(19) 114 Klinika Oczna 2016, 118 (2) ISSN Index

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE (19) Wływ olimorfizmów Y402H, E318D oraz R102G genów kodujących białka układu doełniacza na wyniki leczenia doszklistkowymi iniekcjami czynnika anty-vegf u chorych na wysiękową ostać zwyrodnienia lamki związanego z wiekiem Association between Y402H, E318D and R102G olymorhisms of comlement roteins genes and the resonse to intravitreal anti-vegf treatment in atients with neovascular age-related macular degeneration Agnieszka Kubicka-Trząska 1, Izabella Karska-Basta 1, Joanna Kobylarz 1, Sylwia Dziedzina 2, Marek Sanak 2, Bożena Romanowska-Dixon 1 1 Klinika Okulistyki i Onkologii Okulistycznej Katedry Okulistyki Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie Kierownik: rof. dr hab. n. med. Bożena Romanowska-Dixon 2 Zakład Biologii Molekularnej i Genetyki Klinicznej II Katedry Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie Kierownik: rof. dr hab. n. med. Marek Sanak Abstrakt: Słowa kluczowe: Abstract: Cel: określenie związku między olimorfizmami E318D (rs ) genu kodującego białko C2, R102G ( rs ) genu kodującego białko C3 i Y402H (rs ) genu czynnika CFH układu doełniacza a ryzykiem wystąienia zwyrodnienia lamki związanego z wiekiem oraz ocena ich wływu na efekt leczenia antyangiogennego. Materiał i metody: badaniami objęto 106 chorych na zwyrodnienie lamki związane z wiekiem leczonych doszklistkowymi iniekcjami ranibizumabu i/lub bewacyzumabu. Oceniając skuteczność leczenia, orównywano wyjściową najleszą skorygowaną ostrość wzroku oraz grubość centralnej siatkówki w obrazie badania otycznej koherentnej tomografii z wynikami badań kontrolnych wykonywanych co miesiąc. Okres obserwacji wynosił 6 miesięcy. Gruę kontrolną stanowiło 58 osób, u których wykluczono zwyrodnienie lamki związane z wiekiem. Badania rzerowadzono za omocą sond genetycznych TaqMan firmy Alied Biosystems. Wyniki: olimorfizmy E318D (C2) oraz R102G (C3) nie wykazały związku ze zwyrodnieniem lamki związanym z wiekiem. Genoty CC olimorfizmu Y402H (CFH) wystęował częściej u chorych na zwyrodnienie lamki związane z wiekiem niż u osób z gruy kontrolnej [OR=3,09 (1,28 7,49); =0,0069]. W ostatnim badaniu kontrolnym u chorych na zwyrodnienie lamki związane z wiekiem, u których stwierdzono genoty CC rs CFH, najlesza skorygowana ostrość wzroku była gorsza, a grubość centralnej siatkówki większa niż u chorych na zwyrodnienie lamki związane z wiekiem, u których nie stwierdzono tego genotyu [OR=7,67 (1,77 33,12), =0,0052]. Na leczenie nie zareagowało 25,47% chorych ( non-resonders ), genoty CC olimorfizmu rs CFH stwierdzono u 51,8% sośród nich. U chorych z genotyem TT olimorfizmu rs CFH ostateczna najlesza skorygowana ostrość wzroku była lesza, a redukcja grubości centralnej siatkówki istotna w orównaniu z tymi samymi arametrami u chorych z genotyem CC rs CFH [OR=0,31 (0,11 0,84), =0,0194]. Wnioski: wyniki naszych obserwacji wskazują, że genoty CC rs CFH zwiększa ryzyko wystąienia zwyrodnienia lamki związanego z wiekiem. Ponadto genoty CC rs CFH romuje negatywną odowiedź na leczenie antyangiogenne, odczas gdy genoty TT rs CFH może zmniejszać ryzyko braku odowiedzi na leczenie doszklistkowymi iniekcjami czynnika anty-vegf. układ doełniacza, olimorfizm genowy, zwyrodnienie lamki związane z wiekiem (AMD). Aim: To analyze the correlation between the E318D rs olymorhism of the C2 comlement factor; R102G rs olymorhism of the C3 comlement factor as well as the Y402H rs olymorhism of the CFH comlement factor and risk of AMD as well as the resonse to anti-vegf theray. Material and methods: 106 atients with age-related macular degeneration treated with intravitreal ranibizumab or bevacizumab were enrolled. The resonse to treatment was assessed at 4 weeks intervals for 6 months and was based on the results of best corrected visual acuity and central retinal thickness measurements comared to the resective baseline values. 114 Klinika Oczna 2016, 118 (2) ISSN Index

2 Agnieszka Kubicka-Trząska, Izabella Karska-Basta, Joanna Kobylarz, Sylwia Dziedzina, Marek Sanak, Bożena Romanowska-Dixon Key words: The control grou consisted of 58 healthy volunteers. The testing was erformed using genetic robes (TaqMan Alied Biosystems) in all cases. Results: E318D (C2) and R102G (C3) olymorhisms were not associated with age-related macular degeneration. The genotye CC of Y402H (CFH) olymorhism was more frequent in atients with age-related macular degeneration as comared to controls [OR=3.09 ( ); =0.0069]. At the last follow-u, atients with age-related macular degeneration ositive for the CC rs CFH genotye resented with worse best corrected visual acuity and increased central retinal thickness as comared to their counterarts negative for this genotye [OR=7.67 ( ), =0.0052]. Among 25.47% of non-resonders, the CC rs CFH genotye was resent in 51.8% of cases. In atients with the TT rs CFH genotye the final best corrected visual acuity was better and a significant reduction of central retinal thickness was