Analiza danych pochodzących z sekwencjonowania nowej generacji - przyrównanie do genomu referencyjnego. - część I -

Transkrypt

1 pochodzących z sekwencjonowania nowej generacji - przyrównanie do genomu referencyjnego - część I - Katedra Genetyki Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

2 Plan wykładów część I Wstęp: - Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) - Przyrównanie do genomu referencyjnego - Formaty sekwencji (input) Wybór odpowiedniego środowiska i praca w nim Wizualizacja/ analiza sekwencji część II Wybór programów do: - przyrównywania sekwencji - do wizualizacji przyrównania Formaty sekwencji (output) 2

3 Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) Równoległe sekwencjonowanie wielu bardzo krótkich fragmentów DNA unieruchomionych na podłożu Sekwencjonowanie całych genomów! Efekt bardzo krótkie fragmenty (reads) Relatywnie tanie Relatywnie szybkie Platformy: Ilumina/Solexa, Roche, SOLiD 3

4 Przyrównanie do sekwencji referencyjnej złożenie krótkich fragmentów read ACTGGGGGGGAAAAA GGGAAAAATTTC GGGAACCTTTC CCTTTCTTTGGA reference ACTGGGGGGGAAAAATTTCAAAGGGAACCTTTCTTTGGAGGGTT *Reads podsekwencje genomu referencyjnego 4

5 Sekwencja referencyjna (FASTA) - genom - część genomu - transkryptom 5

6 Krótkie fragmenty sekwencji (FASTQ) SRA FASTQ 6

7 FASTA A Adenozyna C Cytozyna G Guanina T Tymina U Uracyl R G A (puryna) Y T C (pirymidyna) S G C (Silne oddziaływanie) W A T (słabe (ang. Weak) oddziaływanie) B G T C (nie A) (B jest po A) D G A T (nie C) (D jest po C) 7 H A C T (nie G) (H jest po G) V G C A (nie T) (V jest po U) N A G C T (którykolwiek, od ang. any)

8 FASTQ 8

9 Środowisko pracy Linux Dlaczego Linux? Dlaczego serwer? PRZYKŁADOWE KOMENDY: zcat ścieżka/plik.fastq.gz less zcat ścieżka/plik.fastq.gz wc l zcat ścieżka/plik.fastq.gz grep szukane znaki wc l zcat ścieżka/plik.fastq.gz head n > top_10000.fastq zcat ścieżka/plik.fastq.gz bottom n > bottom_10000.fastq 9

10 10

11 Modyfikacja sekwencji: wycinanie adaptorów usuwanie sekwencji o kiepskiej jakości FASTQ FASTA itp... 11

12 FASTQC Kontrola jakości danych (FASTQ, SAM, BAM) Graficzne przedstawienie sekwencji 12

13 Basic statistics 13

14 Per base sequence quality Jakość dla każdej pozycji Mediana Wykres pudełkowy Max/min Średnia Ostrzeżenie niższy kwartyl dla jakiejkolwiek pozycji <10 lub mediana <25 Awaria niższy kwartyl dla jakiejkolwiek pozycji <5 lub mediana <20 14

15 Per sequence quality scores Średnia jakość sekwencji Ostrzeżenie najczęściej obserwowane średnia jakość <27 Awaria najczęściej obserwowane średnia jakość< 20 15

16 Per base sequence content Proporcje zasad azotowych Ostrzeżenie różnica między A i T lub G i C > 10%, w którejkolwiek pozycji Awaria różnica między A i T lub G i C > 20%, w którejkolwiek pozycji 16

17 Per base GC content Odchylenie od średniej wartości dla każdej pozycji Ostrzeżenie odchylenie od średniej wartości GC > 5% Awaria odchylenie od średniej wartości GC > 10% 17

18 Per sequence GC content Ostrzeżenie suma odchyleń od rozkładu normalnego > 15% Awaria suma odchyleń od rozkładu normalnego > 30% 18

19 Per base N content Ostrzeżenie dowolna pozycja pokazuje zawartość N> 5%. Awaria dowolna pozycja pokazuje zawartość N> 20%. 19

20 Sequence Length Distribution Ostrzeżenie sekwencje nie są tej samej długości. Awaria którakolwiek sekwencja ma długość 0 20

21 Sequence Duplication Levels Ostrzeżenie sekwencje nieunikalne >20% Awaria sekwencje nieunikalne >50% 21

22 Overrepresented sequences Ostrzeżenie którakolwiek sekwencja występuje > 0,1% Awaria którakolwiek sekwencja występuje > 1% No overrepresented sequences 22

23 - Koniec części I - 23