AUTOREFERAT. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych.

Transkrypt

1 AUTOREFERAT 1. Imię i nazwisko. 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe. Stopień doktora nauk biologicznych w zakresie biologii nadany uchwałą Rady Naukowej Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego dnia Tytuł rozprawy doktorskiej: Nowe metylotransferazy DNA Neisseria gonorrhoeae. Izolacja genów i wstępna charakterystyka białek. Promotorem w przewodzie doktorskim był prof. dr hab. Andrzej Piekarowicz (Zakład Wirusologii Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski), a recenzentami: prof. dr hab. Anna Podhajska (Katedra Mikrobiologii Wydziału Biologii, Uniwersytet Gdański) oraz prof. dr hab. Ewa Bartnik (Zakład Genetyki, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski). Tytuł magistra biologii o specjalności mikrobiologii uzyskany na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego Tytuł pracy magisterskiej: Zastosowanie szczepów Escherichia coli K-12 z termowrażliwą mutacją w systemie McrB do selekcji klonów zawierających metylotransferazy DNA. Opiekunem pracy był prof. dr hab. Andrzej Piekarowicz. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych do chwili obecnej: Starszy wykładowca w Zakładzie Wirusologii Instytutu Mikrobiologii na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego : Adiunkt w Zakładzie Wirusologii Instytutu Mikrobiologii na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego : Stanowisko research coordinator w Molecular Biology Research Program, Henry Ford Health System, Detroit, USA : Asystent w Zakładzie Wirusologii Instytutu Mikrobiologii na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego : Pracownik inżynieryjno-techniczny w Zakładzie Wirusologii Instytutu Mikrobiologii na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.). 1

2 a) Tytuł osiągnięcia naukowego. Analiza genomiczna bakteriofagów i sekwencji profagowych oraz jej wykorzystanie do identyfikacji nowych metylotransferaz DNA b) Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego, ze szczegółowym omówieniem indywidualnego wkładu wnioskodawcy. 1. Drozdz M, Piekarowicz A, Bujnicki JM, Radlinska M. (2012) Novel non-specific DNA adenine methyltransferases. Nucleic Acids Research. 40(5): IF ,278; IF 5-letni 8,647, punktacja MNiSW 40; liczba cytowań (wg bazy Web of Science, WoS) 10. Praca wyróżniona Nagrodą I stopnia Polskiego Towarzystwa Genetycznego w konkursie na najlepszą pracę z dziedziny genetyki mikroorganizmów, wykonaną w polskich laboratoriach i opublikowaną w roku Wkład habilitanta: 65%. Autor korespondencyjny. Współautorstwo koncepcji badań; zaplanowanie i wykonanie większości doświadczeń (in vivo i in vitro) oraz kierowanie wykonaniem pozostałych [opieka nad studentem (M. Drożdż) podczas wykonywania przez niego badań, które weszły w skład publikacji]; przeprowadzenie części analiz in silico; analiza i interpretacja wyników; napisanie pierwszej wersji manuskryptu oraz redagowanie wersji ostatecznej, przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; pozyskanie finansowania badań (2P ). 2. Dziewit L, Oscik K, Bartosik D, Radlinska M. (2014) Molecular characterization of a novel temperate Sinorhizobium bacteriophage, ФLM21, encoding DNA methyltransferase with CcrM-like specificity. Journal of Virology. 88(22): IF ,439; IF 5-letni 4,428; punktacja MNiSW 35; liczba cytowań (wg bazy WoS) 4 Wkład habilitanta: 65%. Autor korespondencyjny. Autorstwo koncepcji badań; zaplanowanie i wykonanie większości doświadczeń (in vivo i in vitro) oraz kierowanie wykonaniem pozostałych [opieka nad studentką (K. Ościk) podczas wykonywania przez nią badań, które weszły w skład publikacji]; przeprowadzenie części analiz in silico; analiza i interpretacja wyników; udział w napisaniu pierwszej wersji manuskryptu oraz redagowanie wersji ostatecznej, przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów. 3. Dziewit L, Radlinska M. (2016) Two novel temperate bacteriophages co-existing in Aeromonas sp. ARM81 - characterization of their genomes, proteomes and DNA methyltransferases. Journal of General Virology. 97(8): IF ,192; IF 5-letni 3,131; punktacja MNiSW 30; liczba cytowań (wg bazy WoS) 0. Wkład habilitanta: 70%. Autor korespondencyjny. Autorstwo koncepcji badań; zaplanowanie i wykonanie wszystkich doświadczeń in vivo i większości in vitro; przeprowadzenie części analiz 2

3 in silico; analiza i interpretacja wyników; napisanie pierwszej wersji manuskryptu oraz redagowanie wersji ostatecznej, przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów. 4. Dziewit L, Radlinska M. (2016) Two bacteriophages of an Antarctic Pseudomonas sp. ANT_H14 use the same capsid for packaging their genomes characterization of a novel phage helper-satellite system. PLoS One. 11(7):e IF ,057; IF 5-letni 3,535 punktacja MNiSW 40; liczba cytowań (wg bazy WoS) 0. Wkład habilitanta: 75%. Autor korespondencyjny. Autorstwo koncepcji badań; zaplanowanie i wykonanie wszystkich doświadczeń in vivo i in vitro; przeprowadzenie części analiz in silico; analiza i interpretacja wyników; napisanie pierwszej wersji manuskryptu oraz redagowanie wersji ostatecznej, przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów. Sumaryczny współczynnik oddziaływania czasopism, w których ukazały się publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego, zgodnie z rokiem opublikowania (w przypadku prac z roku 2016 podano współczynnik z roku poprzedzającego tj. 2015) 18,966. Liczba punktów MNiSW za publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego 145. Liczba cytowań publikacji wchodzących w skład osiągnięcia naukowego do dnia złożenia wniosku (wg bazy Web of Science) 14. c) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Wstęp Wirusy bakteryjne to najliczniejsze jednostki biologiczne w biosferze, ich liczbę szacuje się na [1]. 95% wszystkich dotąd poznanych bakteriofagów zostało sklasyfikowanych w rzędzie Caudovirales. Bakteriofagi mają ogromny wpływ na ewolucję bakterii i ich ekologię. Uznawane są za główny czynnik promujący horyzontalny transfer genów między bakteriami [2]. Fagi są określane jako zjadliwe (wirulentne) lub łagodne, a podstawą ich rozróżnienia jest przebieg cyklu infekcyjnego. Fagi zjadliwe, w krótkim czasie po infekcji, wytwarzają cząstki potomne, których uwolnienie indukuje lizę komórki gospodarza (cykl lityczny). Fagi łagodne są dodatkowo zdolne zintegrować swój genom z chromosomem bakteryjnym albo pozostać w cytoplazmie jako niezależny episom (koliście zamknięty lub liniowy plazmid-profag) i trwając w stanie uśpienia (latencji) replikować się z genomem gospodarza przez wiele generacji (cykl lizogenny). Przełączenie do cyklu litycznego jest częściej inicjowane w warunkach stresowych (np. jako efekt uszkodzenia DNA), co skutkuje indukcją ekspresja genów litycznych, nieaktywnych w stanie lizogenii [3]. Analiza genomów bakteryjnych wykazała, że większość z nich zawiera sekwencje profagowe, często bardzo liczne. Na przykład u Escherichia coli O157:H7 Sakai zidentyfikowano 18 sekwencji profagowych, które stanowią 16% genomu tej bakterii [4]. 3

4 Znacząca większość sekwencji profagowych zgromadziła w toku ewolucji wiele mutacji, które uniemożliwiają im wejście w ścieżkę lityczną, utworzenie wirionów, przeprowadzenie lizy komórki gospodarza albo spowodowały utratę infekcyjność [5]. Co ciekawe okazało się, że niektóre profagi uznane, na podstawie analizy sekwencji, za defektywne, są zdolne do utworzenia cząstek potomnych, albo spontanicznie albo po zastosowaniu indukujących czynników fizycznych (np. UV, zmiany temperatury) lub chemicznych (np. mitomycyny C). Prowadzi to do wniosku, że przynajmniej niektóre z nich wciąż mogą funkcjonować jako mobilne elementy genetyczne i brać udział w horyzontalnym transferze genów [6]. Aktywne i defektywne profagi, często wyposażają gospodarzy w korzystne właściwości np. czynniki wirulencji, oporność na antybiotyki czy oporności na superinfekcję (zakażenie lizogena tym samym lub pokrewnym fagiem). Usunięcie wszystkich dziewięciu kryptycznych profagów (166 kbp) z E. coli BW25113 spowodowało spadek oporności na 11 antybiotyków β-laktamowych, zmianę wrażliwości na różne warunki stresowe (stres osmotyczny, oksydacyjny, niskiego ph) oraz w zdolności do tworzenia biofilmu [7]. Postuluje się, że wiele bakteryjnych systemów adaptacyjnych pochodzi od defektywnych profagów np. GTA (ang. gene transfer agents), które przenoszą losowe fragmenty chromosomowego DNA do innych komórek [8]. Większość białek kodowanych przez bakteriofagi jest zaangażowana w morfogenezę wirionów oraz zapewnienie efektywnego namnożenia własnego materiału genetycznego [9]. Enzymy metabolizm kwasów nukleinowych są wykorzystywane przez wirusy do ochrony genomów przed systemami antywirusowymi gospodarza, do przejęcia kontroli nad maszynerię komórkową i zagwarantowania wybiórczej ekspresji własnej informacji genetycznej. Enzymy zaangażowane w te procesy mają wyjątkowe właściwości biochemiczne i katalityczne, w wielu przypadkach występujące tylko u białek wirusowych. Dlatego, właśnie fagowe enzymy znalazły zastosowanie w technikach biologii molekularnej do manipulacji kwasami nukleinowymi (np. polimerazy DNA fagów T4, T7, Φ29 i RNA T7, Φ6; ligazy DNA T4, T3, T7 i RNA T4; integrazy λ, Cre P1; kinazy, egzo- i endonukleazy). Dużą grupę fagowych enzymów metabolizmu kwasów nukleinowych stanowią enzymy modyfikujące DNA. Modyfikacja DNA to zjawisko powszechne u wszystkich jednostek biologicznych, a do nukleotydów mogą być dołączane różnorodne grupy chemiczne. O ile u organizmów komórkowych i ich wirusów modyfikacje zasadniczo ograniczają się do metylacji (dodanie grupy metylowej lub hydroksymetylowej), u bakteriofagów do nukleotydu mogą być dodawane także aminokwasy, poliaminy, mono- i disacharydy. Na przykład u colifagów T- parzystych wszystkie cytozyny są przekształcone do glukozo-5-hydroksymetylocytozyny, natomiast 15% adenin w genomie colifaga Mu, replikującego się poprzez transpozycję, jest zmodyfikowanych do N 6 -karbamylo-metyloadeniny co jest efektem działania fagowego białka Mom [10]. 4

5 Obecność zmodyfikowanych nukleotydów moduluje powinowactwo białek do DNA. Zapewne dlatego wiele mechanizmów komórkowych i wirusowych wykorzystuje modyfikację DNA jako podstawę funkcjonowania, na przykład strategie odróżnienia swój-obcy, ochrony DNA przed degradacją i/lub kontroli regulacji ekspresji genów [11,12]. Najbardziej powszechną formą modyfikacji DNA, zidentyfikowaną we wszystkich domenach życia oraz u wirusów, jest metylacja. U bakterii metylacja cytozyny do 5- metylocytozyny (m 5 C) lub N4-metylocytozyny (m 4 C) oraz adeniny do N6-metyloadeniny (m 6 A), jest wykorzystywana jako znacznik pozwalający na odróżnienie własnego materiału genetycznego od obcego, np. fagowego. W oparciu o tę zasadę działają systemy restrykcji-modyfikacji (RM). Bakteriofagi bardzo często unikają rozpoznania używając podobnych strategii, tj. kodowanych przez siebie metylotransferaz DNA (MTaz DNA) o tych samych specyficznościach, co bakteryjne systemy RM, albo nietypowo modyfikując nukleotydy jak wspomniane wyżej colifagi T-parzyste i Mu [10,13,14]. Natomiast modyfikacje wprowadzane przez niektóre samotne (nie związane z systemami RM) bakteryjne MTazy DNA stanowią znaczniki epigenetyczne odgrywające rolę w regulacji ekspresji genów, patogenezie, kontroli replikacji DNA oraz pozwalające na odróżnienie nici w procesach naprawy błędów poreplikacyjnych i uszkodzeń oksydacyjnych [10]. Ta druga grupa bakteryjnych MTaz DNA, pełniąca funkcje regulacyjne jest zwykle konserwowana w obrębie jednostki taksonomicznej - klasy (łac. classis) np. M.Dam (produkt metylacji Gm 6 ATC) przez gammaproteobakterie czy CcrM (Gm 6 ANTC) przez alfaproteobakterie [14]. Od wielu lat zjawisko metylacji u organizmów prokariotycznych oraz enzymy odpowiedzialne za ten proces są systematycznie badane. Tymczasem nasza wiedza o fagowych MTazach DNA jest ograniczona. Fakt dość powszechnej obecności genów kodujących MTazy DNA w genomach fagowych oraz sekwencjach profagowych, pozwala przypuszczać, że niektóre z nich pełną inną, niż wspomniana wyżej, funkcja ochronna przed degradacją. Na przykład wykazano związek między efektywną inicjacją pakowania genomu łagodnego faga P1 do kapsydu, a kodowaną przez niego MTazą Dmt, o specyficzności identycznej jak M.Dam gospodarza E.coli [15]. Wiele innych fagów infekujących gammaproteobakterie np. colifagów (T1, T2, T4, VT-2) czy HP1 Haemophilus influenzae także koduje MTazy DNA naśladujące specyficzność ich bakteryjnego gospodarza - M.Dam, ale ich funkcja pozostaje nieznana [16]. W prezentowanym przeze mnie cyklu prac przedstawionych jako osiągnięcie habilitacyjne, postawiłam sobie za cel scharakteryzowanie nowych fagowych MTaz DNA, aby w ten sposób rzucić światło na rolę metylacji DNA u wirusów bakteryjnych. W pierwszym etapie, do poszukiwania modeli badawczych, zostały wykorzystane dostępne bazy danych sekwencji oraz 5

6 analiza bioinformatycza. Z użyciem tej strategii zidentyfikowaliśmy grupę niespecyficznych MTaz DNA modyfikujących adeninę do m 6 A (MTazy m 6 A). W drugim etapie połączyłam poszukiwanie genów MTaz DNA z izolacją nowych bakteriofagów łagodnych. Dzięki temu, oprócz samych fagowych MTaz, mogłam zidentyfikować i scharakteryzować unikatowe wirusy bakteryjne, a także poznać relacje pasożyt-gospodarz oraz ustalić związki filogenetyczne pomiędzy bakteriofagami. Wszystkie nowoodkryte łagodne bakteriofagi zostały zidentyfikowane dzięki tej samej procedurze - indukcji z użyciem mitomycyny C i frakcjonowaniu w równowagowym gradiencie chlorku cezu. Gospodarzami tych profagów były bakterie, reprezentujące różne klasy proteobakterii i wyizolowane z różnych środowisk: klasa alfaproteobakterii: Sinorhizobium sp. LM21 - szczep pochodzący z kopalni miedzi, klasa gammaproteobakterii: Aeromonas sp. ARM81 z oczyszczalni ścieków oraz Pseudomonas sp. ANT_H14 z Antarktydy. Wszystkie te trzy szczepy okazały się być polilizogeniczne tzn. ich genomy zawierały więcej niż jednego profaga, ściślej każdy z nich zawierał po dwa profagi, przy czym w przypadku Sinorhizobium sp. LM21 udało się zaindukować tylko jednego z nich. Genom każdego z nowoodkrytych bakteriofagów był sekwencjonowany, adnotowany i poddawany kompleksowej charakterystyce, w celu identyfikacji funkcjonalnych modułów (zespołów genów biorących udział w tym samym procesie biologicznym pozostających pod wspólną kontrolą regulacyjną), a także analizom porównawczym i filogenetycznym. Na podstawie obserwacji wirionów w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM) klasyfikowaliśmy faga do jednej z trzech rodzin rzędu Caudovirales (Sipho-, Myo- lub Podoviridae). Wybrane geny i elementy regulatorowe były poddawane eksperymentalnej weryfikacji funkcji. Wszystkie zidentyfikowane geny MTaz DNA zostały sklonowane, a ich białkowe produkty charakteryzowane biochemicznie. Na podstawie ustalonych właściwości enzymatycznych, w tym specyficzności, aktywności w natywnym gospodarzu oraz lokalizacji genu MTazy w genomie wnioskowaliśmy na temat potencjalnej funkcji. Drożdż M, Piekarowicz A, Bujnicki JM, Radlińska M. (2012) Novel non-specific DNA adenine methyltransferases. Nucleic Acids Res. W wyniku przeprowadzonych analiz bioinformatycznych z użyciem dostępnych baz danych zidentyfikowaliśmy grupę sekwencji profagowych, podobnych do faga Mu. Były to profagi FluMu Haemophilus influenzae Rd i Pnm1 Neisseria meningitidis typu A szczep Z2491 [17] oraz patogenna wyspa H. influenzae biogrupa aegyptius (czynnik infekcyjny gorączki plamicowej brazylijskiej) [18]. Ich wspólną cechą była obecność, w locus zajmowanym przez gen mom w fagu Mu, otwartej ramki odczytu kodującej inny enzym modyfikujący, przypuszczalnie MTazę DNA. 6

7 Geny te tj. hin1523 z H. influenzae Rd30, nma1821 z N. meningitidis Z2491 oraz hia5 z H. influenzae biogrupa aegyptius ATCC11116 zostały sklonowane, a produkty białkowe wyizolowane i oczyszczone. Z użyciem szeregu testów biochemicznych potwierdziliśmy, iż rzeczywiście są to MTazy DNA. Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej pozwoliło nam zidentyfikować produkt reakcji katalizowanej przez te enzymy, N6-metyloadeniny. Wykorzystany przez nas test wrażliwość endonukleaz restrykcyjnych (REaz) na obecność m 6 A w sekwencjach przez nie rozpoznawanych, z użyciem jako substratu DNA zmodyfikowanego in vivo oraz in vitro przez MTazy Hia5, Nma1821 oraz Hin1523, nie pozwolił jednoznacznie określić specyficzności tych enzymów. Okazało się, że badane MTazy modyfikowały DNA w bardzo różnych kontekstach sekwencyjnych, co było mocną przesłanką do przypuszczenia, iż ich specyficzność jest rozluźniona. Dlatego zdecydowaliśmy się na użycie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), dzięki której wykazaliśmy, że MTaza Hia5 w warunkach in vitro w genomowym DNA faga lambda (49,8% G+C) przekształca aż 61% reszt adeninowych do m 6 A. Uzyskany wynik silnie sugerował, że miejsce rozpoznawane przez ten enzym może być co najwyżej dwunukleotydowe. W celu potwierdzenia tej hipotezy zaprojektowaliśmy specjalny zestaw dwuniciowych oligonukleotydów zawierających na jednej z nici powtórzenia danego dwunukleotydu: CA, GA, TA lub AA (tj. poli- A). Okazało się, że MTazy Hia5 oraz jej homologi nie metylują tylko ostatniego z nich, co oznaczało, że każda sekwencja zawierająca adeninę, oprócz traktów poli-a, może być substratem dla badanych MTaz DNA, a więc ich specyficzność można podsumować jako BA (B=G, T, C). Trzeba podkreślić, że wspomniany wyżej nowatorski i niekonwencjonalny zestaw dupleksów oligonukleotydów okazał się być doskonałym narzędziem nie tylko do wykazania ekstremalnie rozluźnionej specyficzności (de facto braku specyficzności) Hia5 i pozostałych badanych MTazy, ale też uniwersalną procedurą do testowania sekwencji rozpoznawanych przez inne nietypowe fagowe MTazy DNA (patrz niżej). Wyniki analizy restrykcyjnej genomowego DNA H. influenzae Rd30 i ATCC11116, oraz HPLC DNA H. influenzae ATCC11116 pozwoliły na wniosek, że MTazy Hia5 i Hin1523 są nieaktywne w komórkach tych bakterii. Ich geny nie ulegają ekspresji prawdopodobnie z powodu braku białka regulatorowego Com, który jest produktem tzw. fagowych genów późnych. Aktywator Com (jego gen poprzedza mom) jest niezbędny do włączenia ekspresji mom u faga Mu, a geny badanych MTaz zajmują ten sam locus co mom. Ekspresji genu mom ma miejsce bardzo późno w cyklu infekcyjnym, tuż przed lizą komórki, zapewne ze względu na cytotoksyczność Mom [19]. Gen kodujący homologa Com faga Mu wykryliśmy zarówno przed genem hia5 jak i hin1523 oraz nma1821. Niewykluczone, że ich działanie regulacyjne jest podobne do Com Mu i gdyby doszło ekspresji genów późnych (w tym com), uruchomiona byłaby też ekspresja genów MTaz. Czy 7

8 faktycznie byłoby to możliwe, nie udało nam się ustalić, gdyż nie powiodły się próby indukcji profaga H. influenzae Rd30 z użyciem mitomycyny. Potencjał do modyfikacji niemal każdej adeniny w DNA, który odkryliśmy u MTaz Hia5, Hin1523 oraz Nma1821, może być bez wątpienia wykorzystany w różnych aplikacjach biologii molekularnej. My użyliśmy go do sprawdzenia czy enzymy restrykcyjne, których sekwencja rozpoznawana zawiera zarówno cytozyny jak i adeniny, przetną ją, jeśli adeninę zastąpi się m 6 A. Dane, które uzyskaliśmy dla kilkunastu komercyjnych REaz, są powszechnie dostępne w bazie REBASE gromadzącej informacje na temat enzymów związanych z restrykcją i modyfikacją DNA ( Właściwości niespecyficznej MTazy Hia5 umożliwiły także wykrycie zdolności endonukleazy R.DpnI do cięcia miejsc niekanonicznych tj. innych niż Gm 6 ATC [20,21]. Przypuszczamy, że Hia5 i jej homologi mogą być także wykorzystane jako narzędzie do badania skutków metylacji adeniny w eukariotycznym DNA lub jako rozszerzenie metodologii mapowania in vivo interakcji białko-genom, zastępując MTazę Dam, która do tej pory była tam stosowana (technika DamID) [22]. Najważniejszym osiągnięciem opisywanej pracy było odkrycie pierwszej niespecyficznej MTazy m 6 A (ściślej grupy enzymów o takich właściwościach). M.Hia5 (oraz jej homologi) stała się w ten sposób prototypem enzymu modyfikującego sekwencje BA. Zidentyfikowane przez nas enzymy są unikatowe i nietypowe w porównaniu do białek komórkowych. Trudne do wyobrażenia jest posiadanie przez bakteryjnego gospodarza funkcjonalnego enzymu o ekstremalnie rozluźnionej specyficzności. Jak już wspomniałam, zmodyfikowane nukleotydy modulują powinowactwo białek do DNA. W takiej sytuacji masowa metylacja zmieniłaby diametralnie oddziaływanie wielu białek z materiałem genetycznym, co w konsekwencji miałoby dla komórki katastrofalne skutki. Dziewit L, Ościk K, Bartosik D, Radlińska M. Molecular characterization of a novel temperate Sinorhizobium bacteriophage, ФLM21, encoding DNA methyltransferase with CcrM-like specificity. (2014) J Virol. Praca prezentuje analizę genomiczną, porównawczą oraz funkcjonalną wybranych elementów regulatorowych i genów (w tym MTazy DNA) wyizolowanego przez nas łagodnego bakteriofaga Sinorhizobium sp. LM21, bakterii pochodzącej z osadów kopalni miedzi Lubin. W genomie ФLM21, tuż przez grupą genów przypuszczalnie związanych z replikacją, zidentyfikowaliśmy gen kodujący MTazę m 6 A (orf27), którego produkt specyficznie modyfikował sekwencję GANTC do Gm 6 ANTC. Enzym ten nie metylował miejsc niekanonicznych. Wszystkie dotąd poznane alfaproteobakterie kodują MTazy m 6 A o specyficzności GANTC (modyfikowany nukleotyd jest podkreślony), których prototypem jest CcrM z Caulobacter crescentus [23]. Wykazaliśmy, że homolog CcrM (CcrM LM21 ) jest kodowany także przez szczep LM21 i ma taką 8

9 samą specyficzność. Wcześniejsze doniesienia wskazywały, że MTazy podobne do CcrM są kluczowe dla żywotności Sinorhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Brucella abortus i C. crescentus oraz, że biorą udział w regulacji cyklu komórkowego [23-26]. Jest prawdopodobne, że CcrM LM21, której sekwencja aminokwasowa jest w 94% identyczna z CcrM Sinorhizobium meliloti 1021, pełni podobną funkcję w szczepie LM21. Wyniki moich prac, jako pierwsze pokazują, że bateriofagi alfaproteobakterii kodują MTazy DNA o specyficzności GANTC naśladując tym samym specyficzność metylacyjną globalnego enzymu regulatorowego swojego bakteryjnego gospodarza. Wcześniej fenomen ten został przeze mnie wykryty w trzech sekwencjach profagowych znajdujących się genomie Paracoccus aminophilus JCM 7686, w tym dla jego aktywnego profaga ΦPam-6 ([27], praca nie włączona do cyklu przedstawianego jako osiągnięcie habilitacyjne). Co ciekawe, geny wspomnianych MTaz DNA u profagów P. aminophilus JCM 7686, tak samo jak orf27 ФLM21, znajdują się tuż przed modułem replikacyjnym, co sugeruje związek aktywności metylacyjnej z tym etapem fagowego cyklu infekcyjnego. Natomiast na poziomie sekwencji aminokwasowej Orf27 ФLM21 oraz MTazy profagów P. aminophilus nie są podobne do MTaz typu CcrM ich bakteryjnych gospodarzy. Pozwala to przypuszczać, że w procesach, w których te enzymy są zaangażowane istotniejsza jest specyficzność a nie ich struktura pierwszorzędowa. Sinorhizobium to niezwykle ważny rodzaj mikroorganizmów z klasy alfaproteobakterii ze względu na ich zdolność do wiązania azotu atmosferycznego i możliwość życia w symbiozie z roślinami motylkowymi. Nasza wiedza na temat fagów infekujących tę istotną z punktu widzenia gospodarczego i ekologicznego grupę bakterii, jest znikoma, do tej pory poznano trzy takie wirusy, a tylko dwa zostały scharakteryzowane [28,29]. Dlatego przeprowadzone przez nas badania stanowią istotny wkład w to zagadnienie tym bardziej, że ФLM21 okazał się być unikatowym nie tylko w porównaniu do fagów infekujących Sinorhizobium, ale także wszystkich dotąd poznanych wirusów bakteryjnych. Dziewit L, Radlińska M. Two novel temperate bacteriophages co-existing in Aeromonas sp. ARM81 - characterization of their genomes, proteomes and DNA methyltransferases. (2016) J Gen Virol. Praca prezentuje analizę genomiczną i porównawczą dwóch łagodnych bakteriofagów, ФARM81mr i ФARM81ld, koegzystujących w jednym gospodarzu, Aeromonas sp. ARM81, bakterii wyizolowanej ze ścieków komunalnych oczyszczalni Czajka w Warszawie oraz charakterystykę kodowanych przez nie MTaz DNA. Mitomycyna C spowodowała symultaniczną indukcję obu wirusów. Co ciekawe, plony obu fagów były dość wysokie, choć w szczepach polilizogennych zazwyczaj tylko jeden z profagów ulega indukcji lub znacząco dominuje w 9

10 stosunku do pozostałych pod względem liczby wytworzonych cząstek potomnych [30]. Podczas wirowania równowagowego w gradiencie chlorku cezu, wiriony ФARM81mr i ФARM81ld utworzyły dwa osobne prążki, co umożliwiło ich rozdzielenie. Dzięki sekwencjonowaniu, analizie restrykcyjnej oraz hybrydyzacji metodą Southerna DNA wyizolowanego z komórek gospodarza oraz kapsydów ustaliliśmy, że ФARM81mr jako profag pozostaje zintegrowany z chromosomem gospodarza, a ФARM81ld jest pozachromosomowym niezależnym replikonem, liniowym plazmidem-profagiem. Forma liniowa cząsteczki DNA profaga ФARM81ld oraz obecność na jej końcach 42-nukleotydowych sekwencji palindromicznych (tzw. telomerów), a także obecność w genomie genu kodującego homologa protelomeraz, enzymów charakterystycznych dla liniowych telomerowych bakteriofagów pozwoliły nam na przypisanie ФARM81ld do tej grupy rzadkich wirusów, których prototypem jest N15 [31]. Liniowe telomerowe profagi-plazmidy stanowią bardzo unikatową formę lizogenii, jak dotąd scharakteryzowano ich zaledwie osiem. ФARM81ld jest pierwszym takim profagiem odkrytym u bakterii z rodzaju Aeromonas. W sekwencjach badanych fagów zidentyfikowaliśmy cztery MTazy DNA. Produkty genów ARM81mr_p29 i ARM81ld_p31, kodowane przez odpowiednio fagi ФARM81mr i ФARM81ld, wykazały 58% identyczności, a także podobieństwo do M.Gel16401IV z Geopsychrobacter electrodiphilus DSM (o specyficzności CCAG) i innych MTaz modyfikujących cytozynę do m 5 C. Gen ARM81mr_p29 znajduje się tuż przed modułem replikacyjnym, a ARM81ld_p31 w sąsiedztwie systemu partycyjnego. Wykazaliśmy, że MTazy ARM81mr_p29 i ARM81ld_p31 modyfikują co najmniej jedną cytozynę w sekwencji CC, jednakże ich aktywność enzymatyczną zademonstrowaliśmy wyłącznie po nadprodukcji w E.coli. Natomiast nie potwierdziliśmy obecności modyfikacji m 5 C w motywach CC w genomowym DNA ФARM81mr i ФARM81ld wyizolowanym z wirionów. Nie można wykluczyć, że MTazy ARM81mr_p29 i ARM81ld_p31 są aktywne w komórkach Aeromonas, ale na przykład na bardzo wczesnych etapach cyklu infekcyjnego obu fagów, albo, że metylacja w warunkach naturalnych dotyczy tylko nieznacznej frakcji miejsc. W genomie ФARM81mr zidentyfikowaliśmy także gen, ulokowany w module rekombinacyjnym, kodujący MTazę m 6 A (ARM81mr_p11) podobną do MTaz typu Dam łagodnych fagów gammaproteobakterii m.in. VT-2 [32] i HP1 [33,34]. Potwierdziliśmy eksperymentalnie jej specyficzność GATC. Szczep ARM81 koduje własną MTazę Dam (Dam ARM81 ), w 94% identyczną z M.AhySSUDam, która warunkuje żywotność i patogenność szczepu A. hydrophila SSU [35], co pozwala przypuszczać, że pełni ona podobną funkcję w szczepie ARM81. Jednakże, mimo identycznej sekwencji rozpoznawanej białka ARM81mr_p11 i Dam ARM81 nie wykazują znaczącego podobieństwa. Taki fenomen molekularnej mimikry specyficzności MTaz typu Dam, kodowanych 10

11 przez fagi oraz przez ich gospodarzy - gammaproteobakterie był już uprzednio opisany [36,37], także jako wynik moich wcześniejszych prac [32,34]. Natomiast tutaj po raz pierwszy został przez nas odkryty w rodzaju Aeromonas. Trzeba podkreślić, że podobne zjawisko zidentyfikowałam u faga ФLM21 i jego gospodarza alfaproteobakterii Sinorizobium sp. LM21, a wcześniej w P. aminophilus JCM 7686 (patrz wyżej). Występowanie takiego fenomenu w obu klasach proteobakterii pozwala przypuszczać, iż fagowe MTazy Dam u gammaproteobakterii oraz fagowe MTazy typu CcrM u alfaproteobakterii pełnią istotne funkcje w ich cyklach infekcyjnych. Można też spekulować, że w tym szczególnym wypadku, tak jak bezwzględnie zachowywana jest specyficzność MTaz fagowych i bakteryjnych, równie istotny i konserwowany jest brak podobieństwa tych białek, co może mieć odzwierciedlenie w różnym sposobie ich działania. Sprawdzenie słuszności tej hipotezy będzie wymagało dalszych badań i jest też jednym z celów moich najbliższych planów naukowych. Najbardziej niezwykłą MTazą DNA, okazał się produkt genu ARM81ld_p56, który kodował enzym w 53% identyczny z niespecyficzną MTazą m 6 A M.EcoGI enterokrwotocznej E. coli O104:H4 C [38]. Z użyciem zestawu dwuniciowych oligonuklotydów zawierających w jednej z nici powtórzenia danego dwunukleotydu: CA, GA, TA lub AA (użytego wcześniej w analizie MTazy Hia5, patrz wyżej) wykazaliśmy, że badany enzym metyluje wszystkie te substraty, co pozwala wnioskować, że MTaza ARM81ld_p56 może modyfikować każdą adeninę bez względu na kontekst sekwencyjny. Enzym ten jest więc potencjalnie zdolny do masowej metylacji, tak samo jak zostało to wykazane dla MTazy Hia5. W genomach funkcjonalnych bakteriofagów zidentyfikowaliśmy wiele homologów ARM81ld_p56. Co ciekawe, wśród nich są MTazy kodowane przez sześć z ośmiu znanych telomerowych fagów liniowych (ФKO2, PY54, vb_vpam_mar, VHML, N15 i VP58.5), a także przez łagodnego faga Aeromonas ФO18P. Niewykluczone, że te MTazy są również niespecyficzne. Tuż przed genem ARM81ld_p56 w genomie ФARM81ld znajduje się gen kodujący homologa białka Com (ARM81ld_p55), który jak, wspomniano wyżej, jest pozytywnym regulatorem translacji enzymu modyfikacyjnego Mom u faga Mu i zabezpiecza przed przedwczesną, cytotoksyczną dla gospodarza, modyfikacją DNA, momifikacją [19]. Niewykluczone, że ARM81ld_p55 pełni podobną funkcję związaną z kontrolą ekspresji MTazy ARM81ld_p56. Ta para genów jest zlokalizowana na końcu prawego ramienia genomu faga ФARM81ld, tuż przed genem kodującym białko umożliwiające dezintegrację ściany komórkowej gospodarza, tak samo jak geny com-mom w fagu Mu i tak samo jak com-hia5. O ile momifikacja wydaje się być wykorzystywana przez faga Mu jako strategia anty-restrykcyjna, w każdym razie efektywnie zabezpiecza fagowy DNA przez strawieniem różnymi REazami [39], enzym ARM81ld_p56 nie wydaje się pełnić takiej funkcji, gdyż nie wykryliśmy masowej metylacji 11

12 genomowego DNA faga ФARM81ld tą MTazą. Wynik ten niezwykle nas zaskoczył, gdyż brak aktywności Hia5 i jej homologów w natywnych gospodarzach (a także innych niespecyficznych MTaz jak wspomnianej M.EcoGI) można było wytłumaczyć represją promotorów profagowych w związku ze stanem lizogenii. Natomiast testowane genomowe DNA ФARM81ld zostało wyizolowane z kapsydów, a więc już po efektywnym zakończeniu ścieżki litycznej tego faga. Być może, potencjał ARM81ld_p56 do masowej metylacji jest wykorzystywany nie do obrony przed restrykcją, ale jako strategia obronna przed superinfekcją. Byłby to więc system wykluczający zakażenie lizogena takim samym lub pokrewnym bakteriofagiem. Masowa metylacja mogłaby skutecznie zablokować zarówno replikację faga-intruza, jak i replikację chromosomu lizogena, co w rezultacie doprowadziłoby do jego śmierci. Wielokrotnie opisywano strategie anty-fagowe bazujące na samobójstwie zaatakowanej komórki, które efektywnie ograniczają możliwość rozprzestrzenienia się pasożyta w populacji [40,41]. Bardzo często takie systemy oporności są kodowane na ruchomych elementach jak plazmidy czy profagi [42]. Oczywiście moja dość śmiała hipoteza, o wykorzystaniu niespecyficznej MTazy DNA jako strategii ochrony przed superinfekcją, wymaga przeprowadzenia odpowiednich badań, które planuję podjąć w najbliższym czasie. Aeromonas występują powszechnie w różnych środowiskach, szczególnie masowo w wodzie, gdzie są prekursorami tworzenia biofilmów. Uważane są za najistotniejszy czynnik etiologiczny zakażeń ryb, a trzy gatunki tj. Aeromonas hydrophila, A. caviae i A. veronii mają znaczenie kliniczne dla człowieka, wywołują zatrucia pokarmowe lub nieżyty żołądkowo-jelitowe. Jak dotąd opisano tylko jednego łagodnego faga Aeromonas [43]. Nasze badania dostarczyły więc bardzo istotnych danych ilustrujących różnorodność łagodnych fagów infekujących ten rodzaj bakterii oraz typów lizogenii przez nie przyjmowanych. Dziewit L, Radlińska M. Two bacteriophages of an Antarctic Pseudomonas sp. ANT_H14 use the same capsid for packaging their genomes characterization of a novel phage helpersatellite system. (2016) PLoS One. Praca prezentuje analizę genomiczną i porównawczą dwóch łagodnych bakteriofagów, ФAH14a i ФAH14b, koegzystujących w jednym gospodarzu, termotolerancyjnym Pseudomomonas sp. ANT_H14 wyizolowanym z gleby na Antarktydzie. W przeciwieństwie do opisanych wcześniej wirusów Aeromonas sp. ARM81, jednoczesna izolacja dwóch różnych fagów z ANT_H14 była dla nas ogromnym zaskoczeniem, gdyż po wirowaniu zawiesiny fagowej (wyizolowanej po indukcji bakterii mitomycyną C) w gradiencie CsCl widoczny był tylko jeden prążek, a na zdjęciu z TEM wszystkie cząstki fagowe były tej samej wielkości. Tymczasem sekwencjonowanie materiału genetycznego pochodzącego z kapsydów wykazało obecność dwóch zupełnie różnych genomów wirusowych. Ponadto analizując skład białkowy wirionów zidentyfikowaliśmy produkty kodowane 12

13 tylko przez jednego z tych fagów ФAH14a. Genom drugiego faga ФAH14b nie zawierał żadnych genów strukturalnych i morfogenetycznych (a także związanych z lizą gospodarza). Uzyskane rezultaty pozwoliły nam na konkluzję, że genomy obu fagów zostały zapakowane do kapsydów zbudowanych z białek strukturalnych faga ФAH14a, a to z kolei na przypuszczenie, że odkryliśmy nowy wirusowy system pomocnik (helper)-satelita, w którym satelita ФAH14b pasożytuje na pomocniku ФAH14a. Bakteriofagi satelitarne to czynniki zdolne do autonomicznej replikacji swojego materiału genetycznego, ale nie kodujące białek strukturalnych i morfogenetycznych oraz litycznych, które do zapakowania genomu wykorzystują elementy strukturalne kodowane przez innego faga tzw. pomocniczego. W ten sposób zapewniają sobie możliwość rozprzestrzenienia się [44]. Wzorcowym przykładem systemu helper-satelita Caudovirales i jak dotąd jedynym scharakteryzowanym u bakterii Gram-ujemnych, jest para bakteriofagów P2-P4 infekujących Enterobakterie. Chociaż wiriony fagów P2 i P4 są zbudowane z tych samych białek, kodowanych przez P2, wielkości obu kapsydów są różne. Genom P2 o długości 33,5 kb jest pakowany do dużych główek, a genom P4 o długości 11,6 kb do małych główek, zmniejszonych dzięki działaniu białka Sid faga P4 [45,46]. Jak wspomniano wyżej cząstki fagowe obserwowane w TEM były jednakowej wielkości, co było zaskakujące gdyż genomy ФAH14a i ФAH14b różnią się znacząco długością (odpowiednio i bp). W oparciu o ilościową analizę restrykcyjną DNA wyizolowanego z cząstek fagowych wywnioskowaliśmy, że genom ФAH14a jest pakowany mniej więcej jako monomer, a ФAH14b jako trimer, a pakowanie odbywa się z użyciem strategii do wypełnienia główki (ang. headful). Podobne zjawisko, braku możliwości zmiany morfologii główki, zaobserwowano u faga P4 z mutacją typu knock-out genu sid. Fagi P4 sid- pakowały trimery genomowego DNA do dużych główek [47,48]. Trzeba podkreślić, że w genomie ФAH14b nie zidentyfikowaliśmy genu, którego produkt byłby homologiczny do Sid P4, mimo, że trzy inne białka (integraza, regulator transkrypcji i prymaza) obu fagów są podobne. Przeprowadzone przez nas analizy porównawcze doprowadziły do identyfikacji w zsekwencjonowanych genomach bakterii z rodzaju Pseudomonas hipotetycznych profagów wykazujących podobieństwo do ФAH14a i ФAH14b, a nawet podobnych par w genomach Pseudomonas sp. TKP, P. cichorii JBC1 i P. mosselii SJ10. Pozwala to przypuszczać, że systemy helper-satelita, spokrewnione z odkrytym przez nas prototypowym duetem ФAH14a-ФAH14b, występują u Pseudomonas powszechnie. W genomie faga pomocniczego ФAH14a zidentyfikowaliśmy gen kodujący MTazę DNA (AH14a_p05), którego białkowy produkt wykazywał podobieństwo do scharakteryzowanych i hipotetycznych MTaz modyfikujących cytozynę do m 4 C. Z użyciem enzymów restrykcyjnych wrażliwych na obecność m 4 C w sekwencji rozpoznawanej wykazaliśmy, że AH14a_p05 13

14 modyfikuje pierwszą cytozynę w motywie CCCGGG. Żadne z 16 miejsc CCCGGG w DNA ФAH14a ani siedmiu w DNA ФAH14b wyizolowanym z wirionów nie było wrażliwe na cięcie REazą SmaI o takiej specyficzności, co pozwoliło przypuszczać, że miejsca te są zmetylowane przez MTazę AH14a_p05. Jednocześnie fakt, że genomowy DNA Pseudomonas sp. ANT_H14 był wrażliwy na SmaI wykluczało możliwość, że szczep ten koduje aktywny system RM o specyficzności CCCGGG, co sugeruje, że MTaza AH14a_p05 nie jest częścią strategii obronnej faga ФAH14a przed restrykcją w tym gospodarzu. Nie wykluczone jednak, że ta strategia sprawdziłaby się w innym gospodarzu, który dysponowałby REazą o specyficzności CCCGGG. Wiele szczepów Pseudomonas koduje REazy, będące częścią systemów RM, o takiej sekwencji rozpoznawanej np. Pseudomonas alcaligenes (Pac25I) [49], Pseudomonas aeruginosa-18 (PaeBI) czy Pseudomonas sp. AL1637 (PspAL). Bierzemy również pod uwagę inną możliwość, że funkcja AH14a_p05 w szczepie ANT_H14 nie jest związana z ochroną przed restrykcją. Lokalizacja genu AH14a_p05 w sąsiedztwie modułu rekombinacyjnego może wskazywać na udział MTazy AH14a_p05 w tym procesie. Zdjęcia z TEM cząstek fagowych ФAH14a i ФAH14b, a także wyniki analizy składu białkowego wirionów, nie pozostawiały wątpliwości, że kapsydy tych fagów składają się tylko z główek pozbawionych ogonków, mimo że w genomie ФAH14a zidentyfikowaliśmy, cały zestaw informacji genetycznej potrzebnej do zbudowania ogonka i przyłączenia go do główki. Przypuszczalnie mutacje nagromadzone w genomie ФAH14a uniemożliwiają mu dokończenie procesu morfogenezy wirionów. Zapewne gromadzące się zmiany degeneracyjne doprowadzą w końcu do przekształcenia tego profaga w wersję w pełni defektywną. Jednakże ФAH14a wciąż zachował zdolność do indukcji cyklu litycznego, replikacji oraz zapakowania genomu do główki. Co ciekawe, wydaje się, że jego satelita ФAH14b utrzymał bez zmian wszystkie swoje natywne funkcje jednoczesnej indukcji wraz z helperem, replikacji i pakowania. Ten ewolucyjny paradoks można wytłumaczyć na dwa sposoby: (i) defektywność ФAH14a jest rezultatem dość niedawnego zdarzenia ewolucyjnego, (ii) mutacje w genomie ФAH14b podlegają bardzo mocnej presji selekcyjnej. Działanie takiej kierunkowej presji selekcyjnej na sekwencję profagową ФAH14b (a nie na ФAH14a) mogłoby wynikać z posiadania, tylko przez genom ФAH14b, jakiejś cechy, która zwiększałaby zdolności przystosowawcze gospodarza. Wskazaliśmy dwa białka kodowane przez ФAH14b, których aktywność mogłaby być potencjalnie korzystna dla bakterii kinaza histydynowa (podobne enzymy wchodzą w skład dwuskładnikowych systemów regulacyjnych, których zadaniem jest odbiór sygnałów płynących ze środowiska zewnętrznego do komórki) [50] oraz regulator AlpA, którego homologi są zaangażowane w tworzenie biofilmu u E.coli [51]. 14

15 Przestawione powyżej hipotezy to naturalnie spekulacje, które wymagają eksperymentalnej weryfikacji. Jednocześnie pozwalają unaocznić jak ciekawym modelem badawczym jest odkryta przez nas para helper-satelita zarówno w kontekście ewolucji wirusów, jak i relacji pasożytgospodarz. Z użyciem zawiesiny fagów ФAH14a i ФAH14b testowaliśmy ich zdolności lityczne wobec kilku szczepów Pseudomonas spp., ale próba ta nie zakończyła się powodzeniem. Chociaż nie można wykluczyć, że użyte przez nas szczepy nie były wrażliwe na te fagi to bardziej prawdopodobna wydaje się utrata zdolności infekcyjnych przez ФAH14a i ФAH14b w związku z brakiem ogonka. Nie jest też dla nas jasne czy w ogóle dochodzi do lizy komórek Pseudomonas sp. ANT_H14, w następstwie prowadzonego przez zaindukowane fagi cyklu replikacyjnego, gdyż nie udało nam się jej zaobserwować. Namnożone cząstki fagowe były uwalniane z komórek z użyciem chloroformu. Zdolność do lizy ФAH14a_p93 domniemanej hydrolazy peptydoglikanu, wykazaliśmy eksperymentalnie w heterologicznym gospodarzu, natomiast przypuszczamy, że gen ФAH14a_p93, z nieznanych przyczyn, nie ulega ekspresji w trakcie cyklu litycznego faga ФAH14a, podobnie jak pozostałe geny późne (w tym geny kodujące białka struktury i morfogenezy ogonka). Podczas analizy składu białkowego wirionów zidentyfikowaliśmy tylko cztery: ФAH14a_p62, _p63, _p66 i _p68 (odpowiednio portalowe, morfogenezy, główne białko główki i łącznikowe). Niewykluczone, że nie dochodzi do ekspresji genów znajdujących poniżej ФAH14a_p68, a więc tych kodujących brakujące elementy kapsydów oraz odpowiedzialnych za lizę. W świetle powyżej opisanych wyników sądzę, że faga ФAH14a można uznać za defektywnego. Określenie defektywny bakteriofag odnosi się do takiego, który nie jest w stanie dokończyć cyklu infekcyjnego, co najczęściej jest utożsamiane z brakiem zdolności do wytworzenia łysinek (jego wiriony są nieinfekcyjne). Jest dość prawdopodobne, że pozostałe badane przez nas bakteriofagi ФLM21 Sinorhizobium sp. LM21 oraz ФARM81mr i ФARM81ld Aeromonas sp. ARM81 mogą także być defektywne. Chociaż ich wiriony wydają nam się kompletne, nie wiemy czy są infekcyjne. Nie wykazaliśmy bowiem ich zdolności do lizy spokrewnionych szczepów bakteryjnych, aczkolwiek ten fakt można wytłumaczyć bardzo wąskim zakresem gospodarza tych fagów, co jest powszechną cechą wielu wirusów bakteryjnych. Badania bakteriofagów, które w sposób naturalny są dysfunkcjonalne na różnych etapach cyklu infekcyjnego może dostarczyć wielu interesujących wniosków na temat zmian ewolucyjnych inaktywujących profagi. Na przykład pozwolić na zrozumienie przebiegu ich regresywnej ewolucji, czy pozwolić zidentyfikować cechy korzystne dla gospodarza, które warunkują konserwację danej sekwencji profagowej w genomie bakteryjnym. 15

16 Podsumowanie Prace badawcze opisane w artykułach przedstawionych jako moje osiągnięcie habilitacyjne zaowocowały wyizolowaniem pięciu nowych łagodnych bakteriofagów z trzech polilizogennych szczepów. Jako profagi wykazują one różne style lizogenii, a także różne wzajemne relacje polilizogenicznej koegzystencji. Cztery profagi są zintegrowane z chromosomem bakteryjnego gospodarza, a jeden jest liniowym plazmidem-profagiem. Profag ФLM21 współegzystuje w komórkach Sinorhizobium sp. LM21 z kolistym plazmidem-profagien plm21s1, który nie indukował się po użyciu mitomycyny C [52]. Niewykluczone, że ФLM21 szybciej się replikuje i dlatego wygrywa wyścig z plm21s1 o zasoby gospodarza. Natomiast fagi ФARM81mr i ФARM81ld Aeromonas sp. ARM81 namnażają się symultanicznie, podobnie jak ФAH14a i ФAH14b Pseudomomonas sp. ANT_H14 tyle, że ФAH14b dokonuje tego pasożytując na białkach ФAH14a. Każdy z tych układów jest więc inny i może stanowić model do badań współzawodnictwa pomiędzy profagami koegzystującymi w jednym gospodarzu, zjawiska do tej pory dość słabo poznanego. Genomy wszystkich badanych fagów zostały poddane gruntownej analizie, zidentyfikowaliśmy wiele ciekawych genów, w tym takie, które przypuszczalnie mogą być korzystne, nie bezpośrednio dla wirusa, tylko dla jego gospodarza. Niektóre z kodowanych enzymów (np. modyfikujące DNA, przeprowadzające integrację, hydrolizujące ścianę komórkową) mogą mieć zastosowanie praktyczne w określonych technikach biologii molekularnej. Szczególnie interesujące są niespecyficzne MTazy m 6 A, które odbiegają swoimi właściwościami od dotychczas poznanych MTaz DNA, szczególnie tych kodowanych przez organizmy komórkowe. Uzyskane wyniki umożliwiły analizy porównawcze i filogenetyczne. Odkryte fagi są unikatowe tj. niepodobne na poziomie sekwencji nukleotydowej do wcześniej scharakteryzowanych wirusów, co oczywiście nie jest zaskakujące w świetle bardzo szybkiej ewolucji tych jednostek biologicznych. Ciekawym odkryciem było natomiast zidentyfikowanie podobnych do nich sekwencji profagowych w genomach zsekwencjonowanych bakterii. Wyniki te mogą więc stanowić inspirację do badań mających na celu sprawdzenie ich funkcjonalności. Każdy z badanych fagów (oprócz satelitarnego ФAH14b) koduje co najmniej jedną MTazę DNA. MTaza faga ФLM21 ma taką samą specyficzność (GANTC) jak regulacyjna MTaza jego gospodarza CcrM LM21. Identyczne są też sekwencje rozpoznawane MTazy ARM81mr_p11 faga ФARM81mr (GATC) i Dam ARM81 gospodarza tego faga. Do wyjaśnienia pozostaje kwestia czy funkcje tych fagowych MTaz są także regulacyjne, podobnie jak ustalenie na jakim etapie cyklu infekcyjnego aktywność tych białek jest najbardziej istotna. Możliwe, że w przypadku faga ФLM21 ma to miejsce na etapie replikacji (np. dlatego, że CcrM LM21 nie jest w stanie zapewnić pełnej metylacji miejsc koniecznych do inicjacji kolejnej rundy replikacji genomu fagowego), a w 16

17 przypadku ФARM81mr na etapie integracji/wycięcia, ze względu na lokalizację genów tych MTaz odpowiednio w modułach replikacyjnym i rekombinacyjnym. Warto zauważyć, że odkryte przeze mnie niespecyficzne MTazy m 6 A kodowane są przez bardziej mobilne elementy (niż klasyczne lambdoidalne profagi) tj. fagi zdolne do transpozycji (podobne do Mu) oraz profagi-plazmidy. Masowa metylacja ich DNA mogłaby być doskonałą cechą przystosowawczą do inwazji szerokiego zakresu gospodarzy - uniwersalnym zabezpieczeniem przed systemami RM o różnych specyficznościach. Równie możliwa jest alternatywna funkcja (w stosunku do ochronnej) tych MTaz, jako mechanizmu zabezpieczającego faga-rezydenta przed konkurencyjną superinfekcją. Dalsze badania będą mogły zweryfikować słuszność każdej z tych hipotez. Wyniki analiz prezentowanych przeze mnie w cyklu prac przedstawionych jako osiągnięcie habilitacyjne bezsprzecznie pokazują jak wszechstronnym modelem badania ewolucji mogą być profagi. Za najważniejsze osiągnięcia przedstawionych prac uważam: Zidentyfikowanie pierwszej niespecyficznej metylotransferazy DNA modyfikującej adeninę do N6-metyloadeniny. Odkrycie zjawiska naśladowania przez MTazy m 6 A kodowane przez łagodne fagi specyficzności metylacyjnej kluczowego enzymu regulatorowego swojego bakteryjnego gospodarza z klasy alfaproteobakterii. Zidentyfikowanie zjawiska mimikry specyficzności metylacyjnej typu Dam bakteryjnego gospodarza z rodzaju Aeromonas przez jego fagowe MTazy. Izolację i scharakteryzowanie dziewięciu nowych fagowych MTaz DNA. Zidentyfikowanie i kompleksową analizę genomiczna pięciu nowych unikatowych łagodnych bakteriofagów. Zidentyfikowanie nowego systemu helper-satelita (pierwszego w rodzaju Pseudomonas a drugiego u bakterii Gram-ujemnych). Plany naukowe Uzyska wyniki, opisane w prezentowanym cyklu prac, pozwoliły na sformułowanie pytań związanych z przypuszczalną rolą metylacji DNA u bakteriofagów, na które będę w najbliższym czasie starała się odpowiedzieć. Moje najbliższe plany naukowe związane są też z już rozpoczętymi projektami badawczymi, które dotyczą identyfikacji i charakterystyki łagodnych bakteriofagów infekujących klasę alfaproteobacterii oraz psychrofilnych bakterii z obszarów 17

18 Antarktydy, a ich celem jest poznanie mobilomów tych mikroorganizmów oraz ustalenia relacji gospodarz-pasożyt. Bibliografia 1 Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ: Prokaryotes: the unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95: Krupovic M, Prangishvili D, Hendrix RW, Bamford DH: Genomics of bacterial and archaeal viruses: dynamics within the prokaryotic virosphere. Microbiol Mol Biol Rev 2011;75: Weinbauer MG: Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol Rev 2004;28: Hayashi T, Makino K, Ohnishi M, Kurokawa K, Ishii K, Yokoyama K, Han CG, Ohtsubo E, Nakayama K, Murata T, Tanaka M, Tobe T, Iida T, Takami H, Honda T, Sasakawa C, Ogasawara N, Yasunaga T, Kuhara S, Shiba T, Hattori M, Shinagawa H: Complete genome sequence of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and genomic comparison with a laboratory strain K-12. DNA Res 2001;8: Casjens S: Prophages and bacterial genomics: what have we learned so far? Mol Microbiol 2003;49: Asadulghani M, Ogura Y, Ooka T, Itoh T, Sawaguchi A, Iguchi A, Nakayama K, Hayashi T: The defective prophage pool of Escherichia coli O157: prophage-prophage interactions potentiate horizontal transfer of virulence determinants. PLoS Pathog 2009;5:e Wang X, Kim Y, Ma Q, Hong SH, Pokusaeva K, Sturino JM, Wood TK: Cryptic prophages help bacteria cope with adverse environments. Nat Commun 2010;1: Bobay LM, Touchon M, Rocha EP: Pervasive domestication of defective prophages by bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 2014;111: Casjens SR: Diversity among the tailed-bacteriophages that infect the Enterobacteriaceae. Res Microbiol 2008;159: Weigele P, Raleigh EA: Biosynthesis and function of modified bases in bacteria and their viruses. Chem Rev Marinus MG, Casadesus J: Roles of DNA adenine methylation in host-pathogen interactions: mismatch repair, transcriptional regulation, and more. FEMS Microbiol Rev 2009;33: Wion D, Casadesús J: N6-methyl-adenine: an epigenetic signal for DNA-protein interactions. Nat Rev Microbiol 2006;4: Blow MJ, Clark TA, Daum CG, Deutschbauer AM, Fomenkov A, Fries R, Froula J, Kang DD, Malmstrom RR, Morgan RD, Posfai J, Singh K, Visel A, Wetmore K, Zhao Z, Rubin EM, Korlach J, Pennacchio LA, Roberts RJ: The Epigenomic Landscape of Prokaryotes. PLoS Genet 2016;12:e Marinus MG, Løbner-Olesen A: DNA Methylation. EcoSal Plus 2014;6 15 Sternberg N, Coulby J: Cleavage of the bacteriophage P1 packaging site (pac) is regulated by adenine methylation. Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87: Murphy J, Mahony J, Ainsworth S, Nauta A, van Sinderen D: Bacteriophage orphan DNA methyltransferases: insights from their bacterial origin, function, and occurrence. Appl Environ Microbiol 2013;79: Morgan GJ, Hatfull GF, Casjens S, Hendrix RW: Bacteriophage Mu genome sequence: analysis and comparison with Mu-like prophages in Haemophilus, Neisseria and Deinococcus. J Mol Biol 2002;317: McGillivary G, Tomaras AP, Rhodes ER, Actis LA: Cloning and sequencing of a genomic island found in the Brazilian purpuric fever clone of Haemophilus influenzae biogroup aegyptius. Infect Immun 2005;73: Hattman S: Unusual transcriptional and translational regulation of the bacteriophage Mu mom operon. Pharmacol Ther 1999;84: Siwek W, Czapinska H, Bochtler M, Bujnicki JM, Skowronek K: Crystal structure and mechanism of action of the N6-methyladenine-dependent type IIM restriction endonuclease R.DpnI. Nucleic Acids Res 2012;40: Mierzejewska K, Siwek W, Czapinska H, Kaus-Drobek M, Radlinska M, Skowronek K, Bujnicki JM, Dadlez M, Bochtler M: Structural basis of the methylation specificity of R.DpnI. Nucleic Acids Res 2014;42: Aughey GN, Southall TD: Dam it's good! DamID profiling of protein-dna interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 2016;5: Brilli M, Fondi M, Fani R, Mengoni A, Ferri L, Bazzicalupo M, Biondi EG: The diversity and evolution of cell cycle regulation in alpha-proteobacteria: a comparative genomic analysis. BMC Syst Biol 2010;4: Wright R, Stephens C, Shapiro L: The CcrM DNA methyltransferase is widespread in the alpha subdivision of proteobacteria, and its essential functions are conserved in Rhizobium meliloti and Caulobacter crescentus. J Bacteriol 1997;179: Kahng LS, Shapiro L: The CcrM DNA methyltransferase of Agrobacterium tumefaciens is essential, and its activity is cell cycle regulated. J Bacteriol 2001;183: Gonzalez D, Kozdon JB, McAdams HH, Shapiro L, Collier J: The functions of DNA methylation by CcrM in Caulobacter crescentus: a global approach. Nucleic Acids Res