demonstrated in all those cases, as comared to subjects with the CC rs CFH genotye [OR=0.31 ( ), =0.0194]. Conclusions: The study showed that the CC rs CFH genotye may be associated with the age-related macular degeneration. Additionally, the CC rs CFH genotye may romote a negative resonse to anti-vegf treatment, while atients with the TT rs CFH genotye showed better functional and structural resonse to anti-vegf agents. comlement system, genetic olymorhism, age-related macular degeneration (AMD). Wrowadzenie W krajach rozwiniętych zwyrodnienie lamki związane z wiekiem (Age-related Macular Degeneration AMD) stanowi obecnie najczęstszą rzyczynę utraty wzroku u osób owyżej 50. roku życia (1). Jest to schorzenie o złożonej etioatogenezie. Do czynników ryzyka zalicza się odeszły wiek, alenie tytoniu, łeć żeńską, rzynależność etniczną kaukaską, choroby sercowo-naczyniowe, cukrzycę, otyłość, dietę bogatą w tłuszcze zwierzęce i ubogą w antyoksydanty, jasny kolor tęczówek, stany o oeracji zaćmy oraz rzewlekłe narażenie na działanie romieniowania ultrafioletowego (2). Sośród czynników ryzyka należy także wymienić rodzinne wystęowanie AMD, może to świadczyć o dziedzicznym charakterze tego schorzenia i otwierdza zasadność oraz konieczność oszukiwania markerów genetycznych ryzyka AMD (3, 4). Do tej ory zidentyfikowano wiele olimorfizmów genetycznych o istotnym owiązaniu z tym schorzeniem (3, 4). Wiadomo, że m.in. olimorfizmy genów kodujących endotelialną syntazę tlenku azotu czy też białka regulujące homeostazę jonów żelaza i kontrolujące nasilenie rocesów stresu oksydacyjnego biorą udział w atomechanizmie AMD (5, 6). Według wsółczesnych oglądów na atogenezę AMD, w którą są zaangażowane nie tylko miejscowe mechanizmy zaalne i immunologiczne, ale także ogólnoustrojowe, najistotniejsze znaczenie jak się wydaje mają olimorfizmy genów kodujących białka układu doełniacza (7, 8). O udziale mechanizmów zaalnych w rzebiegu AMD świadczy m.in. obecność tych białek w druzach oraz odsiatkówkowych błonach neowaskularnych u chorych na AMD. Ponadto w surowicy krwi u chorych na AMD stwierdzono wystęowanie odwyższonych stężeń niektórych białek układu doełniacza białek C2 oraz C3 (9). Obecnie standardem leczenia wysiękowej ostaci AMD są doszklistkowe iniekcje czynnika anty-vegf. Jak otwierdzają obserwacje kliniczne, nie u wszystkich chorych teraia anty- -VEGF jest skuteczna. Około 20 35% chorych to tzw. non-resonders, czyli osoby niereagujące na leczenie antyangiogenne lub reagujące, lecz słabo, u których omimo leczenia dochodzi do rogresji zmian zwyrodnieniowych w lamce oraz ogorszenia widzenia (10, 11). Dlatego coraz większe zainteresowanie wzbudzają badania nad oznaniem genetycznych uwarunkowań tego schorzenia. Poznanie swoistych dla AMD nierawidłowości genetycznych bowiem może być omocne w rzewidywaniu rzebiegu klinicznego choroby i odowiedzi na zastosowane leczenie anty-vegf, a tym samym rzydatne do genetycznej indywidualizacji leczenia tego schorzenia. Wziąwszy od uwagę rzedstawione założenia, rzystąiono do badań, które miały na celu analizę wystęowania olimorfizmów E318D (rs ) genu kodującego białko C2, R102G (rs ) genu kodującego białko C3 oraz Y402H (rs ) genu czynnika CFH układu doełniacza i określenie, jaki mają one związek z ryzykiem wystęowania wysiękowej ostaci AMD, oraz wykazanie zależności między tymi wariantami genów a odowiedzią na leczenie doszklistkowymi iniekcjami czynnika anty-vegf. Materiał i metody Badaniami objęto 106 chorych na wysiękową ostać AMD leczonych w naszej klinice doszklistkowymi iniekcjami ranibizumabu i bewacyzumabu. Wszystkich oddano wstęnemu badaniu okulistycznemu, które obejmowało: ocenę najleszej skorygowanej ostrości wzroku (Best Corrected Visual Acuity BCVA), omiar ciśnienia wewnątrzgałkowego (Intraocular Pressure IOP), ocenę rzedniego odcinka oka i dna oka, kolorową fotografię dna oka (fundus kamera Tocon-TRC-50DX, Jaonia), omiar centralnej grubości siatkówki (Central Retinal Thickness CRT) za omocą otycznej koherentnej tomografii (Otical Coherence Tomograhy OCT) (Tocon 3D OCT 2000, Jaonia) oraz badanie angiografii fluoresceinowej (Fluorescein Angiograhy FA) (Tocon, TRC-50DX/A, Jaonia). Co 4 tygodnie rzerowadzano badania kontrolne wszystkie ww. z wyjątkiem FA. Leczenie doszklistkowymi iniekcjami czynnika anty-vegf (ranibizumabem 0,5 mg/ 0,05 ml, bewacyzumabem 1,25 mg/ 0,5 ml) rzebiegało dwufazowo: w fazie nasycającej każdy chory otrzymywał trzy kolejne iniekcje czynnika anty-vegf w odstęach miesięcznych, a fazie odtrzymującej odstawą doboru leczenia był wynik badania klinicznego wg schematu ro re nata, czyli w razie otrzeby. Grua kontrolna liczyła 58 osób dobranych od względem łci i wieku sośród oerowanych w naszej klinice z owodu zaćmy acjentów, u których wykluczono obecność AMD. W wywiadach lekarskich, które rzerowadzono zarówno u chorych na AMD, jak i u osób z gruy kontrolnej, nie stwierdzono rodzinnego wystęowania chorób dziedzicznych i nowotworowych. ISSN Index Klinika Oczna 2016, 118 (2) 115

