowych), które nie posiadały żadnego z oznaczanych genów inwazji również wnikały do komórek nabłonka na poziomie cfu/ml. W grupie EAEC-IBS 8 (22,2%) szczepów, natomiast w grupie EAEC-zdrowi 5 (45,4%) Tabela II Porównanie liczby szczepów EAEC-IBS i EAEC-zdrowi internalizowanych przez komórki nabłonka Int407. Liczba szczepów (%) IBS n=36 Zdrowi n=11 Brak internalizacji 7 (20,4) 1 (9,1) p=0,4 Internalizacja (cfu/ml) Średnia liczba internalizowanych bakterii 6 (16,7) 16 (44,4) 7 (20,4) 0 8,2 x (18,2) 7 (63,6) 1 (9,1) 3,8 x 10 5 p=0,1 p=0,006 p=0,005 p=0,06 IBS, zespół jelita nadwrażliwego; cfu, liczba kolonii bakteryjnych (colony forming units) Tabela III Częstość występowania oznaczanych genów inwazji wśród badanych szczepów EAEC. IBS, zespół jelita nadwrażliwego Liczba szczepów (%) Grupa aggb afad ipah tia 2 geny 3 geny IBS n=36 (47,3) (27,8) (19,4) (22,2) (19,4) (2,8) Zdrowi n=11 (27,3) (45,4) (36,4) (27,3) (36,4) (9,1) Razem n=47 (42,5) (31,9) (23,4) (23,4) (23,4) (4,2) 396

5 szczepów, wykazało dwa lub trzy różne geny inwazji (np.: aggb+afad lub ipah+afad+aggb). Ilość wykrywanych genów inwazji nie korelowała jednak ze zdolnością i poziomem inwazji badanych szczepów. Aktywność mucynolityczna. Zdolność degradacji mucyny na podłożu LA/M (tj. obecność strefy przejaśnienia wokół kolonii) wykazało 13 (36,1%) szczepów EAEC-IBS oraz 2 (18,2%) szczepy z grupy EAEC-zdrowi (p=0,2) (Ryc. 2). Rycina 2. Dyskusja Inwazja do komórek nabłonka jelita stanowi podstawę patomechanizmu zakażeń wywoływanych przez inwazyjne patogeny przewodu pokarmowego m.in. Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. oraz EIEC. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja zapewnia ochronę przed układem immunologicznym gospodarza, a także niesprzyjającymi warunkami panującymi w świetle jelita (np.: niekorzystnym wpływem metabolitów flory komensalnej jelit). Poza tym, wewnątrzkomórkowa lokalizacja zapewnia patogenom dostęp do składników odżywczych i możliwość okresowego wysiewania się do światła jelita lub inwazji do sąsiednich komórek nabłonka [11]. Pereira i wsp. [12] wykazali in vitro zdolność szczepów EAEC izolowanych od dzieci z biegunką do inwazji spolaryzowanych oraz niespolaryzowanych komórek nabłonka, a także namnażanie się tych szczepów wewnątrz komórek przez wiele godzin. Zlokalizowane w obrębie komórek nabłonka drobnoustroje mogą stanowić niebezpieczne źródło przewlekłych zakażeń przewodu pokarmowego i utrzymującego się stanu zapalnego błony śluzowej jelit, który ostatecznie może doprowadzić do rozwoju zaburzenia funkcji jelit m.in. IBS. W wykonanym teście inwazji większość badanych szczepów EAEC (niezależnie od tego czy szczepy te pochodziły od osób zdrowych, czy osób z IBS) wykazała zdolność inwazji in vitro do komórek nabłonka jelita. Częściej cecha inwazji związana była ze szczepami EAEC od osób zdrowych, co wskazuje, że osoby te nosiciele, mogą stanowić źródło tych szczepów dla osób wrażliwych. Inwazyjny potencjał patogenów jelitowych u osób z prawidłową florą jelit jest zwykle hamowany przez metabolity mikroflory m.in. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe oraz szczepy probiotyczne, co może tłumaczyć brak objawów klinicznych zakażenia u osób zdrowych [13]. Inwazja patogenów przewodu pokarmowego takich jak: Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. do komórek gospodarza kodowana jest przez zespoły genów chromosomalnych i/lub plazmidowych, które mogą rozprzestrzeniać się wśród pałeczek jelitowych na drodze koniugacji lub transdukcji [14]. Inwazyną swoistą dla EAEC jest białko AggB, które na podstawie podobieństw strukturalnych do rodziny inwazyn AfaD, charakterystycznych dla szczepów DAEC, uważane jest za inwazynę promującą internalizację szczepów EAEC do komórek nabłonka [15, 16]. Gen kodujący inwazynę AggB był najczęściej wykrywanym genem inwazji wśród badanych szczepów EAEC. Obecność genu kodującego białko AggB u prawie połowy szczepów EAEC izolowanych od osób z IBS oraz 27% osób zdrowych, wskazuje na jego szerokie rozpowszechnienie wśród tej grupy patogennych E. coli. Jednakże brak statystycznie istotnych różnic w częstości występowania inwazyny AggB oraz brak korelacji pomiędzy obecnością tego antygenu a zdolnością i poziomem inwazji badanych szczepów EAEC, wskazują, że inwazyna ta może odgrywać rolę pomocniczą w procesie internalizacji AggB-dodatnich EAEC do komórek nabłonka, natomiast za proces inwazji odpowiedzialna jest inna, nieznana inwazyna. Ponadto, obecność genu, wykryta w reakcji PCR, niekoniecznie oznacza jego ekspresję, co mogłoby tłumaczyć brak korelacji pomiędzy obecnością tego genu a poziomem inwazji u badanych szczepów EAEC. Nieustalona ostatecznie funkcja białka AggB w procesie inwazji EAEC oraz nieznana częstość jego rozpowszechnienia wśród tych szczepów izolowanych na świecie utrudniła analizę uzyskanych wyników oznaczeń. Dodatkowo, wiele badanych szczepów EAEC prezentowało obok inwazyny AggB, obecność innych genów inwazji, co mogło wpłynąć na wynik testu inwazji. Poza inwazyną AggB, drugim najczęściej występującym genem inwazji wśród badanych szczepów EAEC był gen afad, kodujący inwazynę swoistą dla DAEC. Białko AfaD jest składnikiem osłonki adhezyn afimbrialnych syntetyzowanych przez uropatogenne szczepy E. coli (UPEC), odpowiedzialne za zakażenia układu moczowego oraz biegunki u małych dzieci [17]. Według badań Jouve i wsp. [18] geny kodujące adhezyny Afa posiada 11 32% UPEC. W wykonanych badaniach gen afad częściej występował u szczepów EAEC od osób zdrowych, niż wśród szczepów od osób z IBS, co można wytłumaczyć faktem, że UPEC często kolonizują jelita osób zdrowych. Wykonane badania wykazały po raz pierwszy obecność wśród EAEC genów kodujących inwazyny swoiste dla ETEC, EIEC i pałeczek Shigella spp. tj. geny tia i ipah. Brak danych na temat występowania tych inwazyn wśród EAEC izolowanych na świecie uniemożliwił analizę częstości rozprzestrzeniania tych inwazyn wśród badanych szczepów. Tym niemniej, ich obecność u części badanych szczepów EAEC potwierdza fakt łatwego nabywania przez nie różnych genów wirulencji 397

6 Charakterystyka potencjału inwazyjnego enteroagregacyjnych szczepów Escherichia coli izolowanych od osób... od innych patogenów przewodu pokarmowego. Analiza korelacji pomiędzy inwazją a obecnością oznaczonych genów inwazji nie wykazała jednak żadnego związku z konkretnym, oznaczanym genem. Co więcej, niektóre badane szczepy prezentowały więcej niż jeden gen inwazji, co również nie korelowało ze zdolnością inwazji tych szczepów. Uzyskane wyniki wskazują na konieczność dalszych badań ekspresji genów inwazji zlokalizowanych wewnątrzkomórkowo szczepów EAEC, co umożliwi wyjaśnienie roli wykrytych inwazyny w procesie internalizacji EAEC przez nabłonek jelita. Piśmiennictwo: 1. Nataro JP, Steiner T, Guerrant RL. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis 1998; 4: Navarro-Garcia F, Gutierrez-Jimenez J, Garcia-Tovar C. Pic, an autotransporter protein secreted by different pathogens in the Enterobacteriaceae family, is a potent mucus secretagogue. Infect Immun 2010; 78: Olden KW. The challenge of diagnosing irritable bowel syndrome. Rev Gastroenterol Disord 2003; 3: Locke GR. Natural history of irritable bowel syndrome and durability of the diagnosis. Rev Gastroenterol Disord 2003; 3: Morgan DR, Benshoff M, Cáceres M, et al. Irritable bowel syndrome and gastrointestinal parasite infection in a developing nation environment. Gastroenterol Res Pract 2012, 2012: Sobieszczańska BM, Osek J, Waśko-Czopnik D, et al. Association of enteroagreggative Escherichia coli with irritable bowel syndrome. Clin Microbiol Infect 2007; 13: Boudeau J, Glasser AL, Masseret E, et al. Invasive ability of an Escherichia coli strain isolated from the ileal mucosa of a patient with Crohn s disease. Infect Immun 1999; 67: Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Ausubel FM & Brent R eds. Current Protocols in Molecular Biology, New York: Greene Publ. Assoc. and Wiley Interscience, 1990: Birnboim HC. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA. Methods Enzymol 1983; 100: Gessner AR, Mortensen JE. Pathogenic factors of Pseudomonas cepacia isolates from patients with cystic fibrosis. J Med Microbiol 1990; 33: Huang DB, Dupont HL. Enteroaggregative Escherichia coli: an emerging pathogen in children. Semin Pediatr Infect Dis 2004; 15: Pereira AC, Britto-Filho JD, de Carvalho JJ, et al. Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) strains enter and survive within cultured intestinal epithelial cells. Microb Pathog 2008; 45: Tuohy KM, Rouzaud GC, Bruck WM, et al. Modulation of the human gut microflora towards improved health using prebiotics assesment of efficacy. Curr Pharm Des 2005; 11: Włodarczyk M. Różnorodność cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy. Kosmos 2002; 51: Sobieszczańska BM. Agregacyjne E. coli nowa grupa szczepów E. coli odpowiedzialnych za biegunki. Post Mikrobiol 2003; 42: Garcia MI, Jouve M, Nataro JP, et al. Characterization of the AfaD-like family of invasins encoded by pathogenic Escherichia coli associated with intestinal and extra-intestinal infections. FEBS Lett 2000; 479: Servin AL. Pathogenesis of Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 2005; 18: Jouve M, Garcia MJ, Courcoux P, et al. Adhesion to and invasion of HeLa cells by pathogenic Escherichia coli carrying the afa-3 gene cluster are mediated by the AfaE and AfaD proteins, respectively. Infect Immun 1997; 65: Darfeuille-Michaud A, Boudeau J, Bulois P, et al. High Prevalence of Adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn s disease. Gastroenterol 2004; 127: Dutta S, Chatterjee A, Dutta P, et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. J Med Microbiol 2001; 50: Finansowanie badań: wykonane badania finansowane były z grantu uczelnianego Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu nr 1278 Adres do korespondencji: mgr Anna Krystyna Duda Katedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu Wrocław, ul. Chałubińskiego 4 Tel anna.krystyna.duda@gmail.com Zaakceptowano do publikacji: