RNA jako marker molekularny

Transkrypt

1 RNA jako marker molekularny

2 RNA jako marker diagnostyczny i prognostyczny białaczek Typy białaczek Nowotwory rozrost leukocytów jednego typu w całym organizmie Komórki białaczkowe blasty Podział I: b. limfatyczne (limfoblastyczne)- nieprawidłowe limfocyty b. szpikowe nieprawidłowe inne krwinki białe (granulocyty, monocyty, makrofagi) lub też komórki z których powstają krwinki czerwone lub płytki krwi Podział II: ostre (częstsze) przewlekłe (rzadsze) fazy: przewlekła, przyspieszenie, przełom blastyczny 4 typy białaczek: ostra limfatyczna (ALL), ostra szpikowa (AML), przewlekła szpikowa (CML) i przewlekła limfatyczna (CLL). Aspirat szpiku barwiony metodą Wrighta od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek prekursorowych B. Aspirat szpiku kostnego pacjenta z AML zawierajacy liczne blasty z pałeczkami Auera.

3 1. Przewlekła białaczka szpikowa (CML) Przewlekła białaczka szpikowa (ang. Chronic myeloid leukaemia CML) jest wywoływana przez produkt onkogenu BCR-ABL zlokalizowanego na chromosomie Filadelfia (Ph) BCR-ABL powstaje w wyniku wzajemnej translokacji chromosomalnej t(9;22) (q34;q11) Chromosom Filadelfia - odkryto w 1960 roku było to pierwsze potwierdzone powiązanie między anomalią chromosomalną a rakiem zidentyfikowano translokację odpowiedzialną za jego powstanie - lata 80. identyfikacja regionów w obrębie których następuje translokacja ABL gen kodujący kinazę tyrozynową BCR breakpoint cluster region - białko występujące w cytoplazmie, posiada wiele domen, m.in. domenę o aktywności kinazy serynowo-treoninowej

4 ABL jest protoonkogenem Koduje białko cytoplazmatyczne i jądrowe z rodziny kinaz tyrozynowych ABL - różnicowanie, podział, adhezja i odpowiedź na uszkodzenia komórek Po połączeniu z fragmentem BCR, powstały gen staje się onkogenem jest stale aktywny i wymyka się spod kontroli komórki. Nowe białko przyczynia się do wzrostu częstotliwości podziałów komórkowych blokuje naprawę DNA, powoduje szybkie gromadzenie się mutacji w nowych pokoleniach komórek upośledza zdolność komórek do apoptozy

5 p210 p190 p230 Geny BCR-ABL mogą zawierać egzony 1b i 1a, tylko 1a lub żaden z nich, ale mrna nigdy nie zawiera egzonu tylko 1b ABL Gen BCR może ulegać przełamaniu w trzech różnych obszarach. U 95% pacjentów jest to obszar M, powstaje wtedy białko p210 Bcr-Abl W rzadkich przypadkach następuje przełamanie w obszarze m, powstaje wówczas białko p190 Bcr-Abl Obszar mikro powstaje białko p230 Bcr-Abl

6 Gen BCR-ABL jest wykrywany za pomocą dwustopniowego (nested) RT-PCR Pozytywny wynik testu u osób posiadających objawy białaczki wystarcza do potwierdzenia diagnozy Transkrypty BCR-ABL są jednak wykrywane również u osób zdrowych i wcale nie oznacza to, że ludzie ci zapadną na białaczkę BCR-ABL mrna, powstające po przełamaniu w obszarze M, wykryto aż u 27% zdrowych badanych osób Transkrypty powstające po przełamaniu w obszarze m wykryto u 69% zdrowych osób Poziom ilościowy tych transkryptów jest bardzo niski; 1 10 na 10 8 leukocytów Powstanie onkogenu w wyniku translokacji chromosomalnej nie wystarcza do wystąpienia transformacji nowotworowej Rekombinacje niektórych par niehomologicznych chromosomów są częste w komórkach hematopoetycznych Brak wystąpienia objawów choroby pomimo obecności onkogenu może być wynikiem wystąpienia translokacji w stosunkowo dojrzałych komórkach, które giną w procesie różnicowania