3 Wływ olimorfizmów Y402H, E318D oraz R102G genów kodujących białka układu doełniacza na wyniki leczenia doszklistkowymi iniekcjami Po uzyskaniu zgody Komisji Bioetycznej UJ (KBE- T/67/B/2013) oraz świadomej isemnej zgody acjenta na udział w badaniu we wszystkich rzyadkach obrano jednorazowo do oznaczeń genetycznych 4 5 ml ełnej krwi, w której badano olimorfizmy: E318D rs (C2), R102G rs (C3) oraz Y402H rs (CFH). Izolacja DNA Krew obwodową do badań molekularnych obierano na antykoagulant EDTA. Do ełnej krwi dodawano 6-rocentowy roztwór wielkocząsteczkowego dekstranu (Dexstran T500, Pharmacia) w celu sedymentacji erytrocytów. Bogate w leukocyty osocze odciągano i wirowano rzez 10 min/ x g. DNA izolowano z białych komórek krwi metodą Chomczyńskiego i Sacchiego (DNAzol, Gibco). Ten odczynnik zawiera roztwór lizujący izotiocjanian guanidyny, który dzięki rozbiciu wiązań wodorowych owoduje całkowite uwolnienie DNA z komleksów jądrowych z białkami histonowymi. Do owstałego o odwirowaniu osadu dodawano 0,4 ml odczynnika DNAzol i wstrząsano. Po rozuszczeniu błon komórkowych leukocytów DNA recyitowano 95-rocentowym alkoholem etylowym w objętości 0,2 ml. Nastęnie wyizolowane DNA łukano w 70-rocentowym etanolu i suszono w cielarce w temeraturze 37 C. Wysuszone DNA zalewano wodą redestylowaną i w takiej ostaci oddawano dalszym badaniom. Reakcja łańcuchowa olimerazy w czasie rzeczywistym Wyizolowane w ten sosób DNA było amlifikowane i oddawane genotyowaniu metodą reakcji łańcuchowej olimerazy w czasie rzeczywistym ( real-time PCR Polymerase Chain Reaction PCR). Ta metoda bazuje na klasycznej metodzie olimerazowej reakcji łańcuchowej i ozwala na monitorowanie ilości roduktu amlifikacji w każdym cyklu reakcji, wykorzystując swoiste od względem wariantów sekwencji znakowane fluorescencyjnie sondy molekularne rzyłączające się między arą starterów PCR. W tym rzyadku użyto sond TaqMan (TaqManrobes, 5 -nuclease robes). Są to krótkie oligonukleotydy komlementarne do owielanej sekwencji DNA, zawierające na końcu 5 barwnik fluorescencyjny, a na końcu 3 cząsteczkę wygaszającą fluorescencję. Podczas każdego cyklu PCR sonda rozoznaje swoisty region matrycy DNA i wiąże się z nim między miejscami rzyłączenia starterów. Po związaniu się z nimi w rocesie elongacji sonda jest degradowana rzez olimerazę Taq mającą aktywność 5 -egzonukleazy, w wyniku tego fluorochrom ulega oddzieleniu, wywołując emisję fluorescencji. Reakcja real-time PCR była rzerowadzana na łytkach 96-dołkowych w aaracie 7900 HT Real-Time PCR System (Alied Biosystems). Standardowa mieszanina reakcyjna zawierała roztwory substratów i olimerazy; TaqMan Universal PCR Master Mix, startery, sondy, wodę oraz DNA zgodnie z zaleceniem roducenta (TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol Alied Biosystems). Sondy oraz startery zakuiono w firmie Alied Biosystems w ostaci gotowych do użycia TaqMan Gene Exression Assay. Analiza statystyczna W badanych gruach istotność różnic między częstością alleli i genotyów oceniano za omocą testu Chi 2. Analizę związku genotyów olimorfizmu z wystęowaniem AMD wykonano według modelu regresji logistycznej. Dla każdej ary obliczano wartość ilorazu szans (Odds Ratio OR) oraz rzedział ufności (95% PU). Wartości OR były nastęnie korygowane od względem otencjalnych czynników zakłócających i odawane jako OR skorygowane. Do analizy statystycznej i oracowania wyników użyto orogramowania STATISTICA Wartości <0,05 uznano za statystycznie istotne. Wyniki W tabeli I rzedstawiono szczegółową charakterystykę gruy chorych na AMD oraz gruy kontrolnej. U chorych na AMD zwraca uwagę znacznie częściej wystęujące obciążenie rodzinne tym schorzeniem aniżeli u osób z gruy kontrolnej (=0,0034). Analizie oddano wływ kilku czynników, tj.: łci, wieku, alenia tytoniu, miejsca zamieszkania, ozytywnego wywiadu rodzinnego w kierunku AMD, które otencjalnie zwiększają rawdoodobieństwo rozwoju AMD, na ryzyko rozwoju tego schorzenia niezależnie od badanych olimorfizmów genowych. W naszym materiale klinicznym łeć żeńska, wiek owyżej 60 lat, środowisko miejskie oraz ozytywny wywiad rodzinny istotnie wływały na zwiększenie ryzyka wystąienia AMD najsilniejszą dodatnią korelację stwierdzono dla wieku owyżej 60 lat (=0,0002) oraz ozytywnego wywiadu rodzinnego (=0,0023) (tab. II). Na uwagę za- Badana cecha/ Characteristic Grua AMD/ AMD grou liczba/ number Grua kontrolna/ Control grou liczba/ number Płeć/ Sex 0,0206 kobiety/ females 70 (66%) 30 (53%) mężczyźni/ males 36 (34%) 28 (47%) Wiek/ Age lat (śr. 71,2 roku) lat (śr. 68,4 roku) 60 lat/ 60 years 13 (12,3%) 11 (18,9%) > 60 lat/ > 60 years 93 (87,7%) 47 (81,1%) Palenie tytoniu/ Smoking obecnie/ w rzeszłości/ current/ former 31 (29%) 15 (25,8%) nigdy/ never 75 (71%) 43 (74,2%) Miejsce zamieszkania/ Living environment miasto/ urban 74 (69,8%) 36 (62%) wieś/ rural 32 (30,2%) 22 (38%) Wywiad rodzinny/ Family history of AMD ozytywny/ ositive 24 (22,64%) 4 (4%) negatywny /negative 82 (77,35%) 54 (96%) Tab. I. Tab. I. 0,0232 0,0896 0,0176 0,0034 Charakterystyka chorych na AMD i osób z gruy kontrolnej. Characteristics of subjects with AMD and a control grou. 116 Klinika Oczna 2016, 118 (2) ISSN Index

4 Agnieszka Kubicka-Trząska, Izabella Karska-Basta, Joanna Kobylarz, Sylwia Dziedzina, Marek Sanak, Bożena Romanowska-Dixon Badana cecha/ Characteristics Grua AMD/ AMD grou Liczba/ number Grua kontrolna/ Control grou liczba/ number OR (95% PU) (<0,05) Płeć/ Sex 0,0216 kobiety/ females 70 (66%) 30 (53%) 2,16 (1,11 4,19) mężczyźni/ males 36 (34%) 28 (47%) 0,46 (0,24 0,90) Wiek/ Age 0, lat / 60 years 13 (12,3%) 11 (18,9%) 0,18 (0,24 0,90) > 60 lat / > 60 years 93 (87,7%) 47 (81,1%) 5,51 (2,20 13,80) Palenie tytoniu/ Smoking status 0,0931 obecnie/ w rzeszłości current/ former 31 (29%) 15 (25,8%) 0,50 (0,23 1,13) nigdy/ never 75 (71%) 43 (74,2%) 1,98 (0,89 4,44) Miejsce zamieszkania/ Living environment 0,0191 miasto/ urban 74 (69,8%) 36 (62%) 2,33 (1,14 4,76) wieś/ rural 32 (30,2%) 22 (38%) 0,43 (0,21 0,87) Wywiad rodzinny w kierunku AMD/ Family history of AMD 0,0023 ozytywny/ ositive 24 (22,64%) 4 (4%) 8,44 (3,56 14,70) negatywny/ negative 82 (77,35%) 54 (96%) 0,11 (0,19 0,80) Tab. II. Ryzyko rozwoju AMD związane z łcią, wiekiem, aleniem tytoniu, miejscem zamieszkania i obciążeniem rodzinnym AMD. Tab. II. Risk of AMD develoment deending on atient s sex, age, smoking status, living environment and a family history of AMD. sługuje fakt, że w badanej gruie chorych nie wykazano istotnej statystycznie zależności między aleniem tytoniu, uważanym za jeden z najważniejszych modyfikowalnych czynników ryzyka rozwoju AMD, a wystęowaniem tego schorzenia (=0,0931). W tabelach III, IV i V rzedstawiono rozkład genotyów i alleli trzech badanych olimorfizmów: E318D rs (C2), R102G rs (C3) oraz Y402H rs (CFH) oraz wartości otrzymane dla rzerowadzonej analizy ilorazu szans w gruie chorych na AMD w odniesieniu do gruy kontrolnej. Między dwiema gruami nie wykazano istotnych statystycznie różnic w rozkładzie genotyów i alleli dla olimorfizmów E318D rs (C2) i R102G rs (C3) (tab. III i IV). Natomiast w rzyadku olimorfizmu Y402H rs (CFH) stwierdzono wystęowanie istotnych różnic w rozkładzie genotyów CC (=0,0069), TT (=0,0193) oraz alleli C (=0,034) i T (=0,022) między gruą badaną a gruą osób niechorujących na AMD. Analiza wykazała, że genoty CC oraz allel C zwiększają ryzyko wystąienia wysiękowej ostaci AMD (OR 3,04, 95% PU 1,34 9,91; OR 2,35, 95% PU 1,45 5,44), odczas gdy genoty TT oraz allel T mogą je zmniejszać (OR 0,42, 95% PU 0,20 0,89; OR 0,29, 95% PU 0,11 0,78) (tab. V). Wyniki obserwacji wskazywały, że u 27 chorych (25,47%) z badanej gruy nie odnotowano ozytywnej reakcji na miejscowe leczenie antyangiogenne. U tych chorych omimo leczenia nie uzyskano orawy zarówno funkcji leczonego oka, jak i zobrazowanej badaniem OCT morfologii dołka za brak Genoty/ allel Genotye/ alelle Grua AMD/ AMD grou Grua kontrolna/ Control grou Wskaźnik OR nieskorygowany OR crude (95% PU) Wskaźnik OR skorygowany OR adjusted (95% PU) GG 101 (95%) 51 (88%) 0,36 (0,11 1,20) 0,38 (0,16 1,28) 0,1032 gc 5 (5%) 7 (12%) 2,77 (0,83 9,25) 2,86 (0,88 9,30) 0,1032 G 198 (94,3%) 98 (89%) 0,98 (0,28 2,45) 0,98 (0,28 2,45) 0,1340 g 6 (2,85%) 6 (5,45%) 0,5 (0,12 1,23) 0,5 (0,12 1,23) 0,2240 c 6 (2,85%) 6 (5,45%) 0,5 (0,12 1,23) 0,5 (0,12 1,23) 0,2240 Tab. III. Rozkład genów i alleli olimorfizmu E318D rs C2 oraz analiza ilorazu szans (Odds Ratio OR) w gruie chorych na AMD i w gruie kontrolnej. Tab. III. Distribution of genotyes and alleles of the E318D rs C2 olymorhism as well as the odds ratio (OR) in a study grou and healthy controls. ISSN Index Klinika Oczna 2016, 118 (2) 117

5 Wływ olimorfizmów Y402H, E318D oraz R102G genów kodujących białka układu doełniacza na wyniki leczenia doszklistkowymi iniekcjami Genoty/ Allel Genoty/ Alelle Grua AMD/ AMD grou Grua kontrolna/ Control grou Wskaźnik OR nieskorygowany OR crude (95% PU) Wskaźnik OR skorygowany OR adjusted (95% PU) GG 65 (61%) 40 (69%) 0,81 (0,4 1,64) 0,72 (0,31 1,54) 0,3080 gc 34 (32%) 16 (28%) 1,4 (0,71 2,78) 1,8 (0,88 2,85) 0,5951 cc 7 (7%) 2 (3%) 0,51 (0,23 2,55) 0,58 (0,19 2,95) 0,2862 G 130 (61,93%) 78 (70,9%) 0,66 (0,32 2,67) 0,68 (0,35 2,69) 0,2242 g 33 (15,7%) 14 (12,7%) 1,28 (0,98 2,34) 1,30 (0,85 2,38) 0,3641 c 47 (22,4%) 16 (1,45%) 0,53 (0,23 2,45) 0,68 (0,56 2,86) 0,5428 Tab. IV. Rozkład genów i alleli olimorfizmu R102G rs C3 oraz analiza ilorazu szans (Odds Ratio OR) w gruie chorych na AMD i w gruie kontrolnej. Tab. IV. Distribution of genotyes and alleles of the R102G rs C3 olymorhism and odds ratio (OR) in a study grou and healthy controls. Genoty/ Allel Genotye/ Allele Grua AMD/ AMD grou Grua kontrolna/ Control grou Wskaźnik OR nieskorygowany OR crude (95% PU) Wskaźnik OR skorygowany OR adjusted (95% PU) CC 38 (36%) 9 (15%) 3,04 (1,34 9,91) 3,09 (1,28 7,49) 0,0069 CT 50 (47%) 30 (52%) 0,58 (0,41 1,66) 0,82 (0,41 1,66) 0,5402 TT 18 (17%) 19 (33%) 0,42 (0,20 0,89) 0,41 (0,18 0,93) 0,0193 C 87 (82,9%) 37 (67,3%) 2,35 (1,45 5,44) 2,36 (1,34 5,67) 0,0340 T 66 (62,9%) 47 (85,5%) 0,29 (0,11 0,78) 0,35 (0,18 0,97) 0,0220 Tab. V. Tab. V. Rozkład genów i alleli olimorfizmu Y402H rs CFH oraz analiza ilorazu szans (Odds Ratio OR) w gruie chorych na AMD i w gruie kontrolnej. Distribution of genotyes and alleles of the Y402H rs CFH olymorhism and odds ratio (OR) in a study grou and healthy controls. orawy funkcji oka uznawano brak orawy BCVA lub jej ogorszenie względem tych arametrów uzyskanych w badaniu wyjściowym. Morfologię dołka oceniano omiarami CRT oraz ilości łynu śródsiatkówkowego, od częścią neurosensoryczną siatkówki oraz od nabłonkiem barwnikowym siatkówki (Retinal Pigment Eithelium RPE). Na rycinie 1. rzedstawiono liczbę chorych, u których stwierdzono redukcję CRT, oraz liczbę liczba chorych / of atients m-c 2 m-c 3 m-c 4 m-c 5 m-c 6 m-c redukcja CRT brak redukcji CRT kontrola / follow-u Ryc. 1. Liczba chorych, u których stwierdzono redukcję centralnej grubości siatkówki (Central Retinal Thickness CRT), oraz liczba chorych, w oczach których nie odnotowano orawy morfologii dołka w obrazie OCT w oszczególnych badaniach kontrolnych. Fig. 1. Number of atients with reduction of central retinal thickness (CRT) and with unchanged CRT in treated eyes during a follow-u eriod in OCT scans. chorych, w oczach których nie odnotowano orawy morfologii dołka w obrazie OCT w oszczególnych badaniach kontrolnych. Analiza statystyczna wykazała zależność między genotyami olimorfizmu rs a odowiedzią na zastosowane leczenie antyangiogenne. Analiza stosunku szansy braku reakcji na leczenie u chorych z genotyami CC i TT olimrorfizmu rs do szansy braku reakcji na leczenie u chorych bez tych genotyów wykazała, że genoty CC romuje negatywną odowiedź na leczenie antyangiogenne (OR 7,67 95% PU, 1,77 33,12), odczas gdy genoty TT może zmniejszać ryzyko wystąienia słabej odowiedzi na leczenie doszklistkowymi iniekcjami czynnika anty-vegf (OR 0,31 95% PU, 0,11 0,84 (tab. V). Jednocześnie wykazano, że u chorych z genotyem CC odano średnio o 1,4 iniekcji doszklistkowej więcej w orównaniu do liczby iniekcji odawanych u osób bez tego genotyu. Omówienie Ostatnie obserwacje wskazują na istotny wływ tła genetycznego na wyniki teraii antyoksydantami, fotodynamicznej i doszklistkowymi iniekcjami czynnika anty-vegf u chorych na wysiękową ostać AMD (12 17). W większości ublikacji odkreśla się znaczenie kilku wariantów genów kodujących białka układu doełniacza, wśród których najistotniejsze znaczenie ma olimorfizm rs (Y402H) genu kodującego czynnik CFH (10, 13, 15, 16, 18, 19). Czynnik CFH jest istotnym regulatorem aktywacji układu doełniacza. Jego olimorfizm Y402H (rs ) (zamiana tyrozyny na histydynę), owodujący nadreaktywność drogi alterna- 118 Klinika Oczna 2016, 118 (2) ISSN Index

6 Agnieszka Kubicka-Trząska, Izabella Karska-Basta, Joanna Kobylarz, Sylwia Dziedzina, Marek Sanak, Bożena Romanowska-Dixon tywnej doełniacza, rowadzi do niszczenia własnych komórek, w tym m.in. komórek RPE (17). Wyniki rzerowadzonych dotychczas badań immunohistochemicznych wykazały, że acjenci będący homozygotycznymi nosicielami genotyu CC wykazują 2,5-raza zwiększoną immunoreaktywność białka C reaktywnego (C Reactive Protein CRP) w obrębie naczyniówki, błony Brucha i druz (10, 20). Gromadzenie się CRP w rzestrzeni od RPE jest uważane za biomarker rzewlekłego zaalenia toczącego się w obrębie komleksu RPE naczyniówka (20). To sugeruje, że olimorfizm Y402H zaburza mediowaną rzez czynnik H funkcję CRP, odgrywając w ten sosób ważną rolę w inicjacji lokalnego zaalenia, które rowadzi do uszkodzenia komórek RPE indukowanego aktywacją doełniacza. Polimorfizm Y402H (rs ) imlikuje zmniejszenie roli ochronnej czynnika H lub jego całkowity brak, czynnika, który jest suresorem aktywacji alternatywnej drogi zarówno w osoczu, jak i w tkankach objętych zaaleniem (15). Polimorfizm Y402H wobec wsółistnienia środowiskowych i osobniczych czynników ryzyka AMD osłabia aktywność CFH jako regulatora alternatywnej drogi układu doełniacza, zezwalając na jego niekontrolowaną aktywację. Dochodzi do rozwoju rzewlekłego lokalnego odczynu zaalnego ( ara-inflammation ), który zagraża owstaniem zmian zwyrodnieniowych w lamce (15, 20). Wyniki badań eidemiologicznych udowodniły, że wystąienie olimorfizmu Y402H rs (CFH) 2 4-krotnie zwiększa ryzyko rozwoju AMD u heterozygot oraz 3 7-krotnie u homozygot (19). Ponadto osoby z genotyem homozygotycznym CC wykazują gorszą reakcję na leczenie doustnymi antyoksydantami i cynkiem w orównaniu do osób będących nosicielami homozygotycznego genotyu TT (12). Rozbieżne wyniki natomiast odnotowano w badaniach chorych oddanych teraii fotodynamicznej (Photodynamic Theray PDT) z użyciem werteorfiny. Wykazano, że acjenci będący nosicielami genotyu CC olimorfizmu rs (Y402H) gorzej reagują na PDT (14). Brantley i ws. zaś zaobserwowali, że wyniki leczenia PDT są znacznie gorsze u osób będących homozygotami TT w orównaniu do chorych z genotyem CC (CFH) (13). Istnienie różnych zależności między olimorfizmem rs (Y402H) a odowiedzią na miejscowe leczenie antyangiogenne zostało rzedstawione w kilku ublikacjach (12 17, 21 25). Brantley i ws. obserwacją objęli chorych leczonych doszklistkowymi iniekcjami bewacyzumabu. Wykazali, że o 6 miesiącach od rozoczęcia leczenia BCVA była znacznie gorsza u osób z genotyem CC Y402H rs (CFH) w orównaniu do BCVA u acjentów z genotyami TT i CT (13). Podobne obserwacje oisali Nischler i ws. oraz Imai i ws. (16, 17). Lee i ws. natomiast nie wykazali wływu wystęowania różnych genotyów rs (CFH) na ostateczną BCVA u chorych na wysiękową ostać AMD leczonych doszklistkowymi iniekcjami ranibizumabu. Niemniej jednak o 9 miesiącach obserwacji autorzy odnotowali, że chorzy z genotyem CC otrzymali o około 1 iniekcję więcej w orównaniu do liczby iniekcji u chorych z genotyami TT czy CT (15). Mckibbin i ws. wykazali, że u chorych na wysiękową ostać AMD leczonych ranibizumabem w okresie 6-miesięcznej obserwacji wyniki leczenia były bardziej korzystne u osób z genotyem wysokiego ryzyka (CC) dla rozwoju AMD (26). Menghini i ws. natomiast wykazali, że genoty CT rs (Y402H) CFH był istotnym wskaźnikiem ozytywnej odowiedzi na leczenie i orawy BCVA ocenianej o 12 i 24 miesiącach od włączenia leczenia ranibizumabem (27). Brak zależności między genotyami olimorfizmu rs (Y402H) CFH a wynikami leczenia ranibizumabem u chorych na AMD w okresie rocznej obserwacji rzedstawili w swojej racy Yamashiro i ws. (28). Na uwagę zasługują także wyniki badań rzerowadzonych z udziałem acjentów z 43 ośrodków klinicznych, zostali objęci badaniem CATT (Comarison of AMD Treatments Trials), u których oznaczano olimorfizmy rs (CFH), rs (ARMS2), rs (HTRA1) oraz rs (C3). Analiza statystyczna nie wykazała u chorych różnic w odowiedzi na miejscowe leczenie antyangiogenne, które byłyby zależne od nosicielstwa genotyu badanego wariantu genowego. Żaden z badanych genotyów nie wływał istotnie na ostateczną ostrość wzroku, zmianę CRT czy liczbę odanych iniekcji doszklistkowych czynnika anty-vegf. Podobnie nie wykazano zależności między liczbą wystęujących u jednego chorego genotyów będących czynnikami ryzyka rozwoju AMD a ostatecznymi wynikami leczenia. Nie stwierdzono także zależności między allelami/genotyami zagrażającymi owstaniem AMD a odowiedzią na leczenie niezależnie od rodzaju odawanego doszklistkowo leku oraz zastosowanego schematu leczenia (iniekcje comiesięczne vs ro re nata) (29). Podobnie jak większość oublikowanych wyników i wyniki naszych badań wskazują na istotną zależność między olimorfizmem Y402H rs (CFH), który zwiększa ryzyko wystąienia AMD, a rozwojem tego schorzenia. W okresie 6-miesięcznej obserwacji u chorych z genotyem CC rs (CFH) zaobserwowaliśmy istotnie gorsze funkcjonalne oraz anatomiczne wyniki leczenia doszkistkowymi iniekcjami ranibizumabu i bewacyzumabu aniżeli u osób nieosiadających tego genotyu. U chorych odnotowaliśmy gorszą ostateczną BCVA oraz większą CRT zobrazowaną badaniem OCT. W okresie 6-miesięcznej obserwacji chorym z tej gruy odano średnio o 1,4 iniekcji więcej aniżeli osobom negatywnym dla tego genotyu. Najistotniejsze różnice w odowiedzi na leczenie (BCVA i CRT) między chorymi z genotyami CC oraz TT i CT były zauważalne w ierwszym okresie leczenia (faza nasycająca ), kiedy wszyscy chorzy otrzymali trzy iniekcje czynnika anty-vegf w odstęach comiesięcznych. Wyniki naszych obserwacji wykazały, że olimorfizmy E318D rs (C2) oraz R102G rs (C3) nie mają związku z rozwojem AMD. Wyniki badań rzerowadzonych w Stanach Zjednoczonych rzez Sencera i ws. wykazały, że wariant E318D genu czynnika C2 ełni rolę rotekcyjną wobec rozwoju AMD w oulacji kaukaskiej (30). Wyniki badań rzerowadzonych w Australii nie otwierdziły tej obserwacji (31). Havvas i ws. rzerowadzili badanie z udziałem 120 chorych na AMD, wyniki ich badania również nie wskazywały, aby ten olimorfizm miał istotne imlikacje atogenetyczne dla rozwoju AMD w oulacji greckiej (32). Ochronna rola olimorfizmu genetycznego białka C2 układu doełniacza nie została również otwierdzona w badaniach rzerowadzonych w oulacji azjatyckiej, w której stwierdzono bardzo rzadkie wystęowanie tego wariantu genetycznego (33). Na ochronny wływ olimorfizmu R102G rs (C3) na rozwój AMD w oulacji azjatyckiej natomiast wskazały wyniki badań Pei i ws. oraz Yanagisawa i ws. (34, 35). Ocena wystęowania olimorfizmu R102G rs (C3) w oulacji ISSN Index Klinika Oczna 2016, 118 (2) 119