7 Markery RNA w ocenie prawdopodobieństwa CML u pacjentów po przeszczepie szpiku Często po przeszczepie chromosom Filadelfia nie jest już wykrywany metodami analizy cytologicznej, ale to nie wyklucza, że niewielka ilość komórek białaczkowych nadal pozostaje w organizmie Próbowano wykorzystać klasyczny jakościowy RT-PCR do oceny prawdopodobieństwa ponownego wystąpienia CML u pacjentów po przeszczepie, ale otrzymane wyniki były niezadowalające: - duże różnice między poszczególnymi laboratoriami - zbyt mała lub zbyt duża czułość metody Zastosowano ilościowy RT-PCR do monitorowania kinetyki transkryptu związanego z chorobą w czasie Ustalono poziom progowy liczby transkryptów, po przekroczeniu którego prawdopodobieństwo nawrotu znacznie wzrasta Seria ilościowych analiz RT-PCR pozwala na odróżnienie pacjentów, którzy pozostaną w stanie remisji od tych, u których nastąpi nawrót Wczesne rozpoznanie nawrotu szansa na terapię

8

9 Półilościowy RT-PCR w ocenie prawdopodobieństwa nawrotu OS overall survival LFS leukemia free survival

10 2. Ostra białaczka szpikowa AML Kariotypy: - t(8;21) (q22;q22), inwersja w chromosomie 16 inv16(p13q22) wysoka częstość pełnej remisji, często długi czas przeżycia bez choroby - monosomia 7 chromosomu gorsze rokowania - t(15;17)(q22;q11) wymagana specjalna odmiana chemioterapii Translokacja t(8;21) (q22;q22) fuzja 5 części genu AML1 z chromosomu 21 do prawie kompletnej ramki odczytu genu MTG8 na chromosomie 8. AML1 koduje czynnik transkrypcyjny konieczny dla normalnej hematopoezy

11 RT-PCR w czasie rzeczywistym w detekcji i analizie ilościowej transkryptów AML1/MTG8 RT-PCR z wykorzystaniem sond typu TaqMan, jako gen odnośnikowy zastosowano GAPDH (ang. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

12 Analiza ilościowa komórek rakowych w krwi obwodowej pacjentów chorych na kostniakomięsaka przy zastosowaniu markerów mrna specyficznych dla osteoblastów Kostniakomięsak (ang. osteosarkoma) bardzo złośliwy nowotwór kości i tkanek miękkich Pojawia się między 15 a 30 rokiem życia bolesne powiększające się zgrubienie Wystąpienie osteosarkomy jest związane z mutacjami lub zwiększoną ekspresją pewnych genów np.: Rb, p53 Pomimo operacyjnego usunięcia pierwotnego siedliska choroby, u prawie 90% pacjentów występuje nawrót Główna przyczyną śmierci pacjentów są przerzuty

13 RT-PCR do wczesnej detekcji nawrotów - wybór markera testowano geny, których produkty ulegają tkankowo specyficznej ekspresji w osteoblastach: OC (osteocalcin), ON (osteonectin), OPN (osteopontin), COLL (collagen) - najlepszy okazał się COLL kolagen typu I, jego mrna wykrywano w małych ilościach tylko u 35% zdrowych osób (grupa kontrolna) - Najwyższy poziom COLL wykrywany u zdrowych ludzi ustalono jako odnośnik do odróżniania osób chorych od zdrowych. zdrowi chorzy