7 Wływ olimorfizmów Y402H, E318D oraz R102G genów kodujących białka układu doełniacza na wyniki leczenia doszklistkowymi iniekcjami niemieckiej nie otwierdziła istnienia związku między tym wariantem genowym a rozwojem AMD (36). Ten wariant zmienia mobilność cząsteczki C3, która może rzybierać formy szybką C3F lub wolną C3S, wykazujące różnice w wiązaniu się z recetorami (34 36). Patofizjologię i molekularny mechanizm działania badanych olimorfizmów rzedstawiono szczegółowo w naszej wcześniejszej ublikacji (37). Poznanie olimorfizmów genetycznych zagrażających rozwojem AMD i mających wływ na wyniki leczenia wysiękowej ostaci AMD oraz ich ocena mogą być cennymi narzędziami do wczesnego identyfikowania chorych oornych na teraię antyangiogenną. Ze względu na dużą rozbieżność dotychczas oznanych wyników badań klinicznych, które wskazują na zróżnicowany wływ badanych olimorfizmów genowych na rozwój AMD oraz na wyniki zastosowanego leczenia w zależności od badanej gruy chorych, wydaje się wskazane stworzenie indywidualnego i swoistego dla danej oulacji anelu badań genetycznych. Niektórzy autorzy odkreślają, jak istotne znaczenie ma zjawisko kumulacji efektów alleli ryzyka rozwoju AMD w rognozowaniu odowiedzi na leczenie antyangiogenne (24). Dlatego w celu zwiększenia rawdoodobieństwa ostawienia właściwej rognozy dotyczącej nieowodzenia teraii anty-vegf oszukuje się kolejnych wariantów genowych, które mogłyby wływać na rzebieg kliniczny AMD i jego leczenie. Być może już w niedalekiej rzyszłości będą one istotnym elementem diagnostyki chorych na AMD omogłoby zalanować indywidualną strategię ostęowania w tych rzyadkach. Wnioski U chorych z badanej gruy genoty CC olimorfizmu rs CFH (Y402H) zwiększa ryzyko wystąienia AMD. Genoty CC olimorfizmu rs CFH odowiada za negatywną odowiedź na leczenie antyangiogenne, odczas gdy genoty TT może zmniejszać ryzyko braku odowiedzi na leczenie doszklistkowymi iniekcjami czynnika anty-vegf lub ryzyko, że odowiedź ta będzie słaba. Niezależnie od olimorfizmu Y402H rs (CFH) ryzyko zachorowania na AMD zwiększają: łeć żeńska, wiek owyżej 60. roku życia, środowisko miejskie oraz dodatni wywiad rodzinny. Wrowadzenie do standardów diagnostycznych AMD anelu badań genetycznych może odegrać w niedalekiej rzyszłości dużą rolę w rocesach indywidualizacji i rognozowania skuteczności rowadzonego leczenia antyangiogennego. Praca owstała w ramach rogramu statutowego nr K/ZDS/ Piśmiennictwo 1. Bourne RR, Jonas JB, Flaxman SR, Keeffe J, Leasher J, Naidoo K, et al.: Vision Loss Exert Grou of the Global Burden of Disease Study. Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Euroe: Br J Ohthalmol. 2014; 98(5): Smith W, Assink J, Klein R, Mitchell P, Klaver CC, Klein BE, et al.: Risk factors for age-related macular degeneration: Pooled findings from three continents. Ohthalmology. 2001; 108(4): Cascella R, Ragazzo M, Strafella C, Missiroli F, Borgiani P, Angelucci F, et al.: Age-related macular degeneration: insights into inflammatory genes. J Ohthalmol. 2014; 2014: Ting AY, Lee TK, MacDonald IM: Genetics of age-related macular degeneration. Curr Oin Ohthalmol. 2009; 20: Wysokinski D, Danisz K, Pawlowska E, Dorecka M, Romaniuk D, Robaszkiewicz J, et al.: Transferrin recetor levels and olymorhism of its gene in age-related macular degeneration. Acta Biochim Pol. 2015; 62(2): Synowiec E, Wysokinski D, Zaras M, Kolodziejska U, Stoczynska-Fidelus E, Janik K, et al.: Association between olymorhism of the DNA reair SMUG1 and UNG genes and age-related macular degeneration. Retina. 2014; 34(1): McHarg S, Clark SJ, Day AJ, Bisho PN: Age-related macular degeneration and the role of the comlement system. Mol Immunol. 2015, Mar 21. ii: S (15) doi: /j.molimm Whitmore SS, Sohn EH, Chirco KR, Drack AV, Stone EM, Tucker BA, et al.: Comlement activation and choriocaillaris loss in early AMD: imlications for athohysiology and theray. Prog Retin Eye Res. 2015; 45: Machalińska A, Kawa MP, Marlicz W, Machaliński B: Comlement system activation and endothelial dysfunction in atients with age-related macular degeneration (AMD): ossible relationshi between AMD and atherosclerosis. Acta Ohthalmol. 2012; 90(8): Brantley MA Jr., Fang AM, King JM, Tewari A, Kymes SM, Shiels A.: Association of comlement factor H and LOC genotyes with resonse of exudative age-related macular degeneration to intravitreal bevacizumab. Ohthalmology 2007; 114: Kloeckener-Gruissem B, Barthelmes D, Labs S, Schindler C, Kurz-Levin M, Michels S, et al.: Genetic association with resonse to intravitreal ranibizumab in atients with neovascular AMD. Invest Ohthalmol Vis Sci. 2011; 52: Klein ML, Francis PJ, Rosner B, Reynolds R, Hamon SC, Schultz DW, et al.: CFH and LOC387715/ARMS2 genotyes and treatment with antioxidants and zinc for age-related macular degeneration. Ohthalmology. 2008; 115(6): Brantley MA Jr., Edelstein SL, King JM, Plotzke MR, Ate RS, Kymes SM, et al.: Association of comlement factor H and LOC genotyes with resonse of exudative age-related macular degeneration to hotodynamic theray. Eye. 2009; 23(3): Feng X, Xiao J, Longville B, Tan AX, Wu XN, Cooer MN, et al.: Comlement factor H Y402H and C-reactive rotein olymorhism and hotodynamic theray resonse in age-related macular degeneration. Ohthalmology. 2009; 116(10): Lee AY, Raya AK, Kymes SM, Shiels A, Brantley MA Jr.: Pharmacogenetics of comlement factor H (Y402H) and treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. Br J Ohthalmol 2009; 93: Nischler C, Oberkofler H, Ortner C, Paikl D, Riha W, Lang N, et al.: Comlement factor H Y402H gene olymorhism and resonse to intravitreal bevacizumab in exudative age-related macular degeneration. Acta Ohthalmol. 2011; 89: e Imai D, Mori K, Horie-Inoue K, Gehlbach PL, Awata T, Inoue S, et al.: CFH, VEGF, and PEDF genotyes and the resonse to in- 120 Klinika Oczna 2016, 118 (2) ISSN Index

8 Agnieszka Kubicka-Trząska, Izabella Karska-Basta, Joanna Kobylarz, Sylwia Dziedzina, Marek Sanak, Bożena Romanowska-Dixon travitreous injection of bevacizumab for the treatment of age- -related macular degeneration. J Ocul Biol Dis Infor. 2010; 3: Tsuchihashi T, Mori K, Horie-Inoue K, Gehlbach PL, Kabasawa S, Takita H, et al.: Comlement factor H and high-temerature requirement A-1 genotyes and treatment resonse of age-related macular degeneration. Ohthalmology. 2011; 118(1): Sofat R, Casas JP, Webster AR, Bird AC, Mann SS, Yates JRW, et al.: Comlement factor H genetic variant and age-related macular degeneration: effect size, modifiers and relationshi to disease subtye. Int J Eidemiol. 2012; 41: Johnson PT, Betts KE, Radeke MJ, Hageman GS, Anderson DH, Johnson LV: Individual homozygous for the age-related macular degeneration risk-conferring variant of comlement factor H have elevated levels of CRP in the choroid. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103: Veloso CE, de Almeida LN, Recchia FM, Pelayes D, Nehemy MB: VEGF gene olymorhism and resonse to intravitreal ranibizumab in neovascular age-related macular degeneration. Ohthalmic Res. 2014; 51(1): Veloso CE, Almeida LN, Nehemy MB: CFH Y402H olymorhism and resonse to intravitreal ranibizumab in Brazilian atients with neovascular age-related macular degeneration. Rev Col Bras Cir Nov-Dec; 41(6): Chen H, Yu KD, Xu GZ: Association between variant Y402H in age-related macular degeneration (AMD) suscetibility gene CFH and treatment resonse of AMD: a meta-analysis. PLoS One. 2012; 7(8): e doi: /journal.one Smailhodzic D, Muether PS, Chen J, Kwestro A, Zhang AY, Omar A, et al.: Cumulative effect of risk alleles in CFH, ARMS2, and VEGFA on the resonse to ranibizumab treatment in age- -related macular degeneration. Ohthalmology. 2012; 119(11): Kloeckener-Gruissem B, Barthelmes D, Labs S, Schindler C, Kurz-Levin M, Michels S, et al.: Genetic association with resonse to intravitreal ranibizumab in atients with neovascular AMD. Invest Ohthalmol Vis Sci. 2011; 52(7): McKibbin M, Ali M, Bansal S, Baxter PD, West K, Williams G, et al.: CFH, VEGF and HTRA1 romoter genotye may influence the resonse to intravitreal ranibizumab theray for neovascular age-related macular degeneration. Br J Ohthalmol. 2012; 96(2): Menghini M, Kloeckener-Gruissem B, Fleischhauer J, Kurz-Levin MM, Sutter FK, Berger W, et al.: Imact of loading hase, initial resonse and CFH genotye on the long-term outcome of treatment for neovascular age-related macular degeneration. PLoS One. 2012; 7(7): e Yamashiro K, Tomita K, Tsujikawa A, Nakata I, Akagi-Kurashige Y, Miyake M, et al.: Factors associated with the resonse of age-related macular degeneration to intravitreal ranibizumab treatment. Am J Ohthalmol. 2012; 154(1): Hagstrom SA, Ying GS, Pauer GJ, Sturgill-Short GM, Huang J, Callanan DG, et al.: Pharmacogenetics for genes associated with age-related macular degeneration in the Comarison of AMD Treatments Trials (CATT). Ohthalmology. 2013; 120(3): Sencer KL, Hauser MA, Olson LM, Schmidt S, Scott WK, Gallins P, et al.: Protective effect of comlement factor B and comlement comonent 2 variants in age-related macular degeneration. Hum Mol Gen. 2007; 16(16): Richardson AJ, Islam FMA, Guymer RH, Baird PN: Analysis of rare variants in the comlement comonent 2 (C2) and factor B (BF) genes refine association for age-related macular degeneration (AMD). Invest Ohthalmol Vis Sci. 2009; 50: Havvas I, Marioli DI, Deli A, Zarkadis IK, Pharmakakis N: Comlement C3, C2,and factor B gene olymorhisms and age-related macular degeneration in a Greek cohort study. Eur J Ohthalmol. 2014; 24(5): Wu L, Tao Q, Chen W, Wang Z, Song Y, Sheng S, et al.: Association between olymorhisms of comlement athway genes and age-related macular degeneration in a Chinese oulation. Invest Ohthalmol Vis Sci. 2013; 54(1): Pei XT, Li XX, Bao YZ, Yu WZ, Yan Z, Qi HJ, et al.: Association of c3 gene olymorhisms with neovascular age-related macular degeneration in a chinese oulation. Curr Eye Res. 2009; 34(8): Yanagisawa S, Kondo N, Miki A, Matsumiya W, Kusuhara S, Tsukahara Y, et al.: A common comlement C3 variant is associated with rotection against wet age-related macular degeneration in a Jaanese oulation. PLoS One. 2011; 6(12): e doi: /journal.one Baatz H, Pouel L, Coudert M, Sennlaub F, Combadiere C: Polymorhisms of comlement factor genes and age-related macular degeneration in a German oulation. Klin Monbl Augenheilkd. 2009; 226(8): Kubicka-Trząska A, Karska-Basta I, Dziedzina S, Sanak M: Zmienność genetyczna układu doełniacza w atogenezie zwyrodnienia lamki związanego z wiekiem. Klin Oczna 2015; 117(2): Praca włynęła do Redakcji r. (KO ) Zakwalifikowano do druku r. Adres do koresondencji (Rerint requests to): dr hab. n. med. Agnieszka Kubicka-Trząska Klinika Okulistyki i Onkologii Okulistycznej UJ CM ul. Koernika Kraków akubicka@onet.l ISSN Index Klinika Oczna 2016, 118 (2) 121