14 Przerzuty w ciągu 12 miesięcy Brak przerzutów

15

16 Dystrofina łatwiej badać transkrypt niż gen

17 Markery RNA, rak prostaty i kłopoty z nieuprawnioną transkrypcją Markery biochemiczne w diagnostyce raka prostaty specyficzna dla prostaty kwaśna fosfataza i specyficzny dla prostaty antygen (PSA) Poziom tych białek w krwi wzrasta u mężczyzn, u których nastąpiło powiększenie prostaty w następstwie nowotworu, ale również przerostu nie mającego charakteru nowotworowego Wady markerów biochemicznych nie pozwalają na wykrywanie choroby w stadium utajonym Aby wykryć krążące w krwi komórki prostaty odpowiedzialne za przerzuty nowotworu próbuje się stosować markery mrna genów PSA lub PSM (ang. prostate specific membrane antigen) Stosuje się nested-pcr - pomimo, że technika jest uważana za bardzo czułą (1 pozytywna komórka na 10 6 negatywnych) aż 80-85% pacjentów ze zdiagnozowanym wczesnym rakiem prostaty jest rozpoznawanych jako zdrowi przez test PSA mrna PCR - w przypadku pacjentów w zaawansowanym stadium choroby aż 50-70% wymykało się testowi Aby zwiększyć czułość testu zwiększono liczbę cykli w każdej rundzie nested- PCR do 40 Kłopoty: wykrywano transkrypty PSA nawet w krwi osób zdrowych na skutek zjawiska nieuprawnionej transkrypcji Lepsze wyniki uzyskano dla PSM więcej prawdziwych wyników pozytywnych, ale nadal kłopoty z nieuprawnioną transkrypcją

18 Ekspresja apolipoproteiny L u chorych na schizofrenię Kora przedczołowa obszar mózgu, którego uszkodzenia towarzyszą schzofrenii, odpowiedzialny za pamięć operacyjną Wzrost ekspresji apol u chorych na schizofrenię w korze przedczołowej Lipoproteiny zaopatrują komórki w lipidy apol high density lipoprotein - udział w transporcie cholesterolu - zawartość cholesterolu istotna dla przewodzenia sygnałów.

19 1. Test typu array 300 genów hybrydyzowano z sondami cdna otrzymanymi z preparatów kory przedczołowej 10 chorych i 10 zdrowych osób. Wykryto 2.6 -krotny wzrost ekspresji apol1

20 Ślepa próba na 60 preparatach z Fundacji Stanleya real-time PCR (choroba afektywna dwubiegunowa)

21 oncomirs microrna (mirna) ewolucyjnie konserwowane, endogenne, małe (22nt), niekodujące cząsteczki RNA działają jako posttranskrypcyjne regulatory transkrypcji uczestniczą w regulacji rozwoju, różnicowania, proliferacji, apoptozy genomy kręgowców kodują około 1000 mirna odpowiedzialnych za regulację około 30% genów Mogą działać jako onkogeny i supresory nowotworów oncomirs (ang. oncogenic mirnas)

22 mir-15 i mir-16 oncomirs a rozwój nowotworów zlokalizowane w regionie o wielkości 30 kb, który często ulega delecji u osób chorych na CLL ulegają delecji lub ich ekspresja jest obniżona u CLL ich ekspresja jest obniżona w gruczolaku przysadki 68% chorych na są naturalnymi represorami Bcl2 ich obecność powoduje apoptozę komórek białaczkowych mir (kompleks 7 mirna) Nadekspresja powoduje rozwój chłoniaka lub nowotworu płuc mir-21 Wysoka nadekspresja w komórkach nowotworu piersi Prawdopodobnie celem mir-21 jest tropomiozyna 1 supresor nowotworu

23

24 oncomirs w diagnostyce i prognozowaniu Za pomocą cytometrii przepływowej przeprowadzono systematyczną analizę profili ekspresji mirna w próbkach ludzkich tkanek nowotworowych (jelito, wątroba, trzustka, żołądek). Uzyskane profile pozwoliły na prawidłową klasyfikację nowotworów we wczesnym stadium. Analiza całego mirnaomu w komórkach gruczolaka przysadki i komórkach normalnej przysadki wykazała różnice między mikro- a makrogruczolakiem oraz między próbkami pochadzącymi od leczonych i jeszcze nieleczonych pacjentów oncomirs mogą też mieć wartość prognostyczną ich poziom w niektórych przypadkach koreluje z czasem przeżycia pacjentów.

25 Zmiany trna w nowotworach

26 trna D nukleozydów -Określone nukleozydy występują w stałych pozycjach -ramiona: dwuhydrourydynowe, akceptorowe, zmienne pseudourudunowe aminokwasowe

27 W komórkach nowotworowych obecne są specyficzne izoakceptorowe trna Izoakceptorowe trna produkty tego samego genu - przyłączają ten sam aminokwas - rozpoznawane przez tę samą syntazę aminoacylo-trna - różnią się modyfikacjami nukleozydów Modyfikacje nukleozydów trna proste metylacje zasady lub rybozy - skomplikowane queina, wybutozyna - posttranskrypcyjne w procesie dojrzewania trna - enzymy modyfikujące są bardzo specyficzne, rozpoznają modyfikowany trna, pozycję nukleozydu, zmiany konformacyjne wywołane poprzednimi modyfikacjami działają w określonej kolejności - w komórkach Eukariota wystepuje ponad 100 enzymów modyfikujących trna - rola modyfikacji trna zmiany kinetyki aminoacylacji, elementy rozpoznawcze dla syntetaz Pula izoakceptorowych trna zależy od gatunku, tkanki (gruczoł przędny jedwabnika, produkcja kolagenu)

28 Tkanki nowotworowe wykazują wysoką aktywność transkrypcyjnotranslacyjną Onkogeneza zmienia warunki metabolizmu i jednym z mechanizmów adaptacyjnych są ilościowe i jakościowe zmiany trna 3 koniec trna znakowano radioaktywnie i rozdzielano w dwukierunkowej elektroforezie w żelu poliakrylamidowym (2D PAGE). Zmiany ilościowe trna: - wysoka zawartość trna, więcej aminoacylowanych trna - zmiany zawartości poszczególnych izoakceptorów w porównaniu z trna izolowanym z sąsiadującej tkanki prawidłowej - krótszy okres półtrwania trna w tkankach nowotworowych (od 0.5 do 5 h) w porównaniu z tkankami prawidłowymi (od 5 do 25 dni), wynika to z wysokiej aktywności nukleaz oraz z większej podatności nowotworowych trna na działanie enzymów nukleolitycznych Tkanka prawidłowa Nowotwór łagodny Nowotwór złośliwy Guz przerzutowy

29 Zmiany jakościowe w trna związane z nowotworami wynikają ze zmian posttranskrypcyjnych, a nie z transkrypcji zmutowanych genów obecność specyficznych dla komórek proliferujących izoakceptorów trna - W chłoniaku Hodgkina wykazano dodatkowe izoakceptory trna dla Phe, His, Asp, Asn, Tyr i Met Hipomodyfikacja zasady Q w trna z rodziny Q cząsteczki trna (trnaasn, trnaasp, trnahis, trnatyr) modyfikacja w pozycji 34 (pierwszej pozycji antykodonu) polegająca na zamianie guaniny na queuinę. Wyjątek: mitochondrialne trna izolowane z komórek wątrobiaka Morrisa transkrypt trnaasp jest produktem zmutowanego genu (zamiana G na A) Hipomodyfikacja mniej zmodyfikowanych nukleozydów w trna w tkankach nowotworowych niż w prawidłowych

30 Hipomodyfikacja zasady Q wielkość deficytu zasady Q w przypadku złośliwych guzów nowotworowych płuc jest odwrotnie proporcjonalna do czasu przeżycia pacjentów Hipomodyfikacja zasady Y (wybutozyny) w pozycji 37 trna Phe zamiast zasady Y znajduje się niemodyfikowana G lub jej metylowana pochodna Onkofetalne trna trna z rodziny Q oraz trnaphe - oznaczenie stopnia deficytu zasady Q lub Y mogłoby być markerem diagnostycznym i prognostycznym trnaasp trnatyr Hipermodyfikacja w trna z fibroblastów embrionów kurzych zainfekowanych wirusem mięsaka Rousa stwierdzono wyższą zawartość zmodyfikowanych nukleozydów

31 Produkty biodegradacji trna jako markery nowotworów Modyfikowane nukleozydy nie są refosforylowane i nie są ponownie włączane do RNA, są wydalane z moczem. U pacjentów z chorobą nowotworową jest więcej wydalanych z moczem zmodyfikowanych nukleozydów i zasad U pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową stwierdzono 12-krotnie wyższy poziom produktów rozpadu trna w moczu - metylo-1-inozyna, pseudourydyna, dwumetylo-guanozyna oznaczanie tych produktów pozwala na wcześniejsze przewidywanie nawrotu choroby niż w przypadku parametrów hematologicznych Precyzyjne oznaczanie poziomu poszczególnych zmodyfikowanych nukleozydów pozwala na rozróżnienie między typem białaczki

32 Pseudourydyna 1-metyloinozyna N4-acetylocytydyna 1-metyloguanozyna 2-metyloguanozyna